GENÉTICA MOLECULAR Bajo la denominación de Genética

GENÉTICA MOLECULAR
Conceptos de Biotecnología y Genética Molecular. Concepto.
Importancia y beneficios de la biotecnología. Ingeniería Genética. y
Tecnología del ADN recombinante: estrategias de clonación. Enzimas de
restricción: especificidad. Construcción de moléculas de ADN
recombinante. Vectores de clonación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): fundamentos.
Organismos transgénicos: plantas transgénicas. Utilidad en agricultura y
ganadería. Animales transgénicos: transferencias y expresión de los
transgenes. Bioética y Bioseguridad.
GENÉTICA MOLECULAR
oLa genética molecular estudia todo lo
relacionado con la manipulación del
ADN y del ARN.
oManipulación del ADN
del ADN recombinante
tecnología
oUno de los objetivos de la técnica del
ADN recombinante es aislar segmentos
de ADN específicos e introducirlos en un
genoma más pequeño denominado
vector.
Las herramientas más utilizadas en la manipulación del
ADN:
• Enzimas de restricción.
• ADN ligasas
• Vectores: plásmidos, virus (fagos)
cósmidos, vectores de clonación.
Enzimas de restricción
 Enzimas capaces de degradar el ADN
extraño (1970 en bacterias)
 Son endonucleasas
 Función: reconocer y cortar ADN extraño,
en secuencias específicas de nucleótidos
llamadas secuencias de reconocimiento.
 Estas secuencias de reconocimiento son
palíndromes, es decir que se leen de la
misma manera en cada cadena del ADN.
Ej: 5´ A C G T 3´
3´ T G C A 5
Enzimas de restricción
• Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual
ha sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción
identificada de Escherischia coli.
• Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se
conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia
específica a cada hebra de ADN.
• Pueden cortar en el mismo lugar de las dos cadenas o pueden
hacerlo en posiciones distintas, en el primer caso generan extremos
romos y en el segundo extremos cohesivos, pegajosos o
escalonado, así puede unirse a otros trozos que sean
complementarios.
Enzimas de restricción
Enzima
Bacteria
Tipo de extremo
 Eco RI
Escherichia coli
cohesivos
 Bam HI
Bacillus amyloquefaciens
cohesivos
 Hae III
Haemophilus aegyptius
romos
 Kpn I
cohesivos
Klebsiella pneumoniae
 Sma I
Serratia marcenscens
romos
ADN Ligasas
Las ADN ligasas son enzimas cuya función es unir las moléculas de ADN,
generando el rADN
Enzimas de restricción
Vectores
• Vector: plásmidos, fagos, virus, cósmidos, capaces de mover genes
de un organismo a otro
• El uso de fragmentos de ADN como vectores cumple un rol
fundamental en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir
material genético de un organismo a otro.
• Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble
cadena que contiene un sector con un origen de replicación del
ADN y un marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para
resistencia a un antibiótico. Los plásmidos vectores contienen a
menudo genes marcadores adicionales que identifican un “inserto”.
Vectores
• Los plásmidos se introducen en la célula
bacteriana.
• Hay plásmidos (ej. pBR322) que son
portadores de genes con resistencia a
antibióticos y poseen un sitio de clonaje de
manera que al introducir el ADN extraño se
interrumpe el gen y solo queda como
resistente a uno de los antibióticos que luego
permite identificar la bacteria que lleva el
inserto o ADN extraño.
• Los plásmidos al replicarse, también replican
el ADN clonado (permite clonar 10 – 12 pb).
Manipulación del ADN
 El ADN motivo de estudio, puede ser
cualquier ADN animal o vegetal o un
genoma bacteriano completo, se digiere
con enzimas de restricción para obtener
pequeños fragmentos de ADN con
extremos cohesivos.
 El plásmido vector se corta con enzimas
de restricción en un lugar de clonado
específico y único.
 Se ponen en contacto el ADN extraño y el
vector y se agrega ADN ligasa que une los
extremos pegajosos de ambos. Esta
nueva molécula es el rDNA.
Manipulación del ADN
• Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria
huésped y se multiplican independientemente del
cromosoma bacteriano.
• Dado que todas las copias del gen provienen de una sola
molécula multiplicada a partir de una única bacteria que
dio origen a la colonia, esta técnica se denomina
clonación.
• Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la
molécula de rDNA.
• Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a
antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo
las que hayan incorporado el plásmido (y con él la
resistencia) sobrevivirán.
• La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un
vegetal o a un callo.
• Por último, se debe detectar si se produjo o no la
recombinación.
CLONACIÓN
Clonación del ADN
• El término clon proviene de la jardinería;
desde hace siglos los jardineros generan
plantas nuevas a partir de gajos. Estas
plantas son genéticamente idénticas y
constituyen un clon. Por lo que se define a
un clon como un grupo de células u
organismos genéticamente idénticas.
• La clonación molecular se hace utilizando
células hospedadoras, bacterias
normalmente. Para realizar la clonación se
utilizan vectores.
CLONACIÓN
Oveja Dolly
 Se tomó una célula de la glándula
mamaria de una oveja Doeset (raza
finlandesa) de seis años y se colocó el
material genético de esa célula en un
huevo vaciado (sin núcleo) de una oveja
escocesa Blackface. Aplicaron una suave
corriente eléctrica
 La nueva célula dio origen a un embrión
que fue implantado en el útero de la
oveja. Varios meses después, dio a luz a
un animal idéntico a sí misma.
 La clonación de esa oveja abrió un debate
sobre la ética de este tipo de
experimentos, sobre todo por el temor a
que se pueda utilizar en humanos.
 Lo realmente novedoso fue que se había
logrado clonar a un animal desde una
célula adulta ya diferenciada. Esta noticia
sugería que el núcleo de una célula ya
diferenciada era aún totipotente.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
 Método fue desarrollado por K. Mullis
en 1985, se extendió rápidamente tanto
en investigación básica como en diagnóstico
clínico.
 Esta técnica permite multiplicar in vitro
fragmentros de ADN sin necesidad de recurrir
a vectores y su replicación en bacterias.
 Se puede amplificar pequeñas cantidades de
ADN miles de veces. El fragmento a multiplicar
puede tener desde 50 hasta más de 2000
nucleótidos de longitud. Se basa, en su forma
más simple, en reacciones sucesivas a distinta
temperatura, y estas reacciones se repiten
entre 20 y 40 veces.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
oSe calienta la muestra hasta lograr la
separación de las dos cadenas de ADN “desnaturalización” - 95°C.
oSe incorporan los primers, o iniciadores.
oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 °C apareamiento de la cadena de oligenucleótidos
con la hebra delADN molde.
oLa ADN polimerasa extiende los primers, a
70°, sintetizan las secuencias complementarias
de hebra molde.
oSe agrega a la solución los nucléotidos –
dexosiribonucleósidos trifosfatos.
o La temperatura está limitada a la
temperatura en la cual trabaja la
ADN polimerasa. La más utilizada
es la bacteria Thermus aquaticus Taq polimerasa, actúa
eficientemente entre los 75 y 80°.
o El resultado de la amplificación de
numerosos ciclos da lugar a la
amplificación geométrica del
segmento del ADN.
o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil
se necesita 20 ciclos. Hoy día se hace de manera
automática.
o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para
obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos
(huella genética), pruebas de paternidad, y recuperación de
ADNs de especies extinguidas o a punto de extinguirse.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
 Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser
analizados de diferente forma:
 Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa,
por electroforesis, proceso mediante el cual se produce la
separación por difusión bajo la acción de un campo
eléctrico.
 Hibridación con una sonda marcada radioactivamente,
cuya secuencia de bases complementarias está contenida
en el fragmento de interés.
 Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas
manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la
sonda. La localización de la sonda radioactiva se logra
mediante autoradiografías.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Utilidad en general y en medicina veterinaria:
• Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de
parentesco o en pruebas de paternidad.
•
•
•
•
También sirve en el diagnóstico de enfermedades
En el desarrollo de vacunas
En el estudio de especies extinguidas
En la determinación del sexo en embriones, identificación de
embriones potencialmente transgénicos,
• Investigación de mutaciones en embriones
• Clonación de genes de secuencia desconocida,
• Variaciones génicas en poblaciones.
Organismos transgénicos
•
Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia de genes,
es decir que posee genes extraños integrados en su patrimonio genético.
•
Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la técnica
del rADN en la obtención de mejores variedades.
