Catálogo actualizado - Universitat de València

CATÁLOGO DE TEMAS TFM MÁSTER EN INVESTIGACIÓN
MOLECULAR, CELULAR Y GENÉTICA. CURSO 2016-2017
EN
BIOLOGÍA
1) Regulación de la longevidad de los granos de trigo mediada por los factores de transcripción
Homeobox.
Los bancos de germoplasma juegan un papel fundamental en la conservación de la biodiversidad del
mundo vegetal. Un parámetro fundamental es la denominada longevidad de la semilla, que se define
como el periodo de tiempo en el cual la semilla es capaz de mantener su poder de germinación. En
Arabidopsis, se ha demostrado que el factor de transcripción HB25 regula la cubierta de la semilla, que a
su vez es indispensable para el mantenimiento de su capacidad de germinación. Sin embargo, el papel de
la familia de este factor de transcripción en la longevidad del grano de cereales es incierto. Por ello, se
han obtenido plantas transgénicas de trigo sobreexpresoras de AtHB25. En este trabajo se seleccionarán
las líneas transgénicas, se analizará la expresión del transgén mediante qRT-PCR, se realizarán estudios
de longevidad, cortes histológicos y tinciones específicas del grano de trigo.
Ramón Serrano y Eduardo Bueso.
Contacto: edubueso@gmail.com
2) Papel fisiológico del sistema de transducción de señal de dos componentes de Lactobacillus casei
Los sistemas de transducción de señal de dos componentes (TCS) juegan un papel central en la regulación
fisiológica de las bacterias en respuesta a cambios ambientales. Los TCS típicamente constan de una
proteína sensora (HK) capaz de autofosforilarse en respuesta a un estímulo específico y de transferir el
grupo fosfato al segundo componente, el regulador de la respuesta (RR), cuya actividad está modulada en
función de su estado de fosforilación. Trabajos previos llevados a cabo en el laboratorio han permitido
obtener mutantes deficientes en cada uno de los RR de los 17 TCS codificados por L. casei. La
caracterización de algunos de estos mutantes sugiere que en algunos casos puede darse regulación
cruzada entre distintos TCS. Con el fin de estudiar este fenómeno con mayor detalle, se plantea obtener
mutantes deficientes en cada una de las HK y llevar a cabo su caracterización fenotípica. En aquellos
casos en que se detecten diferencias fenotípicas sustanciales entre los mutantes deficientes en RR y
mutantes deficientes en las correspondientes HK, se llevará a cabo un análisis con mayor profundidad,
mediante el reemplazamiento de los respectivos genes por variantes incapaces de ser fosforiladas y el
estudio del transcriptoma de las cepas mutantes.
PUBLICACIONES
DEL
GRUPO
RELACIONADAS
Landete
et
al.
(2010).
Appl.
Environ.
Microbiol.
76:
84-95.
Alcántara
et
al.
(2011).
Appl.
Environ.
Microbiol.
77:
1516-1519.
Zúñiga
et
al.
(2011).
BMC
Evol.
Biol.
11:
34.
Revilla-Guarinos
et
al.
(2013).
Appl.
Environ.
Microbiol.
79:
3160-3170.
Landete
et
al.
(2013).
Appl.
Environ.
Microbiol.
79:
5509-5518.
Revilla-Guarinos
et
al.
(2014).
Env.
Microbiol.
16:
1225-1237.
Alcántara
et
al.
(2016).
Mol
Microbiol.
doi:
10.1111/mmi.13299
DATOS DE CONTACTO: Manuel Zúñiga Cabrera, Dpto. Biotecnología de Alimentos, IATA-CSIC. Email btcman@iata.csic.es. Tel. 963900022 ext. 2007.
El proyecto de tesis de máster propuesto se enmarca dentro del proyecto “Análisis y control integrado de
Toxoplasma gondii y virus entéricos en vegetales de IV gama”. El objetivo principal es el desarrollo de
nuevos métodos moleculares, basados en PCR a tiempo real (qPCR), para abordar la detección de formas
viables/infecciosas de virus y parásitos transmitidos por alimentos.
3.1) Desarrollo y optimización de un método indirecto para la detección rápida y específica de virus
de la hepatitis E (HEV) y Toxoplasma gondii.
El grupo ya dispone de un método de detección de la infectividad del virus de la hepatitis Ay norovirus
mediante RT-qPCR y PMA (Sánchez et al. 2012, Moreno et al., 2015). Para el HEV y T. gondii se
desarrollará un método de RT-qPCR combinado con un reactivo de viabilidad. Se optimizarán
concentraciones de los reactivos de viabilidad, tiempo de fotoactivación, temperatura, adición de
tensoactivos etc. para una detección eficiente.
3.2) Optimización de un método para la detección simultanea de Toxoplasma gondii y virus
entéricos en vegetales de IV gama.
El grupo ya dispone de una metodología para la detección simultanea de bacterias patógenas, norovirus
humanos y virus de la hepatitis A en vegetales (Sánchez et al. 2012). Para evaluar la eficacia de esta
metodología para la recuperación de Toxoplasma gondii y virus de la hepatitis E, se inocularán
suspensiones de estos patógenos sobre distintos tipos de vegetales y se estimará la recuperación mediante
qPCR o RT-qPCR. Se optimizarán los tampones de elución, tiempo, temperatura, etc. para una detección
eficiente.
3.3) Detección, cuantificación e identificación de virus entéricos y parásitos infecciosos en muestras
de contaminación natural. Determinar la presencia de virus entéricos y T. gondii en la cadena de
producción de vegetales de IV gama mediante las metodologías desarrolladas anteriormente. Para la
identificación de los patógenos se utilizarán técnicas de secuenciación masiva.
Contacto:Gloria Sánchez Moragas
Gloria Sánchez Moragas, PhD
Research Scientist
Avda. Agustin Escardino 7
Paterna (46980), Spain
Telf. 963900022 ext 2319
http://www.uv.es/microbeco
https://www.iata.csic.es/es/personal/gloria-sanchez-moragas
glosanmo@uv.es
4) Genómica funcional en el hongo Penicillium digitatum para estudiar genes implicados en
patogenicidad sobre frutos cítricos
Penicillium digitatum es el hongo responsable de la podredumbre verde de los frutos cítricos durante la
postcosecha. Es el principal patógeno de los frutos cítricos y, de forma natural, no infecta ningún otro
fruto o tejido vegetal. En el grupo estamos interesados en conocer qué genes están implicados en
patogenicidad. Con este fin, una de las aproximaciones que hemos llevado a cabo es realizar un estudio
transcriptómico mediante RNA-Seq a distintos tiempos durante la infección de naranjas por P. digitatum.
Además, disponemos del genoma anotado de este hongo. En el presente trabajo se abordará la
caracterización de un gen de P. digitatum seleccionado en función de su nivel de expresión durante el
proceso de infección y de su posible función biológica. Estamos especialmente interesados en genes que
codifican efectores. Se tratan de proteínas de pequeño tamaño y ricas en cisteínas que son secretadas al
exterior de la célula y alteran las respuestas de defensa del fruto de tal forma que favorecen el desarrollo
infectivo del patógeno.
Para llevar a cabo esta caracterización se estudiará mediante qRT-PCR la expresión del gene tanto
durante el crecimiento del hongo en medio de cultivo, como durante el proceso de infección. Se creará un
plásmido binario en el que se incluyan las regiones promotora y terminadora del gen en cuestión
flanqueado al casete de resistencia a higromicina, antibiótico utilizado en la selección de transformantes.
Se comprobará la construcción obtenida y se transferirá el plásmido a la bacteria Agrobacterium
tumefaciens. Con la cepa recombinante de A. tumefaciens se procederá a transformar P. digitatum y se
analizarán los transformantes obtenidos para identificar aquellos en los que haya tenido lugar la
recombinación homóloga que elimine el gen diana. Estas comprobaciones se llevarán a cabo mediante
PCR. Una vez se identifiquen varios mutantes de deleción se identificarán aquellos en los que no haya
habido una integración adicional del T-DNA. Finalmente, se evaluará el fenotipo del mutante
seleccionado en medio de cultivo y durante la infección controlada de frutos cítricos. Además,
comprobaremos si la incidencia y severidad de la enfermedad causada por el mutante difiere de la cepa
parental.
Datos de contacto: Luis González Candelas (lgonzalez@iata.csic.es)
http://www.iata.csic.es/luisgonzalezcandelas, Phone:+34 963900022
5.1) Aproximaciones terapéuticas antioxidantes y anti-inflamatorias en modelos murinos de
retinosis pigmentaria: Uso de nanocarriers.
