Dotación Plasmídica como Marcador Epidemiológico Bacteriano

Dotación Plasmídica como
Marcador Epidemiológico Bacteriano
Merino, Luis A. - Alonso, José M. - Ronconi, María C. - Hreñuk, Gabriela E.
Instituto de Medicina Regional – Universidad Nacional del Nordeste
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina
Tel: +54 (03722) 428213 - Fax: +54 (03722) 422793 - E-mail: lmerino@bib.unne.edu.ar
ANTECEDENTES
Uno de los principales objetivos que se plantean al abordar el estudio de un brote endémico o epidémico de
etiología bacteriana es averiguar si se trata de una situación producida por una misma cepa o si, por el contrario, se tratan de cepas similares de una misma especie pero no idénticas. Además, se hace necesario estudiar la
identidad o no entre cepas aisladas de los enfermos y del sitio que se sospecha pueda ser el foco de contaminación. Para ello pueden emplearse métodos de caracterización fenotípica y técnicas de biología molecular,
dentro de las cuales el estudio de los perfiles plasmídicos es la más confiable entre las accesibles a un laboratorio de investigaciones clínicas (1).
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico bicatenario circular dotados de replicación autónoma, es decir que no son necesarios para el crecimiento normal de la bacteria. Estos pueden tener distintos
tamaños dependiendo de los pares de bases que los compongan y pueden aparecer en número variable. En
general los plásmidos más pequeños tienen un número elevado de copias y los plásmidos de gran tamaño se
encuentran en número muy reducido (uno o dos). En cepas de igual origen los plásmidos se encuentran en
idéntico número, tamaño y peso molecular (2).
Un gran número de características fenotípicas se relacionan con la presencia de plásmidos como ser la producción de toxinas, metabolismo de hidratos de carbono simples, producción de bacteriocinas, síntesis de
enzimas intra o extracelulares o la resistencia a determinados antibióticos (3).
El estudio de la dotación plasmídica es el primer método genotípico de tipificación para el estudio de un
brote epidémico por su mediana complejidad y puede realizarse en un laboratorio de investigación epidemiológica. Posee un alto poder de discriminación sobre todo cuando se usa en combinación con otros métodos de tipificación y una misma metodología puede ser aplicada a distintos géneros y especies bacterianas. La
aplicación adicional de enzimas de restricción al estudio del ADN plasmídico es útil sobre todo en aquellas
cepas con un único plásmido o cuando existan perfiles plasmídicos similares (4).
OBJETIVO
El objetivo del presente proyecto es la implementación de la técnica de análisis del ADN plasmídico a fin de
aplicarla en el tipado epidemiológico de cepas bacterianas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Origen de las cepas: Se incluyeron en el presente trabajo 50 cepas pertenecientes a los géneros Salmonella y
Shigella provenientes de centros asistenciales de las ciudades de Corrientes, Resistencia y Presidencia Roque
Sáenz Peña (Chaco).
Identificación bacteriana: Las cepas fueron identificadas a nivel de género, especie y serotipo para lo cual se
utilizaron pruebas bioquímicas y serológicas.
Análisis del ADN plasmídico: se siguieron los siguientes pasos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Las bacterias fueron sembradas en 10 ml de caldo L e incubadas durante 24 hs a 35ºC.
Se centrifugó el caldo conteniendo las bacterias durante 15 minutos a 3000 r.p.m., se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 0,5 ml de buffer de electroforesis.
Se evaluaron diferentes metodologías como ser los métodos descriptos por Birnboim-Doly (5), Kado-Liu
(6) y Ruiz Trevisan-Zorzópulos (7). Estas técnicas difieren principalmente en los reactivos y tiempos involucrados en las etapas de lisis bacteriana y extracción del material plasmídico. Como controles se utilizaron las cepas Escherichia coli V517 y Salmonella enterica sub enterica serotipo Tiphymurium M1359,
ambas de dotación plasmídica conocida.
La separación del material plasmídico del resto de los componentes bacterianos se llevó a cabo por centrifugación en centrífuga refrigerada Sorball a 4ºC durante 15 minutos a 5000 r.p.m.
Con la fase acuosa obtenida se realizó la electroforesis en gel de agarosa utilizando buffer Tris-AcetatoEDTA pH=8.4 durante tiempos y voltajes variables a fin de seleccionar la combinación más adecuada para la separación de bandas. Se evaluaron los resultados obtenidos sembrando las muestras antes de sumergir la placa de agarosa en buffer (siembra seca) y luego de sumergida (siembra húmeda).
