Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Juliet Angélica Prieto Rodríguez Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia 2012 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Juliet Angélica Prieto Rodríguez Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Doctor en Ciencias Química Director (a): Doctor, MSc, Químico. Luis Enrique Cuca Suarez Línea de Investigación: Química de Productos Naturales Vegetales Grupo de Investigación: Estudio Químico y de Actividad Biológica de Rutaceae y Myristicaceae Colombianas Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá, Colombia 2012 A Dios, a mi familia y a aquellas personas que directa o indirectamente son parte de esta realidad. Agradecimientos A Dios por ser mi sustento, por darme la vida y por permitirme siempre alcanzar mis sueños. A mis padres y hermana por su valioso e incondicional apoyo, por su amor, por aguantar mis malos ratos, por la paciencia y comprensión en el desarrollo de mi tesis doctoral. A Javi por estar siempre a mi lado en los momentos más trascendentales de mi vida, por todo su apoyo, su amor, comprensión, por brindarme siempre lo mejor de sí. Al profesor LUIS ENRIQUE CUCA SUÁREZ, por la confianza, por las oportunidades brindadas, su dedicacion, paciencia, amistad y por su valiosa dirección, orientación y enseñanzas. A MARÍA JESÚS PASCUAL VILLALOBOS agradezco la oportunidad dada para la realizacion de la pasantia en su grupo de investigacion, por su asesoría en el desarrollo de los ensayos de actividad insecticida, por la confianza y amistad brindada. A los profesores MASSUO KATO y LYDIA YAMAGUCHI por su incondicional ayuda y soporte científico durante la etapa final de mi trabajo de tesis. Agradezco a mis amigos de productos naturales vegetales con los que he tenido el placer de compartir durante esta travesía diferentes momentos (Ludicilla, Moni, Wilman, Oscar, Jorge, Eris) y a los que sin ser mis amigos, me motivaron a dar lo mejor de mi cada día. A Oscar le doy un agradecimiento especial por su apoyo incondicional para que mi tesis llegara a su final, por los jalones de orejas, por las risas, por su apoyo a nivel investigativo, por ser un amigo incondicional. A Lola con quien tuve el placer de compartir muchas experiencias personales y profesionales durante mi pasantía doctoral, le agradezco por su amistad, apoyo, enseñanzas y consejos. A los profesores del departamento de química por sus enseñanzas y colaboración durante el doctorado. A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA y a COLCIENCIAS por la financiación del programa doctoral, mediante la convocatoria “Apoyo a la comunidad Científica Nacional, a través de Doctorados‐Nacionales año 2008”. VIII Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Al IMIDA por la financiación de los materiales y reactivos utilizados en el desarrollo de mi pasantía doctoral. Al LABORATORIO DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR de la Universidad Nacional de Colombia por la toma de espectros de RMN. AL LABORATORIO DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (LCMS) de la Universidad Nacional de Colombia por la toma de los espectros de masas de baja y/o alta resolucion. Al HERBARIO NACIONAL COLOMBIANO de la Universidad Nacional de Colombia por la determinacion taxonómica de las muestras vegetales empleadas en el estudio fitoquimico. Juliet Prieto Resumen y Abstract IX Resumen La presente investigación combina estudios fitoquímicos y de actividad insecticida sobre plagas de almacén, con el fin de contribuir a la búsqueda de compuestos potencialmente útiles en el sector agrícola. El trabajo comprende aislamiento y caracterización de los metabolitos secundarios presentes en hojas y madera de C. capitellata (Myristicaceae), corteza de Z. rigidum (Rutaceae) y corteza de O. longifolia (Lauraceae), caracterización química de los aceites esenciales de 7 especies pertenecientes a las familias Lauraceae, Rutaceae y Myristicaceae, y evaluación de actividad insecticida sobre S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum de los extractos, aceites esenciales y compuestos aislados. El estudio fitoquímico desarrollado en las tres especies objeto de estudio condujo al aislamiento y caracterización de 38 metabolitos secundarios, entre los que se encuentran 3 metabolitos sin reportes previos en la literatura y que fueron denominados: (-)-compsoneurósido HCc-9, ácido (-)-rigidunoico Zr-14 y (+)-longifolina Ol-4. La caracterización química de los aceites esenciales indica que los monoterpenos son los compuestos más abundantes en los aceites de Z. rhoifolium, Z. monophyllum, O. longifolia y V. carinata., mientras los aceites esenciales de Z. fagara, Z. fagara y Z. rigidum están compuestos principalmente por sesquiterpenos. Los resultados de la evaluación de actividad antialimentaria de los compuestos aislados indican que la mayoría de las sustancias evaluadas causaron efectos fagodisuasivos bajos (50% < IDA > 20%) y moderados (70% < IDA > 50%) sobre S. zeamais y T. castaneum, siendo este último la especie más susceptible. En el screening de toxicidad fumigante de los aceites esenciales, solo los aceites de V. carinata., O. longifolia y Z. monophyllum exhibieron toxicidad fumigante contra las tres plagas de almacén. Palabras clave: Compsoneura, Zanthoxylum, Ocotea, Lauraceae, Myristicaceae, Rutaceae, Sitophilus, Tribolium. X Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Phytochemical study of Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) and Ocotea longifolia (Lauraceae) and evaluation of their possible application as biocontrol of Sitophilus sp. Abstract The present research combines phytochemical studies and insecticidal activity on stored pests, with the aim of contributing to the search of potentially useful compounds in the agricultural sector. The work consists of isolation and characterization of the secondary metabolites present in leaves and wood of C. capitellata (Myristicaceae), bark of Z. rigidum (Rutaceae) and bark of O. longifolia (Lauraceae); chemical characterization of the essential oils of 7 species from the families Lauraceae, Rutaceae and Myristicaceae, and insecticidal activity evaluation on S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum of the isolated extracts, essential oils and compounds. The phytochemical study on the three species leads to the isolation and characterization of 38 secondary metabolites, three of them not previously reported in the literature and that were named: compsoneuroside HCc-9, (-)-rigidunoic acid Zr-14 and (+)-longifoline OI-4. The chemical characterization of the essential oils shows that monoterpenes are the most abundant compounds in the oils of Z. rhoifolium, Z. monophyllum, O. longifolia and V. carinata, while the essential oils of Z. fagara and Z. rigidum are mainly constituted by sesquiterpenes. The results from the evaluation of the antifeedant activity of the isolated compounds shows that most of them caused lower (50% < FDI > 20%) and moderate (70% < FDI > 50%) fagodisuasive effects on S. zeamais and T. castaneum, with the last one the most susceptible specie. In the screening of fumigant activity of the essential oils, only the oils of V. carinata, O. longifolia and Z. monophyllum exhibited fumigant toxicity against the three stored pests. Keywords: Compsoneura, Zanthoxylum, Ocotea, Lauraceae, Myristicaceae, Rutaceae, Sitophilus, Tribolium. Contenido XI Contenido Pág. Lista de figuras ............................................................................................................. XIII Lista de tablas ............................................................................................................ XVII Lista de abreviaturas................................................................................................... XIX Producción Científica...................................................................................................... 1 Introducción .................................................................................................................... 1 1. Estado Actual del Tema ........................................................................................... 5 1.1 Generalidades de la familia Myristicaceae ......................................................... 5 1.1.1 Aspectos generales del género Compsoneura ................................................ 5 1.2 Generalidades de la familia Lauraceae .............................................................. 7 1.2.1 Aspectos generales del género Ocotea ........................................................... 8 1.3 Generalidades de la familia Rutaceae .............................................................. 12 1.3.1 Aspectos generales del género Zanthoxylum ................................................ 13 1.4 Biología y comportamiento de plagas de almacén: Especies del género Sitophilus y Tribolium .................................................................................................. 22 1.4.1 Insectos del género Sitophilus ....................................................................... 23 1.4.2 Insectos del género Tribolium ........................................................................ 25 1.5 Daños y pérdidas causados por plagas de almacén......................................... 26 1.6 Métodos de control de plagas de productos almacenados ............................... 28 1.7 Insecticidas sintéticos para el control de plagas ............................................... 33 1.7.1 Insecticidas organofosforados ....................................................................... 33 1.7.2 Insecticidas organoclorados .......................................................................... 33 1.7.3 Insecticidas Carbamatos................................................................................ 34 1.8 Insecticidas botánicos ...................................................................................... 35 1.8.1 Piretroides ..................................................................................................... 36 1.8.2 Neem ............................................................................................................. 36 1.8.3 Rotenona ....................................................................................................... 37 1.8.4 Aceites esenciales ......................................................................................... 37 1.8.5 Familias de plantas reconocidas por su utilidad como insecticidas ................ 38 2. Estudio Fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae), y evaluación de su posible aplicación como antialimentarios de plagas de almacén. .......................................... 39 2.1 Metodología ..................................................................................................... 43 2.1.1 General.......................................................................................................... 43 2.1.2 Material vegetal ............................................................................................. 44 XII Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 2.1.3 Estudio fitoquímico de hojas de Compsoneura capitellata ..............................44 2.1.4 Estudio fitoquímico de la madera de Compsoneura capitellata.......................47 2.1.5 Estudio fitoquímico de la corteza de Zanthoxylum rigidum .............................49 2.1.6 Estudio fitoquímico de la corteza de Ocotea longifolia ....................................51 2.1.7 Evaluación de actividad antialimentaria ..........................................................54 2.2 Resultados y discusión ..................................................................................... 55 2.2.1 Screening de actividad antialimentaria sobre S. seamaiz ...............................55 2.2.2 Estudio fitoquímico de hojas y madera de C. capitellata .................................57 2.2.3 Estudio fitoquímico de la corteza de Z. rigidum ..............................................86 2.2.4 Estudio fitoquímico de la corteza de O. longifolia .........................................109 2.2.5 Estudio de la actividad antialimentaria de los compuestos aislados .............126 3. Composición química y actividad insecticida de aceites esenciales obtenidos de algunas especies de las familias Lauraceae, Myristicaceae y Rutaceae ............133 3.1 Metodología .................................................................................................... 136 3.1.1 Análisis químico de los aceites esenciales ...................................................136 3.1.2 Ensayos de actividad insecticida ..................................................................138 3.1.3 Estudio de inhibición in-vitro e in-vivo de la acetilcolinesterasa. ...................142 3.2 Resultados y discusión ................................................................................... 145 3.2.1 Composición química de los aceites esenciales ...........................................145 3.2.2 Toxicidad fumigante de los aceites esenciales y de los monoterpenos y monoterpenoides activos ........................................................................................153 3.2.3 Toxicidad por contacto de los aceites esenciales .........................................158 3.2.4 Actividad repelente de los aceites esenciales ...............................................160 3.2.5 Actividad antialimentaria de los aceites esenciales y de algunos monoterpenos .........................................................................................................163 3.2.6 Efecto de los aceites esenciales y de algunos monoterpenos en la reproducción de T. castaneum ................................................................................166 3.2.7 Estudio de inhibición in-vitro de la acetilcolinesterasa (AChE) ......................172 3.2.8 Estudio de inhibición in-vivo de la acetilcolinesterasa ...................................180 4. Conclusiones ........................................................................................................184 Bibliografía ...................................................................................................................200 Contenido XIII Lista de figuras Pág. Figura 1-1 Características morfológicas generales de especies del género Compsoneura. ......................................................................................................................................... 6 Figura 1-2 Características morfológicas generales de especies del género Ocotea. ....... 9 Figura 1-3 Características morfológicas generales de especies del género Zanthoxylum. ....................................................................................................................................... 14 Figura 1-4 Ciclo de vida de insectos plaga del género Sitophilus .................................. 24 Figura 1-5 Ciclo de vida de insectos plaga del género Tribolium ................................... 26 Figura 1-6 Estructura de algunos piretriodes ................................................................. 36 Figura 2-1 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en las hojas de Compsoneura capitellata. ............... 46 Figura 2-2 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la madera de Compsoneura capitellata. ............. 48 Figura 2-3 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la corteza de Zanthoxylum rigidum..................... 51 Figura 2-4 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la corteza de Ocotea longifolia. .......................... 53 Figura 2-5 Compuestos aislados de las hojas de C. capitellata. .................................... 57 Figura 2-6 Compuestos aislados de la madera de C. capitellata. .................................. 58 Figura 2-7 Espectro RMN 1H para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). ........... 61 Figura 2-8 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 del compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 100 MHz) .............................................................................................................................. 61 Figura 2-9 Espectro HMQC para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). ............. 62 Figura 2-10 Espectro COSY 1H-1H para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). .. 63 Figura 2-11 Sub-estructuras planteadas para el compuesto HCc-9 ............................... 64 Figura 2-12 Espectro HMBC para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). ........... 64 Figura 2-13 Principales correlaciones observadas en COSY y HMBC para el compuesto HCc-9. ............................................................................................................................ 65 Figura 2-14 Espectro NOESY para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 300 MHz). ......... 66 Figura 2-15 Estructura tridimensional del conformero más estable del compuesto HCc-9 ....................................................................................................................................... 67 Figura 2-16 Estructura del componeurósido HCc-9 ....................................................... 67 Figura 2-17 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para HCc-1 .................................. 68 Figura 2-18 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para HCc-1 ............. 69 Figura 2-19 Espectro de RMN 1H (acetona d 6 , 400 MHz) para HCc-4 ........................... 70 Figura 2-20 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-4 . 70 XIV Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Figura 2-21 Espectro de RMN 1H (acetona d 6 , 400 MHz) para HCc-5............................ 71 Figura 2-22 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-5 . 72 Figura 2-23 Espectro de RMN 1H (acetona d 6 , 400 MHz) de la mezcla de HCc-6 y HCc-7. ....................................................................................................................................... 73 Figura 2-24 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de la mezcla de HCc-6 y HCc-7 ................................................................................................................ 73 Figura 2-25 Espectro RMN 1H (CDCl 3 -CD 3 OD, 400 MHz) para HCc-8 .......................... 74 Figura 2-26 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 -CD 3 OD, 100 MHz) de para HCc-8 ....................................................................................................................................... 75 Figura 2-27 Espectro RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para HCc-10 .............................. 76 Figura 2-28 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-10 77 Figura 2-29 Espectro RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para MCc-3 ....................................... 78 Figura 2-30 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) de para MCc-3 ........ 78 Figura 2-31 Espectro RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para la mezcla de MCc-4 y MCc-5. ....................................................................................................................................... 79 Figura 2-32 Espectro RMN 13C (acetona-d 6 , 100 MHz) para la mezcla de MCc-4 y MCc5...................................................................................................................................... 80 Figura 2-33 Espectro RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para MCc-6 ................................ 81 Figura 2-34 Espectro RMN 13C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para MCc-6........... 81 Figura 2-35 Espectro RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para MCc-7. ............................... 82 Figura 2-36 Espectro RMN 13C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para MCc-7........... 83 Figura 2-39 Espectro RMN 1H (CD 3 OD, 400 MHz) para MCc-8 ..................................... 84 Figura 2-40 Espectro RMN 13C y DEPT 135 (CD 3 OD, 100 MHz) para MCc-8. ............... 84 Figura 2-37 Espectro RMN 1H (CD 3 OD, 400 MHz) para MCc-9 ..................................... 85 Figura 2-38 Espectro RMN 13C y DEPT 135 (CD 3 OD, 100 MHz) para MCc-9. ............... 86 Figura 2-41 Compuestos aislados de la corteza de Z. rigidum ....................................... 87 Figura 2-42 Espectro RMN 1H para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 400 MHz). ........ 89 Figura 2-43 Espectro COSY 1H-1H para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 400 MHz). . 90 Figura 2-44 Espectro RMN 13C y DEPT 135 del compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 100 MHz) ............................................................................................................................... 91 Figura 2-45 Espectro HMQC para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 400 MHz). .......... 92 Figura 2-46 Espectro HMBC para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 400 MHz). ........... 93 Figura 2-47 Principales correlaciones HMBC para el compuesto Zr-14 .......................... 93 Figura 2-48 Espectro NOESY para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 300 MHz). ......... 94 Figura 2-49 Espectro de masas de alta resolución obtenido por ESI en modo negativo para el compuesto Zr-14. ................................................................................................ 95 Figura 2-50 Estructura del ácido (-)-rigidunoico Zr-14 .................................................... 95 Figura 2-51 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) de la mezcla de Zr-4 y Zr-5. ......... 97 Figura 2-52 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) de la mezcla de Zr-4 y Zr-5. ................................................................................................................................ 97 Figura 2-53 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-6. ..................................... 98 Figura 2-54 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-6. ................ 99 Figura 2-55 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-7. ................................... 100 Figura 2-56 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-7. .............. 100 Contenido XV Figura 2-57 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-8.....................................101 Figura 2-58 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-8 ...............102 Figura 2-59 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-9.....................................103 Figura 2-60 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-9. ..............103 Figura 2-61 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-10...................................104 Figura 2-62 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-10. ............105 Figura 2-63 Espectro de RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para Zr-11. ..........................106 Figura 2-64 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para Zr-11. .....106 Figura 2-65 Espectro de RMN 1H (acetona-d 6 , 400 MHz) para Zr-12. ..........................107 Figura 2-66 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para Zr-12 ......108 Figura 2-67 Metabolitos aislados de la corteza de Ocotea longifolia. ............................109 Figura 2-68 Espectro RMN 1H para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz). ..................112 Figura 2-69 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 del compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 100 MHz) ......................................................................................................................................113 Figura 2-70 Espectro HMQC para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) .....................114 Figura 2-71 Espectro COSY 1H-1H para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) ............115 Figura 2-72 Principales correlaciones observadas en HMBC para el compuesto Ol-4. .115 Figura 2-73 Espectro HMBC para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) ......................116 Figura 2-74 Espectro NOESY para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 300 MHz) ....................117 Figura 2-75 Estructura de (+)-longifolina Ol-4 ...............................................................117 Figura 2-76 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-1 ....................................118 Figura 2-77 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-1 ...............119 Figura 2-78 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-2 ....................................120 Figura 2-79 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-2 ...............120 Figura 2-80 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-5 ....................................122 Figura 2-81 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-5. ..............122 Figura 2-82 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-6 ....................................123 Figura 2-83 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-6 ...............124 Figura 2-84 Espectro de RMN 1H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-7 ....................................125 Figura 2-85 Espectro de RMN 13C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-7 ...............125 Figura 2-86 Metabolitos secundarios que exhibieron actividad antialimentaria moderada sobre adultos de T. castaneum .....................................................................................128 Figura 2-87 Metabolitos secundarios que causaron un efecto fagodisuasivo moderado en adultos de S. zeamais. ..................................................................................................129 Figura 3-1 Graficas de lo resultados del efecto de los aceites esenciales y monoterpenos en la eclosión de los huevos. A) resultados para la pareja H trat + M trat ; B) resultados para la pareja H trat + M st ; C) resultados para la pareja H st + M trat ..........................................171 Figura 3-2 Reacción enzimática – Método Ellman .......................................................172 Figura 3-3 Gráficas de velocidad vs concentración de sustrato para diferentes concentraciones de inhibidor (aceites esenciales y monoterpenos) para la AChE extraída de S. oryzae. .................................................................................................................174 Figura 3-4 Representaciones de Lineweaver-Burk para diferentes concentraciones de inhibidor (aceites esenciales y monoterpenos). .............................................................177 XVI Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Figura 3-5 Gráficas de velocidad vs concentración de sustrato para la AChE extraída de S. oryzae luego del tratamiento con la CL 25 , CL 50 y CL 75 de 4 inhibidores (aceite esencial de hojas de O. longifolia, α-terpinoleno, α-felandreno y δ-3-careno) ............................. 