Animales transgénicos
•
El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en EEUU
obtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo normal. Habían
transferido por microinyección el gen de la hormona de crecimiento a
células huevo de ratón y luego implantaron estas células en oviductos de
hembras capaces de llevar a cabo la gestación.
•
Para la obtención de los animales transgénicos, los principales
procedimientos son: la microinyección y la utilización de virus como
vectores.
Microinyección
• Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleos
procedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así,
se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embriones
manipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valor
disminuye en mamíferos.
• Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda
transgénica que produce una proteína humana de interés
terapeútico.
• La leche de “Genie” produce la proteína C que controla la
coagulación de la sangre.
• Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobó
que la cerda producía la proteína humana en su leche.
MICROINYECCIÓN
oSe construyó un fragmento de ADN con
una copia del gen humano de interés y
una secuencia promotora.
oEl promotor procedía del gen que
codifica la proteína de la leche del ratón.
oSe recogieron los embriones de una
cerda donante y se seleccionaron los
huevos fecundados, estos se inyectaron
con el ADN extraño usando una
micropipeta de cristal. El ADN se inyectó
en la región del pro núcleo macho y el
ADN extraño se incorporó en uno de los
cromosomas del cerdo.
oLas células fecundadas se implantaron
en una cerda madre “de alquiler” y se
obtuvo la lechona portadora del ADN
extraño en todas sus células.
Genie
Utilidad de los anímales transgénicos
Sirven para suministrar información sobre la función
del gen y la regulación de su expresión, es decir su
traducción en proteína.
El gen insertado puede determinar la síntesis de una
sustancia útil que se puede extraer, en especial de la
leche (proteínas), cuando se trata de un mamífero.
Mejora en la producción animal.
Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se
intenta conseguir que los órganos de este animal se
pueden utilizar para ser transplantados al hombre.
Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes
que sería interesante transferir para alcanzar estos
objetivos.
Utilidad de los animales transgénicos
Científicos de INTA Balcarce y de la
universidad de San Martín lograron producir la
primera vaca transgénica capaz de producir
leche maternizada. Es decir, que en adulto la
leche contenga dos proteínas importantes para
los humanos, la lisozima y la lactoferrina.
La lisozima tiene propiedades antibacterianas
que los bebés necesitan y normalmente
absorben al mamar de pecho de su mamá.
La lactoferrina, involucrada en la incorporación
del hierro a los glóbulos rojos, necesario para
la correcta oxigenación de la sangre.
La leche de vaca también la lleva pero no es
igual a la humana y por ende no funciona de la
misma forma.
Rosita
Otras aplicaciones
•
•
•
•
Gato modificado genéticamente con la inserción de un gen que codifica una proteína:
PROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP: Green fluorescent proteín ).
Esta GFP fue el descubrimiento por el otorgara a 3 científicos el premio nobel de química en
2008. La proteína se usa para evaluar si un gen insertado se está expresando o para evaluar la
extensión de tejidos tumorales, entre otras aplicaciones. Tiene su origen en las medusas.
Este tipo de modificación genética es más simple y eficiente que los tradicionales de
clonación.
Los gatos son susceptibles al virus de la inmunodeficiencia felina [FIV], un pariente cercano
del VIH, la causa del SIDA. La aplicación de la nueva tecnología es desarrollar el uso de gatos
genéticamente modificados para el estudio de la FIV, proporcionando información valiosa, a
su vez, para el estudio del sida.
• Se sabe que los gatos son una de las pocas especies
animales que normalmente son susceptibles a estos
virus, y de hecho están sujetas a una pandemia, con
síntomas tan devastadores en los gatos como los que
ya que son para los humanos.
•
•
Se aclara que esto no produce nada en la salud del gatito
Fuente: http://www.guardian.co.uk/science/2011/sep/11
BIBLIOGRAFÍA
•DE ROBERTIS, E. D. Y E. M. DE ROBERTIS (h). Biología celular
y Molecular. El Ateneo, 1983.
•Klug, W. S.; Cummings, M. R.; Spencer, C. A. 2006. CONCEPTOS
DE GENÉTICA. 8va. Ed. Pearson. Prentice Hall.
•Pierce,B. A. 2005. GENÉTICA. Un enfoque conceptual. 2da.
Edición. Ed. Médica Panamericana
•Tamarin, R. 1996.PRINCIPIOS DE GENÉTICA. Reverté S. A.