El revelado de las bandas se llevó a cabo mediante coloración con bromuro de etidio 0,5 µg/ml evaluando la utilidad de la coloración previa y posterior a la electroforesis.
El registro de los patrones electroforéticos se realizó mediante fotografía Polaroid mediante transiluminación con luz ultravioleta.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Hace casi dos décadas, se agregó a la nómina de marcadores epidemiológicos bacterianos, el análisis del ADN
plasmídico. Las primeras descripciones de plásmidos se realizaron en miembros de la Familia Enterobacteriaceae pero en la actualidad se los ha encontrado en la mayoría de las bacterias productoras de brotes epidémicos nosocomiales o de la comunidad (8,9).
Numerosos trabajos publicados describen la presencia de plásmidos en cepas de Salmonella y Shigella y su
utilidad como marcador epidemiológico, variando los resultados según la región estudiada. Luque y cols. en
Madrid (10) y Mariscal Larrubia y cols. en Málaga (11) han relacionado la resistencia a antibióticos con la
presencia de plásmidos en cepas de Salmonella aisladas tanto de pacientes como del medio ambiente. Por otra
parte, en Barcelona se lo aplicó esta técnica de tipificación epidemiológica a 26 pacientes afectados por un
brote de disentería por Shigella sonnei (12).
Diversos autores han realizado modificaciones en las técnicas de extracción y separación de plásmidos bacterianos debido a que las condiciones de trabajo pueden variar de un laboratorio a otro según el equipamiento
técnico con el que se cuenta, por lo que se hace necesario realizar adaptaciones puntuales en cada caso en
particular (13,14).
En nuestro trabajo, luego de comparar los resultados obtenidos con las diferentes metodologías se adoptó la
lisis alcalina en caliente descripta por Kado y Liu con las siguientes modificaciones:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
El pH de la solución de lisis (NaOH, SDS y buffer TRIS) debe ser superior a 13 en lugar de 12.
La reducción a la mitad del volumen de reactivos usados en la extracción con fenol-cloroformo evita la
dilución del material plasmídico.
El uso de 100 ml de agarosa en lugar de 40 ml permite aumentar la cantidad sembrada y con ello obtener
mayor cantidad de ADN en cada banda.
La siembra seca con una corrida inicial de 10 minutos a 90 V y posterior cubierta de la placa de agarosa
con buffer asegura que no se pierdan volúmenes de material sembrado.
Con una electroforesis durante 18 horas a 20 V en lugar de 2 hs a 75 V se consigue mayor resolución
entre bandas.
Es conveniente colorear la agarosa luego de la electroforesis ya que la unión previa del bromuro de etidio
con el ADN retrasa la migración de las diferentes bandas.
Las bacterias estudiadas presentaron entre 1 y 3 plásmidos; uno de ellos de gran tamaño (aproximadamente
130 kilobases ≅ 86 MD) estuvo presente en todas. En la figura 1 se muestra a modo de ejemplo bandas obtenidas con algunas de las cepas incluidas en este trabajo.
SP99
HV141
SP98
SP39
SP26
SP1
~130 kb
~70 kb
Crom.
Salmonellas
Shigellas
Figura 1: Electroforesis de ADN plasmídico de cepas 6 cepas de Salmonella y Shigella estudiadas.
Kb= kilobases. Crom. = restos de ADN cromosómico
CONCLUSIONES
Una vez puesta a punto la técnica elegida, su aplicación es simple y permite estudiar la dotación plasmídica de
diferentes especies bacterianas.
El escaso número de plásmidos encontrados en las bacterias estudiadas no posibilitan su utilización como
marcador epidemiológico, salvo que se apliquen otras técnicas más complejas para discernir si las bandas del
tamaño corresponden a plásmidos iguales o no. Para ello debería recurrirse a técnicas de digestión del ADN
plasmídico con enzimas de restricción y electroforesis en campo pulsátil.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación “Alberto J. Roemmers” y de la Secretaría
General de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional del Nordeste. Los autores desean además expresar
su agradecimiento al Personal de Apoyo del Departamento de Bacteriología del Instituto de Medicina Regional, a las colegas que proveyeron cepas para ser incluidas en este trabajo y a los Profesionales de los Servicio
de Antimicrobianos y Enterobacterias del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas “Dr. Carlos G.
Malbrán” quienes incondicionalmente apoyaron técnica y científicamente la realización de este proyecto.
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