182 Contenido XVII Lista de tablas Pág. Tabla 1-1 Usos etnobotánicos de algunas especies del género Compsoneura en Colombia. ......................................................................................................................... 6 Tabla 1-2 Actividad Biológica de algunos metabolitos secundarios aislados de especies del género Ocotea. ......................................................................................................... 10 Tabla 1-3 Reportes de actividad biológica para algunas especies del género Zanthoxylum. .................................................................................................................. 15 Tabla 2-1 Resultados de actividad antialimentaria sobre S. zeamais de los extractos etanólicos de diferentes especies de las familias Rutaceae, Lauraceae y Myristicaceae 55 Tabla 2-2 Constantes físicas y datos espectroscópicos para Eudesm-11-en-4α-ol HCc-1 ....................................................................................................................................... 68 Tabla 2-3 Constantes físicas y datos espectroscópicos para biochanina A HCc-4 ......... 69 Tabla 2-4 Constantes físicas y datos espectroscópicos para la formononetina HCc-5 ... 71 Tabla 2-5 Datos espectroscópicos para la mezcla de los compuestos 3,4dihidroxibenzaldehído (HCc-6) y ácido 15-nor-10-hidroxioplopan-4-oico (HCc-7)........... 72 Tabla 2-6 Constantes físicas y datos espectroscópicos para kaempferol-3-O-(2″,4″-di-Ep-coumaroil)-ramnósido HCc-8 ....................................................................................... 74 Tabla 2-7 Constantes físicas y datos espectroscópicos para (-)-compsoneurósido HCc-9 ....................................................................................................................................... 75 Tabla 2-8 Constantes físicas y datos espectroscópicos para afzelina HCc-10 ............... 76 Tabla 2-9 Constantes físicas y datos espectroscópicos para megislactona MCc-3 ........ 77 Tabla 2-10 Datos espectroscópicos para la mezcla de los compuestos MCc-4 y MCc-5 79 Tabla 2-11 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3(3’’,4’’-metilenodioxifenil)propano MCc-6 ........................................................................ 80 Tabla 2-12 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3-(2’’metoxi-4’’,5’’-metilenodioxifenil)propano MCc-7.............................................................. 82 Tabla 2-13 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cinchonaina Ic MCc-8 .... 83 Tabla 2-14 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cinchonaina Id MCc-9 .... 85 Tabla 2-15 Datos espectroscópicos para la mezcla de lignanos savinina Zr-4 e isosavinina Zr-5 .............................................................................................................. 96 Tabla 2-16 Datos espectroscópicos y constantes físicas para flindersina Zr-6 ............... 98 Tabla 2-17 Datos espectroscópicos y constantes físicas para Dimetilmatairesinol Zr-7 . 99 Tabla 2-18 Datos espectroscópicos y constantes físicas para γ-fagarina Zr-8 ..............101 Tabla 2-19 Datos espectroscópicos y constantes físicas para skimmianina Zr-9 ..........102 Tabla 2-20 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-siringaresinol Zr-10..104 Tabla 2-21 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cafeato de etilo Zr-11 ....105 XVIII Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-22 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 7-hidroxicumarina Zr-12 107 Tabla 2-23 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ácido (-)-rigidunoico Zr-14 ..................................................................................................................................... 108 Tabla 2-24 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ácido 11,13-dihidrocustoso Ol-1 ............................................................................................................................... 118 Tabla 2-25 Datos espectroscópicos y constantes físicas para Litsealiicolido C Ol-2 ..... 119 Tabla 2-26 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-longifolina Ol-4 ........ 121 Tabla 2-27 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-hidroxiatractilólido Ol-5 ..................................................................................................................................... 121 Tabla 2-28 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ocotealactol Ol-6........... 123 Tabla 2-29 Datos espectroscópicos y constantes físicas para kudtdiol Ol-7 ................. 124 Tabla 2-30 Resultados de la actividad antialimentaria sobre S. zeamais y T. castaneum de los metabolitos secundarios aislados. ...................................................................... 126 Tabla 3-1 Rendimientos y constantes físicas de los aceites esenciales. ....................... 145 Tabla 3-2 Composición química relativa de los aceites esenciales ............................... 146 Tabla 3-3 Resultados del ensayo de toxicidad fumigante de los aceites esenciales sobre tres plagas de almacén ................................................................................................. 150 Tabla 3-4 Resultados del ensayo de toxicidad fumigante de los compuestos puros sobre tres plagas de almacén ................................................................................................. 151 Tabla 3-5 Concentración (ppm) de los compuestos puros activos en los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum. 152 Tabla 3-6 Concentraciones letales (CL 50 ) de los aceites esenciales de O. longifolia, V. carinata y Z. monophyllum (24 horas) sobre tres plagas de almacén. ........................... 153 Tabla 3-7. Concentraciones letales (CL 50 ) de monoterpenos y monoterpenoides (24 horas) sobre tres plagas de almacén. ........................................................................... 154 Tabla 3-8 Resultados de toxicidad por contacto para los aceites esenciales de hojas O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre tres plagas de almacén. ..................................................................................................................................... 159 Tabla 3-9 Resultados de la actividad repelente de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre tres plagas de almacén ..................................................................................................................................... 161 Tabla 3-10 Resultados de actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales y monoterpenos sobre tres plagas de almacén. ............................................................... 164 Tabla 3-11 Resultados del estudio del efecto post-tratamiento de adultos de T. castaneum con las CL 50 de los aceites esenciales y monoterpenos. ............................. 167 Tabla 3-12 Inhibición de la actividad de la AChE causada por los aceites esenciales y monoterpenos (CI 50 ) ..................................................................................................... 175 Tabla 3-13 Valores de K M y V max para diferentes concentraciones de las seis sustancias evaluadas como inhibidores de la AChE extraída de Sitophilus oryzae ........................ 179 Tabla 3-14. Concentraciones letales del aceite esencial de hojas de O. longifolia y de los monoterpenos δ-3-careno, α-terpinoleno y α-felandreno sobre S. oryzae. .................... 181 Contenido XIX Lista de abreviaturas Abreviatura AcOEt AcOiPr AChE AcTCh AE ANOVA °C c c CC CCD CCDP CDCl 3 CD 3 OD CF CG‐EM CG/FID CI 50 CL 25 CL 50 CL 75 CLV cm‐1 COSY d da dd DDT DE DEPT D2O dt DTNB E EdP EM EMAR ES ESI EtOH Término Acetato de etilo Acetato de isopropilo Acetilcolinesterasa Acetilcolina Aceite esencial Análisis de varianza Grado Celcius Cuarteto Concentración Cromatografía en columna Cromatografía en capa delgada Cromatografía en capa delgada preparativa Cloroformo deuterado Metanol deuterado Cromatografía flash Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas Cromatografía de gases con detector de ionización por llama Concentración inhibitoria del 50% Concentración letal para el 25% de la población Concentración letal para el 50% de la población Concentración letal para el 75% de la población Cromatografía líquida al vacío Centímetros inversos Correlation Spectroscopy Doblete Doblete ancho Doble doblete Diclorodifeniltricloroetano Desviación estándar Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Agua deuterada Doble triplete Ácido 5-(3-carboxi-4-nitrofenil)disulfanil-2-nitrobenzoico Enzima Éter de petróleo Espectrometría de masas Espectrometría de masas de alta resolución Complejo enzima-sustrato Ionización por electrospray Etanol XX Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Abreviatura FDI GABA HMBC HMQC HPLC HPLC‐UV‐DAD HR H st H trat Hz IDA IE IK IMIDA IOC IOP IR J KM LCMS LC‐MS‐IT‐TOF m m/z MeOH MHz M st M trat NOESY ppm RMN 1H RMN 13C rpm s sa t tR TIC UV V max 1D 2D [α] δ δC δH Término Feeding Deterrent Index Ácido γ-aminobutírico Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Cromatografía líquida de alta eficiencia Cromatografía líquida de alta eficiencia con detector ultravioleta– visible de arreglo de diodos Humedad relativa Hembras sin tratar Hembras tratadas Hertz Índice de Disuasión Alimentaria Impacto electrónico Índice de retención de Kovats Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario. Insecticidas organoclorados Insecticidas organofosforados Espectroscopía Infrarroja Constante de acoplamiento Constante de Michaelis Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas empleando trampa de iones y detección de tiempo de vuelo Multiplete Relación masa/carga Metanol Megahertz Macho sin tratar Macho tratado Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Partes por millón Resonancia magnética nuclear de hidrógeno Resonancia magnética nuclear de carbono 13 Revoluciones por minuto Singlete Singlete ancho Triplete Tiempo de retención Total ion current Ultravioleta Velocidad máxima Unidimensional Bidimensional Rotación óptica Desplazamiento químico Desplazamiento químico en 13C Desplazamiento químico en 1H Producción Científica Parte de los resultados obtenidos de la presente tesis doctoral han sido objeto de las siguientes publicaciones: 1. Prieto, J. A.; Cuca, L. E. (-)-rigidunoic acid and other constituents of the wood bark of Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. Ex Wild. (Rutaceae). Helv. Chim. Acta, 2013. (Sometido). 2. Prieto, J. A.; Cuca, L. E. A new sesquiterpene lactone and other sesquiterpenoids from Ocotea longifolia Kunth. (Lauraceae). Biochem. System. Ecol., 2013. (Sometido). 3. Prieto, J. A.; Cuca, L. E. (-)-compsoneuroside, a new acid derivative from leaves from Compsoneura capitellata (A. DC.) Warb (Myristicaceae). Phytochem. Lett. 2013. (Sometido). 4. Oscar Javier Patiño L., Juliet Angélica Prieto R. and Luis Enrique Cuca S. (2012). Zanthoxylum Genus as Potential Source of Bioactive Compounds, Bioactive Compounds in Phytomedicine, Iraj Rasooli (Ed.), ISBN: 978-953-307-805-2, InTech, Disponible en: http://www.intechopen.com/articles/show/title/zanthoxylum-genus-aspotential-source-of-bioactive-compounds. 5. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Delgado, W. A.; Moreno, J. P.; Cuca, L. E. Chemical composition, insecticide and antifungal activities of the essential oils of fruits of three Zanthoxylum species from Colombia. Chilean Journal of Agricultural Research, 2011, 71, 73 – 82. 6. Prieto, J. A.; Pabón, L. C.; Patiño, O. J.; Delgado, W. A.; Cuca, L. E. Constituyentes químicos, actividad insecticida y antifúngica de los aceites esenciales de hojas de Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 2 dos especies colombianas del género Ocotea (Lauraceae). Revista Colombiana de Química, 2010, 39, 199 – 209. Así mismo se participó como ponente en los siguientes congresos: 1. Prieto, J. A.; Cuca, L. E. Actividad insecticida de aceites esenciales de plantas colombianas sobre dos plagas de almacén y su posible mecanismo de acción. III Congreso de Química de Productos Naturales Chileno-Argentino-Hispano - La Diversidad Química y Biológica. Punta Arenas, Chile, 2012. Participación en modalidad póster. 2. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Ávila, M. C.; Delgado, W. A.; Cuca, L. E. Aceites esenciales de plantas colombianas como agentes fitosanitarios para el control de plagas de almacén. XI Congreso Colombiano de Fitoquímica. Medellín, Colombia, 2011. Participación en modalidad oral. 3. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Ávila, M. C.; Delgado, W. A.; Barrera, D. A.; Alvárez, J. M.; Macías, V. E.; Parra, J. E.; Cuca, L. E. Evaluación de actividad antialimentaria de extractos de plantas colombianas contra Sitophilus zeamais. XI Congreso Colombiano de Fitoquímica. Medellín, Colombia, 2011. Participación en modalidad póster. 4. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Ávila, M. C.; Delgado, W. A.; Orduz, L. L.; Barrera, D. A.; Alvárez, J. M.; Macías, V. E.; Parra, J. E.; Cuca, L. E. Screening preliminar de aceites esenciales como insecticidas volátiles para el control del gorgojo del maíz. XI Congreso Colombiano de Fitoquímica. Medellín, Colombia, 2011. Participación en modalidad póster. 5. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Ávila, M. C.; Delgado, W. A.; Cuca, L. E. Evaluación de aceites esenciales de aromáticas tradicionales como posibles agentes bicontroladores del gorgojo del maíz (Sitophilus zeamais). XXIX Congreso Latinoamericano de Química. Cartagena, Colombia, 2010. Participación en modalidad póster. Producción científica e Introducción 3 6. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Moreno, J. P.; Delgado, W. A.; Cuca, L. E. Uso potencial de aceites esenciales de especies del género Zanthoxylum como insecticidas y antifúngicos. X Congreso Colombiano de Fitoquímica. Popayán, Colombia, 2009. Participación en modalidad oral. 4° Puesto en la modalidad oral. 7. Prieto, J. A.; Patiño, O. J.; Pabón, L. C.; Delgado, W. A.; Cuca, L. E. Evaluación de actividad fumigante de aceites esenciales como alternativa para el control del gorgojo del arroz. X Congreso Colombiano de Fitoquímica. Popayán, Colombia, 2009. Participación en modalidad oral. Introducción La agricultura desempeña un papel importante en la supervivencia de los seres humanos y animales, y además representa un factor económico, social y alimenticio de alta importancia, particularmente en países en vía de desarrollo como Colombia. Las regiones tropicales y subtropicales tienen un alto potencial para la producción de alimentos y pueden producir múltiples cultivos anuales, sin embargo, las condiciones climáticas agradables de estas zonas hacen que los productos agrícolas que se obtienen en países tropicales y subtropicales sufran graves pérdidas debido al ataque de plagas, incluso durante el almacenamiento (Dubey et al., 2011). El deterioro de los productos alimenticios almacenados se debe principalmente a insectos plaga, los cuales causan grandes pérdidas, especialmente en áreas húmedas y cálidas del mundo, calculándose entre 20 y 30% en países tropicales (Rees, 2004). Los efectos principales del ataque de plagas a granos almacenados son: pérdida de peso, disminución de poder germinativo y cambios resultantes del calentamiento espontáneo debido a la actividad de los insectos, y que conllevan a un ataque posterior por hongos, además de pérdidas de valor nutritivo, sabor y olor (Haque et al., 2000). Una de las plagas más comunes y que revisten mayor importancia económica y social a nivel mundial por las pérdidas que producen en cereales como maíz, trigo, sorgo, arroz y demás granos almacenados, son los insectos del género Sitophilus, conocidos popularmente como gorgojos. Estos insectos son considerados como una plaga de infestación primaria que afecta seriamente los granos, reduciendo la cantidad de producto apto para consumo y la calidad del que queda disponible para comercializar (Liu y Ho, 1999; FAO, 1983). Los principales representantes de este género son: S. zeamais (gorgojo del maíz), S. oryzae (gorgojo del arroz) y S. granarius (Rees, 2004). 2 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Los insectos del género Tribolium también son plagas importantes de productos almacenados a nivel mundial. Estos insectos son considerados una plaga secundaria ya que son incapaces de dañar el grano sano, limpio y seco. Los principales representantes de este género son T. confusum y T. castaneum (gorgojo rojo del harina), siendo este último el más peligroso debido a su capacidad de volar (Rees, 2004; FAO, 1983). Para evitar o disminuir los efectos adversos que producen estos insectos, los controles químicos o insecticidas convencionales ha sido la alternativa más utilizada, pero su uso tiene importantes desventajas, pues muchos poseen efectos tóxicos inherentes que ponen en peligro la salud de los operadores que los aplican, los consumidores y el medio ambiente. Además de esto, muchas de las plagas tratadas han empezado a mostrar resistencia ante algunos de estos plaguicidas, principalmente por su uso indiscriminado (Kather, 2012; Prieto et al., 2009). La tendencia actual hacia el mantenimiento de una agricultura sostenible ha conllevado a buscar nuevas alternativas para reducir la incidencia de plagas y enfermedades que afectan productos agrícolas sin que se altere el equilibrio en la naturaleza. En general, la agricultura sostenible busca descubrir y desarrollar estrategias para el control de plagas que sean de bajo costo y que causen mínimos efectos secundarios en el medio ambiente (Kather, 2012; Dubey et al, 2011), y que permitan sustituir los productos químicos utilizados actualmente. Para este fin las plantas pueden ser una fuente potencial para la búsqueda de agentes fitosanitarios, si se considera que cada una de estas puede contener centenares de metabolitos secundarios bioactivos y que muchos de estos son producidos por las plantas como defensa química (Zoubiri y Baaliouamer, 2011; Newman y Cragg, 2007; Colegate y Molyneux, 2008; Cragg et al., 2005), razón por la que es importante explorar la actividad plaguicida de los productos obtenidos de plantas. Actualmente, los estudios fitoquímicos han tomado gran impulso en la búsqueda de sustancias útiles a nivel agrícola, con el fin de encontrar soluciones económicas y de bajo impacto ambiental para controlar plagas. La flora colombiana, una de las más diversas a nivel mundial, posee una amplia variedad de familias de plantas, donde Rutaceae, Myristicaceae y Lauraceae son representativas. Estas familias se caracterizan por poseer especies con diversidad de metabolitos secundarios que han mostrado significativa actividad insecticida, antifúngica y/o antibacteriana. Las anteriores consideraciones Producción científica e Introducción 3 hacen de estas familias objetos de interesantes estudios fitoquímicos y de actividad biológica, y además si se tiene en cuenta que en el país a pesar de existir muchas especies de estas familias no existe un estudio sistemático y químico completo. En este contexto, el presente trabajo se planteó con el objetivo de contribuir a las investigaciones dirigidas en la búsqueda de sustancias con posible uso en el sector agrícola para el control de plagas de almacén, y hace parte de los resultados de investigación de un macro-proyecto titulado: “Búsqueda de metabolitos secundarios con propiedades insecticidas pertenecientes a las familias Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae para el control de insectos plaga del género Sitophilus que atacan cereales almacenados”, financiado por Colciencias y la Universidad Nacional en la Modalidad Recuperación Contingente Año 2008. La selección de las especies vegetales objeto de estudio fitoquímico se hizo con base en los siguientes criterios: 1) resultados del screening preliminar de actividad antialimentaria sobre S. zeamais, 2) estudio fitoquímico y cromatográfico preliminar y 3) antecedentes bibliográficos. Teniendo en cuenta lo anterior, para el desarrollo de la tesis doctoral se propuso realizar el aislamiento y caracterización de los metabolitos secundarios presentes en hojas y madera de Compsoneura capitellata, corteza de Zanthoxylum rigidum y corteza de Ocotea longifolia; la caracterización química de los aceites esenciales de algunas especies de las familias Rutaceae, Myristicaceae y Lauraceae; y la evaluación de la actividad insecticida sobre S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum de los extractos, fracciones, aceites esenciales y compuestos aislados. La tesis doctoral está dividida en tres capítulos. El capítulo 1 describe el estado actual del tema de trabajo. En el capítulo 2 se describe el estudio fitoquímico realizado en C. capitellata, Z. rigidum y O. longifolia, junto con los resultado de actividad antialimentaria sobre dos plagas de almacén de los extractos y compuestos aislados, contribuyendo así a las investigaciones fitoquímicas y de actividad biológica de las espcies trabajadas. En el capítulo 3 se presentan los resultados de la composición química y actividad insecticida de aceites esenciales de algunas especies de las familias Lauraceae, Myristicaceae y Rutaceae con lo que se contribuye a la caracterización química y biológica de estas sustancias. 1. Estado Actual del Tema 1.1 Generalidades de la familia Myristicaceae La familia Myristicaceae comprende aproximadamente 500 especies reunidas en 21 géneros, en donde se destacan especies por su importancia económica como Myristica fragrans Houtt. (nuez moscada). Las especies de esta familia de angiospermas se distribuyen a nivel mundial especialmente en regiones tropicales (Doyle et al, 2004; Sauquet, 2004; Sauquet et al., 2003). Esta familia comprende árboles de gran porte, que por lo general son de valor económico para la industria maderera. La mayoría de las especies se caracterizan por la presencia de aceites esenciales en diferentes órganos y porque de sus follajes y troncos se obtienen resinas o mucilagos, de color rojizo o amarillento. (Taylor y Devia, 2000; Herrera, 1994). Los metabolitos secundarios que se han encontrado en diferentes especies de esta familia comprenden principalmente alcaloides triptamínicos y β-carbonílicos, flavonoides de diversos tipos (iryantherinas, virolanos, virolanoles, dihidrochalconas, flavanas, flavonas, isoflavonas), lignanos (diarilbutánicos, diarilbutirolactónicos y diariltetrahidrofuránicos), neolignanos, juruenólidos y tocotrienoles (Bernal y Cuca, 2009; Martínez, 2000; Miles et al., 1987). 