Las degeneraciones retinianas son la principal causa de ceguera caracterizada por la pérdida de las células
fotorreceptoras (bastones y conos). La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad rara que constituye
la principal causa genética de ceguera en el mundo desarrollado. Los pacientes con RP suelen perder la
visión nocturna en la adolescencia, la visión periférica en la edad adulta temprana y la visión central a una
edad más avanzada debido a la muerte progresiva de bastones y conos. Actualmente hay descritos
alrededor de 80 genes implicados en la patogénesis de la RP. Actualmente no existe una terapia efectiva
para tratarla por lo que es relevante buscar nuevas dianas terapéuticas. Los estudios en modelos animales
y los datos en pacientes sugieren que la inflamación y el estrés oxidativo, estrechamente relacionados,
pueden contribuir a su progresión. El objetivo es comprender los mecanismos moleculares y celulares
implicados en la muerte de los fotorreceptores, en pacientes con RP y modelos experimentales de RP
(ratones rd10, explantes de retina) con el fin de diseñar tratamientos antioxidantes o anti-inflamatorios
que prevengan o retrasen la muerte de los fotorreceptores.Para ello se emplean diversas técnicas
histológicas, bioquímicas, inmunológicas y de biología molecular.
Contacto: Regina Rodrigo, Grupo de Biomedicina Molecular, Celular y Genómica, IIS- La Fe.
email: regina.rodrigo@yahoo.es
5.2) Evaluación de propiedades neuroprotectoras de sustancias naturales en modelos in vitro de
degeneración retiniana
Diversos estudios epidemiológicos y clínicos demuestran los beneficios de compuestos nutricionales
derivados de plantas en patologías retinianas como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE),
la retinosis pigmentaria (RP), glaucoma, retinopatía diabética o cataratas gracias a sus propiedades
antioxidantes y/o antiinflamatorias. La DMAE y la RP son enfermedades neurodegenerativas en las que
el desarrollo y progresión son el resultado de una interacción compleja entre la genética y los factores
ambientales de riesgo (por ejemplo, intensidad lumínica). Tanto el estrés oxidativo como la inflamación
crónica participan en su patología. En estudios experimentales con modelos murinos se ha observado que
ciertos compuestos presentes en frutas y verduras como la curcumina, los polifenoles, luteína, o
zeaxantina pueden proteger a las células fotorreceptoras del estrés preservando su función y morfología.
El objetivo es evaluar las propiedades neuroprotectoras de extractos de diversas frutas y verduras sobre la
degeneración inducida in vitro en células fotorreceptoras.
Contacto: Regina Rodrigo, Grupo de Biomedicina Molecular, Celular y Genómica, Unidad Mixta de
Nutrición, Endocrinología y Dietética Clínica, IIS- La Fe. email: regina.rodrigo@yahoo.es
6) Genética clínica y molecular de las enfermedades raras que tienen una afectación sobre los órganos
sensoriales y de forma particular sobre la visión y/o audición (Distrofias retinianas, hipoacusias
hereditarias, síndrome de Usher). Estrategias para su diagnóstico y tratamiento.
Esta línea de investigación aborda 2 objetivos:
6.1) Desarrollo y aplicación de herramientas diagnósticas genómicas para la búsqueda de
mutaciones germinales responsables de la enfermedad, en pacientes con retinosis pigmentaria (RP)
y síndrome de Usher (USH):
Técnicas empleadas:
- Extracción de ADN y ARN a partir de muestras biológicas de pacientes
- PCR y RT-PCR
- Secuenciación:
A) convencional (método de Sanger)
B) de nueva generación (NGS):
- paneles customizados
- WES (whole exome sequencing)
- WGS (whole genome sequencing)
Tecnologías: amplicones + Ion Torrent y captura + Illumina
6.2) CRISPR/Cas9 como herramienta de terapia génica y generación de animales modelo.
Desarrollo de pruebas concepto en cultivos celulares. Fenotipación de animales modelo generados.
Técnicas empleadas:
Clonación
Cultivos celulares
Transfección
Extracción de ácidos nucleicos
PCR y secuenciación
Estudios histológicos y bioquímicos para caracterizar degeneración retiniana en ratones.
DATOS DE CONTACTO:
Dr. José M. Millán (millan_jos@gva.es)
Unidad de Genética y Diagnóstico Prenatal del Hospital Universitario La Fe
IP del Grupo Acreditado de Investigación en Biomedicina Molecular, Celular y Genómica del Instituto de
Investigación Sanitaria La Fe (IIS-La Fe).
Subdirector del CIBERER (CIBER de Enfermedades Raras)
Dra. Elena Aller Mañas (elenaller@yahoo.es)
Investigadora Posdoctoral CIBERER del Grupo Acreditado de Investigación en Biomedicina Molecular,
Celular y Genómica del Instituto de Investigación Sanitaria La Fe (IIS-La Fe).
7) Ensayos funcionales para caracterizar genes implicados en neuropatías periféricas hereditarias
Las neuropatías periféricas hereditarias comprenden grupos de enfermedades con un amplio espectro
clínico y genético. Las técnicas basadas en Next Generation Sequencing (NGS) han mejorado el
diagnóstico genético, aunque el gran número de cambios identificados dificulta determinar cuál es el
causante de la enfermedad. El análisis de segregación y los predictores informáticos de patogenicidad
pueden ayudar, pero no son concluyentes. Disponemos de familias estudiadas mediante secuenciación de
exoma en cuyos pacientes se han detectado cambios noveles cuyo efecto en el fenotipo es incierto.
Algunos de estas variantes se localizan en genes que por primera vez se asocian a enfermedad, lo que
dificulta el análisis, pero que permitirá descubrir un nuevo gen implicado en este grupo de neuropatías. La
tesis de máster se centraría en el desarrollo de ensayos funcionales con el fin de establecer si los cambios
detectados son realmente mutaciones causantes de la enfermedad. Entre las aproximaciones propuestas
están: análisis de expresión mediante ensayo de luciferasa para investigar el efecto de una mutación que
podría variar los niveles de expresión del gen cuando está mutado, y estudio de minigenes con el objetivo
de determinar una variante que probablemente afecta al splicing.
Contacto: Carmen Espinós (cespinos@cipf.es)
Realización: Unidad de Genética y Genómica de Enfermedades Neuromusculares del Centro de
Investigación Príncipe Felipe (espinos.cipf.es)
8) Fibronectina en la regeneración muscular: papel de las señales mecánicas. Un estudio con un
modelo experimental en ratones genéticamente modificados.
Nombre del grupo: Matriz Extracelular
Contacto: Mercedes Costell Rosselló
Dep. Bioquímica i Biologia Molecular
Universitat de València
(34)963543465
9) Estudio de la función del complejo COPI de Arabidopsis mediante silenciamiento génico
La vía secretora es responsable, en las células eucarióticas en general y en las de plantas en particular, de
la síntesis, plegamiento y adecuada distribución intra y extracelular de una amplia variedad de proteínas.
Además, la vía secretora está implicada en numerosos procesos específicos de plantas. Es una factoría
esencial para la biogénesis de los componentes de la pared celular y está también implicada en la
señalización hormonal, el desarrollo, los tropismos, la defensa frente a patógenos o la respuesta a estrés
abiótico. Por todo ello, el conocimiento de los mecanismos que regulan la ruta secretora es de gran interés
desde el punto de vista básico y plantea además potenciales aplicaciones biotecnológicas.
La vía secretora se inicia en el retículo endoplásmico (ER) y desde allí la mayoría de las proteínas son
transportadas hasta el aparato de Golgi. Este orgánulo actúa como una central que conecta el flujo de
proteínas entre los distintos compartimentos que participan en la vía secretora. El tráfico entre el ER y el
Golgi es bidireccional. El tráfico anterógrado (ER-Golgi) está mediado por vesículas recubiertas por el
complejo COP(Coat Protein)II y el transporte retrógado (trans- a cis-Golgi o cis-Golgi a ER) está
mediado por vesículas recubiertas por el complejo COPI. La cubierta COPI está formada por un complejo
como coatómero, que se recluta en bloque desde el citosol hasta las membranas del Golgi. Las vesículas
COPI participan en el transporte de proteínas entre las diferentes cisternas del complejo de Golgi y en la
ruta de retorno desde el cis-Golgi hacia el ER. Mientras que Saccharomyces cerevisiae solo contiene una
copia de cada una de las subunidades que forman la cubierta COPI, en vertebrados se han identificado dos
-COP. Esto permite formar diferentes combinaciones que
podrían generar complejos COPI alternativos. En Arabidopsis thaliana, las subunidades de la cubierta
COPI está
-COP. Ello sugiere que en
plantas se pueden formar combinaciones alternativas del coatómero, que podrían ser responsables de la
formación de diferentes subpoblaciones de vesículas COPI, para el transporte intra-Golgi o la ruta de
retorno desde el cis-Golgi hacia el ER.