1.1.1 Aspectos generales del género Compsoneura El género Compsoneura, perteneciente a la familia Myristicaceae, comprende alrededor de 11 especies distribuidas desde el sur de México hasta la Amazonía de Brasil y Perú. En Colombia se encuentra especies de este género en 13 de los 32 departamentos, principalmente en bosques húmedos del Pacífico y la Amazonía (Herrera, 1994). Las especies de este género son generalmente árboles de hasta 18 metros de altura, con la corteza marrón, y exudado rojo. Las hojas son oblongo-elípticas, con la base aguda o atenuada, y el ápice cuspidado y cortamente acuminado. Las inflorescencias son 6 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. racemosas y se encuentran en las axilas de las hojas o en ramas defoliadas. Las flores están agregadas al final de las ramas, en grupos de 2-3, y son de color amarillo. Los frutos son elipsoides de color marrón-rojizo, carnosos y pubescentes en la superficie. En la Figura 1.1 se ilustran las características morfológicas generales de especies del género Compsoneura (Herrera, 1994; Chavarro, 1999). C B A A. hojas alternas, coriáceas, con margen entera, sin estípulas y con el pecíolo fuertemente canaliculado. B. Las flores están agregadas al final de las ramas, en grupos y son de color amarillo. C. Los frutos son cápsulas que, al igual que las semillas, son elipsoides a ovoides y subglobosas, presentando una sutura longitudinal lisa. Las semillas están envueltas por un arilo vistoso, generalmente rojo y carnoso Figura 1-1 Características morfológicas generales de especies del género Compsoneura. Las especies del género Compsoneura se han utilizado principalmente con fines alimenticios y maderables, y en menor proporción con fines medicinales humanos y mágico-rituales. En la Tabla 1.1 se muestran los principales usos etnobotánicos dados en Colombia de algunas especies de Compsoneura (Herrera, 1994). Tabla 1-1 Usos etnobotánicos de algunas especies del género Compsoneura en Colombia. ESPECIE C. atopa C. capitellata C. rigidifolia PARTE DE LA PLANTA Semilla Tronco Alimento Maderable Cocida o tostada. Madera para construcción de casas Semilla Alimento Sin cocer. Tronco Fruto Maderable Alimento Construcción de casas. Sin cocer. USO MODO DE USO LUGAR Costa Pacífica Costa Pacífica Caquetá, etnia Miraña Caquetá Valle Capítulo 1 7 Medicinal Paludismo MágicoRitual Maderable Corteza C. sprucei Ramas C. trianae Tronco Se toma la infusión de corteza en agua. Amazonas Protectores simbólicos. Amazonas Tablas para cajas. Amazonas Estudios Fitoquímicos en el Género Compsoneura Son pocos los estudios fitoquímicos realizados en especies del género Compsoneura y en general se han encontrado compuestos fenolicos, flavonoides, derivados de ácidos y lignanos. En un estudio realizado con hojas de diferentes especies colombianas del género Compsoneura se encontraron principalmente agliconas de flavonoides (quercetina 1) y ácidos polihidroxilados derivados de ácido cinámico (ácido p-cumárico 2, ácido caféico 3, ácido ferúlico 4 y ácido sinápico 5) y ácido benzóico (ácido gentísico 6 y ácido siríngico 7) (Herrera, 1994). En estudio fitoquímico realizado en hojas y corteza de C. atopa se reportó el aislamiento de dos lignanos diariltetrahidrofuránicos de la corteza, lignanos conocidos como (+) verrucosin 8 y (+) 3,3-dimetoxilarreatricina 9 (Chavarro, 1999). O OH R1 OH OH HO HO O R2 O OH R3 2: 3: 4: 5: OH OH O 1 HO R1 = H; R2 = OH; R3 = H R1 = H; R2 = OH; R3 = OH R1 = H; R2 = OH; R3 = OMe R1 = OMe; R2 = OH; R3 =OMe HO 6 O MeO MeO OMe OH 7 O HO OMe OH MeO O HO 8 OMe OH 9 1.2 Generalidades de la familia Lauraceae La familia Lauraceae perteneciente a las Angiospermas del Orden Laurales, es una de las cinco familias con mayor representación en cuanto al número de especies, consta de 56 géneros con más de 4000 especies. Su distribución es cosmopolita, pero 8 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. generalmente se encuentra en regiones tropicales y subtropicales (Van der Werff, 1991). Las especies de esta familia generalmente son árboles o arbustos con hojas ricas en glándulas con aceites esenciales (Rowher, 1993; Van der Weff, 1991). En Colombia están presentes 18 géneros dentro de los que se encuentra Aniba, Cassytha, Cinnamomum, Cryptocarya, Nectandra, Ocotea, Persea, entre otros. A esta familia pertenecen diferentes especies de interés económico debido a que de ellas se obtienen aceites esenciales, especias, frutos comestibles o maderas, siendo Persea americana una de las especies más representativas, debido a que su fruto (aguacate) es comestible y se usa para la obtención de aceites con aplicación en la industria cosmética (Pabón, 2009). Son numerosos los reportes de estudios químicos para especies pertenecientes a la familia Lauraceae, en los cuales se menciona que los principales componentes de aceites esenciales corresponden a monoterpenos y sesquiterpenos (Prieto et al, 2010). Otros metabolitos secundarios de amplia distribución en la familia son: alcaloides de tipo aporfínico y bencilisoquinolínico (Pabón y Cuca, 2010; Zhao et al., 2006), lignanos (Yang et al., 2009), neolignanos (Li et al., 2011; Rossi et al., 1997; Rippegur et al., 1996), flavonoides (Feng et al., 2012; Murai et al., 2008; Rossi et al., 1997) y α-pironas (Nehme et al., 2002; Cavalheiro y Yoshida, 2000; Drewes et al., 1996). 1.2.1 Aspectos generales del género Ocotea El género Ocotea, uno de los más abundantes de la familia Lauraceae, cuenta con aproximadamente 350 especies distribuidas principalmente en America y en Suráfrica. En Colombia están presentes 35 especies de este género, distribuidas en todo el territorio colombiano; principalmente en la Región Andina (Pabón y Cuca, 2010). Las especies de este género se caracterizan por ser árboles o arbustos. Poseen hojas lanceoladas, alternas, rara vez opuestas. Sus frutos son en forma de baya globosa con una cúpula carnosa o endurecida que al madurar se torna de color negro. Sus flores se presentan en panículas, poligamodioicas o bisexuales. Los tépalos de cáliz son 6 y desiguales, poseen 9 estambres fértiles y anteras con 4 valvas (Van der Weff, 1991). En la Figura 1.2 se ilustran características morfológicas generales de especies del género Ocotea. Capítulo 1 9 C D A B A. Especies son conocidas como “Aguacatillo” y se caracterizan por ser árboles o arbustos siempre verdes. B. hojas lanceoladas, alternas, rara vez opuestas. C. Los Frutos son en forma de baya globosa con una cúpula carnosa o endurecida que al madurar es de color negro. D. Flores en panículas, poligamodioicas o bisexuales Figura 1-2 Características morfológicas generales de especies del género Ocotea. Especies del género Ocotea se caracterizan por su alto contenido de aceites esenciales, razón por la que son apetecidas en la industria cosmética. La madera de las especies de este género se caracteriza por su dureza y resistencia al ataque de los insectos, razón por la que son ampliamente utilizadas con fines maderables; por tal motivo especies como O. perubela, O. bullata y O. quixos se encuentran protegidas por su tala indiscriminada (Pabón, 2009; Cárdenas y Salinas, 2006). En medicina tradicional, las especies de Ocotea también presentan numerosos usos, tal es el caso de O. quixos, que es utilizada como desinfectante, anestésico local y como antidiarréico (Ballabeni et al., 2007). O. lancifolia como antiparasitario (Fournet et al., 2007) y el aceite esencial de O. caparrapi es utilizado para las picaduras de insectos y mordeduras de serpientes, así como para lesiones epiteliales, bronquitis y tumores cancerígenos (Palomino et al., 1996). Actividad biológica para el género Ocotea Para especies de este género se han realizado varios estudios de actividad que incluyen evaluación de actividad antiparasitaria, antiplaquetaria, antiinflamatoria, antimicrobiana e 10 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. insecticida principalmente. Por ejemplo, el extracto alcaloidal de O. lancifolia presentó actividad antiparasitaria contra tres líneas de promastigote del género Leshmania: L. braziliensis, L. amazonensis y L. donovani (Fournet et al., 2007). Las hojas de O. duckei presentaron actividad mutagénica contra la especie Salmonella typhimurium (Marques et al., 2003). La actividad antiinflamatoria ha sido encontrada para la corteza y hojas de O. bullata (Zchocke et al., 2000), y para el aceite esencial de la especie O. quixos (Bruni et al., 2004), cuyos componentes principales son trans-cinamaldehído (27.8%) y cinamato de metilo (21.6%). Para este aceite también se ha reportado actividad antiplaquetaria en roedores (Ballabeni et al., 2007). El aceite esencial de hojas de O. longifolia presentó actividad insecticida sobre Sitophilus zeamais, una importante plaga de productos almacenados (Prieto et al., 2010). El extracto etanólico y el alcaloide (+)-dicentrina obtenidos de la corteza de O. velloziana exhibieron actividad insecticida sobre larvas de Aedes aegypti (Garcez et al., 2009). En la Tabla 1.2, se muestran algunos reportes de actividad biológica para algunas sustancias aisladas de especies del género Ocotea. Tabla 1-2 Actividad Biológica de algunos metabolitos secundarios aislados de especies del género Ocotea. ESPECIE O. lancifolia O. bullata O. duckei O. velloziana SUSTANCIA AISLADA Alcaloides: Domesticina Nordomesticina Neolignano: Ocobullenona Lignano: Yangambina Alcaloide: Reticulina Alcaloide: (+)-dicentrina ACTIVIDAD REFERENCIA Actividad Leishmanicida Fournet et al., 2007. Actividad antiinflamatoria Zschocke et al., 2000. Actividad antiplaquetaria Disminución de la coordinación motora Actividad larvicida contra Aedes aegypti. Marques et al., 2007. Morais et al., 1998. Garcez et al., 2009. Estudios Fitoquímicos para el Género Ocotea El mayor número de reportes para las especies de este género, consisten en la determinación de la composición química de sus aceites esenciales. El estudio de la composición del aceite esencial de 10 especies del género Ocotea mostró la presencia de algunos componentes comunes en todas las especies como β-cariofileno 10, αhumuleno 11, germacreno-D 12, γ-cadineno 13, δ-cadineno 14 (Takaku et al., 2007), Capítulo 1 11 compuestos que también fueron encontrados en los aceites esenciales de hojas de O. macrophylla y O. longifolia (Prieto et al., 2010). 10 11 12 13 14 Los lignanos y neolignanos han sido aislados de diferentes especies del género Ocotea, y prácticamente se han encontrado en todas las partes de la planta (madera, corteza, raíces, hojas y frutos). Lignanos de tipo tetrahidrofuránico como 2-(2',5'-dimetoxifenil)-3,4dimetil-5-(3", 4", 5"-trimetoxifenil)-tetrahidrofurano 15 han sido aislados de hojas de O. foetens (López et al., 1995) y lignanos furofuránicos como la yangambina 16 han sido aislados de las hojas de O. duckei (Marques et al., 2003). Neolignanos benzofuránicos como la burchelina B 17 han sido encontrados en O. cymbarum y O. catharinensis (Cabral et al., 2010; Lordello y Yoshida, 1997), y neolignanos biciclo[3.2.1]octánicos, como la iso-ocobullenona 18 y otras ocobullenonas han sido aisladas de corteza de O. bullata y de hojas de O. catharinensis (Zschocke et al., 2000; Lordello y Yoshida, 1997, Drewes et al., 1995). OMe OMe O OMe MeO O OMe H MeO OMe OMe 15 H OMe O MeO 16 MeO O O O OMe O O O O O 17 O 18 Alcaloides aporfínicos y bencilisoquinolínicos son los principalmente reportados para especies del género Ocotea. Varios alcaloides aporfínicos han sido aislados de la 12 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. madera de O. macrophylla, como lo son (S)-3-metoxi-nordomesticina 19, (S)-Netoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina 20, (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina 21 y (S)N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina 22 (Pabón y Cuca, 2010). Alcaloides bencilisoquinolínicos como coclaurina 23 y reticulina 24 han sido aislados de O. duckei (Silva et al., 2002) y de la corteza de O. caparrapi (Cuca, 1980), respectivamente. OMe MeO MeO MeO N R H HO 19: R = H 20: R = COOCH2CH3 21: R = CHO 22: R = COOCH3 O NH HO H3CO HO OH 23 O N HO 24 Los flavonoides son otros metabolitos encontrados en diversas especies del género Ocotea. En la especie O. vellosiana se han aislado glicósidos de flavonoides como quercetina 3-O-rhamnósido 25 y astragalina 3-O-β-D-glucósido 26 (Garcez et al., 1995). En estudios recientes se reporta el aislamiento de quercetina 3-O-β-D-glucosido 27, quercetina 3-O-β-D-galactósido 28, quercetina 3-O-xilosido 29, de las hojas de O. corymbosa (de Luca-Batista et al., 2010). OH OH HO HO O OH OR OH O 25: R = Rhamnosa 27: R = Glucosa 28: R = Galactosa 29: R = Xilosa O O-Glu OH O 26 1.3 Generalidades de la familia Rutaceae La familia Rutaceae está conformada en su mayoría por árboles, arbustos y enredaderas leñosas que crecen en regiones tropicales y subtropicales. Está compuesta por aproximadamente 1815 especies que se distribuyen en 161 géneros (Wei et al, 2012). Las especies de esta familia son ampliamente conocidas por su importancia económica, las más notables son las especies del género Citrus que producen tanto los frutos comestibles comercializables (limones, naranjas, mandarinas, toronjas, etc) y aceites esenciales utilizados en perfumería. Las especies de Pilocarpus también son Capítulo 1 13 importantes, pues son fuente de pilocarpina, un fármaco utilizado para tratar el glaucoma, y las especies de Boronia, Choisya, Poncirus y Skimmia también son conocidas, pues se utilizan como plantas ornamentales (Seidemann, 2005; Chase et al., 1999). Los metabolitos más comunes dentro de las especies de esta familia son: alcaloides, cumarinas, flavonoides, lignanos, terpenos, crómanos y amidas, entre otros (Patiño y Cuca, 2010; Cuca et al., 1998; Waterman y Grundon, 1983). 1.3.1 Aspectos generales del género Zanthoxylum El género Zanthoxylum pertenece a la familia Rutaceae, y su nombre se deriva de la palabra Xanthoxylum que proviene del vocablo griego: "xanthon xylon" que significa "madera amarilla", y es debido a esto que es común que los autores empleen la palabra Xanthoxylum ó Zanthoxylum (Chaaib, 2004). Zanthoxylum comprende alrededor de 549 especies distribuidas a nivel mundial, principalmente en regiones tropicales y templadas (Global Biodiversity Information Facility, 2012). Este género incluye árboles y arbustos generalmente dioicos. Las especies de este género se caracterizan por la presencia de espinas recurvadas a lo largo del tronco y de las ramas. Las hojas son variadas, pueden ser alternas u opuestas, simples o compuestas. Las inflorescencias están generalmente en forma de panículas o umbelas compuestas, axilares o terminales con flores pequeñas. Las flores son actinomorfas, hermafroditas y unisexuales, raramente bisexuales y generalmente blancas o verdes. Los frutos son folículos o esquizocarpos, contienen de uno a cinco carpelos, generalmente aromáticas, y de color rojo o negro con semillas brillantes (Melo y Zickel, 2004, Silva y Paoli, 2000). Las características morfológicas generales de especies del género Zanthoxylum se muestran en la Figura 1.3 (Patiño, 2004). Las especies de este género son de importancia económica como fuente de frutos comestibles, aceites, madera, materias primas para diversas industrias, plantas medicinales, plantas ornamentales y productos con aplicaciones culinarias. Por ejemplo, en África se utiliza la madera de Z. gillettii, Z. tessmannii, Z. lemairei y Z. leprieurii en la construcción de casas, edificios, barcos y muebles de madera decorativos, y de la industria del papel; mientras que la corteza de raíz y tallo de muchas especies de 14 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Zanthoxylum se emplean como vermífugos, febrífugos y piscicidas (Yang, 2008, Adesina, 2005; Seidemann, 2005). B C D A A. Hábito: árboles y arbustos con espinas recurvadas a lo largo del tronco y de las ramas. B. Las hojas son variadas, generalmente opuestas. C. Los frutos son folículos o esquizocarpos y de color rojo o negro con semillas brillantes. D. Las inflorescencias están generalmente en forma de panículas o umbelas compuestas, axilares o terminales con flores pequeñas generalmente blancas o verdes. Figura 1-3 Características morfológicas generales de especies del género Zanthoxylum. Las especies de Zanthoxylum también son usadas en el campo de la perfumería y en la industria alimenticia por los aceites esenciales que se obtiene de hojas, frutos e inflorescencias. Por ejemplo, los aceites esenciales de Z. xanthoxyloides (Ngassoum et al., 2003), Z. gillettii (Jirovetz et al., 1999) y Z. simulans (Chyau et al., 1996) han sido ampliamente usados a nivel industrial. Una característica común de casi todas las especies del género Zanthoxylum es la capacidad de producir resinas o latex, que podrían ser utilizadas en la industria farmacéutica como encapsulantes, agentes emulsionantes o diluyentes. Algunas investigaciones se han llevado a cabo con el latex recogido de la corteza de Z. tessmannii (Adesina, 2005). Muchas especies del género Zanthoxylum han sido utilizadas en diferentes partes del mundo, especialmente en Asia, África y América para tratar diferentes enfermedades en humanos y animales (Adesina, 2005; Chaaib, 2004; Diéguez et al., 2003; Patiño, 2004). Las propiedades etnobotánicas principales que son atribuidas a las especies de este género son: alivio de problemas dentales, tratamiento de malaria, trastornos Capítulo 1 15 gastrointestinales, gonorrea, reumatismo y enfermedades pulmonares, de la piel y genitourinarias, uso como anti-diarreico y anti-helmíntico en animales y seres humanos, febrífugo, antihemorrágico, diurético y anti-convulsivo (Patiño et al, 2012). Además de las propiedades medicinales, algunas especies del género Zanthoxylum también se utilizan como materiales de construcción, pesticidas y como colorantes de textiles. Por ejemplo, se ha reportado que la decocción de hojas y pericarpio de Z. dipetalum y de Z. hawaiiense (Marr y Tang, 1992) y la decocción de las raíces de Z. nitidum (Bhattacharya et al., 2009) son utilizados como insecticidas contra diversas especies de insectos que atacan a los seres humanos y a productos de interés económico. Actividad Biológica para el género Zanthoxylum El género Zanthoxylum es bien conocido por su diversidad química y por sus amplias aplicaciones etnobotánicas, características que han sido la base para desarrollar diversos estudios de actividad biológica, que han ayudado a encontrar nuevos extractos y compuestos bioactivos. Las actividades biológicas de muchas especies de Zanthoxylum están principalmente asociadas con la evaluación de actividad antimicrobiana, insecticida, anti-inflamatoria, antioxidante, antiparasitaria, antitumoral, anti-helmíntica y antiviral, así como estudios de inhibición enzimática y efectos sobre el sistema nervioso central y sobre componentes celulares de la sangre (Patiño et al., 2012). En la Tabla 1.3 se resumen algunos resultados de ensayos de actividad biológica, principalmente de tipo insecticida, realizados en algunas especies del género Zanthoxylum. Tabla 1-3 Reportes de actividad biológica para algunas especies del género Zanthoxylum. ESPECIE PARTE EVALUADA Extracto metanólico y algunos constituyentes de las raíces ACTIVIDAD BIOLÓGICA Actividad antifúngica e inhibición de la enzima acetilcolinesterasa. REFERENCIA Queiroz et al., 2006 Z. xanthoxyloides Extractos metanólicos hojas, corteza y raíz Z. usambarense Z. armatum de Extracto metanólico de corteza de raíz, corteza y hojas. Aceite esencial de semillas Actividad insecticida sobre Sitophilus zeamais y Callosobruchus maculatus Actividad antimicrobiana, insecticida, antiinflamatoria. Actividad larvicida sobre A. aegypti, A. stephensi y C. quinquefasciatus. Udo, 2011 Matu 2003 y Staden, Tiwary et al., 2007 16 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Z. macrophylla Alcaloides obtenidos de corteza: arborinina, tembetarina, xanthoxolina, 1-hidroxi-3-metoxi-N-metilacridona y magnoflorina. Z. schinifolium Extracto metanólico de frutos Z. limonella Z. bungeanum Z. lemairei Z. piperitum Aceite esencial Extracto CH 2 Cl 2 de frutos y piperitona, linalool y 4terpineol Alcaloides obtenidos del extracto metanólico de raíz: 10-O-demetil-17-Ometilisoarnottianamida, 6acetonil-N-metildihidrodecarina, nitidina y queleritrina Actividad antialimentaria en larvas de Spodoptera frugiperda y S. littoralis Actividad antialimentaria en larvas de Attagenus unicolor japonicus Actividad larvicida sobre Aedes dirus y A. aegypti Actividad repelente sobre hormigas del género Crematogaster. Actividad larvicida Anopheles gambiae sobre Tringali et al., 2001 Han et al., 2006 Pitasawat 2007 el at., Bowers et al., 1993 Talontsi et al., 2011 Actividad repelente contra Armigeres subalbatus Nerio et al., 2010 Actividad fumigante contra Callosobruchus chinensis Kim et al., 2003 Aceite esencial de frutos Estudios Fitoquímicos para el Género Zanthoxylum Los estudios fitoquímicos llevados a cabo en especies de este género han permitido el aislamiento de alcaloides de diversos tipos, lignanos, cumarinas y amidas; metabolitos secundarios que tienen importancia quimiotaxonómica para el género Zanthoxylum. También han sido aislados otros metabolitos como flavonoides, esteroles y terpenos (Patiño et al., 2012). Los alcaloides son los compuestos más importantes en el género Zanthoxylum, pues están presentes en la mayoría de las especies y se han encontrado en todos los órganos de la planta, siendo abundantes en el tronco y en la corteza de la raíz (Diéguez et al., 2003). Los alcaloides que principalmente se han reportado en son de dos tipos: isoquinolínicos (benzofenantridinas, bencilisoquinolinas, aporfiinas, protoberberinas and berberinas) y quinolínicos (Krane et al. 1984; Waterman y Grundon, 1983; Cordell, 1981). Las benzofenatridinas son los alcaloides más reportados en el género Zanthoxylum y son importantes debido a la interesante y variada actividad biológica que han exhibido estas sustancias (Maiti y Kumar, 2009; Tillequin, 2007, Maiti y Kumar, 2007, Dvorak et al., Capítulo 1 17 2006, Nyangulu et al., 2005, Eun y Koh, 2004, Tang et al. 2003; Slaninová et al., 2001, Simeon et al., 1989). La distribución de este tipo de alcaloides en platas es limitada, y solo han sido aislados de algunos géneros de las familias Papaveraceae, Rutaceae y Fumiraceae principalmente, donde son considerados marcadores quimiotaxonómicos (Krane et al., 1984; Cordell, 1981). Los principlaes representantes de los alcaloides benzofenantridínicos son: fagaronina 30, nitidina 31, queleritrina 32y sanguinarina 33, compuestos que han sido aislados de varias especies del género Zanthoxylum (Krane et al., 1984). R1 R5 R2 N+ R4 30: 31: 32: 33: R1 = OH; R2 = OMe; R3 = H; R4 = R5 = OMe R1 + R2 = OCH2O; R3 = H; R4 = R5 = OMe R1 + R2 = OCH2O; R3 = R4 = OMe; R5 = H R1 + R2 = R3 + R4 = OCH2O; R5 = H R3 Los alcaloides bencilisoquinolinicos también tienen distribución restringida en plantas. En el género Zanthoxylum no son muy típicos, pero se han encontrado en algunas especies, como es el caso de los alcaloide cuaternarios (R)-(+)- isotembetarina 34 y (S)-(-)xylopinidina 35 aislados de la corteza de of Z. quinduense (Patiño y Cuca, 2010). Las berberinas y protoberberinas han sido reportadas en muchas especies del género Zanthoxylum, por ejemplo, alcaloides tetrahidroberberínicos como N- metiltetrahidrocolumbamina 36 y N-metiltetrahidropalmatina 37 han sido aislados de corteza de Z. quinduense (Patiño y Cuca, 2010). La berberina 38 es el alcaloide generalmente responsable del color amarillo observado en madera y corteza de algunas especies de Zanthoxylum, como es el caso de Z. monophyllum, especie que es ampliamente utilizada como colorante (Patiño y Cuca, 2011). En el género Zanthoxylum, los alcaloides aporfínicos no son los más representativos, pero han sido aislados de varias especies y son importantes debido a su actividad antitumoral (Adesina, 2005). Por ejemplo, la N,N-dimetillindicarpina 39, obtenida de la corteza de la raíz de Z. zanthoxyloides (Queiroz et al., 2006). 