El objetivo de este trabajo es estudiar la función de diferentes isoformas de las subunidades COPI en
Arabidopsis thaliana utilizando una estrategia de silenciamiento génico. Para ello, se obtendrán y
caracterizarán plantas transgénicas que expresen amiRNAs (microRNA artificiales) específicos contra
distintas isoformas. En la caracterización de las plantas transgénicas se utilizarán, entre otras técnicas,
RT-PCR y análisis Western Blot.
Grupo: “Tráfico de proteínas”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (Facultad de
Farmacia), ERI de Biotecnología y Biomedicina, Universitat de València.
Contacto:
Fernando
Aniento
(mariajesus.marcote@uv.es).
(Fernando.aniento@uv.es)
y
María
Jesús
Marcote
10) Interacciones que ocurren entre los virus entéricos y el hospedador
El Grupo de Investigación en Gastroenteritis Víricas del Departament de Microbiologia i Ecologia
desarrolla su labor en la Facultat de Medicina i Odontologia y está vinculado al Servicio de Microbiología
Clínica del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Nuestro principal objetivo es investigar los
mecanismos patogénicos de los virus productores de gastroenteritis, principalmente de rotavirus y
norovirus, así como la respuesta inmunitaria que provocan estas infecciones. Rotavirus y norovirus
producen gastroenteritis que afectan a los niños, aunque los norovirus también pueden infectar a personas
de cualquier edad, con frecuencia provocando brotes epidémicos. Estudiamos los mecanismos
inmunológicos de protección frente a estas infecciones, así como los determinantes moleculares que
condicionan la susceptibilidad a padecerlas.
Dentro del grupo se desarrollan varias líneas de investigación entre las que se pretende potenciar la línea
dedicada al Estudio de las interacciones virus/microbiota/hospedador. El objetivo de la presente linea de
investigación es el estudio de las interacciones que ocurren entre los virus entéricos y el hospedador sin
excluir las interacciones que ocurren entre los virus entericos y la microbiota intestinal ni la interacción
entre la microbiota intestinal y el hospedador
Contacto: Jesús Rodríguez Díaz
Correo: jesus.rodriguez@uv.es
Teléfono: 0034 96 3864903
Ubicación: Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Avenida Blasco Ibañez 17, 46010.
Valencia
11) Estudio de la función de las giberelinas en la iniciación y desarrollo de los óvulos en Arabidopsis
Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan multitud de procesos fisiológicos tales como
germinación, elongación del tallo, fotomorfogénesis, crecimiento de la hoja y de la raíz, floración,
desarrollo del polen y fructificación. Resultados preliminares obtenidos en nuestro laboratorio sugieren
que las GAs también están implicadas en la iniciación de los óvulos determinando tanto el número como
la forma. En las últimas décadas, se han identificado numerosos genes implicados en la determinación de
la identidad de los óvulos y en su desarrollo. Sin embargo, se conoce muy poco sobre qué genes
determinan el número de óvulos. Desde un punto de vista económico y agronómico, es importante
determinar cuáles son estos factores ya que el número de óvulos determina en gran medida el número de
semillas y por tanto afecta al rendimiento de los cultivos. Nuestro objetivo es comprender cómo las GAs
regulan la iniciación y desarrollo de los óvulos de Arabidopsis, y cómo la vía de señalización de GAs
interactúa con las vías de señalización de auxinas, citoquininas y brasinoesteroides que también participan
en estos procesos de desarrollo.
El proyecto de Trabajo Fin de Máster que se propone podría integrarse en una de estas tres líneas: a)
caracterización morfológica y molecular de los óvulos que se generan en mutantes de la ruta de
señalización de GAs; b) localización de la expresión de los componentes de la ruta (enzimas de
biosíntesis, receptores GIDs y proteínas DELLA) en la placenta y los primordios de óvulo y c)
identificación de proteínas dianas de los genes DELLA en los óvulos.
Contacto: Miguel A. Pérez-Amador y María Dolores Gómez
mpereza@ibmcp.upv.es y mdgomez@ibmcp.upv.es
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas
CSIC-Universidad Politécnica de Valencia
Ciudad Politécnica de la Innovación- Edificio 8E
Ingeniero Fausto Elio, s/n
46022 Valencia, Spain
Tel: +34 96 3877778(ext. 78651/77778)
12) Síntesis enzimática de oligosacáridos de la leche humana y evaluación de su potencial bioactivo
La leche humana es una fuente de nutrientes muy completa y esencial para el desarrollo de los niños, y es
rica en moléculas bioactivas como los oligosacáridos (OLHs). Para estos compuestos existen muchas
evidencias que sugieren que desempeñan funciones importantes para la salud, así, están asociados con el
efecto protector de la leche humana contra la gastroenteritis, bien a través de la inhibición competitiva de
la unión (anti-adhesión) de enteropatógenos a las células huésped, y también a través de su efecto
prebiótico, esto es, estimulando el crecimiento de bacterias beneficiosas en el colon. Estudios recientes
sugieren también que los OLHs tienen funciones únicas como inmunomoduladores a través de
mecanismos diversos. Las aplicaciones potenciales de los OLHs en la industria alimentaria, como
ingredientes en alimentos funcionales y leches infantiles, están limitadas debido a las dificultades
implícitas a su obtención de la leche humana o por síntesis química. Además, se desconoce la actividad
funcional de OLHs individuales debido a la gran diversidad de estructuras químicas que presentan los
OLHs en las muestras de leche humana. El objetivo general del trabajo de investigación sería sintetizar
oligosacáridos utilizando la actividad de transglicosilación de glicosidasas aisladas de bacterias lácticas.
Los oligosacáridos producidos serán evaluados in vitro por su potencial prebiótico con bacterias
gastrointestinales, y por sus propiedades anti-adhesivas contra enteropatógenos.
Contacto: María Jesús Yebra
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC)
Av. Agustín Escardino 7, Paterna
Tel. 96 390 0022 ext 2018
Email: yebra@iata.csic.es
13) Herramientas biotecnológicas derivadas de virus de plantas
Los virus que infectan plantas superiores son muy sencillos genéticamente. Sin embargo, sus pequeños
genomas contienen información suficiente para completar complejos ciclos infecciosos que, además de la
replicación, movimiento y transmisión del virus, incluyen la desactivación de las defensas de la planta.
Un caso extremo de sencillez genética, dentro de los patógenos de las plantas, es el de los viroides, cuyos
pequeños genomas de RNA circular no codifican ninguna proteína. La sencillez estructural y riqueza
funcional de los virus y viroides facilita el desarrollo de instrumentos biotecnológicos basados en
elementos de su biología. Entre los principales objetivos de nuestro grupo de investigación
(http://personales.upv.es/jadaros/) está el construir clones recombinantes de virus y viroides para expresar
proteínas y RNAs de interés en plantas o microorganismos que actúen como biofactorías. Así, en nuestro
grupo, modificando los genomas de virus como el del grabado del tabaco, el virus X de la patata o el del
mosaico del tabaco, hemos conseguido expresar enzimas biosintéticas y factores de transcripción para
manipular el metabolismo de las plantas y obtener productos de interés farmacéutico e industrial, como
antocianinas y carotenoides. También hemos conseguido producir grandes cantidades de RNAs con
actividad reguladora en cultivos de la bacteria Escherichia coli utilizando el viroide latente de la
berenjena (ELVd) como andamio molecular.
Más concretamente, el objetivo de este trabajo será producir RNAs bicatenarios con potencial actividad
contra plagas de insectos en cultivos de E. coli. Para ello se utilizará nuestro sistema recientemente
patentado (Daròs, Aragones y Cordero, 2014, Recombinant RNA production, Patent EP14382177.5,
PCT/EP2015/060912) y licenciado por la compañía británica PBL (http://www.pbltechnology.com/),
basado en la coexpresión en E. coli del RNA del ELVd y la tRNA ligasa de berenjena, enzima que
cataliza la circularización de este viroide en las plantas infectadas. Nuestras investigaciones han mostrado
que, cuando estos dos elementos se coexprean en E. coli, el RNA viroidal se procesa adecuadamente y la
tRNA ligasa lo circulariza. El viroide, sin necesidad de replicarse en E. coli, acaba acumulándose a
concentraciones muy altas en las bacterias, del orden de decenas de miligramo por litro de cultivo. Esta
sobreacumulación no cambia cuando en la molécula de viroide se inserta un RNA de interés, como
pueden ser, en este caso, RNAs bicatenarios homólogos a genes cruciales de insectos. En insectos, se ha
demostrado que la ingestión de RNAs bicatenarios, homólogos a genes endógenos inducen el
silenciamiento de dichos genes, a través de las rutas de interferencia por RNA (RNAi), provocando la
muerte, cambios en el comportamiento o la huida de los insectos. Es por ello que los RNAs bicatenarios
están actualmente considerados como una potencial herramienta de control de plagas que podría ser muy
específica, ya que está basada en homología de secuencia, y de actividad duradera, si se elige
adecuadamente el gen diana en el insecto.
En este trabajo se diseñarán RNAs bicatenarios homólogos a diferentes genes de la mosca del
Mediterráneo (Ceratitis capitata), una de las principales plagas que afecta a los cultivos frutales en la
cuenca del Mediterráneo, y se producirán en cultivos de E. coli utilizando el sistema derivado del ELVd.
Los RNAs bicatenarios se purificarán mediante cromatografía para ensayar su actividad insecticida contra
la mosca C. capitata.
Más información: http://personales.upv.es/jadaros/
Director:
José Antonio Darós Arnau
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC-Universidad Politécnica de Valencia), en
breve en el Instituto de Biología de Sistemas e Integrativa (I2SysBio, CSIC-Universitat de València)
Información de contacto: jadaros@ibmcp.upv.es
14) Caracterización molecular y funcional de nuevas enzimas implicadas en la coloración de los
frutos cítricos.
El color de los frutos cítricos es un importante atributo de calidad y un factor decisivo en la aceptación
por los consumidores. La coloración en estos frutos se debe principalmente al contenido y composición
en carotenoides, que constituyen una amplia familia de compuestos isoprenoides C40 de gran importancia
nutricional (Rodrigo et al., 2013a). Durante los últimos años en el laboratorio de Fisiología y
Biotecnología Postcosecha (IATA-CSIC) se ha realizado un importante esfuerzo en el estudio de la
biosíntesis y acumulación de carotenoides en los frutos cítricos, complementando aproximaciones
fisiológicas con estudios moleculares. En este sentido, recientemente hemos identificado un nuevo grupo
de enzimas denominado dioxigenasas de corte de carotenoides (CCD, del inglés `Carotenoid Cleavage
Dioxygenase´) que catalizan la fragmentación de carotenoides y que están directamente relacionadas con
intenso color naranja-rojizo que presenta la piel de numerosas variedades de mandarinas y naranjas
(Rodrigo et al., 2013b). Adicionalmente, en los genomas de cítricos hemos identificado al menos dos
genes más de esta nueva familia (CCD tipo 4) con una elevada homología a otras CCDs de distintas
especies vegetales cuya actividad determina el color del fruto o la flor (Ohmiya et al . 2006; Falchi et al.,
2013). Con estos antecedentes en este trabajo se propone llevar a cabo una caracterización a nivel
molecular y funcional de los diferentes miembros de esta nueva familia de CCD en cítricos y estudiar su
posible papel regulando el contenido de carotenoides, y por tanto, la coloración del fruto. Para ello, se
llevarán a cabo las siguientes actividades:
1. Búsqueda in silico de secuencias CCD tipo 4 en las bases de datos de cítricos (genomas
completos y colecciones de ESTs) y aislamiento de los correspondientes cDNAs de longitud
completa en diferentes especies de cítricos (comerciales y ancestrales) con una coloración
contrastante (mandarina, naranja, limón, cidro, pumelo etc).
2. Análisis de la expresión de los genes de CCDs tipo 4 en las especies de cítricos seleccionadas
en diferentes tejidos del fruto (piel y pulpa) a lo largo de la maduración. Actualmente ya se
disponen de colecciones de material vegetal que se completarán durante la ejecución del
proyecto. La expresión de los genes se determinará por PCR cuantitativa a tiempo real.
3. Determinación de la composición de carotenoides en las muestras anteriormente mencionadas y
estudio de su relación con la expresión de los genes CCD4. El análisis del perfil de carotenoides
se llevará cabo mediante cromatografía liquida de alta resolución acoplada a detector de
fotodiodos (HPLC-PDA).
4. Ensayos funcionales de los nuevos genes CCD4 tipo 4 mediante ensayos de `complementación
de color´ en Escherichia coli. Para ello se utilizarán cepas de E. coli que acumulan diferentes
carotenoides y se co-transformarán con los genes de CCD4 de interés. Mediante HPLC-PDA se
analizarán las variaciones en el perfil de carotenoides y, por tanto, la posible actividad de las
CCD4 sobre los distintos carotenoides.
Referencias:
Falchi et al. 2013. Three distinct mutational mechanisms acting on a single gene underpin the origin of
yellow flesh in peach. Plant Journal, 76(2), 175–187. doi:10.1111/tpj.12283
Ohmiya et al. 2006. Carotenoid cleavage dioxygenase (CmCCD4a) contributes to white color formation
in chrysanthemum petals. Plant Physiology, 142(3), 1193–1201. doi:10.1104/pp.106.087130
Rodrigo et al. 2013a. Biochemical bases and molecular regulation of pigmentation in the peel of Citrus
fruit. Scientia Horticulturae. 163 (2013) 46–62
Rodrigo et al. 2013b. A novel carotenoid cleavage activity involved in the biosynthesis of Citrus fruitspecific apocarotenoid pigments. Journal Experimental Botany, 64(14), 4461–4478.
doi:10.1093/jxb/ert260
Contacto: Mª Jesús Rodrigo (mjrodrigo@iata.csic.es);Lorenzo Zacarías (lzacarías@iata.csic.es)
Laboratorio de Fisiología y Biotecnología Postcosecha.
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos-CSIC (Paterna, Valencia).
15) Respuesta molecular a la deficiencia de hierro en levadura: mecanismos de regulación de
procesos dependientes de hierro a través de la proteína de unión a mRNAs Cth2.
El hierro es un elemento esencial para todos los eucariotas porque participa como cofactor en procesos
celulares tan importantes como la respiración mitocondrial, la síntesis de DNA o la traducción de
proteínas, entre otros. Sin embargo, la baja solubilidad del hierro a pH fisiológico disminuye
enormemente su biodisponibilidad, convirtiéndolo en un factor limitante para el crecimiento de los seres
vivos. Así, la deficiencia de hierro en humanos es el desorden nutricional más común en el mundo, con
consecuencias importantes para la salud, especialmente en niños y mujeres en edad fértil. En nuestro
grupo de investigación utilizamos la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo eucariota
modelo para estudiar los mecanismos de respuesta a la deficiencia de hierro. Hemos determinado que, en
condiciones de escasez de hierro, una proteína denominada Cth2 (conocida en humanos como TTP o
tristetraprolina) permite la utilización óptima del hierro en la célula (1). La proteína Cth2 en levadura y
TTP en humanos poseen dos dedos de zinc que les permiten unirse a un gran número de mRNAs con
elementos ricos en secuencias AU (AREs) en su región 3’ no traducida (3’UTR), promoviendo su
degradación. Nuestros datos sugieren que Cth2 se une a sus mRNAs diana en el núcleo de la célula
mientras que la degradación de estos se produce en el citoplasma (2,3). De esta forma, en condiciones de
escasez de hierro, Cth2 promueve la degradación de mRNAs que codifican proteínas que consumen
mucho hierro y que son prescindibles, al tiempo que degrada mRNAs que codifican inhibidores de
procesos dependientes de hierro que son esenciales para la célula como la síntesis del DNA (4). En este
trabajo de investigación pretendemos decifrar el proceso de ensamblaje entre Cth2, otras proteínas y el
mRNA diana que da lugar a esta regulación post-transcripcional coordinada de muchos mRNAs. Para ello
utilizaremos estrategias moleculares que nos permitan identificar proteínas que interaccionen con Cth2 y
mutantes que nos indiquen en qué punto se produce la interacción con estas proteínas (núcleo,
citoplasma). Además, estudiaremos las posibles interacciones de Cth2 con la cromatina y el DNA en su
paso por el núcleo.
Bibliografía:
1.- Puig S, Askeland E, and Thiele DJ (2005). Coordinated Remodeling of Cellular Metabolism during
Iron Deficiency through Targeted mRNA Degradation. Cell 120: 99-110.