18 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. MeO HO N+ MeO N+ MeO OH OH N+ RO OMe HO 36: R = H OMe 34 35 MeO OMe 37: R = CH3 HO O N+ O 38 N+ MeO OMe HO OMe MeO 39 Los alcaloides quinolínicos son muy comunes en el género Zanthoxylum, y usualmente se encuentran de dos tipos: furoquinolinas y piranoquinolinas. La mayoría de estos alcaloides se caracterizan por tener un grupo carbonilo en la posición 2 del núcleo quinolínico simple y son llamados 2-quinolonas (Waterman y Grundon, 1983). Alcaloides de este tipo han sido aislados de la corteza de Z. budrunga, encontrando dos piranoquinolinas: N-metilflindersina 40 y zanthobungeanina 41, junto con dos furoquinolinas: dictamina 42 y skimmianina 43 (Rahman et al., 2005). De Z simulans también se han aislado alcaloides piranoquinolínicos como zhantosimulina 44 y huajiaosimulina 45, los dos con actividad citotóxica (Chen et al., 1994). OMe O 40: R = H 41: R = OMe N O 42: R1 = R2 = H R2 O N 43: R1 = R2 = OMe R1 R O O O N N O 44 O 45 Alcaloides de tipo bishoderninilterpénicos, indolopiridoquinazolínicos, canthin-6-ona, quinazolínicos y carbazólicos, entre otros, no son muy comunes en el género Capítulo 1 19 Zanthoxylum y han sido encontrados en especies muy particulares. Alcaloides bishoderninilterpénicos como 46 han sido aislados de hojas de Z. integrifoliolum (Liu et al., 2000). Alcaloides indolopiridoquinazolínicos como 1-hidroxirutaecarpina 47, rutaecarpina 48, y 1-metoxirutaecarpina 49 han sido obtenidos de frutos de Z. integrifoliolum (Sheen et al., 1996). Los alcaloides canthin-6-ona son raros en la familia Rutaceae, pero se han encontrado en algunos géneros incluyendo Zanthoxylum. Por ejemplo, de Z. rugosum (Diehl et al., 2000), Z. chiloperone (Ferreira et al., 2002) y Z. budrunga (Rahman et al., 2005) han sido aislados canthin-6-ona 50 y 5-metoxicanthin-6ona 51. Alcaloides quinazolínicos has sido aislados de Z. budrunga, como es el caso de lunacridina 52 (Ahmad et al., 2003). Alcaloides carbazólicos como 3-metoxi-9-metil-9Hcarbazol-2-ol 53 se han aislado de madera de Z. rhoifolium (Taborda y Cuca, 2007). Actualmente, de la corteza de Z. monophyllum fue aislado un alcaloide derivado de prolina y denominado monophyllidina 54 (Patiño y Cuca, 2011). OH N N H O N N N O 47: R = OH R R 48: R = H 46 N O 50: R = H 51: R = OMe 49: R = OMe O OMe O N OMe HO N N H N OH HO 53 52 54 OMe O Diferentes tipos de lignanos han sido reportados en muchas especies de la familia Rutaceae, pero en el género Zanthoxylum los lignanos más reportados son de dos tipos: diarilbutirolactónicos y 2,6-diaril-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octánicos (Adesina, 2005; Waterman y Grundon, 1983). Lignanos furofuránicos como syringaresinol 55 fueron obtenidos de Z. quinduense y Z. monophyllum (Patiño y Cuca, 2010; 2011). De Z integrifoliolum (Chen et al., 1999), Z. culantrillo (Cuca et al., 1998) y Z. naranjillo (Bastos et al., 1999) ha sido aislado (+)-sesamina 56. Lignanos diarilbutirolactónicos como (-)cubebina 57 han sido aislados de Z. monophyllum (Cuca et al., 1998) y Z. naranjillo 20 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. (Bastos et al., 1999). Un nor-neolignano, ailanthoidol 58, fue aislado de la madera de Z. ailanthoides (Sheen et al., 1994). OMe O OH O MeO O H O O O HO O OMe H OH O O H H H H O O 55 57 56 O MeO O OH HO O MeO OMe 58 El género Zanthoxylum se caracteriza por la presencia de diferentes tipos de cumarinas (simples, lineares, dihidrofurocumarinas, furocumarinas y piranocumarinas). Las dihidrofurocumarinas lineares y angulares han sido identificadas en diferentes especies de este género, pero las dihidrofurocumarinas angulares no son comunes en especies de la familia Rutaceae, razón por la que se conocen como sustancias de valor quimiotaxonómico para el género Zanthoxylum (Murray et al., 1982; Waterman y Grundon, 1983). De Z. schinifolium fueron aisladas las terpenilcumarina conocidas como larcinatina 59, aurapteno 60 y collinina 61 (Tsai et al., 2000). Furanocumarinas con actividad citotóxica contra diversas líneas tumorales humanas han sido encontradas en Z. americanum, por ejemplo psoraleno 62 (Saquib et al., 1990). O O OMe 59 O O O O O O R 60: R = H 62 61: R = OMe Las amidas son compuestos de gran importancia quimiotaxonómica para el género Zanthoxylum y han sido encontradas principalmente en el pericarpio de los frutos, tallos y raíces. Este género se caracteriza químicamente por la frecuente acumulación de O Capítulo 1 21 alcamidas olefínicas (Adesina, 2005; Chaaib, 2004). Un ejemplo de este tipo de amidas es el α-sanshool 63, aislado de Z. liebmannianum (Navarrete y Hong, 1996). Otro tipo de amidas encontradas en especies de Zanthoxylum son las amidas aromáticas descritas en ocasiones como alcaloides o trans-cinnamoilamidas. Un ejemplo típico de este tipo de amidas es la syncarpamida 64, aislada de Z. syncarpum (Ross et al., 2004). MeO O O MeO N H OH 63 N H 64 En el género Zanthoxylum los flavonoides encontrados principalmente son glicosidos de flavonas, flavonoles y flavanonas. Los flavonoides encontrados en especies de Zanthoxylum, al igual que los aislados de otros géneros de la familia Rutaceae, se caracterizan por estar polimetoxilados (Waterman y Grundon, 1983). Una investigación llevada a cabo con frutos de Z. integrifoliolum permitió el aislamiento de 3,5diacetiltambuline 65 (Chen et al., 1999). OMe OMe MeO O OAc OAc O 65 Los esteroles son componentes comunes en la mayoría de las plantas. Mientras que βsitosterol 66 está presente en todas las plantas, el triterpeno lupeol 67 está presente principalmente en especies del género Zanthoxylum. Lupeol, β-sitosterol, generalmente asociados con estigmasterol 68, campesterol 69 y β-amirina 70 han sido aislados de varios órganos vegetales de la mayoría de especies del género Zanthoxylum estudiadas hasta el momento (Adesina, 2005). 22 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. R HO 66: R = CH2CH3 HO 67 68: R = CH3 HO HO 69 70 1.4 Biología y comportamiento de plagas de almacén: Especies del género Sitophilus y Tribolium Teniendo en cuenta el número de especies conocidas hasta el momento, los insectos son las especies más abundantes y diversas a lo largo de la vida de la tierra. Los insectos se dividen en 32 órdenes, y sólo a tres de ellos, Coleóptera (escarabajos), Lepidóptera (polillas) y Psocóptera (psócidos o piojos de los libros) pertenecen las principales plagas de productos almacenados. Insectos de otros órdenes pueden aparecer en productos almacenados por accidente o debido a que son depredadores de las plagas de almacén (Rees, 2004). Desde hace 10000 años la sociedad humana comenzó a producir y almacenar grandes cantidades de productos orgánicos secos como granos, fibras y pieles; pero estos nuevos recursos atrajeron a un selecto grupo de insectos que se alimentan de estos materiales de origen vegetal y animal. Un amplio número de plagas de almacén han sido asociadas con la actividad humana. Originalmente, muchas especies tenían una distribución restringida, pero miles de años de comercio han conllevado a una distribución cosmopolita de la mayoría de las plagas de almacén (Rajendran y Hajira, 2005; Cox y Collins, 2002). Capítulo 1 23 La infestación de productos almacenados por insectos conlleva a una variedad de daños y pérdidas económicas. Las regiones tropicales como Colombia, que dependen de la agricultura, son especialmente vulnerables a las pérdidas ocasionadas por el ataque de insectos de almacén. Se estima que las pérdidas anuales de productos almacenados en estas regiones son superiores al 20% (Moreira et al, 2007). Los insectos que infestan productos almacenados se clasifican de acuerdo a su forma de alimentación y al entorno en el que habitan, de la siguiente manera: 1) Consumidores de productos básicos (plagas primarias y secundarias); 2) consumidores de hongos; 3) depredadores; 4) parasitoides; 5) recolectores de residuos y 6) forrajeros y accidentales (Rees, 2004). En particular los insectos pertenecientes al los géneros Sitophilus y Tribolium pertenecen a los consumidores de productos básicos. Este tipo de insectos se alimentan directamente de un producto, principalmente de semillas y productos derivados de ellas. Se dividen en plagas primarias (capaces de atacar productos intactos) y secundarias (requieren de un producto previamente dañado para poder atacarlo) (López, 2008; FAO, 1983). 1.4.1 Insectos del género Sitophilus Las especies del género Sitophilus, conocidos popularmente como gorgojos, son una de las plagas más comunes y de mayor importancia económica y social a nivel mundial por las pérdidas que producen en cereales como maíz, trigo, sorgo, arroz y demás granos almacenados. Estos insectos son una plaga de distribución cosmopolita e infestación primaria que causan efectos desfavorables en la calidad, seguridad y conservación de los granos (Kim et al., 2003; Park et al., 2003; Isman, 2000; Liu y Ho., 1999). Atacan principalmente cereales, tanto en campo como en almacén. El adulto y las larvas se alimentan vorazmente de los granos como trigo, maíz, arroz, sorgo, cebada, avena, centeno. Ocasionalmente se ha encontrado en productos molidos, aunque difícilmente se multiplica en este medio. La alimentación de las larvas de Sitophilus deja grandes cavidades dentro de los granos y los adultos al emerger dejan grandes agujeros irregulares en los granos. Los adultos causan daños posteriores por el ataque de granos dañados. La infestación por Sitophilus spp. produce una gran cantidad de calor y humedad, lo que favorece la pérdida de calidad del grano, el crecimiento del hongos y de poblaciones de otras especies de insectos. Los principales representantes de este 24 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. género son: S. zeamais (gorgojo del maíz), S. oryzae (gorgojo del arroz) y S. granarius (Rees, 2004). Los insectos del género Sitophilus se clasifican taxonómicamente de la siguiente manera (Jiménez, 1991): Reino: Animal Philum: Artrópoda Subphilum: Mandibulata Clase: Insecta Subclase: Pterigota Orden: Coleóptera Suborden: Polifaga Familia: Curculionidea Género: Sitophilus Sitophilus oryzae Ciclo de vida En la Figura 1.4 se observa el ciclo de vida de los insectos del género Sitophilus. La hembra deposita el huevo en pequeñas cavidades escavadas por ella, colocando de 8 a 10 huevos diarios. El huevo mide 0,7 mm aproximadamente, tiene forma ovalada y eclosiona después de tres a cinco días de ovipositado, dependiendo de la temperatura. Las larvas son ápodas, pequeñas, de color blanco perlado y cuerpo grueso, con cabeza pequeña y de forma cuneiforme. Posee cuatro estadios larvales por los cuales pasa en un período de 19 a 34 días. Las larvas son caníbales, por lo tanto las larvas grandes pueden comerse a las larvas de menor tamaño. Figura 1-4 Ciclo de vida de insectos plaga del género Sitophilus Las pupas recién formadas son de color blanco, con algo de semejanza al adulto, con cabeza redonda y probosis larga, con patas dirigidas hacia el cuerpo y alas cubriéndolo. Capítulo 1 25 Tarda de tres a seis días en el proceso de pasar de ninfa a adulto. El gorgojo ya desarrollado tiene una longitud entre 2,1 y 2,8 mm, de color café oscuro o negro, cuerpo cilíndrico, cabeza prolongada en pico, soporta un par de mandíbulas resistentes. Los élitros tienen en sus ángulos posteriores 4 manchas de color rojizo y alas funcionales (Campbell, 2002; Jiménez, 1991). 1.4.2 Insectos del género Tribolium El género Tribolium está constituido por aproximadamente 30 especies. Varias especies de este género están asociadas con productos almacenados; entre ellas se encuentran T. castaneum (gorgojo rojo del harina) y T. confusum como una de las plagas más importantes de productos almacenados en todo el mundo, pero la capacidad de T. castaneum de volar lo hace más peligroso que T. confusum. Estos insectos atacan prácticamente cualquier material de origen animal o vegetal, pero son especialmente importantes como plagas de almacén. Se alimentan principalmente de cereales partidos o dañados por otros insectos, productos de molienda de cereales, harinas, semillas de oleaginosas y sus productos, galletas, nueces partidas y otros productos suaves o dañados. Los insectos de este género son considerados como plaga de infestación secundaria de los cereales ya que es incapaz de dañar el grano sano, limpio y seco. Tanto el adulto como las larvas se alimentan de cereales partidos o dañados y sus productos. Se considera una plaga primaria para los productos de molienda de cereales, legumbres y oleaginosas. Es muy común encontrarlos en molinos de trigo y diversas fábricas que trabajan con cereales molidos. El daño causado específicamente por este insecto no es fácilmente identificable. Las infestaciones pueden dar lugar a la persistencia de olores y colores desagradables en el producto debido a la secreción de benzoquinonas por las glándulas abdominales. Los insectos del género Tribolium se clasifican taxonómicamente de la siguiente manera (Rees, 2004; FAO, 1983): Reino: Animal Philum: Artrópoda Subphilum: Hexapoda Clase: Insecta Orden: Coleóptera Suborden: Polifaga Familia: Tenebrionidae Género: Tribolium Tribolium castaneum 26 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Ciclo de vida La hembra oviposita hasta 450 huevos entre la harina o residuos de los granos. Los huevos están cubiertos con una secreción pegajosa que permite que se adhiera a la superficie del huevo de harina u otras partículas, facilitando así la infestación. Los huevos incuban entre 5 y 12 días, dando origen a larvas son elateriformes pequeñas, delgadas, cilíndricas que llegan a medir 5 mm de longitud, de color blanco matizado a amarillo. Las larvas se alimentan de la materia prima infestada y de otros insectos. El canibalismo entre las larvas y los adultos es común. Las larvas de plena madurez de T. castaneum llegan a medir hasta 10 mm de largo. La pupa al principio es blanca, gradualmente cambia a amarillo, después a café y finalmente se transforma en adulto. El ciclo completo demora de 5 a 8 semanas y los adultos viven de 12 a 18 meses. El cuerpo de los adultos es de forma alargada y ligeramente plana. Posee antenas que se ensanchan gradualmente desde la base hasta los extremos, ojos pequeños y redondos. Protórax densamente cubierto con diminutos puntos negros. Los élitros tienen bandas longitudinales difíciles de ver a simple vista. El adulto mide de 3 a 4 mm, T. castaneum es de color café rojizo brillante y T. confusum es de color café opaco (Rees, 2004; FAO, 1983). En la Figura 1.5 se observa el ciclo de vida de los insectos del género Tribolium. Figura 1-5 Ciclo de vida de insectos plaga del género Tribolium 1.5 Daños y pérdidas causados por plagas de almacén Debido a las condiciones ambientales existentes en los silos de almacenamiento, la mayoría de las plagas tienen un desarrollo óptimo y rápido, alcanzando con prontitud la madurez sexual. Como resultado, la velocidad de crecimiento es muy alta y las poblaciones aumentan con rapidez, a tal punto que en pocos meses, una sola pareja de Capítulo 1 27 insectos pude desarrollar una progenie suficiente para infestar varias toneladas de producto. Los daños causados por una especie insectil, se miden por la intensidad de daño causado, el cual está en función de la densidad de población de insectos presentes. A nivel mundial, las pérdidas ocasionadas por los insectos en granos y cereales almacenados, oscila entre el 10 y 50% de la producción anual. Los daños causados por los insectos pueden dividirse en dos categorías: daños directos y daños indirectos (De los Mozos, 1997; Jiménez, 1995). Daños directos: Son los daños más notables y son producidos por la alimentación de la plaga sobre el producto. Pueden ser causados por larvas y adultos, o bien exclusivamente por las larvas. La mayor parte de los coleópteros de almacén, incluidos Sitophilus spp. y Tribolium spp., causan daños en estado larval y adulto. Para el caso de estos dos insectos se tiene que los adultos son longevos y el período de ovoposición muy prolongado, lo que facilita la proliferación de la plaga (De los Mozos, 1997). Los daños directos, en general, suelen ser de escasa importancia en comparación con los daños indirectos. Los daños directos más relevantes sobre los granos y cereales son: pérdidas de peso, daño en la calidad del producto, contaminación por insectos muertos y excrementos, y cambios en el valor nutricional (Jiménez, 1995). Daños indirectos: Son daños graves en productos alimentarios que causan la inviabilidad total del producto para el consumo humano o animal. La presencia de deyecciones y otros restos de las especies infestantes causan una notable pérdida del valor comercial del producto. Algunos insectos confieren al producto atacado un sabor y olor desagradables, y su ingestión puede causar serios problemas digestivos en humanos y animales. También es frecuente que los restos de algunas especies provoquen reacciones alérgicas a las personas que entran en contacto con los productos atacados (De los Mozos, 1997). La actividad metabólica de la plaga crea un considerable calentamiento del producto en la zona atacada. El gradiente de temperatura provoca la condensación de agua en la periferia de la zona atacada, lo cual favorece el desarrollo de hongos e incluso la germinación de los granos. Los propios insectos actúan como vectores de esporas 28 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. fúngicas por todo el producto. El desarrollo de hongos supone un grave problema, pues el producto se contamina con micotoxinas y queda inservible para la alimentación (Rees, 2004; Jiménez, 1995). Además de los daños directos e indirectos, las plagas de productos almacenados causan: 1) rechazo por parte de los consumidores, 2) altos costos sociales y jurídicos, 3) costos asociados con la aplicación de métodos para controlar y prevenir las infestaciones, 4) riesgos para la salud y el medio ambiente causados por uso de plaguicidas y fumigantes y 5) serios daños de relaciones comerciales entre países por temor a la introducción involuntaria de nuevas plagas, lo que conlleva a graves perjuicios en la economía (Rees, 2004). En Colombia, los daños causados a granos almacenados por acción de insectos plaga es de gran importancia, ya que origina cuantiosas pérdidas. Esto se debe principalmente a que en el país las condiciones de almacenamiento no son adecuadas, debido a que no se cuenta con los recursos necesarios para poder mantener los granos bajo condiciones específicas de humedad y temperatura, dificultando así el control de plagas. 1.6 Métodos de almacenados control de plagas de productos Los primeros indicios de protección de productos almacenados contra el ataque de insectos provienen de los egipcios. Entre las medidas que adoptaban los egipcios se citan el lavado con soluciones de carbonato de sodio y la aplicación de diversas sustancias, de origen animal y/o vegetal, sobre las paredes de los graneros. Los procesos de fumigación de los granos lo hacían con inciensos preparados a base de resinas, gomas y especias (De los Mozos, 1997). Desde los primeros intentos de control de plagas de almacén el hombre ha desarrollado una variada gama de técnicas de control basadas en el conocimiento de la biología y comportamiento de las plagas de interés, con el objetivo de disminuir o eliminar los daños y pérdidas que esas especies ocasionan en la agricultura. Estas técnicas han permitido abordar el problema de las plagas de productos almacenados desde distintas perspectivas. Algunos métodos de control son preventivos y su aplicación es siempre recomendable; y otros son de tipo curativo y deben ser aplicados cuando se ha iniciado Capítulo 1 29 la infestación si se quiere preservar la integridad del producto almacenado. Los métodos químicos pueden ser curativos o preventivos (Schöler et al.,1997). Los siguientes son algunos tipos de métodos de control de plagas de almacén comúnmente usados: 1) Manejo de temperatura y humedad: La temperatura y la humedad son factores abióticos determinantes en el desarrollo de los insectos. Para prevenir el ataque de plagas es conveniente mantener los productos almacenados a una temperatura máxima de 15 °C, temperatura a la cual muy pocas especies pueden desarrollarse. No obstante, esta es una medida preventiva, pues aunque evita el desarrollo de algunas plagas, no sirve para desinfestarlo una vez atacado, pues varias especies son tolerantes al frío (Chown et al., 2011). 2) Almacenamiento hermético y atmósferas controladas: El almacenamiento hermético se basa en que la actividad respiratoria de las semillas, animales y microorganismos agota el oxígeno y aumenta el contenido de dióxido de carbono del ambiente interior de contenedor. Esta atmósfera generada mata las plagas y hongos, o al menos reduce el crecimiento de sus poblaciones. La eficiencia de este método depende de la hermeticidad del contenedor, temperatura, humedad del grano, abundancia inicial de la plaga y periodo de almacenaje. Las técnicas de atmósfera controladas consisten en la modificación del aire que rodea el producto de forma que sea letal para las plagas, y están directamente relacionadas con las técnicas de almacenaje hermético. Las dos técnicas más habituales de conseguir una atmósfera letal son reducir el contenido de oxígeno y aumentar la proporción de CO 2 . La atmósfera controlada es un método limpio y puede considerarse como una técnica de fumigación especializada. La protección puede mantenerse por largos periodos si el sistema permite conservar adecuadamente las características de la combinación gaseosa generada (Conyers y Bell, 2007). 3) Radiación electromagnética: Los distintos tipos de radiación permiten enfocar el problema de control de plagas desde distintas perspectivas, pero su elevado costo y peligrosidad son los principales limitantes de este método de control. Las microondas producen un calentamiento proporcional al contenido de agua de los materiales irradiados, y su aplicación en el control de plagas se basa en que el 30 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. contenido de agua de los insectos es mucho mayor que el de los granos. Las radiaciones UV-Vis pueden emplearse en el control de plagas de forma indirecta, pues los insectos tienen picos de receptividad visual a determinadas longitudes de onda. La atracción de algunos insectos por determinados colores, como el azul o el amarillo es conocida y empleada para la preparación de trampas cromáticas, especialmente para el monitoreo de plagas. En condiciones de almacén, la principal utilidad de este tipo de radiación es la detección precoz de infestaciones (El-Naggar y Mikhaiel, 2011; Vadivambal et al., 2007). Los rayos X, α, β y γ son radiaciones que tiene la facultad de ionizar tejidos. Los rayos γ han sido utilizados ampliamente para el control de plagas, pues provocan daños irreparables en el ADN y en los fosfolípidos de la membrana celular. Efectos similares pueden obtener con los rayos α y β, siendo los rayos β los de mayor poder ionizante y de penetración. Las radiaciones más utilizadas en el control de plagas en general y de almacén son los rayos γ y los rayos β, que pueden aplicarse en dosis letales para eliminar de inmediato la plaga infestante o en dosis subletales que inducen la esterilidad de los individuos irradiados (Hasan et al., 2012; El-Naggar y Mikhaiel, 2011). 4) Control biológico: Los productos almacenados son ecosistemas característicos donde varias especies interactúan. Varios grupos de depredadores y parasitoides aparecen en asociación con las plagas típicas de productos almacenados, y por lo tanto pueden causar elevadas mortalidades de la plaga. Sin embargo, aunque la relación depredador-presa establecida permita mantener la plaga controlada, este proceso tiene dos grandes inconvenientes: 1) existe un conocimiento mínimo de la fauna útil asociada a las plagas de almacén y 2) los umbrales de daño permitidos en los productos almacenados son bajos por lo general (De Los Mozos, 1997). Actualmente, la posibilidad de utilizar cepas de bacterias, hongos y de parasitoides que sean activos contra coleópteros se ha constituido en una buena posibilidad para el control de plagas de almacén, como es el caso del hongo Beauveria bassiana (Lord, 2007; Padín et al., 2002) y del parasitoide Theocolax elegans (Flinn et al., 2006) que han sido empleados para controlar diferentes plagas de almacén, incluidos Sitophilus spp. y T. castaneum. Capítulo 1 31 5) Feromonas: Las feromonas de las principales plagas de almacén se han identificado y se encuentran disponibles comercialmente. Debido a la especificidad de estas sustancias, han servido como una herramienta para detectar la plaga en una etapa temprana, determinar el momento adecuado para aplicar medidas de control y para establecer el alcance y calidad de una medida de control. El diseño de trampas con feromonas varía en función de la especie considerada y del objetivo. En coleópteros, donde tanto larvas como adultos caminan sobre el sustrato o por el suelo, las trampas más utilizadas son las de papel corrugado tratado con insecticidas, donde los insectos al penetrar las ranuras de la trampa mueren en el interior. Adicionalmente, para infectar a una población de plagas con agentes entomopatógenos, las trampas de feromonas en combinación con virus, hongos y bacterias son una buena opción (Cox, 2004). 6) Control químico: Los insecticidas sintéticos de contacto y los fumigantes son todavía las principales sustancias empleadas en la protección de productos almacenados gracias a su eficacia y bajo costo, pero debido a la estricta normatividad en relación con los residuos de insecticidas en los productos alimentarios, la gama de este tipo de productos es cada vez más restringida. Los insecticidas de contacto son sustancias que tienen mayor poder residual que los fumigantes y su costo de aplicación es menor. Sin embargo, la eficacia de los fumigantes es mucho mayor y tienen como ventaja su elevado poder de penetración, lo que evita el movimiento del producto para realizar el tratamiento. Los tratamientos con estos productos se pueden emplear como medidas preventivas o curativas, en el último caso aplicando el insecticida directamente en el grano para acabar con plagas infestantes, pero este procedimiento tiene amplias restricciones por posibles residuos y por el uso que se le va a dar al grano (De Los Mozos, 1997). 7) Otros métodos de control: Existen otras técnicas menos conocidas que pueden ser alternativas de interés para situaciones concretas. Una de estas técnicas se basa en la aplicación de sustancias abrasivas sobre los granos, con el objetivo de que dañen las cubiertas cuticulares que protegen a los insectos de la deshidratación. El uso de tierra de diatomáceas (DEs) para el control de insectos plaga en granos almacenados ha sido una alternativa promisoria, pues el origen de esta es natural, no deja residuos en los alimentos y tiene baja toxicidad para los mamíferos. Otra 32 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. ventaja de la tierra de diatomáceas es que tiene un modo de acción único y específico sobre los insectos: inactiva los lípidos impermeables de la cutícula, causando la muerte de los insectos por deshidratación. Actualmente se conoce que las DEs son muy eficaces contra los insectos plaga que afectan productos almacenados y varias formulaciones de esta sustancia están registradas en el mundo para su uso directamente sobre los productos básicos. Sin embargo, existen varios factores que restringen su uso. Uno de los más importantes es que depende del insecto objetivo, pues la eficacia de las tierras de diatomáceas varía considerablemente entre especies, o incluso entre diferentes etapas de la vida de la misma especie (Athanassiou et al., 2007). En países en desarrollo como Colombia, los métodos físicos de control (manejo de temperatura y humedad, almacenamiento hermético y atmósferas controladas y radiación electromagnética) son poco utilizados, ya que los pequeños agricultores carecen de los recursos económicos para acceder a estos, así como de la información y conocimiento necesarios para su manejo, por lo tanto, el control de plagas se hace químicamente. En nuestro país son empleados tres insecticidas sintéticos de alta toxicidad para el control de plagas de almacén, como lo son Fosfamin, Detiagas y Nuvan 50. Los dos primeros, son insecticidas que tienen como principio activo el fosfuro de aluminio, el cual al reaccionar con la humedad del ambiente produce fosfina, gas altamente tóxico que causa la muerte inminente de los insectos plaga. El problema de estos dos insecticidas es que su manejo requiere un extremo cuidado por parte de los agricultores, para evitar una intoxicación que puede desencadenarse en su muerte, además muchas veces la fosfina producida para aniquilar los insectos no es completamente liberada de los granos dispuestos para consumo, lo que representa un alto riesgo para los seres humanos (Killphos, 2012). Por otra parte, Nuvan es un insecticida organoclorado de origen sintético reviste menor peligro para la sociedad y para el medio ambiente (sin dejar de ser altamente tóxica), ya que el principio activo de esta sustancia comercial no presenta una toxicidad tan elevada como la de la fosfina; además es un líquido que puede percibirse y por lo tanto eliminarse con mayor facilidad (NUVAN® 50 EC, 2012). Capítulo 1 33 1.7 Insecticidas sintéticos para el control de plagas Los insecticidas sintéticos más empleados para el control de plagas que afectan tanto a cultivos como a granos y productos almacenados son los que comúnmente se conocen como organofosforados, organoclorados y carbamatos. 