2.- Pedro-Segura E, Vergara SV, Rodriguez-Navarro S, Parker R, Thiele DJ, Puig S (2008) The Cth2
ARE-binding Protein Recruits the Dhh1 Helicase to Promote the Decay of Succinate Dehydrogenase
SDH4 mRNA in Response to Iron Deficiency. J. Biol. Chem. 283: 28527-28535.
3.- Vergara SV, Puig S, Thiele DJ (2011). Early Recruitment of AU-Rich Element-Containing mRNAs
Determines Their Cytosolic Fate during Iron Deficiency. Mol. Cell. Biol. 31: 417-429.
4.- Sanvisens N, Bañó MC, Huang M, Puig S (2011). Regulation of ribonucleotide reductase in response
to iron deficiency. Mol Cell. 44: 759-769.
Contacto:
María Teresa Martínez Pastor. Dept Bioquímica y Biología Molecular. Universitat de Valencia. Tel: 96
354 3629. E-mail: maria.teresa.martinez@uv.es
Sergi Puig. Dept Biotecnología. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA). Tel: 96
390 0022 ext. 2308. E-mail: spuig@iata.csic.es
Grupo Homeostasis de hierro (www.iata.csic.es/spuig)
16.1) Utilización de Drosophila como modelo para el estudio de patologías humanas de origen
genético
Nuestro grupo está interesado en el estudio de la enfermedad de Parkinson (EP), que es la segunda
enfermedad neurodegenerativa más común. Aunque la mayoría de los casos de EP son esporádicos, las
formas familiares representan el 5-10% y aparecen como consecuencia de mutaciones en determinados
genes. El estrés oxidativo (EO) constituye un factor clave en los mecanismos patológicos de la EP,
asociado fundamentalmente a la disfunción mitocondrial. Entre los genes implicados en la EP, el más
estrechamente asociado con el EO es DJ-1, cuyas mutaciones causan una forma autosómica recesiva de
EP familiar de inicio precoz. DJ-1 realiza varias funciones críticas en la respuesta al EO, ya que es una
proteína ubicua y citoprotectora que actúa como un sensor redox, y regula la expresión de genes
implicados en la respuesta al EO. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo de la EP
en Drosophila utilizando mutantes en el gen DJ-1β (ortólogo del gen humano DJ-1), que presentan un
alto nivel de daño oxidativo yreproducen algunos aspectos de la EP, como elevada sensibilidad al EO
y defectos motores. En este modelo hemos llevado a cabo experimentos de proteómica redox que nos han
permitido identificar proteínas con mayores niveles de oxidación en moscas mutantes que en moscas
control, y que podrían ser relevantes en la ruta de patogénesis de la EP. Actualmente estamos en el
proceso de validación de esas proteínas candidatas no solo en Drosophila sino también en células
humanas y en muestras de sangre de pacientes. El objetivo es identificar un conjunto de genes con
ortólogos en humanos, implicados en desarrollo de la EP y que pueden convertirse en marcadores y/o
dianas terapéuticas de la misma. Por otro lado, y dado que la EP es un trastorno incurable para el que solo
existen tratamientos que actúan a nivel sintomático, estamos buscando compuestos capaces de suprimir
los defectos motores y de reducir los niveles de EO en el modelo de la EP en Drosophila. Hemos
identificado varios compuestos candidatos, que están siendo validados en células humanas y
posteriormente lo serán en modelos vertebrados, por lo que podrían convertirse en moléculas
potencialmente terapéuticas para esta enfermedad.
16.2) Estudio de procesos básicos del desarrollo en Drosophila relevantes para la salud humana
Nuestro grupo también está interesado en el estudio de procesos básicos del desarrollo
de Drosophila como son el cierre dorsal embrionario y la cicatrización de heridas. El cierre dorsal
(CD) es un proceso morfogenético que ocurre hacia el final del desarrollo embrionario de Drosophila.
Este proceso implica migración y fusión de capas epiteliales y se utiliza como modelo in vivo de la
cicatrización de heridas en vertebrados. Entender las bases moleculares de la cicatrización de heridas y la
regeneración es uno de los principales desafíos en biología y medicina, lo que conducirá a avances
médicos que permitan acelerar la cicatrización de tejidos dañados, la reconstrucción de tejidos/órganos y
la restauración de la homeostasis. Drosophila es un buen modelo para su estudio porque tanto la
maquinaria celular como las rutas de señalización implicadas en el CD embrionario y la cicatrización de
heridas en este organismo son similares a las que actúan en vertebrados. El objetivo de esta línea de
investigación es identificar nuevos mecanismos de regulación implicados en el CD embrionario y la
cicatrización de heridas en Drosophila y analizar la dinámica celular, combinando técnicas genéticas con
técnicas avanzadas de live-imaging y de secuenciación masiva. En este contexto estamos determinando la
función y las dianas transcripcionales de Cabut (Cbt), un factor de transcripción implicado en CD y
regeneración en Drosophila. Dado que Cbt es el ortólogo enDrosophila de las proteínas TIEG de
vertebrados, y que éstas tienen un papel en la cicatrización de heridas, algunos de nuestros resultados
podrían ser trasladables a humanos y servir como punto de partida para investigaciones futuras sobre ese
proceso.
Grupo: Genética Molecular del Desarrollo y Modelos Biomédicos
IP: Nuria Paricio (nuria.paricio@uv.es)
Departamento de Genética
17) Grupo de investigación: Evolución y Salud
El grupo de investigación en Evolución y Salud está compuestos por miembros del Departamento de
Genética de la Universitat de València, la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y
Biomédica de la Comunitat Valenciana, y el recientemente creado Instituto Integrativo de Biología de
Sistemas (centro mixto Universitat de València – Consejo Superior de Investigaciones Científicas).
Rafael Sanjuán es uno de los dos investigadores principales del grupo Evolución y Salud. Su laboratorio
se centra en el estudio de virus, con especial énfasis en virus humanos y de importancia biotecnológica.
Se trata de un grupo de trabajo de unas 10 personas que incluye doctores, estudiantes de tesis, técnicos de
laboratorio y estudiantes de máster. El laboratorio cuenta con financiación tanto del Ministerio de
Economía y Competitividad como de la Unión Europea.
17.1) Estudio de las interacciones virus-virus.
Los virus son a menudo considerados como agentes infecciosos sencillos y sin capacidad de establecer
interacciones con otros miembros de la población viral. Sin embargo, resultados recientes de nuestro
grupo y otros investigadores internacionales han demostrado que algunos virus se propagan formando
agregados de múltiples partículas infecciosas, dentro de los cuales pueden establecerse interacciones
sociales como la cooperación o la defección. Pretendemos investigar cómo estas interacciones permiten
que diferentes variantes genéticos de un virus, o incluso virus distintos, se propaguen conjuntamente. A
su vez investigaremos como estas interacciones determinan la virulencia y la aparición de resistencias a
fármacos antivirales. Utilizaremos dos sistemas modelo de interés práctico. Por un lado, trabajaremos con
el rinovirus humano, causante del resfriado común y uno de los patógenos más extendidos en todo el
mundo. Por otro lado, utilizaremos baculovirus, unos importantes patógenos de insectos lepidópteros con
aplicaciones en control de plagas y biotecnología.
Artículos recientes del grupo relacionados con el tema:
Combe M., Garijo R., Geller R., Cuevas J.M., Sanjuán R. (2015). Single-cell analysis of RNA
virus infection identifies multiple genetically diverse viral genomes within single infectious
units. Cell Host Microbe 18: 424-432.
http://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(15)00378-9
Artículo divulgativo en
http://www.uv.es/uvweb/unidad-cultura-cientifica-innovacion-catedra-divulgacionciencia/es/unidad-cultura-cientifica-innovacio-catedra-divulgacion-ciencia/universitat-revelavirus-tienen-vida-social-infectan-celulas-grupo1285898622434/Novetat.html?id=1285949603479
17.2) Virus como agentes terapéuticos en cáncer.
Una interesante propiedad de muchos virus es que infectan más eficientemente a células tumorales que a
células normales. La base de este tropismo es que, con gran frecuencia, las células tumorales presentan
deficiencias en la ruta del interferón y otros mecanismos de inmunidad innata que son clave para
controlar las infecciones virales. Esto se debe a que el interferón es también uno de los mediadores de la
respuesta inmunitaria contra el cáncer y, por tanto, eliminar esta ruta resulta beneficioso para las células
tumorales puesto que les permite evadir la respuesta inmunitaria. Sin embargo, esto las predispone a ser
infectadas por virus. Basándose en estos principios, se han desarrollado numerosos “virus oncolíticos”, en
los que mediante ingeniería genética se ha potenciado su selectividad por células tumorales. Sin embargo,
esto resulta a menudo complejo, ya que nuestra comprensión de las interacciones virus-célula es aún
limitada. Proponemos una aproximación alternativa para obtener virus oncolíticos que se basa en la
evolución dirigida. Mediante la selección artificial, es posible obtener variantes virales que infecten con
mayor eficacia a las células tumorales y que presenten poca o nula capacidad de infectar células
normales, sin necesidad de conocer a priori los mecanismos moleculares implicados. Utilizaremos como
sistema modelo el virus de la estomatitis vesicular, un virus en fase de ensayo clínico para su uso como
agente antitumoral.
Artículos recientes del grupo relacionados con el tema:
Sanjuán R., Grdzelishvili V.Z. (2015). Evolution of oncolytic viruses. Curr. Opin. Virol. 13: 1-5.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625715000164
Hernández-Alonso P., Garijo R., Cuevas J.M., Sanjuán R. (2015). Experimental evolution of an
RNA virus in cells with innate immunity defects. Virus Evol. 1: vev008.
http://ve.oxfordjournals.org/content/1/1/vev008
Garijo R., Hernández-Alonso P., Rivas C., Diallo J.S., Sanjuán R. (2014). Experimental
evolution of an oncolytic vesicular stomatitis virus with increased selectivity for p53-deficient
cells. PLoS One 9:e102365.
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0102365
Técnicas más frecuentes:
Cultivo y manipulación de virus en el laboratorio
Biología molecular (RT-PCR, clonación, mutagénesis dirigida, etc.)
Biología celular (cultivo celular, microscopía óptica, de fluorescencia y electrónica, etc.)
Secuenciación Sanger y ultrasecuenciación de nueva generación
Bioinformática
Análisis evolutivo de secuencias
Investigador: Rafael Sanjuán
Contacto: rafael.sanjuan@uv.es
Web: www.uv.es/rsanjuan
18) Validación de la desrepresión de muscleblind como estrategia terapeutica en distrofia miotónica
tipo 2
La distrofia miotónica de tipo 2 (DM2) se debe a la expansión del tetranucleotido CCTG en el primer
intron del gen CNBP1. La acumulación de intrones con estas expansiones se comporta como sumidero
para una serie de proteínas nucleares, en particular los factores de splicing de la familia Muscleblind-like
1 (MBNL 1) y MBNL2. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo de DM2 en Drosophila
que reproduce aspectos de la enfermedad, tales como presencia de foci ribonucleares, secuestro de
Muscleblind (ortólogo en Drosophila de MBNLs), alteraciones en el splicing alternativo, atrofia muscular
y alteraciones cardiacas. Previamente identificamos una serie de represores naturales de muscleblind e
hipotetizamos que los métodos para levantar dicha represión natural pueden constituir terapias potenciales
para DM2 al potenciar la expresión endógena de Muscleblind, la cual es limitante. En el TFM se propone
validar dicha hipótesis en el modelo en Drosophila utilizando una serie de moscas transgénicas, técnicas y
métodos en su mayor parte ya optimizados en el laboratorio.
Prof. Ruben Artero
Fundación de Investigación Sanitaria INCLIVA. Departamento de Genética, Universidad de Valencia
C/ Doctor Moliner, 50. E-46100 Burjasot. Spain. Tel: 96 3543028
Skype: rartero.uv.es
http://www.incliva.es/investigacion/areas/metabolismo/grupo-de-genomica-traslacional
19) Función de los TLRs en la diferenciación de células madre y progenitores hematopoyéticos:
implicaciones en la protección frente a las infecciones por Candida albicans
Las células madre y progenitores hematopoyéticos (HSPCs) expresan los receptores tipo Toll (TLRs), lo
que indica que estos receptores podrían participar en la hematopoyesis en respuesta a los
microorganismos durante una infección. Nuestro grupo ha demostrado previamente: (i) que células
inactivadas de Candida albicans (hongo patógeno oportunista) inducen in vitro la proliferación y
diferenciación de las HSPCs de ratón hacia el linaje mieloide, por una vía dependiente de TLR2 y
dectina-1, y (ii) además, utilizando un modelo de trasplante murino, que la estimulación vía TLRs de las
HSPCs ocurre in vivo y que dicha señalización induce la diferenciación hacia macrófagos, tanto en
respuesta a ligandos puros como en respuesta a la infección por C. albicans.
Estos resultados sugieren que los patógenos o sus ligandos pueden ser directamente reconocidos por las
HSPCs a través de los PRRs, promoviendo así la capacidad de reaprovisionamiento del sistema
inmunitario innato durante una infección.
La señalización mediada por los PRRs podría dar lugar a la reprogramación de los progenitores, para
generar fenotipos funcionales de células maduras mejor preparadas para hacer frente al patógeno, o por el
contrario, generar células menos eficaces, representando por tanto un mecanismo de evasión inmune. Es
por ello que el objetivo general del proyecto será caracterizar el fenotipo de los macrófagos generados a
partir de HSPCs en respuesta a ligandos de diferentes PRRs (TLR2 y dectina-1) mediante ensayos in
vitro, ex vivo y con un modelo de trasplante de HSPCs in vivo. Se estudiarán los marcadores que
expresan las células diferenciadas, así como sus características funcionales: la producción de citocinas, y
la capacidad de fagocitar y destruir levaduras de C. albicans. Además, se estudiará la capacidad de las
células diferenciadas para proteger de las candidiasis en un modelo experimental en ratón.
Nombre del grupo: Inmunología de las infecciones fúngicas.
Directores: María Luisa Gil (m.luisa.gil@uv.es) y Daniel Gozalbo (daniel.gozalbo@uv.es)
ERI Biotecnología y Biomedicina, Dpt. Microbiología y Ecología, Universitat de València.
20) Identificación y caracterización de lacasas (LMCO) de bacterias procedentes de alimentos.
Las lacasas o “laccase-like multicopper oxidases” (LMCO) son multicobre oxidasas que catalizan la
oxidación de compuestos fenólicos y no fenólicos (aminas aromáticas, diaminas y ascorbato), usando O 2
y produciendo agua. Participan en la polimerización de monómeros y en la degradación de polímeros, así
como en la rotura del anillo aromático. Sus funciones biológicas están relacionadas con resistencia y
pigmentación de esporas, lignificación de paredes de células vegetales, homeostasis del cobre y del
hierro, biodegradación de lignina, transformación del humus, y procesos de destoxificación. Las
aplicaciones industriales abarcan muchos sectores: textil, alimentación, papel, farmacéutico,
instrumentación (biosensores, nanobiotecnología), cosmético y biorremediación.
Una mención especial merece la utilización de LMCO en alimentación, ya que se pueden emplear para
mejorar o modificar la apariencia y características sensoriales de los mismos, biorremediación de aguas
residuales de estas industrias, y fabricación de sistemas de medida (biosensores) para la cuantificación de
compuestos en alimentos (polifenoles) o determinación del su poder antioxidante.
Aunque se han descrito LMCO en plantas, hongos, bacterias e insectos, la gran mayoría de las aisladas
proceden de plantas y hongos; sólo estas últimas están bien caracterizadas y son las que se usan en
aplicaciones biotecnológicas. Las de plantas no han sido caracterizadas ni usadas extensamente ya que su
detección y purificación son dificultosas. Las de insectos son minoritarias y de muy reciente descripción.
Poco se conoce acerca de las LMCO bacterianas debido a dificultades para su identificación y
caracterización, y tan sólo hace 20 años que se describió la primera LMCO bacteriana. Sin embargo,
estudios genómicos y metagenómicos recientes sugieren que estas enzimas están ampliamente
distribuidas en procariotas de grupos filogenéticos muy diferentes.
En nuestro grupo hemos descrito recientemente la existencia de LCMO en bacterias de origen
alimentario, clonado, sobreexpresado, y estudiado sus características bioquímicas y tecnológicas. Hemos
visto que estas LCMO son capaces de degradar entre otros sustratos aminas biógenas (que pueden
constituir un serio problema en alimentos).