1.7.1 Insecticidas organofosforados Se denominan insecticidas organofosforados (IOP) aquellas sustancias orgánicas derivadas de la molécula del ácido fosfórico. Forman parte de los insecticidas de contacto al absorberse por intermedio de los lípidos del caparazón de los insectos. Los conocimientos acerca de la química del fósforo y de compuestos derivados del fósforo se remontan a comienzos del siglo XIX, pero fue en 1932 cuando se describieron por primera vez los efectos nocivos de los IOP sobre los seres vivos (Carod, 2002). Químicamente, los IOP son ésteres, amidas o tioles derivados de los ácidos fosfórico, fosfónico y tiofosfórico. Se descomponen con mayor facilidad que otros plaguicidas y se degradan por oxidación e hidrólisis, dando origen a productos solubles en agua, tentativamente menos persistentes y poco acumulables en el organismo humano. Estas sustancias se consideran tóxicas por su capacidad de fosforilar la acetilcolinesterasa, causando la acumulación de acetilcolina conllevando a síntomas y signos de intoxicación aguda (Carod, 2002; Ramírez y Lascaña, 2001). Los compuestos organofosforados son principalmente utilizados en la agricultura, fundamentalmente como insecticidas, y en menor grado como acaricidas, nematocidas, fungicidas y herbicidas (Coats, 1994). 1.7.2 Insecticidas organoclorados Los insecticidas organoclorados (IOC) son moléculas orgánicas cloradas de alto peso molecular que se caracterizan por ser depresores de sistema nervioso central. Estos compuestos fueron sintetizados a finales del siglo XIX; pero su poder como insecticidas fue conocido y empleado durante la segunda guerra mundial. El representante más importante es el diclorodifeniltricloroetano (DDT) (Coats, 1994). 34 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. El uso generalizado de los IOC se debe a dos razones principales; la primera de ellas es su persistencia y baja biodegradabilidad, sin embargo, esta misma persistencia resulta perjudicial al dar como resultado una degradación lenta del compuesto. La segunda razón es el hecho de que la mayoría de los IOC son muy económicos, sobre todo el DDT (Ramírez y Lascaña, 2001; Wang et al., 2008). En los países tropicales, los IOC son ampliamente utilizados en los programas de control de vectores de malaria y para el control de plagas y parásitos que afectan el ganado (Mishra y Sharma, 2011). Los plaguicidas organoclorados, por su alta persistencia en el medio ambiente y su liposolubilidad, se acumulan principalmente en el tejido adiposo (Cid et al., 2007). La frecuencia de uso de este tipo de sustancias es cada vez menor, debido a que muchos insectos han desarrollado diversos mecanismos de resistencia y a que están siendo reemplazados por otros insecticidas de similar eficacia pero que son biodegradables y no persisten en el medio ambiente (Coats, 1994). 1.7.3 Insecticidas Carbamatos Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas (Martínez-Valenzuela y Gómez-Arroyo, 2007; Wan y Harrington, 2000). Los carbamatos se utilizan además de plaguicidas como fármacos para tratar el Alzheimer y el glaucoma y en medicina veterinaria (Gupta, 2006). Todas estas sustancias derivan del ácido carbámico Los plaguicidas carbamatos pueden ser de tres tipos principales (Ramírez y Lascaña, 2001): a) derivados de ésteres carbamatados, comúnmente usados como insecticidas. b) derivados del ácido tiocarbámico, utilizados como fungicidas. c) carbamatos propiamente dichos, que se emplean como herbicidas. Los carbamatos son menos persistentes que los organoclorados y los organofosforados, y su mecanismo de acción se basa en la unión reversible de estas sustancias a las colinesterasas inactivándolas, perdiéndose este efecto espontáneamente en menos de una hora (Martínez-Valenzuela y Gómez-Arroyo, 2007; Coats, 1994). Capítulo 1 35 1.8 Insecticidas botánicos La utilización de extractos de plantas y sus mezclas como insecticidas data de la época del imperio romano. En el siglo XVII se utilizó la nicotina como controlador de plagas, y hacia el siglo XIX aparecieron las piretrinas naturales (Pascual-Villalobos, 1996). Actualmente, existen gran cantidad de materias activas y millares de productos técnicos para el control de plagas registrados en diferentes países, siendo la tendencia actual la de elaborar productos cada vez más sofisticados que alteren alguna de las fases del ciclo normal del insecto (González-Coloma et al., 2010; Belles, 1993). En la agricultura es necesario el uso de productos fitosanitarios, pues se estima que todavía el 45% del rendimiento potencial de los cultivos mundiales se destruye debido a las malezas, plagas y enfermedades antes y después de la recolección. La investigación y desarrollo de plaguicidas basados en productos naturales busca disminuir los problemas ocasionados por los plaguicidas sintéticos. Los compuestos naturales se consideran válidos y útiles si: 1) son muy específicos para una plaga (selectividad), 2) son menos contaminantes y biodegradables y 3) reducen la peligrosidad para el consumidor (Pascual-Villalobos, 1996). La detección e investigación de plantas no tóxicas para el ser humano reduce el riesgo de descubrir bioplaguicidas tóxicos. La posibilidad de encontrar nuevos biopesticidas se incrementa con la selección de plantas que se utilizan para alimentos, cosméticos o especias, o plantas que tradicionalmente han sido utilizados como protectores de cultivos. Las plantas tienen un excelente historial en el suministro de claves para la búsqueda de nuevos agentes protectores de cultivos, especialmente en el campo de los insecticidas (González-Coloma et al., 2010). Esto se puede atribuir a la evolución de los metabolitos secundarios para la protección de la planta huésped de insectos, patógenos y competidores de las plantas. Los plaguicidas botánicos también cuentan con la ventaja de ser compatibles con otras opciones de protección de cultivos que son de bajo riesgo y aceptables para el manejo de insectos, entre los que se incluyen: el uso de feromonas, aceites, detergentes, hongos entomopatógenos, depredadores y parasitoides. Actualmente, se emplean principalmente cuatro insecticidas botánicos, entre los se encuentran los pretroides, el Neem, la Rotenona y los aceites esenciales de diversas especies (Isman, 2006; Coats, 1994). 36 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 1.8.1 Piretroides Las piretrinas, crisantematos y piretratos (Figura 1.6) se extraen de las flores de T. cinerariaefolium. La flor seca en polvo de T. cinerariaefolium se ha utilizado como insecticida desde la antigüedad (González-Coloma et al., 2010). Estos insecticidas se caracterizan por su rápido efecto knockdown, particularmente sobre insectos voladores, y de hiperactividad y convulsiones en los demás insectos. Los síntomas causados por estas sustancias son producto de su acción neurotóxica, que genera el bloqueo de los canales de sodio en los axones nerviosos. Las piretrinas son moderadamente tóxicas para mamíferos y su principal problema es que son lábiles en presencia de luz UV, lo que limita su uso a campo abierto (Isman, 2006). R= -CH3 (crisantematos) o –CO2CH3 (piretratos) R1= -CH=CH2 (pirectrina) o - CH3 (cineria) o –CH2CH3 (jasmolina) Figura 1-6 Estructura de algunos piretriodes 1.8.2 Neem Dos tipos de insecticidas botánicos pueden ser obtenidos de las semillas del árbol de neem de la India (Azadirachta indica). El aceite esencial de las semillas es uno de estos insecticidas y es efectivo contra insectos de bajo peso y ácaros. La presencia de grupos disulfuro en este aceite contribuye significativamente a su bioactividad. El extracto obtenido con solventes de mediana polaridad a partir del residuo de semillas después de remover el aceite es el otro insecticida obtenido a partir de neem. Este extracto se caracteriza por contener el triterpeno azadiractina y más de una docena de análogos de esta sustancia, siendo estos compuestos los responsables de la actividad insecticida (Isman, 2006). Los limonoides más importantes extraídos del neem son azadiractina 71, nimbina 72 y salanina 73. Los productos que contienen azadiractina se pueden utilizar en una amplia gama de cultivos, incluyendo los vegetales, algodón, té, tabaco, café, plantas ornamentales y en el sector forestal. La azadiractina tiene dos efectos importantes en los insectos. A nivel fisiológico esta sustancia bloquea la síntesis y liberación de hormonas Capítulo 1 37 de muda desde la glándula protorácica, provocando una ecdisis incompleta en insectos inmaduros. En adultos hembra un mecanismo similar al descrito anteriormente ocasiona esterilidad. Adicionalmente, la azadiractina es un potente agente antialimentario para muchos insectos (Isman, 2006). Azadiractina es considerada como no tóxico para mamíferos y no se espera que tenga efectos adversos en organismos no vegetales o el medio ambiente (González-Coloma et al., 2010). 71 72 73 1.8.3 Rotenona Insecticida botánico que ha sido empleado por más de 150 años. La rotenona 74 es una isoflavona producida en raíces o rizomas de leguninosas tropicales de los géneros Derris, Lonchocarpus y Tephrosia. La rotenona es un veneno mitocondrial, el cual bloquea la cadena de transporte de electrones y evita la producción de energía. Como insecticida es considerado un veneno estomacal, pues debe ingerirse para ser efectivo (Isman, 2006). 74 1.8.4 Aceites esenciales Los aceites esenciales de plantas se han utilizado desde la antigüedad para el control de insectos. Estas sustancias están generalmente compuestas por complejas mezclas de monoterpenos, fenoles y sesquiterpenos, los cuales se caracterizan por su acción neurotóxica sobre insectos y por la baja toxicidad para mamíferos, y dicho efecto tóxico está directamente relacionado con el patrón de metabolitos secundarios que los 38 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. componen (Philogéne et al., 2003; Reagnault-Roger, 1997). Debido a las propiedades físicas de los aceites esenciales éstos pueden ser tóxicos por cuatro vías (Philogéne et al., 2003): 1) Inhalación: Provocada por su riqueza en compuestos volátiles. 2) Contacto: Los insectos mueren como consecuencia de la formación de una película impermeable, provocando la asfixia del insecto. 3) Absorción: debido a su carácter lipofílico son absorbidos en la cutícula de los insectos. 4) Ingestión: los insectos sufren intoxicación tras ingerir alimento contaminado con el aceite. Los monoterpenos son las principales sustancias responsables de la actividad insecticida que presentan los aceites esenciales, por ejemplo, las sustancias responsables de la actividad insecticida del aceite esencial de Rosmarinus officinale es 1,8-cineol, el de Syzygium aromaticum el eugenol y de Mentha sp. el mentol (Isman, 2006). 1.8.5 Familias de plantas reconocidas por su utilidad como insecticidas Actualmente, se conoce que aproximadamente 656 especies de plantas, distribuidas en 110 familias, han presentado significativa actividad insecticida. La familia más que cuenta con más reportes de actividad insecticida es la Lamiaceae, con 181 especies que poseen actividad insecticida, representando cerca del 28% de las especies que han presentado esta actividad (Boulogne et al., 2012). Además de las Lamiaceae, las familias botánicas más estudiadas por la significativa actividad insecticida de varias de sus especies son: Meliaceae, Astereaceae, Rutaceae, Leguminosae, Labiatae, Piperarceeae, Lauraceae, Umbelliferae, Cruciferae, Solonaceae y Euphorbiaceae (Scott et al., 2008; PascualVillalobos, 1996, Yang y Tang, 1988) 2. Estudio Fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae), y evaluación de su posible aplicación como antialimentarios de plagas de almacén. Los productos naturales se han utilizado por miles de años para el beneficio de la humanidad, ya sea como alimentos, prendas de vestir, cosméticos, construcciones, herramientas, medicamentos y agentes de protección de cultivos. La importancia de los productos naturales se debe a que son fuente de nuevos compuestos gracias a: 1) la producción de diversos metabolitos secundarios bioactivos por parte de las plantas e invertebrados marinos como defensa química; 2) son fuente de muchos medicamentos nuevos, algunos de los cuales son inaccesibles por otras vías y 3) pueden proporcionar las plantillas necesarias para el diseño de nuevos productos en el futuro (Colegate y Molyneux, 2008; Kaufman et al., 2006; Cragg et al., 2005). El uso de plantas como fuente de insecticidas naturales tiene su origen en observaciones empíricas realizadas por el hombre, en donde detectaron que ciertos vegetales se protegían mejor que otros frente al ataque de insectos, siendo así los insecticidas botánicos más antiguos que los demás pesticidas. Desde la antigüedad, los griegos, romanos y chinos utilizaban extractos de plantas para combatir las plagas de sus cultivos; y actualmente en muchas comunidades indígenas esta práctica aún se mantiene y representa un recurso renovable, más accesible y económico que los insecticidas sintéticos (Isman, 2006). La capacidad que poseen las plantas para defenderse frente a insectos perjudiciales es el resultado de años de evolución, tiempo en el cual desarrollaron la capacidad de 40 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. producir una diversidad de metabolitos secundarios con funciones diferentes. Estas sustancias son conocidas como aleloquímicos que pueden clasificarse, según su modo de acción, como: sustancias defensivas, tóxicas, repelentes, disuasorias de la alimentación o atrayentes (Cox y Collins, 2002), siendo así las plantas una fuente de sustancias químicas que podrían ser la base del surgimiento de nuevos productos insecticidas altamente selectivos, de baja persistencia en el ambiente y con menor posibilidad de generar fenómenos de resistencia (Caballero-García, 2004). En la actualidad los insecticidas botánicos más empleados para el control de insectos son los piretroides, el neem, la rotenona y los aceites esenciales (Isman, 2006), pero su aplicación ha sido limitada debido a la baja efectividad, pues se tiene conocimiento de que han empezado a presentarse fenómenos de resistencia de algunos insectos antes dichas sustancias (Stefanazzi, 2010; Correa et al., 2006; Isman, 2006; Caballero-García, 2004), por el inadecuado uso de estos productos. Este mismo fenómeno se ha presentado con los insecticidad de origen sintético, acompañado de serios problemas ambientales y de salud pública (Strand, 2000). Las anteriores consideraciones hacen cada vez más indispensable la búsqueda de nuevos agentes fitosanitarios que permitan controlar plagas y enfermedades que afectan a muchas plantas y productos fuentes de alimento y/o de uso industrial. Para este fin, la investigación en plantas representa una fuente ptencial para el descubrimiento de nuevas sustancias, si se considera que cada una de estas puede contener centenares de metabolitos secundarios. De las 250.000 a 300.000 especies vegetales reportadas, solamente una pequeña parte ha sido objeto de estudios fitoquímicos y de sus propiedades biológicas (Tringali, 2001). Actualmente, los estudios fitoquímicos han tomado gran impulso en la búsqueda de sustancias con propiedades insecticidas, con el fin de encontrar soluciones económicas y de bajo impacto ambiental para el control de plagas. Principalmente se reporta el uso de aceites esenciales de diferentes especies vegetales como insecticidas (Rajendran y Sriranjini, 2008; Kim et al., 2003; Enan, 2001; Lamiri et al., 2001; Kétïa, et al., 2000; Regnault-Roger, 1997) y últimamente se han reportado propiedades insecticidas promisorias para metabolitos secundarios como terpenoides (Sosa y Tonn, 2008; Omar Capítulo 2 41 et al., 2007), sesquiterpenos (Sosa y Tonn, 2008; Cis et al., 2006), alcamidas (Saadali et al., 2001), fenilpropenos (Tewary et al., 2006), diterpenos tipo neo-clerodano, benzopiranos, benzofuranos, fenoles, cumarinas, flavonoides, iridoides (Sosa y Tonn, 2008) y alcaloides (Domínguez et al., 2008; Schardl et al., 2007; Siciliano et al., 2005; Jinbo et al., 2002; Tringali et al.,2001). La flora colombiana, una de las más diversas a nivel mundial, posee una amplia variedad de familias de plantas, donde Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae son algunas de las más representativas y de importancia económica debido a sus aplicaciones a nivel alimenticio, industrial y medicinal. Estas tres familias se caracterizan por poseer especies productoras de aceites esenciales y de metabolitos secundarios como alcaloides, lignanos, flavonoides y terpenos. A algunos extractos, aceites y compuestos aislados de especies de estas tres familias se les ha determinado sus propiedades para el control de plagas. De las investigaciones en la familia Myristicaceae se ha encontrado que el ácido anacárdico aislado de Knema elegans presenta actividad insecticida frente al escarabajo de la papa, Leptinotarsa decemlineata (Schultz et al., 2006). De la especie Virola calophylla se aislaron tres alcaloides 5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina, 2-metil-6- metoxitetrahidro-β-carbolina y nicotina y un triterpeno friedelan-3-ona que exhibieron actividad antialimentaria frente al gorgojo del algodón, Anthonomus grandis (Miles et al., 1987). En la familia Rutaceae también se han encontrado sustancias con promisoria actividad insecticida, por ejemplo, 2-fenilflavona aislada de Sculletaria baicarensis presenta actividad antialimentaria frente a Spodoptera litoria (Morimoto et al., 2003); (-)-loliolido aislado de Zanthoxylum setulosum tiene actividad insecticida frente a Atta cephalotes (Okunade y Wiemer, 1985); fraccinelona y dictamina aislados de Dictamnus dasycarpus, exhiben actividad antialimentaria frente a Tribolium castaneum y Sitophilus zeamais (Liu et al., 2002); eritrococamida A aislada de Dinosperma erythrococca presenta actividad insecticida contra Musca domestica y Heliothis virescens (Latif et al., 1998); entre otros. En cuanto a las especies de la familia Lauraceae, por ejemplo, de Cinnamomum cassia se reporta el aislamiento de trans-cinamaldehído, eugenol y salicilaldehído, presentando 42 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. los tres promisoria actividad insecticida frente a Mechoris ursulus (Park et al., 2000). En Persea americana se menciona el aislamiento de 2-(pentadecil)-furano y 2-(tetradecil)furano, sustancias con actividad insecticida contra Spodoptera exigua (Rodriguez-Saona et al., 1999) y de Persea indica se reporta el aislamiento de perseanol, el cual posee actividad antialimentaria frente a Spodoptera lituria (Fraga et al.; 1997). A pesar de que las especies pertenecientes a estas tres familias han sido objeto de gran número de estudios fitoquímicos y de actividad biológica, aún hay gran cantidad de éstas que carecen de estudios de este tipo. En Colombia, a pesar de existir una gran diversidad de especies de estas familias no existe un estudio sistemático y químico completo, tal es el caso de Compsoneura capitellata, Zanthoxylum rigidum y Ocotea longifolia, para las cuales hay escasos o nulos reportes etnobotánicos, químicos y de actividad biológica. Las anteriores consideraciones hacen de las especies pertenecientes a las familias Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae objetos interesantes de estudio para emprender invetigaciones encaminadas en la búsqueda de sustancias con propiedades para el control de plagas y enfermedades, que tal vez en un futuro puedan ser empleados como agentes fitosanitarios de uso a nivel agrícola. En este sentido, se realizó un screening de actividad antialimentaria sobre S. zeamais de varias especies pertenecientes a las familias objeto de estudio, con el fin de seleccionar las más promisorias para inicar los estudios fitoquímicos enfocados en contribuir al conocimiento químico y de actividad biológica de las especies seleccionadas. En este capítulo se presentan los resultados del estudio fitoquímico realizado en hojas y madera de C. capitellata (Myristicaceae), corteza de Z. rigidum y corteza de O. longifolia; así como los resultados de la evaluación de la actividad antialimentaria sobre S. zeamais y T. castaneum para los extractos, fracciones y compuestos asilados. Capítulo 2 43 2.1 Metodología 2.1.1 General Las separaciones cromatográficas en columna se realizaron por efecto de la gravedad (CC), por aplicación de presión mediante cromatografía flash (CF) y por aplicación de vacío mediante cromatografía líquida al vacío (CLV). La fase estacionaria utilizada para el método tradicional de CC fue sílica gel 60 Merck (70-230 Mesh), para la CF fue sílica gel 60 Merck (230-400 Mesh) y para CLV sílica gel 60HF 254 Merck. Las separaciones cromatográficas en capa delgada preparativa (CCDP) se realizaron en placas de sílica gel 60 HF 254 Merck de 1 mm de espesor. Los estudios cromatográficos, el monitoreo de las cromatografías en columna y preparativa y el control de pureza se realizó por cromatografía en capa delgada (CCD) empleando cromatoplacas de sílica gel 60 HF 254 Merck, utilizando como reveladores vapores de yodo, luz UV (254 y 365 nm) y vainillina/H 3 PO 4 . Los solventes empleados para las separaciones cromatográficas fueron de grado técnico (destilados antes de su uso) y/o grado analítico. Como control de pureza también se empleó la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para lo cual se utilizó un cromatógrafo (HPLC-UV-DAD) Merck-Hitachi D-7000, equipado con un detector de arreglo de diodos L-4500, bomba inteligente L-6200A e interfase L-6000A, usando una columna analítica de fase reversa C 18 (25 cm x 10 mm) y una velocidad de flujo de 0,8 mL/min. Se emplearon solventes LiChrosolv (Merck) para el sistema en fase reversa. Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13 C, así como los experimentos DEPT 135, COSY, HMQC y HMBC fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance 400 y Bruker Avance 300, operado a 400 MHz y 300 MHz para 1H y a 100 MHz y 75 MHz para 13C, respectivamente. Como solventes y patrones internos se emplearon cloroformo deuterado (CDCl 3 ), acetona deuterada (acetona-d 6 ), metanol deuterado (CD 3 OD) y agua deuterada (D 2 O) a una temperatura de 25 °C. Los desplazamientos químicos (δ) están expresados en partes por millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) en hercios (Hz). Las multiplicidades están asignadas como sigue: s = singlete, d = doblete, t = triplete, c = cuarteto, quint = quinteto, m = multiplete, dd = dobledoblete, dt = dobletriplete, etc. Para los espectros de 13 C se indica entre paréntesis la información obtenida de los experimentos DEPT y cuando es posible, la asignación de la señal. 44 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Los espectros Infrarrojo (IR) fueron registrados en el espectrómetro Perkin Elmer FTIR Panagon 500 serie 1000 en película en una celda de KBr y en pastilla de KBr. Solo se incluyen las absorciones características, estando indicada entre paréntesis la asignación. La Rotación óptica se determinó en un equipo Atago-Polarimeter Polax-L. Los espectros de masas de baja (EM) y/o alta resolución (EMAR) fueron realizados por el Laboratório de Química de Produtos Naturais de la Universidad de Sao Paulo (Brasil) y por el Laboratorio de Cromatografía Líquida Acoplada a Espectrometría de Masas (LCMS) de la Universidad Nacional de Colombia usando ionización por electrospray en modo positivo o negativo, de acuerdo al tipo de compuesto. Los fragmentos significativos se indican como: m/z (intensidad relativa al pico base = 100), con masa exacta determinada para el ión molecular (M) o fragmento iónico adecuado. 2.1.2 Material vegetal Las 11 especies de vegetales empleadas en este estudio (Zanthoxylum rigidum COL 519810, Z. monophyllum COL 517520, Z. rhoifolium COL 522896, Z. quinduense COL 511101, Z. fagara COL 522891, Ocotea longifolia COL 522892, O. macrophylla COL 517191, Compsoneura capitellata COL 519809, Virola elongata COL 572082, V. carinata COL 563244 y V. peruviana COL 549606) fueron colectadas en diferentes regiones de Colombia entre los años 2005 y 2008, y fueron determinadas por el Biólogo Adolfo Jara Muñoz del Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia. Un ejemplar de cada espécimen colectado reposa en el herbario anteriormente mencionado. Los órganos colectados de cada planta se secaron al aire a temperatura ambiente, después se molieron y se prepararon los extractos por maceración con etanol al 96%. 