La búsqueda de nuevas LCMO en bacterias de origen alimentario puede realizarse mediante distintas
aproximaciones: bioinformática, proteómica y microbiológica. Es de gran interés identificarlas y
caracterizarlas a nivel bioquímico, estudiar el rango de sustratos susceptibles de ser utilizados y su
mecanismo de acción. De las condiciones de actuación de las nuevas LCMO y de la capacidad para
utilizar sustratos de interés alimentario (polifenoles, aminas, etc.) se podrán deducir sus aplicaciones
biotecnológicas e inferir las relaciones filogenéticas existentes entre ellas y las relaciones estructurafunción. De especial interés nos resultan aquellas LMCO que puedan utilizarse para la eliminación de
aminas biógenas en los alimentos y de los etilfenoles de las bebidas alcohólicas. Otras aplicaciones, como
su potencialidad para estabilizar bebidas alcohólicas o para la fabricación de biosensores, también entran
en nuestro horizonte.
En cuanto a los objetivos específicos para el TFM propuesto son:
-
Identificar secuencias y actividades LMCO en las bacterias Gram+ asociadas a procesos
fermentativos (especialmente bacterias lácticas) mediante aproximaciones diversas: detección de
la actividad en células enteras, análisis extractos libres de células, proteómica, o bioinformática.
Isabel Pardo
ENOLAB, ERI-ISIC BioTecMed, Edifici Investigació 3.71. Universitat de
València
c/ Dr. Moliner 50. E-46100 Burjassot-València. Spain
Phone: Office +34 963544518. Lab +34 963543145
Fax: +34 963544570
E-mail: Isabel.Pardo@uv.es
http://www.uv.es/enolab
21) Detección identificación y cuantificación de microrganismos de interés enológico mediante la
técnica de loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
El vino es una bebida alcohólica obtenida tras la fermentación del mosto por las levaduras. Aunque
esencialmente son las levaduras las que desarrollan el papel principal en la vinificación, también se
encuentran implicados otros microrganismos, entre los que destacan las bacterias lácticas (responsables
de la fermentación maloláctica) y las bacterias acéticas (causantes del picado acético).
La necesidad de conocer la población de las diferentes bacterias y levaduras presentes durante la
vinificación es importante, ya que nos permite controlar la fermentación alcohólica y la fermentación
maloláctica, conocer la población microbiana en cada momento y poder tomar medidas correctivas a
tiempo para regular el crecimiento de microorganismos indeseables.
Los métodos tradicionales para identificar y cuantificar estos microorganismos se basan en técnicas
convencionales de cultivo en placa, que tienen el inconveniente de ser tediosas y de conducir a resultados
inconsistentes, debido a que dependen de las diferentes condiciones fisiológicas de los microorganismos.
Como alternativa se han desarrollo diferentes técnicas moleculares que disminuyen el tiempo de
identificación y aumentan la especificidad y la sensibilidad. Sin embargo, la mayoría de técnicas
moleculares son muy costosas, presentan metodologías complejas, requieren un equipo especial y
personal cualificado, por lo que es difícil ponerlas en práctica en la mayoría de las bodegas.
La amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP) es una novedosa técnica molecular que puede
resultar aplicable a la industria enológica. Este método molecular permite la amplificación de ADN en
condiciones isotérmicas. Para ello se utiliza una polimerasa con capacidad para desplazar la doble cadena
de ADN y un conjunto de 4 a 6 cebadores que reconocen un total de 6 a 8 secuencias de la región diana.
El seguimiento de la reacción de LAMP puede ser realizado mediante turbidez, fluorimetría o
electroforesis. Esta metodología puede tener una enorme aplicabilidad en enología ya que es muy
sensible, es capaz de sintetizar grandes cantidades de ADN en un corto espacio de tiempo y de detectar
secuencias diana que estén en baja concentración. Además, resulta muy específico dado que reconoce
varias secuencias de la región diana, rápido puesto que en 1 hora se obtiene el resultado final.
Por ello, los objetivos de este trabajo son:
- Desarrollar la metodología de LAMP, para detectar e identificar especies de interés enológico
como por ejemplo, Acetobacter aceti, Gluconobacter oxydans Zygosaccharomyces bailli,
Saccharomyces cerevisiae.
- Evaluar la aplicabilidad y sensibilidad de la técnica de LAMP a partir de muestras de mostos y
vinos blancos y tintos.
- Adaptar la metodología desarrollada a métodos de cuantificación mediante medida de la
intensidad de florescencia a tiempo real (qLAMP).
-
Evaluar la posibilidad de adaptar la técnica de qLAMP a métodos de diferenciación entre células
vivas y muertas, a través del uso de agentes intercalantes de la doble cadena de DNA (p.e:
PMA).
Sergi Ferrer
ENOLAB, ERI-ISIC BioTecMed, Edifici Investigació 3.71. Universitat de
València
c/ Dr. Moliner 50. E-46100 Burjassot-València. Spain
Phone: Office +34 963544518. Lab +34 963543145
Fax: +34 963544570
E-mail: Sergi.Ferrer@uv.es
http://www.uv.es/enolab
22) Identifying flowers nectar inside the body of parasitoid insects using DNA molecular analysis &
Testing flower attractiveness
A MASTER Thesis is offered for a student to be involved in the FLOWERFOOD IF Marie Curie
program, a project from the “Université de Rennes 1” (France) in collaboration with UPV. The research
will be performed at the ECOBIO Research Center of Rennes 1 University (https://ecobio.univrennes1.fr/) for a period of 4-6 months and at the Mediterranean Agroforestry Institute of UPV
(www.iam.upv.es) for the remaining research period. The student will have a fellowship from the Rennes
1 University of 500 €/month during the research period performed in ECOBIO to cover travel and
mobility allowance. This amount can be complemented with the Erasmus Plus Placement fellowship. A
room in a granted student residence (economic price) may be offered for the incoming person. Flexible
starting date from May to September.
Prerequisites: + Good English level
+ Basic knowledge of DNA molecular analysis
An interview in English with the applicants that meets prerequisites will take place in May.
Project summary:
Part 1 (to be developed at ECOBIO)
Identifying flowers nectar inside the body of parasitoid insects using DNA molecular analysis
Aphid parasitoids use floral nectar as a complementary source of food. Nectar is composed mainly by
sugars (sucrose, glucose and fructose) but a small proportion of some amino acids is always present.
Floral nectar can be found in the gut content, feces and in other parts of the parasitoids. The analysis of
these insect parts could give information about the plants they feed if we are able to find the same
chemical composition in the floral nectar and the insect body or if we could determine a specific protein
of the plant present in the insect body.
There are several methods that can be used in order to determine the composition of parasitoid gut
content. The most commonly used are the chromatography methods (GLC, gas–liquid chromatography
and high-performance liquid chromatography, HPLC) that are usually preceded by a two-dimensional gel
electrophoresis (SDS-PAGE). These techniques give information about the specific kinds of sugar present
in the parasitoid body (see Wäckers and Steppuhn, 2003, Hogervorst et al., 2007, Wäckers and van Rijn
2012). However nectars rarely have ‘‘signature’’ sugars and they tend to have varying levels of sucrose,
fructose, and glucose which means the identification of the plants that were used as food source by the
insects is problematic. For this reason new molecular methods for DNA analysis based on real-time PCR
systems (Laube et al., 2010, Valentini et al., 2010) have been recently developed for insects feeding on
floral nectar (mainly bees). The outcomes of these studies show that it is possible to identify most of the
plants that were used by the insect as source of food. These methods could be adapted for parasitoids
feeding on floral nectar. Developing this new technic will be the aim of present internship. Similarly, new
methods for DNA analysis of parasitoid gut contents to determine the host species they consume have
been recently developed (see Rougerie et al., 2010, Derocles et al., 2012 and Wirta et al., 2013). These
methods are based on the molecular analysis of parasitoid linkages (MAPL) and DNA barcoding.
Part 2 (to be developed at IAM)
Testing flower attractiveness to Aphid parasitoids under semi-field conditions.
Based on previous finding under laboratory conditions flower-parasitoid associations will be tested under
greenhouse conditions. The student will assess the flower attractiveness by offering wheat infested with
aphids and several flowering plants to the parasitoids (choice experiments). The effect of the flower
distance and spatial distribution will be also evaluated.
The experiment will be performed under optimal temperature conditions for parasitoids (spring +
greenhouse) and under extremely hot temperature (summer + greenhouse) to check the effects of climate
conditions on flower-parasitoid associations.
* Tasks include:
o Rearing aphid and parasitoid insects inside climate rooms.
o Sowing plant seeds in germination trays and transplanting to pots.
o Data collection.
o Statistical analysis.
o Writing report in English.