2.1.3 Estudio fitoquímico de hojas de Compsoneura capitellata La especie C. capitellata (A. DC.) Warb (COL 519809) fue colectada por la Bióloga Adriana Aguilar en agosto de 2006 en la estación el Zafire, en la ciudad de Leticia (Amazonas). Capítulo 2 45 Las hojas secas y molidas (2550 g) de C. capitellata fueron extraídas con etanol al 96% por maceración a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado mediante destilación a presión reducida obteniéndose 163 g de extracto crudo. De este extracto, 100 g se sometieron a extracción sólido-líquido sucesiva mediante un equipo Soxhlet con éter de petróleo (EdP), CHCl 3 , AcOiPr y MeOH. Luego de la evaporación de los solventes se obtuvieron las fracciones denominadas EdP (32,0 g), CHCl 3 (14,8 g), AcOiPr (11,5 g) y MeOH (32,2 g). La fracción de EdP (10,0 g) fue sometida a cromatografía en columna (CC) eluyendo con mezcla de EdP:AcOiPr en polaridad creciente (80:20 a 100), obteniéndose 17 fracciones. De las fracciones 5 y 6 (900,0 mg) por CC repetitiva con tolueno:AcOiPr (85:15), hexano:acetona (85:15) y CHCl 3 se obtuvo el compuesto eudesman-11-en-4α-ol HCc-1 como un aceite incoloro (110,0 mg). La fracción 7 se purificó por cromatografía flash (CF) eluyendo con tolueno:AcOiPr (90:10) para obtener un sólido cristalino blanco correspondiente a la mezcla de β-sitosterol HCc-2 y estigmasterol HCc-3 (150,0 mg). La fracción AcOiPr (11,0 g) se sometió a CLV eluyendo con mezcla AcOiPr:MeOH en polaridad creciente (98:2 a 0:100), obteniéndose 12 fracciones. De la fracción 2 (157,2 mg) utilizando CF repetitiva con hexano:acetona (80:20) y hexano:AcOEt (70:30) como fases móviles, se obtuvo un sólido rojo correspondiente al flavonoide biochanina A HCc-4 (4,0 mg). Las fracciones 4 y 5 (181,0 mg) fueron purificadas mediante CF eluyendo con EdP:acetona (70:30) y CHCl 3 :acetona (70:30), obteniéndose el flavonoide formononetina HCc-5 como un sólido marrón (4,0 mg). Las fracciones 6 y 7 (215,0 mg) se reunieron y se sometieron a CF con EdP:AcOEt (50:50) y hexano:acetona (60:40), para obtener un sólido café correspondiente a la mezcla de 3,4-dihidroxibenzaldehído HCc-6 y del terpenoide denominado ácido 15-nor-10-hidroxi-oplopan-4-oico HCc-7 (6,0 mg). De la fracción 9 (170,0 mg) por CF eluyendo con CHCl 3 :MeOH (90:10) y hexano:acetona (40:60) se obtuvo un sólido amarillo correspondiente al flavonoide conocido como kaempferol-3-O-(2″,4″-di-trans-p-coumaroil)-ramnósido HCc-8 (22,9 mg). La fracción 11 (4,1 g) fue purificada por CLV eluyendo con mezcla AcOiPr:MeOH en polaridad creciente (95:5 a 0:100) obteniendo 8 fracciones, denominadas 11.1 a 11.8. La fracción 11.2 (1,98 g) fue sometida a CF repetitiva empleando AcOEt:MeOH (95:5), CHCl 3 :MeOH (90:10) y CHCl 3 :MeOH (85:15) como sistemas de elución, para obtener como un aceite café el derivado de ácido benzóico denominado (-)-compsoneurósido HCc-9 (10,6 mg), el 46 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. flavonoide afzelina HCc-10 como un sólido naranja (21,6 mg) y un esterol conocido como glicósido de 3-O-sitosterol HCc-11 como un sólido blanco (10,0 mg). En la Figura 2.1 se resume el procedimiento llevado a cabo para el aislamiento de los metabolitos secundarios del extracto etanólico del hojas de C. capitellata. Hojas secas y molidas (2550 g) Extracción con etanol 96% Extracto etanólico (163 g) BIOENSAYOS Fraccionamiento por Soxhlet (100 g) Fracción EdP Fracción CHCl3 Fracción AcOiPr Fracción MeOH (32,0 g) (14,8 g) (11,5 g) (32,2 g) BIOENSAYOS HCc-1 HCc-2 HCc-3 HCc - 4 HCc - 9 HCc - 5 HCc – 10 HCc - 6 HCc - 11 HCc - 7 HCc - 8 Figura 2-1 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en las hojas de Compsoneura capitellata. Capítulo 2 47 2.1.4 Estudio fitoquímico capitellata de la madera de Compsoneura La madera seca y molida (712,5 g) de C. capitellata (COL 519809) fue extraída con etanol al 96% por maceración a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado mediante destilación a presión reducida, obteniéndose 26 g de extracto crudo. 23 g de este extracto se sometieron a extracción sólido-líquido discontinua asistida por ultrasonido empleando hexano, CHCl 3 , AcOiPr y MeOH como solventes de extracción. Luego de la evaporación de los solventes se obtuvieron las fracciones denominadas hexano (600,0 mg), CHCl 3 (800,0 mg), AcOiPr (7,0 g) y MeOH (13,0 g). La fracción de Hexano (500,0 mg) fue purificada mediante CF eluyendo con mezcla de hexano:AcOEt (90:10), obteniéndose 15 fracciones. De la fracción 7 (96,7 mg) por CF con CHCl 3 :acetona (95:5) como fase móvil, se aisló un sólido cristalino blanco correspondiente a la mezcla de los esteroles β-sitosterol MCc-1 y estigmasterol MCc-2 (48,7 mg). La fracción 8 (118,6 mg) se purificó por CF repetitiva eluyendo con tolueno:AcOiPr (90:10) y CHCl 3 , para obtener un sólido blanco correspondiente a una butirolactona denominada megislactona MCc-3 (14,0 mg). La fracción de CHCl 3 (700,0 mg) fue sometida a CF eluyendo con la mezcla CH 2 Cl 2 :MeOH (90:10), obteniendo 9 fracciones. De la fracción 2 se obtuvo un sólido vinotinto correspondiente a la mezcla de las dihidrochalconas 2´,4´-dihidroxi-6´-metoxi3,4-metilenodioxidihidrochalcona MCc-4 y 2´,4´-dihidroxi-6´-metoxi-3-hidroxi-4- metoxidihidrochalcona MCc-5 (9,2 mg), mediante la purificación por CF empleando como solventes de elución hexano:acetona (85:15), CHCl 3 :AcOEt (98:2) y hexano:acetona (80:20). La fracción 3 se purificó por CF empleando como fase móvil CH 2 Cl 2 :acetona (80:20), obteniéndose los diarilpropanos (1-(2,3-dihidroxifenil)-3-(3,4- metilenodioxifenil)propano MCc-6 como un sólido marrón-rojizo (39,1 mg) y 1-(2’,3’dihidroxifenil)-3-(3’’,4’’-metilenodioxi-6’’-metoxifenil)propano MCc-7 como un aceite rojo (7,8 mg). La fracción AcOiPr (6,8 g) fue purificada por CLV eluyendo con mezcla CHCl 3 :MeOH en polaridad creciente (90:10 a 0:100), obteniendo 5 fracciones. Las fracciones 2 y 3 (3,5 g) fueron reunidas y sometidas a CF con CH 2 Cl 2 :MeOH (85:15) resultando 15 fracciones, 48 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. denominadas 2.1 a 2.15. Las fracciones 2.7 a 2.10 (1,5 g) fueron reunidas y purificadas por CF empleando la mezcla CHCl 3 :MeOH (80:20), obteniendo 6 fracciones, denominadas 2.7.1 a 2.7.2. La fracción 2.7.2 se purificó por CC en fase reversa empleando RP-18 como fase estacionaria y la mezcla H 2 O:MeOH (60:40) como fase móvil, obteniendo de esta manera los compuestos cinchonaina Ic MCc-8 como un sólido crema (281,3 mg) y cinchonaina Id MCc-9 como un sólido marrón (129,8 mg). En la Figura 2.2 se resume el estudio fitoquímico realizado en la madera de C. capitellata. Madera seca y molida (712,5 g) Extracción con etanol 96% Extracto etanólico (26 g) BIOENSAYOS Extracción sólido-líquido asistida por ultrasonido (23 g) Fracción Hexano Fracción CHCl3 Fracción AcOiPr Fracción MeOH (600 mg) (800 mg) (7,0 g) (13,0 g) BIOENSAYOS MCc - 1 MCc - 4 MCc - 2 MCc - 5 MCc - 3 MCc - 6 MCc - 8 MCc - 9 MCc - 7 Figura 2-2 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la madera de Compsoneura capitellata. Capítulo 2 49 2.1.5 Estudio fitoquímico de la corteza de Zanthoxylum rigidum La especie Z. rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd. (COL 519810) fue colectada por el Químico M.Sc. Wilman Delgado en enero de 2008 en el municipio de Icononzo (Tolima). La corteza seca y molida (2244 g) de Z. rigidum fue extraída con etanol al 96% por maceración a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado mediante destilación a presión reducida obteniéndose 117 g de extracto crudo. De este extracto, 100 g fueron fraccionados por CLV eluyendo con CHCl 3 y mezclas de CHCl 3 :MeOH en polaridad creciente (90:10 a 0:100), obteniendo 10 fracciones. La fracción 1 (2,48 g) se sometió a CF repetitiva con sílica gel, usando como sistemas de elución EdP:AcOiPr (90:10) y Hexano:AcOEt (90:10), obteniéndose un triterpeno como un sólido blanco identificado como lupeol Zr-1 (150,0 mg). La fracción 2 (20,0 g) fue sometida a CLV eluyendo con mezcla EdP:AcOiPr en polaridad creciente (85:15 a 0:100), obteniendo 12 fracciones, denominadas 2.1 a 2.12. Las fracciones 2.2 y 2.3 fueron reunidas (9,2 g) y purificadas por CF repetitiva empleando como sistemas de elución CHCl 3 y CHCl 3 :AcOEt (98:2) para obtener el triterpeno lupenona Zr-2 como un sólido blanco amorfo (2,8 g). La fracción 2.4 (4,9 g) fue sometida a CF eluyendo con CHCl 3 :AcOEt (95:5), obteniendo nueve fracciones denominadas 2.4.1-2.4.9. De la fracción 2.4.4 se obtuvo un sólido blanco correspondiente al triterpeno denominado betulina Zr-3 (11,5 mg) mediante CF empleando como fase móvil hexano:acetona (70:30). La fracción 2.5 (770,0 mg) se purificó por CF sucesiva empleando como solventes de elución CHCl 3 y mezclas CHCl 3 :AcOEt (95:5), obteniéndose un sólido verde correspondiente a la mezcla de los lignanos butirolactónicos conocidos como savinina Zr-4 y 2,3-di-(3',4'-metilenodioxibencil)-2-buten4-olido Zr-5 (33,4 mg). Las fracciones 2.6 y 2.7 (1,8 g) fueron reunidas y purificadas por CF empleando CH 2 Cl 2 :MeOH (98:2) y hexano:acetona (80:20) como fase móvil para obtener el alcaloide quinolónico flindersina Zr-6 (25,2 mg) como un sólido amarillo pálido. Las fracciones 2.9 y 2.10 (617,0 mg) se reunieron y purificaron mediante CF con sílica gel, eluyendo con CHCl 3 :AcOEt (90:10) para dar 8 fracciones (2.9.1 – 2.9.8), de las cuales las fracciones 2.9.1 y 2.9.2 (554 mg) fueron reunidas y sometidas a CF repetitivas empleando como fases móviles CHCl 3 :acetona (95:5), hexano:acetona (60:40) y CHCl 3 :acetona (98:2) y posterior purificación por CCDP en sílica gel eluyendo con 50 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. CHCl 3 :acetona (98:2) obteniendo así el lignano butirolactónico conocido como (+)dimetilmatairesinol Zr-7 (aceite amarillo; 33,9 mg), y los alcaloides quinolínicos γ-fagarina Zr-8 (sólido amarillo; 5,1 mg) y skimnianina Zr-9 (sólido amarillo-verdoso; 9,5 mg). La fracción 2.12 se purificó por CF eluyendo con CH 2 Cl 2 :MeOH (98:2) obteniéndose el lignano furofuránico denominado (+)-siringaresinol Zr-10 como un aceite amarillo pálido (30,2 mg). La fracción 3 (11,3 g) fue sometida a CLV eluyendo con mezcla tolueno:AcOiPr en polaridad creciente (70:30 a 0:100) para obtener siete fracciones, denominadas 3.1 – 3.7. La fracción 3.2 (5,4 g) fue purificada por CF sucesivas eluyendo con tolueno:AcOiPr (7:3), CHCl 3 :acetona (96:4) y CHCl 3 :acetona (90:10) obteniendo los compuestos cafeato de etilo Zr-11 como un sólido color naranja pálido (130,2 mg) y la cumarina denominada umbeliferona Zr-12 como un sólido blanco (31,6 mg). La fracciones 3.3 y 3.4 (1,95 g) se reunieron y sometieron a CF repetitivas empleando como fases móviles hexano:AcOEt (30:70) y hexano:acetona (60:40) para obtener un sólido blanco correspondiente a un monoglicérido conocido como monopalmitato de glicerilo Zr-13 (236,3 mg). Las fracciones 8 y 9 (10 g) se reunieron y la mezcla resultante se fraccionó por CLV empleando CHCl 3 :MeOH (70:30) como fase móvil para obtener seis fracciones denominadas 8.1 – 8.6. La fracción 8.4 (795,4 mg) fue purificada mediante CF eluyendo con mezcla CHCl 3 :MeOH (68:32) para obtener nueve fracciones (8.4.1 – 8.4.9). De la fracción 8.4.8 (287 mg) se aisló un compuesto derivado de los ácidos caféico y quínico que fue denominado ácido (-)-rigidunoico Zr-14 (sólido verde; 76,9 mg) al purificarlo por CF en fase reversa (RP-18) empleando como sistema de elución la mezcla H 2 O: MeOH (80:20). En la Figura 2.3 se resume el procedimiento llevado a cabo para realizar el estudio fitoquímico de la corteza de Z. rigidum. Capítulo 2 51 Corteza seca y molida (2244 g) Extracción con etanol 96% BIOENSAYOS Extracto etanólico (117 g) Fraccionamiento por CLV (100 g) CHCL3 MeOH 10 FRACCIONES Fracción 1 BIOENSAYOS Zr-1 Zr-2 Zr-5 Zr-8 Zr-3 Zr-6 Zr-9 Zr-4 Zr-7 Zr-10 Fracción 3 Zr-11 Zr-12 Fracciones 8 y 9 Zr-14 Fracción 2 Zr-13 Figura 2-3 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la corteza de Zanthoxylum rigidum. 2.1.6 Estudio fitoquímico de la corteza de Ocotea longifolia La especie O. longifolia Kunth (COL-522892) fue colectada por el Químico M.Sc. Wilman Delgado en enero de 2008 en el municipio de Icononzo (Tolima). La corteza seca y molida (1500 g) de O. longifolia fue extraída con etanol al 96% por maceración a temperatura ambiente. El solvente fue evaporado mediante destilación a presión reducida para obtener 78 g de extracto crudo. De este extracto, 60 g se 52 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. fraccionaron por CLV empleando CHCl 3 y mezclas de CHCl 3 :MeOH en polaridad creciente (90:10 a 0:100) como sistemas de elución, obteniéndose 9 fracciones. La fracción 1 (6,50 g) se purificó por CLV eluyendo con mezclas hexano:acetona en polaridad creciente (98:2 a 70:30) obteniendo nueve fracciones denominadas 1.1 – 1.9. La fracción 1.3 (1,50 g) fue sometida a CF repetitivas empleando las fases móviles CHCl 3 :AcOEt (99:1) y hexano:acetona (85:15) para obtener el sesquiterpeno conocido como ácido 11,13-dihidrocostuso Ol-1 como un aceite amarillo (21,9 mg). La fracción 1.4 (673,4 mg) se purificó por CF eluyendo con CH 2 Cl 2 :AcOEt (98:2) para obtener diez fracciones denominadas 1.4.1 – 1.4.10. La fracción 1.4.5 (55,0 mg) se purificó mediante CF y CCDP empleando en los dos casos CHCl 3 como solvente de elución, para obtener un aceite amarillo correspondiente al butanólido denominado Litsealiicolido C Ol-2 (10,5 mg). Las fracciones 1.4.6 y 1.4.7 fueron reunidas (220,0 mg) y sometidas a purificación por recristalización empleando metanol como solvente, para obtener de esta manera el compuesto β-sitosterol Ol-3 como un sólido blanco (125,5 mg). La fracción 1.5 (1,24 g) fue purificada por CF empleando la mezcla CH 2 Cl 2 :AcOEt (98:2) como solvente de elución para obtener 7 fracciones (1.5.1 – 1.5.7). La fracción 1.5.6 (66,1 mg) se purificó por CCDP eluyendo con hexano:acetona (80:20) para obtener un aceite amarillo pálido correspondiente a una sesquiterpenlactona denominada (+)-longifolina Ol-4 (30,2 mg). Las fracciones 2 y 3 se reunieron (5,1 g) y se sometieron a CLV empleando como fase móvil mezclas CH 2 Cl 2 :acetona en polaridad creciente (95:5 a 80:20), obteniendo 10 fracciones denominadas 2.1 a 2.10. La fracción 2.2 (189,1 mg) fue purificada por CF sucesivas eluyendo con CHCl 3 :AcOEt (95:5) y hexano:acetona (80:20), seguido por una CCDP empleando la mezcla hexano:acetona (80:20) como eluyente, permitiendo así obtener el sesquiterpeno conocido como (+)-hidroxiatractilólido Ol-5 (38,8 mg). La fracción 2.4 (558,4 mg) fue purificada por CF eluyendo con la mezcla hexano:acetona (70:30), obteniéndose unos cristales de color crema correspondientes a la sesquiterpenlactona denominada ocotealactol Ol-6 (50,5 mg). La fracción 2.5 (388,0 mg) se sometió a CF empleando la mezcla CHCl 3 :acetona (85:15) como fase móvil, obteniendo ocho fracciones, denominadas 2.5.1 – 2.5.8. Las fracciones 2.5.4 y 2.5.5 (154,0 mg) fueron reunidas y purificadas por CF sucesivas, empleando como solventes Capítulo 2 53 de elución las mezclas hexano:acetona (70:30) y hexano:AcOEt (60:40), para obtener de esta manera el sesquiterpenoide denominado kudtdiol Ol-7 un aceite incoloro (10,7 mg). La fracción 4 (6,4 g) se purificó por CLV eluyendo con mezclas CHCl 3 :MeOH en polaridad creciente (98:2 a 90:10) obteniendo cinco fracciones denominadas 4.1 – 4.5. La fracción 4.3 (437,4 mg) fue sometida CF empleando la mezcla CH 2 Cl 2 :MeOH (90:10) para obtener ocho fracciones (4.3.1 – 4.3.8). El glicósido de 3-O-sitosterol Ol-8 se obtuvo como un sólido blanco (50,0 mg) luego de realizar varios lavados con acetona a la fracción 4.3.5 (150,0 mg). En la Figura 2.4 se resume el estudio fitoquímico realizado en la corteza de O. longifolia. Corteza seca y molida (1500 g) Extracción con etanol 96% BIOENSAYOS Extracto etanólico (78 g) Fraccionamiento por CLV (60 g) CHCL 3 MeOH 9 FRACCIONES Fracción 1 BIOENSAYOS Ol-1 Ol-2 Ol-3 Ol-4 Fracciones 2 y 3 Ol-5 Fracción 4 Ol-8 Ol-6 Ol-7 Figura 2-4 Esquema general de extracción, fraccionamiento y purificación de los metabolitos secundarios presentes en la corteza de Ocotea longifolia. 54 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 2.1.7 Evaluación de actividad antialimentaria Para determinar la actividad antialimentaria de los extractos y compuestos se empleo el método de discos de harina (Xie et al., 1996) con algunas modificaciones. Se preparó una suspensión agua-harina mezclando 1,0 g de harina de trigo (1,0 g) con 5 mL de agua destilada agitando con ayuda de ultrasonido. Posteriormente se adicionaron 2 gotas de Tween 20 y se agitó nuevamente la mezcla. A la suspensión anterior se adicionaron 50 μL de una solución stock del extracto o compuesto, para obtener concentraciones finales de 1000 y 500 ppm para extractos, 100 y 300 ppm para compuestos puros, agitando la mezcla final con ayuda de ultrasonido. Alícuotas de 200 μL de la suspensión final se colocaron en la parte inferior de cajas de Petri de plástico formando discos. Los discos se dejaron secar a temperatura ambiente por 24 horas y posteriormente se transfirieron a una incubadora para equilibrarlos a 27 °C y 65-70% HR durante 48 h. Cada disco harina pesaba entre 36 y 39 mg. Una vez secos los discos, se colocaron en viales de plástico para pesarlos, y posteriormente se ubicaron dentro de cada vial diez (10) insectos sin sexar y se pesó el conjunto vial-disco-insectos. Todos los insectos empleados en el ensayo se mantuvieron sin alimento por 24 horas antes de su uso. El montaje del experimento se dejó en la cámara de cultivo durante 3 días (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). 50 μL de etanol fueron aplicados para producir los discos control. Como control positivo se empleo el extracto etanólico de semillas de Neem. Para cada ensayo se realizaron cuatro (4) replicas. Los Índices de Disuasión Alimentaria (IDA) se calcularon comparando los resultados obtenidos con el alimento tratado con los observados con el alimento sin tratar, empleando la siguiente fórmula (Liu et al., 2007): 𝐶−𝑇 � 𝐶 𝐼𝐷𝐴 = 100 × � C= masa consumida de disco control, T= masa consumida de disco tratado Capítulo 2 55 2.2 Resultados y discusión 2.2.1 Screening de actividad antialimentaria sobre S. seamaiz Para evaluar la actividad fagodisuasiva sobre S. seamaiz de 18 extractos etanólicos obtenidos de algunas especies de las familias Lauraceae, Rutaceae y Myristicaceae se empleó un ensayo de no elección realizado con pequeños discos de harina impregnados con el extracto a evaluar. El objetivo de este estudio preliminar de actividad antialimentaria era determinar cual o cuales de los extractos evaluados tienen potencial para inhibir la alimentación del gorgojo del maíz, y de esta manera seleccionar los más activos para realizar el estudio fitoquímico. Los resultados del screening preliminar de actividad antialimentaria se presentan en la Tabla 2.1, donde se reporta el Índice de Disuasión Alimentaria (IDA), expresado en porcentaje, que causa cada extracto evaluado sobre S. zeamais. Tabla 2-1 Resultados de actividad antialimentaria sobre S. zeamais de los extractos etanólicos de diferentes especies de las familias Rutaceae, Lauraceae y Myristicaceae No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 EXTRACTO Corteza Zanthoxylum rhoifolium Corteza Zanthoxylum monophyllum Corteza Zanthoxylum quinduense Corteza Zanthoxylum fagara Corteza Zanthoxylum rigidum Corteza Ocotea longifolia Madera Ocotea macrophylla Hojas Ocotea macrophylla Hojas Compsoneura capitellata Madera Compsoneura capitellata Hojas Virola elongata Corteza Virola elongata Madera Virola elongata Hojas Virola peruviana Corteza Virola peruviana Madera Virola peruviana Corteza Virola carinata Madera Virola carinata Control positivo (Extracto semillas Neem) FAMILIA Rutaceae Rutaceae Rutaceae Rutaceae Rutaceae Lauraceae Lauraceae Lauraceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Myristicaceae Meliaceae * Media ± 1DE de las cuatro repeticiones IDA (%) -18,1 ± 1,5 68,9 ± 2,4 37,7 ± 1,4 60,9 ± 1,7 76,9 ± 2,9 54,1 ± 1,6 23,9 ± 1,2 12,5 ± 1,4 56,3 ± 2,2 50,4 ± 1,6 19,6 ± 1,6 -4,4 ± 1,0 21,7 ± 1,4 -8,7 ± 1,5 10,9 ± 1,6 14,7 ± 1,7 23,9 ± 2,4 29,0 ± 1,6 61,3 ± 2,2 56 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Los resultados presentados en la Tabla 2.1 muestran que de los 18 extractos evaluados, seis presentaron actividad fagodisuasiva entre moderada y fuerte (resaltados en rojo en la tabla), de acuerdo a los criterios establecidos por Liu y colaboradores (2007): % IDA < 20% - No disuasión alimentaria 50% > % IDA ≥ 20% + Disuasión alimentaria débil 70% > % IDA ≥ 50% ++ Disuasión alimentaria moderada % IDA ≥ 70% +++ Disuasión alimentaria fuerte Dentro de los extractos que fueron activos, tres pertenecen a especies de la familia Rutaceae (corteza de Z. monophyllum, Z. fagara y Z. rigidum), uno a la familia Lauraceae (corteza de O. longifolia) y dos a la familia Myristicaceae (hojas y madera de C. capitellata), siendo el extracto de corteza de Z. rigidum (IDA = 76,9 %) la sustancia que más inhibió la alimentación de S. zeamais. Los resultados de actividad antialimentaria reportados en la Tabla 2.1 corresponden al primer reporte de efectos inhibitorios de la alimentación sobre insectos de productos almacenados de los todos los extractos etanólicos evaluados. Debido a que el desarrollo de este trabajo estuvo enmarcado en un proyecto macro titulado: “Búsqueda de metabolitos secundarios con propiedades insecticidas pertenecientes a las familias Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae para el control de insectos plaga del género Sitophilus que atacan cereales almacenados” (financiado por Colciencias y la Universidad Nacional de Colombia), se buscaba trabajar una especie activa de cada una de las familias objeto de estudio, razón por la que para desarrollar el estudio fitoquímico se seleccionaron las especies Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Ocotea longifolia (Lauraceae) y Zanthoxylum rigidum (Rutaceae), que fueron los especímenes de cada familia que presentaron la actividad antialimentaria más promisoria. Adicionalmente se seleccionaron estas especies debido a que presentaron un perfil químico interesante cuando fueron sometidas a estudio cromatográfico preliminar en CCD y HPLC, y además se tuvo en cuenta que son especies para las cuales hay escasos o nulos reportes etnobotánicos, químicos y de actividad biológica. Capítulo 2 57 2.2.2 Estudio fitoquímico de hojas y madera de C. capitellata La purificación por cromatografía en columna y preparativa sobre sílica gel de las fracciones de éter de petróleo y acetato de isopropilo, obtenidas a partir del extracto etanólico de hojas de C. capitellata, condujo al aislamiento e identificación de dos sesquiterpenos (eudesman-11-en-4α-ol HCc-1, ácido 15-nor-10-hidroxi-oplopan-4-oico HCc-7), tres esteroles (β-sitosterol HCc-2, estigmasterol HCc-3 y glicósido de 3-Ositosterol HCc-11), cuatro flavonoides (biochanina A HCc-4, formononetina HCc-5, kaempferol-3-O-(2″,4″-di-trans-p-coumaroil)-ramnósido HCc-8 y afzelina HCc-10), un bencenoide (3,4-dihidroxibenzaldehído HCc-6) y un derivado de ácido benzóico ((-)-compsoneurósido HCc-9). Las estructuras de los compuestos aislados de las hojas de C. capitellata se muestran en la Figura 2.5. OH H HO HO HCc-3 HCc-2 HCc-1 H HO O HO OH O HCc-4 O H OH HO O O O O O H OH OH HCc-5 HCc-6 HCc-7 OH O HO OH O O O OH O HO O O O HO HO O OH O OH O OH O OH O OH O O HO OH O OH O O HCc-8 HCc-9 HCc-10 Glu-O HCc-11 Figura 2-5 Compuestos aislados de las hojas de C. capitellata. OH 58 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. El estudio fitoquímico realizado en las fracciones de hexano, cloroformo y acetato de isopropilo obtenidas del extracto de la madera de C. capitellata permitió el aislamiento e identificación de nueve sustancias, entre las que se encuentran dos esteroles (βsitosterol MCc-1 y estigmasterol MCc-2), una γ-lactona (megislactona MCc-3), dos dihidrochalconas (2´,4´-dihidroxi-6´-metil-3,4-metilenodioxidihidrochalcona MCc-4 y 2´,4´dihidroxi-6´-metil-3-hidroxi-4-metoxidihidrochalcona MCc-5), dos diarilpropanos (1-(2’,4’dihidroxifenil)-3-(3’’,4’’-metilenodioxifenil)propano MCc-6 y 1-(2’,3’-dihidroxifenil)-3-(3’’,4’’metilenodioxi-6’’-metoxifenil)propano MCc-7) y dos cinchonainas (cinchonaina Ic MCc-8 y cinchonaina Id MCc-9). En la Figura 2.6 se presentan las estructuras de los compuestos aislados e identificados en la madera de C. capitellata. OH 12 5 O HO HO HO OMe HO O HO O O OH MCc-3 MCc-2 MCc-1 O OMe OMe + OH O OH MCc-4 MCc-5 O O OH HO OH HO OH HO MCc-6 HO O HO O O O OH O OH O O O OH OH O MCc-8 OH OH OH MCc-9 MCc-7 Figura 2-6 Compuestos aislados de la madera de C. capitellata. El estudio fitoquímico de C. capitellata condujo al aislamiento de una sustancia sin reportes previos en la literatura y con estructura novedosa, que corresponde a un derivado de ácido benzóico que fue denominado (-)-compsoneurósido HCc-9. Aunque es común la presencia de derivados de ácido benzoico en la familia Myristicaceae, no hay Capítulo 2 59 reportes de sustancias con estructura similar a HCc-9, en la que se tiene un fragmento de ácido benzoico glicosidado unido a un ácido graso de cadena corta, que tiene como característica estructural la presencia de un anillo 1,4-dioxánico. Como resultado del estudio fitoquímico realizado en hojas y madera de C. capitellata también se pudo determinar la presencia de sesquiterpenos, flavonoides de diversos tipos, esteroles, γ-lactonas y bencenoides, siendo este el primer estudio químico reportado para esta especie y para el género. Los metabolitos aislados en esta investigación han sido reportados previamente en diferentes especies de la familia Myristicaceae, principalmente en especies de los géneros Iryanthera y Virola, por lo que los metabolitos secundarios encontrados en este trabjo pueden tener importancia quimiotaxonómica para la familia y el género. Los tipos de flavonoides presentes en las especies de la familia Myristicaceae son muy característicos y en algunos casos pueden ser empleados como marcadores quimiotaxonómicos de algunos géneros de la familia (Martínez, 2000), por ejemplo los denominados virolanos, viralanoles e iryantherinas. En la presente investigación se encontraron diferentes tipos de flavonoides (flavonas, isoflavonas, dihidrochalconas, glocósidos de flavonas, 1,3-diarilpropanos y cinchonainas) en C. capitellata. Una característica encontrada en los flavonoides glicosidados es la presencia del azúcar ramnosa unido al oxígeno del C-3, como es el caso de HCc-8 y HCc-10, que esta de acuerdo con lo reportado por Martínez en una revisión sobre la distribución de flavonoides en la familia Myristicaceae (Martínez, 2000). La presencia de 1,3diarilpropanos e isoflavonas está muy restringida en la naturaleza y se encuentran principalmente en especies de la familia Myristicaceae, razón por la que son conocidos como marcadores quimiotaxonómicos de esta familia (Martínez, 2000). En este trabajo se encontraron sustancias de tipo 1,3-diarilpropano (MCc-6 y MCc-7) en la madera e isoflavonas (HCc-4 y HCc-5) en las hojas de C. capitellata, hecho que amplia la distribución de estos metabolitos a otros generos de la familia, pues solo habían sido reportados en especies de Virola, Iryanthera, Otoba, Knema y Pycnanthus. Derivados de la (-)-epicatequina como las cinchonainas Ic (MCc-8) e Id (MCc-9) aisladas en este trabajo son características del género Cinchona (Rubiaceae) y su distribución en la familia Myristicaceae ha sido poco reportada, por ejemplo se han aislado de la corteza de los tallos de I. megistophylla (Ming et al., 2002). 