Supervisors
Rennes 1 University: Joan van Baaren, Juan Sorribas
UPV: Ferran Garcia-Mari
Please send your CV in English and a brief letter of interest to:
Juan Sorribas, juan.sorribas@univ-rennes1.fr
23) Modelos experimentales para el estudio del daño hepático inducido por fármacos
La hepatotoxicidad es la principal causa de retirada de fármacos del mercado debido al papel central del
hígado en el metabolismo y biotransformación de los compuestos. El objetivo principal del trabajo será
el desarrollo/aplicación de diferentes ensayos in vitro para el estudio de la hepatotoxicidad inducida por
fármacos y de los mecanismos moleculares implicados. Para ello, se utilizarán adenovirus recombinantes
(clonación, purificación, dosificación, optimización de protocolos de transducción) y se generarán células
hepáticas en cultivo con niveles variables de enzimas de biotransformación de fármacos; determinación
de actividades de fase I (citocromo P450) y fase II (enzimas de conjugación). La determinación del
potencial hepatotóxico se realizará, entre otros, mediante técnicas de análisis de imagen de alto contenido
(high-content screening).
Datos de Contacto
Mª Teresa Donato Martín/Laia Tolosa Pardo
Unidad Hepatología Experimental-IIS La Fe
Av Fernando Abril Martorell 106 Torre A Planta 6
46026 Valencia
email: laiatolosa@hotmail.com
El Laboratorio de Virología del Area de Genómica y Salud de FISABIO-Salud Pública ofrece 2 plazas
para
TFM
en
las
siguientes
líneas
de
investigación:
24) Virus humanos crónicos: variabilidad, evolución, inmunidad y susceptibilidad a la infección, en
concreto utilizando el modelo del virus de la hepatitis C (VHC). Uso de técnicas de secuenciación
masiva para la determinación de resistencias a antivirales y para virología clínica.
25) Virus respiratorios humanos (en colaboración con el Area de Vacunas). Vigilancia de casos de
infección respiratoria que requieren ingreso hospitalario. Determinación molecular de virus
respiratorios, secuenciación de virus de gripe, correlación con la susceptibilidad a la infección y la
efectividad de la vacuna de anual.
Dr. F. Xavier López Labrador
Virology Laboratory
Genomics and Health / Genomica i Salut
FISABIO - Public Health Research
Public Health Department, Generalitat Valenciana
Av. Catalunya, 21
46020 Valencia, Spain
Phone: +34 96 192 58 39
Fax: +34 96 192 5978
e-mail: F.Xavier.Lopez(AT)uv.es
PubMed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=pubmed&term=lopez-labrador[au]
26) Análisis de la dinámica mitocondrial en la transdiferenciación celular de fibroblastos en
neuronas
La reprogramación celular de fibroblastos a células pluripotentes inducidas tiene lugar mediante la
expresión forzada y continuada de determinados factores de transcripción en los fibroblastos. Se han
conseguido reprogramar fibroblastos a células madre pluripotentes inducidas, hepatocitos o
cardiomiocitos, tipos celulares que se caracterizan por ser células que proliferan activamente. Sin
embargo, también se ha conseguido reprogramar fibroblastos a interneuronas y motorneuronas, los cuales
son linajes celulares postmitóticos.
Recientemente, nuestro grupo ha identificado el proceso de fisión mitocondrial como la barrera
fisiológica más temprana a la que se enfrenta la célula somática al comenzar el proceso de
reprogramación a células madre pluripotentes inducidas (Prieto et al., Nature Communications. 2016).
Además, hemos observado que la fisión mitocondrial está estrechamente ligada al proceso de
proliferación celular inducido por la expresión constitutiva de los factores de reprogramación en las
células somáticas.. Nosotros proponemos el estudio de la dinámica mitocondrial en la transdiferenciación
de fibroblastos a neuronas, un linaje postmitótico.
Se realizarán ensayos de transdiferenciación de fibroblastos embrionarios de ratón a neuronas mediante la
expresión constitutiva de los factores de transcripción Brn2, Ascl1 y Myt1l utilizando retrovirus. A
diferentes tiempos las células se fijarán y se analizará la morfología mitocondrial mediante técnicas
inmunohistoquímicas.
-JOSEMA TORRES, PhD
Pluripotent Stem cells
Cellular Neurobiology Research Unit
Dept. Biología Celular y Parasitología
Fac. Biología Ed-B
Dr. Moliner, 50
46100 Burjassot
SPAIN
Tel. (office) +34 9635 43925
Tel. (lab) +34 9635 43384
http://orcid.org/0000-0001-6906-7164
http://www.uv.es/neurocel/index.html
27) Título del trabajo: Oligosacáridos de la leche humana como anti-adhesinas frente a rotavirus y
norovirus.
Descripción del grupo de Investigación:
El Grupo de Investigación en Gastroenteritis Víricas del Departament de Microbiologia i Ecologia
desarrolla su labor en la Facultat de Medicina i Odontologia y está vinculado al Servicio de Microbiología
Clínica del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Nuestro principal objetivo es investigar los
mecanismos patogénicos de los virus productores de gastroenteritis, principalmente de rotavirus y
norovirus, así como la respuesta inmunitaria que provocan estas infecciones. Rotavirus y norovirus
producen gastroenteritis que afectan a los niños, aunque los norovirus también pueden infectar a personas
de cualquier edad, con frecuencia provocando brotes epidémicos. Estudiamos los mecanismos
inmunológicos de protección frente a estas infecciones, así como los determinantes moleculares que
condicionan la susceptibilidad a padecerlas.
Datos del director.
Nombre: Jesús Rodríguez Díaz
Correo: jesus.rodriguez@uv.es
Teléfono: 0034 96 3864903
Ubicación: Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Avenida Blasco Ibañez 17, 46010.
Valencia
28) Edición y reparación del gen de la alfa-1-antitripsina humana utilizando tecnología
CRISPR/Cas9
El déficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es un trastorno metabólico de carácter hereditario que afecta a 15:10.000 individuos, por lo que se considera una enfermedad rara o minoritaria (ORPHA60). Está
causado por mutaciones en la secuencia que codifica para el gen de la alfa-1-antitripsina (AAT), una
proteasa inhibidora de las serin-proteasas que es sintetizada y secretada principalmente por
los hepatocitos, cuya principal función es proteger al tejido pulmonar del daño causado por varios
enzimas proteolíticos como la elastasa de los neutrófilos y la proteinasa-3. Las mutaciones en el gen que
codifica para la AAT impiden su salida del hepatocito y su posterior función. A causa de esto,
los pacientes pueden llegar a desarrollar enfisema pulmonar y cirrosis o cáncer de hígado. No obstante,
dada la baja prevalencia de la patología, a día de hoy no se dispone de tratamientos eficientes y
definitivos que consigan mejorar la calidad de vida de los pacientes que la padecen. Una vía
de investigación novedosa, puede ser la edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9, estrategia con
la que ya se ha conseguido la reparación de genes mutados causantes de enfermedades en modelos
celulares y animales. El presente proyecto tiene como primer objetivo la puesta a punto de este sistema de
edición para la reparación del gen de la AAT en la línea celular establecida de monocitos humanos MonoMac-6, como estrategia terapéutica emergente para el DAAT. El segundo objetivo del proyecto es el
aislamiento e inmortalización de monocitos de la sangre de individuos con fenotipos MM, MZ y ZZ.
Por último, el tercer objetivo consiste en trasladar la estrategia de edición del gen de la AAT puesta a
punto en la línea celular Mono-Mac-6 a los monocitos obtenidos a partir de las células de los pacientes,
con el fin de reparar la mutación Z presente en los individuos MZ y ZZ.
Dr. Francisco Dasí
Associate Professor.
University of Valencia. School of Medicine. Dept. Physiology.
Fundación Investigación Hospital Clínico Universitario de Valencia. Instituto de Investigación Sanitaria
INCLIVA.
Avda. Menéndez y Pelayo, 4
46004 Valencia
Francisco.Dasi@uv.es
Phone: +34 676 515 598
29) Caracterización molecular y celular del mecanismo de acción de nuevas proteínas antifúngicas
de hongos.
Dr. JOSE F. MARCOS
Scientific Researcher CSIC
Biotechnology Department
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA)
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Avda. Agustin Escardino - 7
46980 Paterna (Valencia)
SPAIN
Tel:
[+0034] 963 900 022 (X. 2030)
e-mail:
jmarcos@iata.csic.es
web:
http://www.iata.csic.es/en/personal/jose-f-marcos
twitter:@marcosLab_
Investigadores responsables: Paloma Manzanares y Jose F. Marcos. Departamento de Biotecnología,
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), CSIC