60 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Las butirolactonas son sustancias restringidas en la naturaleza y son características de las Angiospermas primitivas, como es el caso de especies de las familias Myristicaceae y Lauraceae. Este tipo de metabolitos se han encontrado en especies del género Iryanthera y también fueron encontrados en este estudio en la madera de C. capitellata, aislándose específicamente megislactona MCc-3, compuesto que fue encontrado previamente en I. megistophylla (Ming, 2002). Los compuestos HCc-1 a HCc-11 y MCc-1 a MCc-9 fueron elucidados por métodos espectroscópicos (RMN 1D y 2D, IR, EM), por comparación con los datos descritos en la literatura y/o por cocromatografía en CCD con muestras auténticas. A continuación se describe la elucidación estructural detallada del compuesto HCc-9 que no tiene reportes previos en la literatura. Los datos espectroscópicos y constantes físicas de los compuestos conocidos se presentan de manera resumida en las Tablas 2.2 a 2.14, y adicionalmente los espectros de RMN 1H y 13C se muestran en las Figuras 2.17 a 2.40. Elucidación estructural del compuesto HCc-9 El compuesto HCc-9 se obtuvo como un líquido viscoso café cuyo espectro IR presentó bandas en 3100, 2957, 2918, 2851, 1720, 1670, 1597, 1512 y 1267 cm‐1, indicando presencia de grupos hidroxilo, carbonilos y de aromaticidad en la molécula. La rotación óptica determinada fue [α]20 -40.3 (c 0.80, MeOH). Los espectros de RMN 1H y 𝐷 13 C P (Figura 2.7 y 2.8) presentan señales entre δ H 0 y 9,50, y δ C 10 y 180, respectivamente. Los desplazamientos observados para las señales sugieren que el compuesto presenta un anillo aromático, una unidad de monosacárido y una cadena alifática. Las señales con δ H 6,93 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H) y 9,26 (s, 1H) en RMN 1H junto con las señales en δ C 117,0 (CH), 123,2 (C), 133,8 (CH), 163,9 (C) y 167,4 (C) para 13 C, indican que el fragmento de la parte aromática corresponde a un derivado de ácido phidroxibenzoico (Dhakal et al., 2008). Este fragmento fue confirmado por las correlaciones observadas en los experimentos bidimensionales COSY, HMQC y HMBC. 1.36 1.34 1.33 1.32 0.92 0.90 0.88 2.60 2.58 2.56 2.54 2.37 2.36 2.33 2.32 4.97 4.69 4.66 4.65 4.53 4.51 4.51 4.49 6.94 6.91 7.93 7.91 3.85 3.67 3.65 3.63 3.61 3.35 3.34 61 9.27 Capítulo 2 4'' HO 6' H-5’ y H-1’’’’ H-4’a H-7’ 3.35 3.34 3.85 4.69 4.66 4.65 4.53 4.51 4.51 4.49 OH OH O O1' H-8’a O 3' 1 HO O 8' O 4.97 7'' 2'' 3.67 3.65 3.63 3.61 O 6'' 2 CH3 (H-6’’’) 1''' 3''' 5''' H-2’’ y H-6’’ 5.0 4.4 4.6 4.8 4.2 4.0 f1 (ppm) 3.6 3.8 3.4 H-3’’ y H-5’’ 9.5 9.0 8.5 7.5 8.0 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 f1 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 3.5 5.9 2.9 1.5 1.1 2.6 1.3 1.9 1.0 1.8 1.9 1.1 2.0 0.8 H-O-(C-4’’) 1.0 0.5 0.0 1 15.3 33.7 32.7 29.8 26.7 25.5 24.2 63.5 82.0 81.6 76.9 76.5 76.4 73.5 117.0 123.2 133.8 167.4 163.9 179.1 RMN13C 104.3 Figura 2-7 Espectro RMN H para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). O 6'' 7'' HO 4'' 6' 8' O HO O 2'' O1' O 3' 1 OH OH O 4C 2 1''' 3''' C-1 5''' C-4’’ C-7’’ C-1’’ C-3’’ y C-5’’ C-2’’ y C-6’’ DEPT 135 1 CH3 C-4’a C-6’ a C-8’ C-6’’’ 11 CH 7 CH2 210 200 190 180 170 160 150 Figura 2-8 Espectro de RMN 140 13 130 120 110 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 C-1’’’’ 50 40 30 20 C y DEPT 135 del compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 100 MHz) 10 62 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Las señales en δ H 3,35 (td, J = 8,8; 8,8; 4,0 Hz, 1H), 3,65 (m, 3H), 3,80 (td, J = 9,2; 4,6 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) y 4,97 (t, J = 9,5 Hz, 1H) para RMN 1H y las señales en δ C 63,5 (CH 2 ), 73,5 (CH), 76,4 (CH), 76,5 (CH), 76,9 (CH), y 104,3 (CH) para 13C, indican la presencia de una hexosa en forma hemiacetálica. La conectividad de cada hidrógeno del monosacárido con su respectivo carbono fue establecida por medio del experimento HMQC (Figura 2.9). Por ejemplo, se estableció que la señal del carbono anomérico en δ C 104,3 (CH) conecta con la señal de hidrógeno en δ H 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) y las señales en δ C 63,5 (CH 2 ) y 76,9 (CH) conectan con la señal de los hidrógenos centrados en 3,65 (m, 3H). 20 30 40 50 60 70 90 100 f1 (ppm) 80 110 120 130 140 150 160 170 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 f2 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Figura 2-9 Espectro HMQC para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). Con base en el análisis de las constantes de acoplamiento y a las correlaciones escalares observadas en el experimento COSY (Figura 2.10), se determinó que el fragmento de monosacárido cíclico corresponde a la β-glucopiranosa (Roslund et al., 2008). Con este análisis se estableció correlación entre el protón sobre el carbono Capítulo 2 63 anomérico en δ H 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) con el protón en δ H 3,35 (td, J = 8,8; 8,8; 4,0 Hz, 1H), que a su vez correlaciona con el protón en δ H 3,80 (td, J = 9,2; 4,6 Hz, 1H), y el cual correlaciona con el protón en δ H 4,97 (t, J = 9,5 Hz, 1H) que a su vez correlaciona con los protones centrados en δ H 3,65 (m, 3H) que corresponden al metino y metileno de las posiciones 6’ y 1’’’’. 0 1 2 3 5 f1 (ppm) 4 6 7 8 9 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 1 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 f2 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1 Figura 2-10 Espectro COSY H- H para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). Las señales que aún no se han asignado en δ H 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,50 (m, 10H), 2,36 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 3,85 (td, J = 6,5; 2,2 Hz, 1H) y 4,69 (m, 1H) para hidrógeno, junto con las señales en δ C 15,3 (CH 3 ), 24,2 (CH 2 ), 25,5 (CH 2 ), 26,7 (CH 2 ), 29,8 (CH 2 ), 32,7 (CH 2 ), 33,7 (CH 2 ), 81,6 (CH), 82,0 (CH) y 179,1 (C) para 13 C, indican que el fragmento alifático puede corresponder a un ácido carboxílico lineal de diez átomos de carbono, en cuya cadena alifática hay dos carbonos oxigenados. En el experimento COSY (Figura 2.10) se observan las correlaciones escalares entre el protón en δ H 3,85 (td, J = 6,5; 2,2 Hz, 1H) con los protones en δ H 1,50 (m, 10H) y del protón δ H 4,69 (m, 1H) con los hidrógenos de un metileno en posición α al carbonilo con δ H 2,36 (m, 1H) y 64 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 2,56 (m, 1H). Esto sugiere que los carbonos oxigenados del ácido graso deben corresponder a los carbonos β y γ respecto al carboxilo (Silverstein y Webster, 1996). El análisis realizado hasta el momento permite plantear tres subunidades presentes en el compuesto HCc-9 y que se ilustran en la Figura 2.11. O H OH O O HO HO O O H O H H O O OH H O Figura 2-11 Sub-estructuras planteadas para el compuesto HCc-9 Para unir los fragmentos propuestos, se realizó el análisis de las correlaciones a larga distancia observadas en el experimento HMBC (Figura 2.12). 10 20 30 40 50 60 70 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Figura 2-12 Espectro HMBC para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 400 MHz). 0.5 f1 (ppm) 80 Capítulo 2 65 En el espectro HMBC (Figura 2.12) se observa la correlación de los hidrógenos en δ H 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H) con el carbono en δ C 167,4 (C), que corrobora la asignación de un carbono carboxílico sobre el anillo aromático, y se observa correlación de este carbono con el hidrógeno en δ H 4,97 (t, J = 9,5 Hz, 1H) de la glucopiranosa, lo que indica que el azúcar esta unido al derivado de ácido benzoico por el oxígeno ubicado en el carbono 4. Por otro lado, se observa la correlación del hidrógeno ubicado sobre el carbono anomérico en δ H 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) con uno de los carbonos oxigenados del fragmento de ácido carboxílico hacia δ C 82 (CH), y del hidrógeno sobre el carbono γ del ácido alifático en δ H 3,85 (td, J = 6,5; 2,2 Hz, 1H) con el carbono anomérico en δ C 104,3 (CH), lo que indica que la glucopiranosa está unida al ácido carboxílico alifático mediante un oxígeno presente entre el carbono anomérico y el carbono oxigenado en posición γ respecto al carboxilo. En el experimento COSY se puede observar la correlación entre los hidrógenos en δ H 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) y 3,85 (td, J = 6,5; 2,2 Hz, 1H); así como la correlación entre el hidrógeno en δ H 4,69 (m, 1H) y el hidrógeno en δ H 3,35 (td, J = 8,8; 4,0 Hz, 1H), confirmando que el azúcar esta unido al ácido graso a través de los oxígenos en las posiciones β y γ, formándose así otro ciclo como se muestra en la Figura 2.13, en donde se resumen algunas de las correlaciones observadas en COSY y HMBC. O O OH HO OH O HO O O O HMBC COSY Figura 2-13 Principales correlaciones observadas en COSY y HMBC para el compuesto HCc-9. El análisis espectroscópico realizado conduce a que el compuesto presenta una fórmula molecular de C 23 H 32 O 10 , consistente con 8 grados de insaturación y que está de acuerdo con el análisis realizado por EMAR con ESI en modo positivo, en donde se observaron iones pseudomoleculares con fórmula molecular de C 23 H 32 O 10 Na (m/z 491,1888 [M+Na]+, calculado para C 23 H 32 O 10 Na, 491,1893) y de fórmula C 23 H 33 O 10 (m/z 469,2062 [M+H]+, calculado para C 23 H 33 O 10 , 469,2073). 66 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Para determinar la estereoquímica del compuesto se utilizó el modelamiento molecular computacional junto con el experimento NOESY. El modelo molecular se realizó con el programa PC Spartan Pro 2005 para determinar el conformero más estable y visualizar la molécula en su forma tridimensional. El resultado obtenido indica que la conformación más estable de los ciclos fusionados de seis miembros es en forma de silla. 1.0 1.5 2.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 f2 (ppm) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Figura 2-14 Espectro NOESY para el compuesto HCc-9 (acetona-d 6 , 300 MHz). En el experimento NOESY (Figura 2.14) se observan correlaciones espaciales entre el protón anomérico en δ H 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H) con los protones en δ H 3,80 (td, J = 9,2; 4,6 Hz, 1H) y en 3,65 (m, 3H), y del protón en δ H 3,35 (td, J = 8,8; 4,0 Hz, 1H) con el protón en δ H 3,85 (td, J = 6,5; 6,5; 2,2 Hz, 1H), el cual a su vez correlaciona con el protón en δ H 4,69 (m, 1H). Lo anterior confirma que el monosacárido es la β-glucopiranosa e indica que los hidrógenos sobre los carbonos β y γ respecto al carboxilo están en posición synperiplanar entre ellos y respecto al hidrógeno de la posición 8a, estando de este modo de acuerdo al conformero más estable calculado con el programa f1 (ppm) 2.5 Capítulo 2 67 computacional y cuyos resultados se ilustran en la Figura 2.15, donde se resaltan las correlaciones observadas en el espectro NOESY. Figura 2-15 Estructura tridimensional del conformero más estable del compuesto HCc-9 La estereoquímica propuesta fue asignada teniendo en cuenta las correlaciones establecidas con el experimento NOESY, la estereoquímica de la β-D-glucopiranosa y el valor de la rotación óptica (York et al., 1997). De este modo, HCc-9 fue identificado como ácido (2’R, 3’S, 4’aS, 6’R, 7’R, 8’R, 8’aR) 2-(3’-hexil-8’-hidroxi-7’-(4’’-hidroxibezoiloxi)-6’(hidroximetil)hexahidro-4’aH-pirano[2’,3’-b][1’,4’]dioxin-2’-il) acético, denominado (-)- compsoneurósido (Figura 2.16). Este compuesto presenta una estructura inusual que no ha sido previamente reportada en la literatura, originándose por biosíntesis mixta mediante la condensación de un éster β-D-glucosídico del ácido p-hidroxibenzoico y un ácido graso con insaturación o dihidroxilación poco comunes en las posiciones β y γ. Ácidos grasos beta gama insaturados con isomería cis han sido reportados previamente en microalgas y bacterias marinas, siendo estas sustancias precursoras de macrólidos (Dewick, 2009). En esta investigación se reporta por primera vez la presencia en plantas de metabolitos secundarios derivados de ácidos grasos beta gama insaturados, lo que sugiere que este tipo ácidos no son exclusivos de organismos marinos. O O HO OH HO O O HO O O Figura 2-16 Estructura del componeurósido HCc-9 68 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. DATOS ESPETROSCÓPICOS COMPUESTOS CONOCIDOS AISLADOS DE HOJAS Y MADERA DE C. capitellata Tabla 2-2 Constantes físicas y datos espectroscópicos para Eudesm-11-en-4α-ol HCc-1 Nombre: Eudesm-11-en-4α-ol HCc-1 15 Estado físico 9 1 5 3 Aceite translúcido Fórmula molecular 7 13 11 H OH 14 C 15 H 26 O Peso molecular 222.3 g/mol Rotación óptica [α]20 : +26.1°(c 0.35, CHCl 3 ) 𝐷 IR: ν (cm-1) = 3392 (O-H), 3086 (=C-H), 2945 (C-H), 1645 (C=C), 1388 (HC-H),1235 (C-O) cm-1. 12 RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 4,70 (m, 2H, H-12), 1,88 (m, 4H, H-3 y H-6), 1.74 (s, 3H, H-13), 1,55 (m, 3H, H-2 y H-8a), 1,41 (m, 3H, H-1 y H-9a), 1,25 (m, H-1, H-5a), 1,18 (m, 2H, H-8b y H-9b), 1,11 (s, 3H, H-14), 1,03 (m, 1H, H-7), 0,88 (s, 3H, H-15). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 150,7 (C-11), 108,1 (C-12), 72,2 (C-4), 54,9 (C-5), 46,3 (C-7), 44,6 (C-9), 43,4 (C-3), 41,1 (C-1), 34,6 (C-10), 26,8 (C-8), 26,0 (C-6), 22,7 (C-14), 21,1 (C-13), 20,1 (C-2), 18,7 (C-15). 1.74 1.56 1.55 1.54 1.54 1.44 1.42 1.41 1.40 1.25 1.24 1.20 1.19 1.11 1.03 0.88 4.71 4.69 4.69 Datos descritos en la literatura: Corbett y Smith, 1967. 15 9 1 5 3 7 13 H-14 11 H-15 H OH 14 12 H-13 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.0 3.5 f1 (ppm) 1 3.0 2.5 2.0 4.04 4.67 3.96 3.85 1.32 3.92 4.84 4.5 2.93 2.00 H-12 1.5 Figura 2-17 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para HCc-1 1.0 0.5 34.6 26.8 26.0 22.7 21.1 20.1 18.7 54.9 72.2 108.1 RMN13C 46.3 44.6 43.3 41.1 69 150.7 Capítulo 2 15 9 1 5 3 7 13 C-5 11 H OH 14 C-4 12 C-11 C-7 DEPT 135 C-15 C-12 170 160 150 140 130 120 110 C-2 100 Figura 2-18 Espectro de RMN 90 80 f1 (ppm) 70 60 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para HCc-1 Tabla 2-3 Constantes físicas y datos espectroscópicos para biochanina A HCc-4 Nombre: HO 8 O 4 OH 2 1' 3' O 5' O Biochanina A HCc-4 Estado físico Sólido rojo Fórmula molecular C 16 H 12 O 5 Peso molecular 284,1 g/mol Punto de fusión 211 – 213 °C (Acetona) IR: ν (cm-1) = 3420 (O-H), 2935 (C-H), 1657 (C=O), 1611 (C=C), 1551 (C=C), 1510 (C=C), 1234 (C-O), 1118 (C-O). RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 12,99 (s, 1H, OH), 8,20 (s, 1H, H-2), 7,55 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7,00 (d, J = 8,8, 2,2 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 6,43 (sa, 1H, H-8), 6,41 (sa1H, H-6), 3,84 (s, 3H, OCH 3 ). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 182,6 (C-4), 166,2 (C-7), 164,9 (C-5), 161,7 (C-4’), 160,0 (C- 9), 155,5 (C-2), 132,1 (C-2´y C-6’), 125,2 (C-3), 124,8 (C-1’), 117,7 (C-4a), 115,5 (C-3’ y C-5’), 100,9 (C-6), 95,5 (C-8), 56,6 (OCH 3 ). Datos descritos en la literatura: Dos Santos et al., 1995; Braz Filho et al., 1976. 70 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 8 HO O 3.84 7.01 6.99 6.43 6.29 2 4 OH 8.20 8.01 7.80 7.78 7.56 7.53 9.85 12.99 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 1' 3' O OCH3 O 5' H-2’ H-6’ H-3’ H-5’ OH 11.5 10.5 9.0 8.5 7.5 7.0 f1 (ppm) 8.0 6.5 3.27 1.13 1.14 3.50 1.05 0.36 1.22 2.37 9.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 15.32 12.5 24.26 13.5 0.99 0.83 H-6 H-8 1.0 0.5 1 HO 8 O 56.59 95.50 2 4 OH 133.78 132.10 125.20 124.80 117.67 115.53 166.18 164.89 161.69 160.06 155.52 182.57 192.02 RMN13C 100.89 Figura 2-19 Espectro de RMN H (acetona d 6 , 400 MHz) para HCc-4 1' 3' O C-2’ C-6’ O 5' C-3’ C-5’ OCH3 C-6 C-8 C-4 DEPT 135 230 220 210 200 190 180 170 160 150 Figura 2-20 Espectro de RMN 140 13 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-4 0 Capítulo 2 71 Tabla 2-4 Constantes físicas y datos espectroscópicos para la formononetina HCc-5 Nombre: 8 HO O 7 Estado físico 1 Sólido marrón 2 9 Fórmula molecular 2' 10 6 Formononetina HCc-5 4 3 1' 3' 5 O 4' 6' O 5' C 16 H 12 O 4 Peso molecular 268,1 g/mol Punto de fusión 258 – 260 °C (Acetona) IR: ν (cm ) = 3416 (O-H), 2950 (C-H), 1659 (C=O), 1611 (C=C), 1561 (C=C), 1501 (C=C), 1243 (C-O), 1117 (C-O). -1 RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 8,17 (s, 1H, H-2), 8,06 (d, J= 8,8 Hz, 1H, H-5), 7,56 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7,00 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, H-6), 6,97 (d, J = 8,8, 2H, H-3’, H-5’), 6,90 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-8), 3,83 (s, 3H, OCH 3 ). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 175,4 (C-4), 161,5(C-7), 159,8 (C-4’), 154,4 (C-9), 152,5 (C-2), 132,0 (C-2’ y C-6’), 129,5 (C-5), 126,6 (C-3), 125,9 (C-1’), 117,0 (C-10), 116,7 (C-6), 115,4 (C-3’ y C-5’), 104,2 (C-8), 56,6 (4-OCH 3 ) 3.83 7.01 7.01 6.99 6.98 6.97 6.91 6.90 7.57 7.55 8.07 8.05 8.17 8.07 8.05 8.01 7.57 7.55 7.01 7.01 6.99 6.98 6.97 6.91 6.90 Datos descritos en la literatura: Zhao et al., 2009; Tolleson et al, 2002; Herath et al., 1998. 4’ OCH3 8 HO O 7 1 H-3’ 2 9 H-2’ 2' 10 6 4 3 1' 3' 5 H-5 H-8 H-6 O 4' 6' O 5' 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 f1 (ppm) 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 14 13 12 11 10 9 8 7 3.49 3.50 1.15 1.00 1.07 15 2.18 H-2 6 f1 (ppm) 1 5 4 3 2 1 0 -1 Figura 2-21 Espectro de RMN H (acetona d 6 , 400 MHz) para HCc-5 -2 -3 -4 72 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 8 HO O 7 1 56.5 80.3 80.0 79.7 104.2 2 9 2' 10 6 116.7 115.4 RMN13C 132.0 129.5 161.5 159.8 154.4 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 4 3 1' C-2 y C-6 3' 5 O 4' 6' O 5' C-9 C-7 DEPT 135 C-3 y C-5 4-O-CH3 210 200 190 180 170 160 150 140 Figura 2-22 Espectro de RMN 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-5 Tabla 2-5 Datos espectroscópicos para la mezcla de los compuestos 3,4-dihidroxibenzaldehído (HCc-6) y ácido 15-nor-10-hidroxioplopan-4-oico (HCc-7) H O 13 12 11 Nombre: O OH H 7 4 Estado físico 5 10 OH HCc-6 14 OH Sólido café 3 1 HO 3,4-dihidroxibenzaldehído (HCc-6) y ácido 15nor-10-hidroxioplopan-4-oico (HCc-7) H HCc-7 Fórmula molecular C 7 H 6 O 3 y C 14 H 24 O 3 Peso 138,0 y 240,2 g/mol Datos para HCc-6 (desde la mezcla) = RMN H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 9,77 (s, 1H, CHO), 8,01 (s, 1H, OH), 7,36 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-2), 7,33 (dd, J = 8,0; 1.9 Hz, 1H, H-6), 6,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 192,2 (CHO), 153,5 (C-4), 147,6 (C-3), 131,9 (C-1), 126,4 (C-6), 117,2 (C-5), 116,2 (C-2). 1 Datos para HCc-7 (desde la mezcla): RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 2,40 (ddd, J = 10,9; 9,6; 5,5 Hz, 1H, H-5), 1,84 (m, 1H, H-11), 1,72 (m, 2H, H-9a y H-1), 1,56 (m, 2H, H-8), 1,48 (m, 2H, H-2), 1,43 (m, 1H, H-6), 1,39 (m, 1H, H-9b), 1,28 (m, 2H, H-3), 1,15 (m, 1H, H-7), 1,12 (s, 3H, H-14), 0,90 (d, J = 6,8 Hz, 3H, H-12), 0,73 (d, J = 6,8 Hz, 3H, H-13); RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 179,8 (C-4), 73,1 (C-10), 58,8 (C-6), 51,4 (C-7), 50,0 (C-1), 49,5 (C-5), 44,0 (C-9), 30,9 (C-3), 30,4 (C-11), 27,2 (C-2), 24,6 (C-8), 23,2 (C-12), 21,4 (C-14), 17,0 (C-13). Datos reportados en la literatura para HCc-6 Mulvena et al., 1969 y para HCc-7: Brown et al., 2003. 2.43 2.41 2.40 2.40 2.39 2.39 2.38 2.36 7.36 7.35 7.35 7.34 7.33 7.32 7.00 6.98 9.77 H 13 12 O 1.84 1.71 1.51 1.48 1.39 1.38 1.28 1.12 0.91 0.89 0.74 0.72 73 8.01 Capítulo 2 11 O OH H 7 4 5 HO 14 OH OH HCc-6 3 1 10 H H-14 HCc-7 H-12 H-13 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 f1 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.78 5.18 3.52 2.89 1.35 3.23 4.72 0.86 5.46 4.39 1.00 1.87 0.41 0.92 10.5 1.80 H-5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1 H O 27.1 24.6 23.2 21.4 17.0 51.4 50.0 49.5 44.0 58.8 73.1 117.2 116.2 126.4 131.9 147.6 153.5 RMN13C 179.8 192.2 Figura 2-23 Espectro de RMN H (acetona d 6 , 400 MHz) de la mezcla de HCc-6 y HCc-7. 13 12 11 O OH H 7 4 5 10 HO 14 OH CHO HCc-6 C-4 3 1 OH C-6 H C-13 C-10 HCc-7 DEPT 135 C-9 220 210 200 190 180 170 160 Figura 2-24 Espectro de RMN 150 13 140 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de la mezcla de HCc-6 y HCc-7 74 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-6 Constantes físicas y datos espectroscópicos para kaempferol-3-O-(2″,4″-di-E-pcoumaroil)-ramnósido HCc-8 3' HO 9 OH 1' O 5' Estado físico 1 10 OH O O 5'' 1'''' 9'''' 5'''' 7'''' O 1'' 3'' 1''' 9''' Sólido amarillo OH O 3'''' HO 3''' 3 6 kaempferol-3-O-(2″,4″-di-E-p-coumaroil)ramnósido HCc-8 Nombre: 5''' Fórmula molecular C 39 H 32 O 14 Peso molecular 724,2 g/mol Punto de fusión Se descompone a 230°C antes de fundir 7''' O OH O O RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 -CD 3 OD): δ 7,67 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7,57 (d, J= 15,9 Hz, 1H, H-7’’’’), 7,49 (d, J = 15,9 Hz, 1H, H-7’’’), 7,37 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2’’’, H-6’’’), 7,32 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-2’’’’, H-6’’’’), 6,93 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 6,75 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3’’’, H-5’’’), 6,72 (d, J = 8,6 Hz, 2H, H-3’’’’, H-5’’’’), 6,29 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6), 6,25 (d, J = 15,9 Hz, H-8’’’’), 6,18 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 6,16 (d, J = 15,9 Hz, H-8’’’), 5,63 (sa, 1H, H-1’’), 5,48 (sa, 1H, H-2’’), 4,88 (t, J = 9,8 Hz, 1H, H-4’’), 4,09 (dd, J = 9,8, 3,4 Hz, 1H, H-3’’), 3,35 (m, 1H, H-5’’), 0,84 (d, J = 6,2 Hz, 3H, H-6’’). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 -CD 3 OD): δ 177,8 (C-4), 167,6 (C-9’’’’), 167,0 (C-9’’’), 163,9 (C-7), 161,4 (C-5), 159,8 (C-4’’’), 159,3 (C-4’’’’), 159,3 (C-4’), 157,7 (C-9), 156,9 (C-2), 146,3 (C-7’’’), 145,9 (C-7’’’’), 133,5 (C-3), 132,5 (C-2’ y C-6’), 130,5 (C-2’’’ y C-6’’’), 130,0 (C-2’’’’ y C-6’’’’),125,7 (C-1’’’ y C-1’’’’), 121,1 (C-1’), 115,6 (C-3’ y C-5’), 115,4 (C-3’’’ y C-5’’’), 114,9 (C-3’’’’ y C-5’’’’), 113,5 (C-8’’’), 113,3 (C-8’’’’), 104,9 (C-10), 98,9 (C-1’’), 97,9 (C-6), 94,0 (C-8), 73,5 (C-4’’), 71,7 (C-2’’), 68,3 (C-5’’), 67,8 (C-3’’),16,8 (C-6’’). HO 9 1.09 O 3'''' 7.40 1.89 1.93 2.07 1.11 7.55 7.50 7.45 f1 (ppm) 7.35 6.30 6.29 6.27 6.23 6.18 6.17 6.14 6.76 6.74 6.74 6.71 6.94 6.92 0.85 0.84 3.36 3.35 3.34 OH O O 7'''' O 1'' 5'' 9'''' 5'''' 7.60 4.11 4.10 4.08 4.08 10 OH H-7’’’ 3''' 3 6 3'' 1''' 9''' H-3’ y H-5’ 5''' H-3’’’ y H-5’’’ H-8’’’, H-8 y H-8’’’’ H-6 7''' O OH O O 7.0 7.30 6.9 6.8 4.02 H-2’’’’ y H-6’’’’ 1'''' 7.65 OH 5' 1 H-2’’’ y H-6’’’ HO 7.70 1' O 4.44 H-2’ y H-6’ H-7’’’’ 4.90 4.88 4.85 6.30 6.29 6.27 6.18 6.17 5.62 5.48 5.48 5.48 6.94 6.76 6.74 6.74 7.38 7.36 7.33 7.30 3' 2.00 7.51 7.47 7.60 7.56 7.69 7.67 7.69 7.67 7.60 7.56 7.51 7.47 7.38 7.36 7.33 7.30 7.26 Datos descritos en la literatura: Lee et al., 2008; Jagan Mohan Rao et al., 2002; Fiorini et al., 1998 6.7 6.6 6.5 f1 (ppm) 6.4 6.3 6.2 6.1 H-6’’ H-1’’ H-4’’ H-2’’ H-3’’ 8.5 8.0 7.5 6.5 5.5 5.0 1 4.5 f1 (ppm) 4.0 3.5 3.11 1.03 1.59 0.96 0.84 6.0 1.07 4.02 2.00 7.0 4.44 2.07 1.11 1.09 3.86 H-5’’ 3.0 2.5 2.0 1.5 Figura 2-25 Espectro RMN H (CDCl 3 -CD 3 OD, 400 MHz) para HCc-8 1.0 0.5 0.0 16.8 73.5 71.7 68.2 67.7 98.9 97.9 94.0 133.5 132.5 132.4 130.5 130.0 125.7 121.1 146.3 145.9 115.6 115.4 113.5 113.3 104.9 75 167.6 167.0 163.9 161.4 159.8 159.3 157.7 156.9 177.8 Capítulo 2 RMN13C C-3’ y C-5’ C-6’’ C-4 C-1’ C-10 3' DEPT 135 C-3’’ y C-5’’ HO 1' O 9 OH 5' 1 10 OH 1'''' 9'''' 7'''' 170 180 160 150 140 130 Figura 2-26 Espectro de RMN 120 110 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 O O 1'' 5'' 5'''' 190 OH O O 3'''' HO C-7’’’ y C-7’’’ 3''' 3 6 3'' 1''' 9''' 5''' 7''' O OH O O 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 -CD 3 OD, 100 MHz) de para HCc-8 Tabla 2-7 Constantes físicas y datos espectroscópicos para (-)-compsoneurósido HCc-9 Nombre: O 6'' 7'' HO HO 6' 8' O OH O O1' Líquido viscoso café Fórmula molecular C 23 H 32 O 10 OH Peso molecular 468,2 g/mol [α]20 : 𝐷 Rotación óptica 3' 1 Estado físico O 2'' 4'' (-)-compsoneurósido HCc-9 O 2 Datos EMAR 1''' 3''' 5''' -40.3 (c 0.80, MeOH) Masa calculada para C 23 H 33 O 10 469,2073 observada 469,2062 IR: ν (cm-1) = 3100 (OH), 2957 (C-H), 2918 (C-H), 2851 (C-H), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1597 (C=C), 1512 (C=C) y 1267 (C-O). RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 9,27 (s, 1H, 4’’-OH), 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2’’ y H-6’’), 6,92 (d, J= 8,7 Hz, 2H, H-3’’ y H-5’’), 4,97 (t, J = 9,5 Hz, 1H, H-7’), 4,69 (m, 1H, H-2’), 4,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-4’a), 3,85 (td, J = 6,5, 2,2 Hz, 1H, H3’), 3,80 (td, J = 9,2, 4,6 Hz, 1H, H-8’), 3,65 (m, 3H, H-6’ y H-1’’’’), 3,35 (td, J = 8,8, 4,0 Hz, H-8’a), 2,56 (m, 1H, H-2a), 2,36 (m, 1H, H-2b), 1,50 (m, 10H, H-1’’’ hasta H-5’’’), 0,90 (t, J = 6,9 Hz, 3H, H-6’’’). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 179,1 (C-1), 167,4 (C-7’’), 163,9 (C-4’’), 133,8 (C-2’’ y C-6’’), 123,2 (C-1’’), 117,0 (C3’’ y C-5’’), 104,3 (C-4’a), 82,0 (C-3’), 81,6 (C-2’), 76,9 (C-6’), 76,5 (C-8’a), 76,4 (C-7’), 73,5 (C-8’), 63,5 (C-1’’’’), 33,7 (C2), 32,7 (C-1’’’), 29,8 (C-2’’’), 26,7 (C-3’’’), 25,5 (C-4’’’), 24,2 (C-5’’’), 15,3 (C-6’’’). Elucidación estructural por análisis espectroscópico descrita en las páginas 60 – 67. 76 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-8 Constantes físicas y datos espectroscópicos para afzelina HCc-10 3' HO 7 9 afzelina HCc-10 Estado físico O 3 O O 1'' 5 Sólido naranja 5' 1' 1 OH O Nombre: OH OH 5'' 3'' OH Fórmula molecular C 21 H 20 O 10 Peso molecular 432,1 g/mol Punto de fusión Se descompone a 220°C antes de fundir IR: ν (cm-1) = 3425 (O-H), 2942 (C-H), 1669 (C=O), 1605 (C=C), 1519 (C=C), 1464 (C=C),1230 (C-O), 1110 (C-O). OH RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 7,85 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-2’, H-6’), 7,02 (d, J = 8,8 Hz, 2H, H-3’, H-5’), 6,47 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 6,26 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6), 5,53 (sa, 1H, H-1’’), 4,45 (m, 1H, H-3’’), 4,23 (sa, 1H, H-2’’), 3,80 – 3,30 (m, 2H, H-4’’ y H-5’’), 0,90 (d, J = 5,8 Hz, 3H, H-6’’). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 180,3 (C-4), 166,0 (C-7), 164,2 (C-5), 161,9 (C-4’), 159,4 (C-2), 159,0 (C-9), 136,7 (C-3), 132,7 (C-2’ y C-6’), 123,5 (C-1’), 117,3 (C-3’ y C-5’), 106,8 (C-10), 103,5 (C-1’’), 100,5 (C-6), 95,5 (C-8), 74,0 (C3’’), 73,1 (C-4’’), 72,5 (C-2’’), 71,6 (C-5’’),18,7 (C-6’’). HO 7 O 9 1' 1 3 5 OH O 0.90 0.89 3.35 3.33 3.32 3.31 3.77 3.75 3.71 3.70 3.69 3.66 5.53 4.49 4.46 4.45 4.44 4.43 4.23 4.13 4.12 4.11 4.10 3.77 3.75 3.71 3.70 3.69 3.66 3.35 3.33 3.32 3.31 3.07 7.03 7.01 6.47 6.47 6.27 6.26 4.23 4.13 4.12 4.11 4.10 3' 4.49 4.46 4.45 4.44 4.43 7.86 7.84 12.70 Datos descritos en la literatura: Soliman et al., 2002; Matthes et al., 1980. OH 5' O O 1'' OH 4.5 4.1 4.3 3.9 f1 (ppm) 2.11 2.95 0.95 1.72 OH OH 1.92 5'' 3'' 3.7 3.5 3.3 H-6’’ H-3’ y H-5’ 13.0 12.5 12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 1 7.0 6.5 f1 (ppm) 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.05 2.11 2.95 H-1’’ 1.72 1.92 0.83 H-6 0.98 0.99 2.02 2.00 1.05 H-8 1.01 H-2’ y H-6’ OH (C-5) 3.0 2.5 Figura 2-27 Espectro RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para HCc-10 2.0 1.5 1.0 0.5 18.7 77.9 74.0 73.9 73.1 72.5 72.3 71.6 65.5 106.8 103.6 100.5 95.5 117.3 123.5 132.7 180.3 RMN13C 136.7 77 166.0 164.2 161.9 159.4 159.0 Capítulo 2 C-6 C-4 DEPT 135 3' HO 7 C-1’ C-3 9 O 3 5 OH O OH C-2’ y C-6’ 5' 1' 1 C-10 C-3’ y C-5’ O C-6’’ OH O 1'' C-1’’ C-8 5'' 3'' OH OH 210 200 190 180 170 160 150 140 Figura 2-28 Espectro de RMN 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 (acetona d 6 , 100 MHz) de para HCc-10 Tabla 2-9 Constantes físicas y datos espectroscópicos para megislactona MCc-3 Nombre: 25' 26' 16' 5 18' 14' Estado físico OH 1' 12 O Fórmula molecular 2 34 1 O 5 megislactona MCc-3 Sólido blanco C 31 H 58 O 3 Peso molecular 478,4 g/mol Punto de fusión 51 – 53 °C (CHCl 3 ) Rotación óptica [α]20 : - 8,1°(c 0.5, CHCl 3 ) 𝐷 EM-IE: m/z (%) = 478 (90), 450 (53), 432 (20), 129 (43), 116 (10), 99 (20), 97 (25), 95 (30), 83 (50), 69 (80), 57 (100) IR: ν (cm-1) = 3420 (O-H), 2942 (C-H), 1757 (C=O), 1460 (C=C), 1377 (H-C-H), 1319 (H-C-H), 1195 (C-O) RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 5,34 (dt, J = 10,5, 4,6 Hz, 2H, H-17’ y H-18’), 4,63 (dq, J = 6,5, 4,6 Hz, 1H, H-4), 4,20 (d, J = 2,7 Hz, 1H, H-3), 2,53 (m, 1H, H-2), 2,01 (m, 4H, H-16’ y H-19’), 1,72 (m, 1H, H-1’a), 1,57 (m, 1H, H-1’b), 1,48 (m, 2H, H-2’), 1,40 (d, J = 6,5 Hz, 3H, H-5), 1,37 – 1,20 (m, 38H, H-3’ hasta H-15’ y H-20’ hasta H-25’), 0,87 (t, J = 6,7 Hz, 3H, H26’). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 177,6 (C-1), 129,9 (C-17’ y C-18’), 78,2 (C-4), 74,1 (C-3),.49,2 (C-2), 31,9 – 29,4 (C-3’ hasta C-15’ y C-20’ hasta C-25’), 29,3 (C-2’), 28,5 (C-1’), 27,3 (C-16’), 27,2 (C-19’), 14,1 (C-5), 13,9 (C-26’). Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Ming et al., 2002. 78 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 1.58 1.57 1.56 1.55 1.48 1.41 1.39 1.25 0.89 0.88 0.86 2.01 2.00 2.54 2.54 2.53 4.20 4.19 5.34 4.64 4.63 4.62 4.61 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 5.34 4.64 4.63 4.62 4.61 4.20 4.19 H-3’ hasta H-15’ y H-20´hasta H-25’ 25' H-17’ y H-18’ 26' 16' OH 14' 1' 18' 5 2 34 12 O 1.08 1.00 1.97 5.2 5.0 4.8 f1 (ppm) 5 O H-3 H-4 5.4 1 4.4 4.6 4.2 H-5 H-26’ H-16’ y H-19’ H-1b H-2 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 f1 (ppm) 3.5 3.0 2.5 2.0 3.24 2.09 3.33 38.22 1.26 4.21 1.13 1.08 1.00 1.97 7.5 H-1a 1.5 1.0 0.5 1 13 RMN C 25' 26' 16' 5 31.9 29.8 29.7 29.6 29.5 29.5 29.4 29.3 29.3 28.4 27.2 27.2 14.1 13.9 49.2 74.1 78.2 177.6 129.9 Figura 2-29 Espectro RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para MCc-3 OH 14' 1' 18' 2 34 12 1 O O C-3’ a C-15’ y C-20’ a C-25’ 5 C-2 C-1 DEPT 135 C-17’ y C-18’ C-26’ C-3 C-4 190 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-30 Espectro de RMN 110 13 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 30 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) de para MCc-3 20 10 Capítulo 2 79 Tabla 2-10 Datos espectroscópicos para la mezcla de los compuestos MCc-4 y MCc-5 HO 5' 5 OMe O 3' Nombre: O 2 OH O MCc-4 5' HO 2´,4´-dihidroxi-6´-metoxi-3,4metilenodioxidihidrochalcona (MCc-4) y 2´,4´-dihidroxi-6´-metoxi-3-hidroxi-4metoxidihidrochalcona (MCc-5) Estado físico 5 OMe OMe 3' C 17 H 16 O 6 y C 17 H 18 O 6 OH 2 OH O Fórmula molecular Sólido vino tinto Peso MCc-5 316,1 y 318,1 g/mol Datos para MCc-4 (desde la mezcla) = RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 13,90 (s, 1H, OH), 6,80 (sa, 1H, H-2), 6,75 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-5), 6,73 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-6), 6,04 (sa, 1H, H-5’), 5,96 (sa, 1H, H-3’), 5,94 (s, 2H, OCH 2 O), 3,89 (s, 3H, OCH 3 ), 3,27 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,88 (t, J = 7,5 Hz, 2H); RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 206,0 (C=O), 169,3 (C-6’), 166,6 (C-4’), 165,5 (C-2’), 149,5 (C-3), 147,6 (C-4), 137,6 (C-1), 123,0 (C-5), 110,7 (C-2), 109,8 (C-6), 106,8 (C-1’), 102,7 (OCH 2 O), 97,8 (C-3’), 92,9 (C-5’), 57,2 (OCH 3 ), 47,7 (CH 2 ), 32,1 (CH 2 ). Datos para MCc-5 (desde la mezcla) = RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 13,90 (s, 1H, OH), 6,80 (sa, 1H, H-2), 6,75 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-5), 6,73 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-6), 6,04 (sa, 1H, H-5’), 5,96 (sa, 1H, H-3’), 3,89 (s, 3H, OCH 3 ), 3,75 (s, 3H, OCH 3 ), 3,27 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,88 (t, J = 7,5 Hz, 2H); RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 206,0 (C=O), 169,3 (C-6’), 166,6 (C-4’), 165,5 (C-2’), 149,5 (C-3), 147,6 (C-4), 137,6 (C-1), 123,0 (C-5), 110,7 (C-2), 109,8 (C-6), 106,8 (C-1’), 97,8 (C3’), 92,9 (C-5’), 57,2 (OCH 3 ), 57,1 (OCH 3 ), 47,7 (CH 2 ), 32,1 (CH 2 ). Datos reportados en la literatura Martínez y Cuca, 1989; Kawanishi et al., 1990. HO 5' OMe OH O 5 O 3' O 2 MCc-4 HO 5' 5 OMe 3' OH 2 O OMe OH MCc-5 1 Figura 2-31 Espectro RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para la mezcla de MCc-4 y MCc-5. 80 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 5' HO 5 OMe O 3' O 2 OH O MCc-4 HO 5' 5 OMe OMe 3' OH OH 2 O MCc-5 Figura 2-32 Espectro RMN 13 C (acetona-d 6 , 100 MHz) para la mezcla de MCc-4 y MCc-5. Tabla 2-11 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3-(3’’,4’’metilenodioxifenil)propano MCc-6 Nombre: Estado físico HO 6' 4' 2' OH 4'' 6'' 1 O O 3 Fórmula molecular 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3-(3’’,4’’metilenodioxifenil)propano MCc-6 Sólido marrón-rojizo C 16 H 16 O 4 Peso molecular 272,1 g/mol Punto de fusión 99 – 100 °C 2'' IR: ν (cm-1) = 3305 (O-H), 2932 (C-H), 1605 (C=C), 1550 (C=C), 1495 (C=C),, 1464 (C=C), 1423 (H-C-H), 1205 (C-O), 1140 (C-O). RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 8,04 (sa, 4’-OH) , 7,95 (sa, 1H, 2’-OH), 6,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6’), 6,73 (d, J = 1,3 Hz, 1H, H-2’’), 6,72 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-5’’), 6,66 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-6’’), 6,38 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-3’), 6,27 (dd, J = 8,1, 2,2 Hz, 1H, H-5’), 5,92 (s, 2H,- O-CH 2 -O-), 2,58 – 2,52 (m, 4H, H-1 y H-3), 1,84 (m, 2H, H-2). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 158,3 (C-4’), 157,6 (C-2’), 149,5 (C-4’’), 147,4 (C-3’’), 138,5 (C-1’’), 132,2 (C-6’), 122,9 (C-6’’), 121,3 (C-1’), 110,5 (C-5’’), 109,7 (C-2’’), 108,2 (C-5’), 104,4 (C-3’), 102,6 (-O-CH 2 -O-), 37,0 (C-3), 34,0 (C-1), 30,8 (C-2). Datos descritos en la literatura: Salazar et al., 1988; Díaz y Díaz, 1986. 2.58 2.56 2.55 2.53 3.75 6.88 6.86 6.73 6.73 6.71 6.67 6.65 6.38 6.38 6.28 6.28 6.26 6.26 5.92 -O-CH2-O- HO 6.28 6.28 6.26 6.26 6.38 6.38 6.73 6.73 6.71 6.67 6.65 6.88 6.86 4'' 6'' 6' 4' 2' O O 1 3 2'' OH H-2’’ y H-5’’ H-6’ 1.84 81 8.04 7.95 Capítulo 2 H-3’ H-6’’ H-5’ 6.8 1.01 0.91 1.74 1.02 6.9 1.00 H-1 y H-3 6.7 6.6 6.5 f1 (ppm) 6.4 6.3 6.2 OH (C-4) OH (C-2’) 9.5 9.0 8.5 7.5 8.0 7.0 6.5 6.0 2.14 4.16 1.91 1.01 1.00 0.96 0.93 1.02 1.74 0.91 H-2 5.5 5.0 f1 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1 C-4’ y C-2’ 30.8 37.0 110.5 109.7 108.2 104.4 102.6 122.9 121.3 132.2 138.5 RMN13C 149.5 147.4 158.3 157.6 207.3 Figura 2-33 Espectro RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para MCc-6 C-1 C-1’ C-1’’ C-4’ C-3’ DEPT 135 HO 2' 4'' 6'' 6' 4' C-6’ C-6’’ O C-3’ O 1 3 2'' OH (-O-CH2-O-) C-3 210 200 190 180 170 160 150 140 Figura 2-34 Espectro RMN 130 13 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 C-2 30 C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para MCc-6. 20 10 82 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-12 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3-(2’’-metoxi4’’,5’’-metilenodioxifenil)propano MCc-7 1-(2’,4’-dihidroxifenil)-3-(2’’-metoxi-4’’,5’’metilenodioxifenil)propano MCc-7 Nombre: 3'' 5' HO MeO O O 3' 1 OH 6'' 3 Estado físico Aceite rojo Fórmula molecular C 17 H 18 O 5 Peso molecular 302,1 g/mol EM-IE: m/z (%) = 302 (43), 165 (100). IR: ν (cm-1) = 3325 (O-H), 2942 (C-H), 1605 (C=C), 1550 (C=C), 1495 (C=C),, 1464 (C=C), 1423 (H-C-H), 1235 (C-O), 1160 (C-O). RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 6,88 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-6’), δ 6,69 (s, 1H, H-6’’) y 6,61 (s, 1H, H-3’’), 6,37 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-3’), 6,27 (dd, J = 8,1; 2,4 Hz, 1H, H-5’), 5,88 (s, 2H, -OCH 2 O-), 3,75 (s, 3H, OCH 3 ), 2,55 (m, 4H, H-1 y H-3) y 1,79 (m, 2H, H-2). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 158,3 (C-2’), 157,6 (C-3’), 154,3 (C-2’’), 147,9 (C-4’’), 142,7 (C-5’’), 132,0 (C-6’), 125,0 (C-1’’), 121,6 (C-1’), 111,2 (C6’’), 108,2 (C-5’), 104,4 (C-3’), 102,7 (O-CH 2 -O), 96,6 (C-3’’), 57,7 (O-CH 3 ), 32,6 (C-3), 31,5 (C-1), 31,0 (C-2). 1.79 2.56 2.55 2.54 3.75 6.38 6.37 6.28 6.28 6.25 5.88 6.89 6.87 6.69 6.61 6.61 Datos descritos en la literatura: Braz Filho et al., 1973. 3'' 5' HO MeO O O 3' 6'' 6.38 6.37 6.28 6.28 6.26 6.25 6.69 6.61 6.61 3 6.89 6.87 OH 1 OCH3 (2’) H-6’’ H-3’’ H-3’ H-6’ H-5’ H-1 y H-3 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 1 4.0 f1 (ppm) H-2 3.5 3.0 2.5 2.06 4.05 3.01 1.91 0.98 0.96 1.00 0.97 0.91 OCH2O (4’’ y 6’’) 2.0 Figura 2-35 Espectro RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para MCc-7. 1.5 1.0 32.6 31.5 31.0 57.7 96.6 111.2 108.2 104.4 102.7 121.6 125.0 132.0 142.7 RMN13C 147.9 83 158.2 157.6 154.3 Capítulo 2 3'' 5' HO MeO O O 3' OH 1 6'' 3 C-2 C-1’’ C-2’’ C-4’’ C-5’’ C-3’ C-2’ C-1’ DEPT 135 O-CH3 C-6’ C-6’’ C-3’’ C-5’ O-CH2-O 210 200 190 180 170 160 150 140 Figura 2-36 Espectro RMN 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 13 C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para MCc-7. Tabla 2-13 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cinchonaina Ic MCc-8 HO Nombre: OH 3'' 5'' HO 1'' Estado físico 7 7'' 9'' O Fórmula molecular 9 O 5 10 5' O 1 3 OH 1' OH 3' OH cinchonaina Ic MCc-8 Sólido crema C 24 H 20 O 9 Peso molecular 452,1 g/mol Punto de fusión > 280 °C (MeOH) Rotación óptica [α]20 : - 23,1 (c 0.5, MeOH) 𝐷 IR: ν (cm-1) = 3300 (O-H), 2912 (C-H), 1733 (C=O), 1600 (C=C), 1433 (C=C), 1360 (H-C-H), 1109 (C-O) cm-1. RMN 1H (400 MHz, CD 3 OD): δ 7,00 (dd, J = 1,5, 9,0 Hz, 1H, H-6’’) , 6,77 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-2’’), 6,76 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5’’), 6,61 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5’), 6,53 (d, J = 2,1 Hz, 1H, H-2’), 6,45 (dd, J = 8,1, 2,1 Hz, 1H, H-6’), 6,21 (s, 1H, H8), 4,84 (sa, 1H, H-2), 4,54 (da, J = 7,2 Hz, 1H, H-7’’), 4,25 (m, 1H, H-3), 3,06 (dd, J = 15,7, 7,2 Hz, 1H, H-8’’a), 2,87 (m, 3H, H-8’’b y H-4). RMN 13C (100 MHz, CD 3 OD): δ 170,9 (C-9’’), 157,1 (C-7), 153,4 (C-9), 152,0 (C-5), 146,3 (C-3’), 145,8 (C-4’), 145,7 (C3’’), 145,1 (C-4’’),135,3 (C-1’’), 131,7 (C-1’), 119,4 (C-6’’), 119,3 (C-6’), 116,6 (C-2’’), 116,0 (C-5’), 115,3 (C-5’’), 115,0 (C2’), 106,2 (C-6), 105,2 (C-10), 96,5 (C-8), 80,1 (C-2), 66,9 (C-3), 38,6 (C-8’’), 35,4 (C-7’’), 29,5 (C-4). Datos descritos en la literatura: Nonaka y Nishioka, 1982. 84 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia HO H-2’’ y H-5’’ 3.08 3.07 3.04 3.03 2.87 3.31 4.25 4.24 4.84 6.53 6.53 6.62 6.60 6.78 6.77 6.77 6.46 6.46 6.44 6.44 6.98 6.97 6.78 6.77 6.77 6.62 6.60 6.53 6.53 6.46 6.46 6.44 6.44 6.21 6.98 6.97 4.55 4.54 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. OH 3'' 5'' H-5’ HO H-2’ H-6’ 1'' 7 9 H-6’ 7'' 7.0 6.9 6.7 f1 (ppm) 6.8 6.6 1.02 0.99 1.18 1.76 1.04 9'' 6.5 O 5 10 5' O 1 O OH 1' 3 3' OH OH 6.4 H-8 H-8’’b y H-4 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) H-3 4.0 3.5 2.48 1.10 1.10 H-8’’a 1.10 1.01 6.5 1.64 7.0 0.98 1.76 1.18 0.99 1.02 7.5 8.0 1.04 H-7’’ 3.0 2.5 2.0 1.5 1 29.5 35.4 38.6 66.6 79.7 96.3 106.1 105.3 119.3 119.2 116.5 116.0 115.1 115.1 132.0 135.4 146.3 146.0 145.8 145.1 157.3 153.4 152.1 170.8 Figura 2-37 Espectro RMN H (CD 3 OD, 400 MHz) para MCc-8 RMN13C C-6’’ y C-6’ C-9’’ C-6 C-1’’ C-1’ C-7 DEPT 135 HO C-10 OH 3'' 5'' HO 1'' 7 9 7'' 9'' O 5 O 10 5' O 1 OH C-8 OH 1' 3 3' C-2 C-7’’ C-3 OH C-8’’ 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-38 Espectro RMN 110 13 100 90 f1 (ppm) 80 70 60 50 40 C-4 30 C y DEPT 135 (CD 3 OD, 100 MHz) para MCc-8. 20 10 Capítulo 2 85 Tabla 2-14 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cinchonaina Id MCc-9 HO 5'' HO 1'' Estado físico 7 O Sólido marrón Fórmula molecular 9 7'' 9'' cinchonaina Id MCc-9 Nombre: OH 3'' 10 5 5' O Peso molecular 1 O OH 1' 3 3' OH C 24 H 20 O 9 OH 452,1 g/mol Punto de fusión 178-180 °C (MeOH) [α]20 : 𝐷 Rotación óptica + 27,3 (c 0.50, MeOH) IR: ν (cm-1) = 3400 (O-H), 2942 (C-H), 1748 (C=O), 1605 (C=C), 1464 (C=C), 1380 (H-C-H), 1110 (C-O) cm-1. RMN 1H (400 MHz, CD 3 OD): δ 6,82 (sa, 1H, H-2’’) , 6,70 (m, 2H, H-5’ y H-5’’), 6,62 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-2’), 6,60 (da, J = 8,2 Hz, 1H, H-6’’), 6,53 (dd, J = 8,2, 1,8 Hz, 1H, H-6’), 6,23 (s, 1H, H-8), 4,81 (sa, 1H, H-2), 4,42 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H-7’’), 4,17 (m, 1H, H-3), 2,87 (m, 4H, H-4,H-8’’). RMN 13C (100 MHz, CD 3 OD): δ 170,8 (C-9’’), 157,3 (C-7), 153,4 (C-9), 152,1 (C-5), 146,3 (C-3’), 146,0 (C-4’), 145,8 (C3’’), 145,1 (C-4’’),135,4 (C-1’’), 132,0 (C-1’), 119,3 (C-6’’), 119,2 (C-6’), 116,5 (C-2’’), 116,1 (C-5’), 115,1 (C-5’’), 115,1 (C2’), 106,1 (C-6), 105,3 (C-10), 96,3 (C-8), 79,7 (C-2), 66,6 (C-3), 38,2 (C-8’’), 35,1 (C-7’’), 29,2 (C-4). 2.90 2.85 3.31 4.17 4.43 4.42 6.54 6.54 6.52 6.52 6.63 6.62 6.61 6.71 6.70 6.69 6.68 6.82 6.82 6.71 6.70 6.69 6.68 6.63 6.62 6.61 6.54 6.54 6.52 6.52 6.23 Datos descritos en la literatura: Nonaka y Nishioka, 1982. HO OH 3'' H-5’ y H-5’’ H-2’’ 5'' HO H-2’ 1'' H-6’’ H-6’ 6.75 6.70 6.65 f1 (ppm) 6.60 6.55 O 5 10 5' O 1 OH 1' 3 O 1.16 2.24 2.30 1.20 6.80 9 7'' 9'' 6.85 7 3' OH OH 6.50 H-8 H-4 y H-8 H-3 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) 1 4.0 3.5 4.96 1.17 1.38 1.30 1.70 1.00 1.20 2.30 2.24 1.16 H-7’’ 3.0 2.5 Figura 2-39 Espectro RMN H (CD 3 OD, 400 MHz) para MCc-9 2.0 1.5 1.0 86 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 29.2 35.1 38.2 66.9 80.1 96.5 106.1 105.2 119.4 119.3 116.6 116.0 115.3 115.0 131.7 135.3 157.1 153.4 153.4 152.0 151.9 146.3 145.8 145.7 145.1 170.9 170.9 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. RMN13C C-6’’ y C-6’ C-9’’ DEPT 135 C-7 HO C-6 C-10 C-1’’ C-1’ OH 3'' 5'' HO 1'' 7 9 7'' 9'' O 5 O 10 OH C-2 C-7’’ C-3 OH 1' 3 C-8 5' O 1 3' OH C-4 C-8’’ 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-40 Espectro RMN 110 100 90 f1 (ppm) 80 70 60 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 (CD 3 OD, 100 MHz) para MCc-9. 2.2.3 Estudio fitoquímico de la corteza de Z. rigidum La purificación por técnicas cromatográficas de las fracciones obtenidas a partir del extracto etanólico de la corteza de Z. rigidum condujo al aislamiento e identificación de catorce compuestos (Figura 2.41), entre los que se encuentran tres alcaloides (flindersina Zr-6, γ-fagarina Zr-8 y skimnianina Zr-9), cuatro lignanos (savinina Zr-4, 2,3-di(3',4'metilenodioxIbencil)-2-buten-4-olido Zr-5, (+)-dimetilmatairresinol Zr-7 y (+)-siringaresinol Zr-10), una cumarina (umbeliferona Zr-12), tres triterpenos (lupeol Zr-1, lupenona Zr-2 y Betulina Zr-3), un monoglicérido (monopalmitato de glicerilo Zr-13) y dos derivados de ácido (cafeato de etilo Zr-11 y ácido (-)-rigidunoico Zr-14). Capítulo 2 87 OH O HO HO Zr-2 Zr-1 Zr-3 O O O O O O Zr-4 O O O O O O + O Zr-5 O O N H O O O Zr-7 Zr-6 O O O O O OH O O O N N H O O O O O H O OH Zr-9 O O HO O OH (CH2)14 OH HO O OH Zr-12 Zr-11 Zr-10 O O O HO HO Zr-8 HO O O OH O Zr-13 Zr-14 OH OH Figura 2-41 Compuestos aislados de la corteza de Z. rigidum De los metabolitos aislados e identificados en la corteza de Z. rigidum, solo el triterpeno lupeol Zr-1 ha sido previamente reportado en la corteza de la raíz de esta especie (Moccelini et al, 2009), siendo este el primer reporte de la presencia de los otros 13 compuestos en Z. rigidum. De acuerdo con el estudio fitoquímico realizado en la corteza, se concluye que todos los tipos de metabolitos encontrados en ésta han sido previamente reportados en especies de la familia Rutaceae, incluyendo el género Zanthoxylum, excepto el compuesto denominado ácido (-)-rigidunoico Zr-14 que no presenta reportes previos en la literatura, estando así estos resultados de acuerdo con la quimiotaxonomía de la familia y del género (Grycová et al., 2007; Adesina, 2005; Krane, et al., 1984; Waterman y Grundon, 1983). 88 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Es importante resaltar que de acuerdo a los metabolitos encontrados en la corteza de Z. rigidum se puede concluir que esta especie biosintetiza principalmente alcaloides derivados del ácido antranílico, como lo son los alcaloides quinolinicos e isoquinolonicos encontrados en este estudio, a diferencia de especies como Z. quinduense (Patiño y Cuca, 2010a; Patiño y Cuca, 2010b), Z. nitudum (Geng et al., 2009; Yang et al., 2008; Hu et al., 2007) y Z. rhoifolium (de Moura et al., 1997), entre otras, que se sintetizan principalmente alcaloides bencilisoquinolínicos, biosintetizados a partir del aminoácido tirosina. Las estructuras de los compuestos Zr-1 a Zr-14 fueron determinadas mediante análisis espectroscópico, por comparación con los datos descritos en la literatura y/o por cocromatografía en CCD con muestras auténticas. A continuación se describe la elucidación estructural del ácido (-)-rigidunoico Zr-14. Los datos espectroscópicos de los demás compuestos aislados de Z. rigidum se presentan de manera resumida en las Tablas 2.15 a 2.23 , acompañados de los espectros de RMN 1H y RMN 13 C de cada sustancia, que se presentan en las Figuras 2.51 a 2.66. Elucidación estructural del compuesto Zr-14. El compuesto Zr-14 es un sólido amorfo de color amarillo-verdoso que se descompone a 250°C antes de fundir (CH 3 OH) y da prueba positiva con cloruro férrico, indicando así la posible presencia de hidroxilos fenólicos en su estructura. Su espectro IR se caracteriza por presentar señales indicativas de grupos hidroxilo (en 3415 cm-1, banda ancha de estiramiento O-H y en 1279, 1231 cm-1 señales por tensión C-O), de grupos carbonílicos (señales intensas en 1660 y 1645 cm-1, características de estiramientos C=O), de grupos alifáticos (señales en 2919, 2851 cm-1 por tensiones C-H y en 1450, 1355 cm-1 por flexiones en el plano H-C-H) y de aromáticos (señales en 1600, 1498 y 1462 cm-1 debidas a las tensiones C=C en aromáticos). Su espectro de RMN 1H (Figura 2.42) presenta señales que integran para un total de 12 protones, entre las que se destacan las señales para un anillo aromático trisustituido en δ 6,76 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,87 (da, J = 8,0 Hz, 1H) y 7,00 (sa, 1H) que indican la presencia de dos hidrógenos en posición orto y uno en posición meta respecto a uno de ellos. 2.09 3.81 3.81 3.79 3.78 4.26 4.25 5.33 5.32 5.30 5.29 5.28 5.26 6.25 6.21 7.00 6.88 6.86 6.77 6.75 89 7.49 7.45 Capítulo 2 OH 7' 9' O 6' 1' 8' 6.25 6.21 H-5’ 1 6 7 OH O 3.81 3.81 3.79 3.78 OH 4.26 4.25 OH 5.33 5.32 5.30 5.29 5.28 5.26 6.88 6.86 6.77 6.75 7.00 7.49 7.45 H-2’ 5 O 3' H-7’ 2 3 4 4' 2' OH HO 5' H-8’ H-6’ H-5 H-4 H-3 7.5 7.3 7.1 6.9 6.7 f1 (ppm) 6.5 6.3 5.4 5.2 5.0 4.8 4.4 4.6 f1 (ppm) 4.2 4.0 3.8 8.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) 4.0 4.81 1.14 1.06 7.0 1.14 7.5 0.94 1.06 1.06 0.96 8.5 1.00 H-2 y H-6 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1 Figura 2-42 Espectro RMN H para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 400 MHz). También en el espectro se destacan las señales en δ 6,23 (d, J = 15,9 Hz, 1H) y 7,48 (d, J = 15,9 Hz, 1H) que por su multiplicidad y desplazamiento corresponden a los protones en posición trans sobre un doble enlace, y dada la diferencia entre los desplazamientos de estas dos señales sugieren la presencia de un fragmento de carbonilo α,β-insaturado siendo estos hidrógenos los ubicados sobre los carbonos en posiciones α y β, respectivamente. Se observan también señales en la región alifática del espectro en: δ 5,30 (dt, J = 10,9; 10,9; 4,9 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 3,80 (dd, J = 9,6; 2,7 Hz, 1H) y 2,09 (m, 4H), donde por su desplazamiento las tres primeras corresponden a hidrógenos ubicados sobre carbonos alifáticos oxigenados y cuyas señales en general sugieren la presencia de un fragmento de ácido quínico en la molécula (Eliel and Bello, 1997). El espectro COSY 1H-1H (Figura 2.43) permitió determinar las correlaciones escalares existentes entre los protones sobre carbonos vecinos, lo que permitió corroborar la presencia de un anillo aromático trisustituido y de un fragmentó de ácido 0.0 90 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. quínico en la molécula. En la Figura 2.43 se ilustran las correlaciones existentes entre las señales de hidrógeno que permitieron corroborar la presencia de ácido quínico en la molécula, observándose la correlación del protón en δ H 3,80 (dd, J = 9,6; 2,7 Hz, 1H) con las señales de los protones en δ H 5,30 (dt, J = 10,9; 10,9; 4,9 Hz, 1H) y 4,26 (d, J = 2,3 Hz, 1H), las cuales correlacionan con la señal de los grupos metilenos centrada en δ H 2,11 (m, 4H). 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 5.0 5.5 6.0 6.5 H HO 7.5 7.0 6.5 6.0 1 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 H 7.0 H OH 7.5 8.0 OH 3.5 8.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1 Figura 2-43 Espectro COSY H- H para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 400 MHz). Del análisis de los espectros RMN 13C y DEPT 135 (Figura 2.44), se observan en total 16 señales de carbonos para el compuesto Zr-14 de las cuales dos corresponden a carbonos tipo metileno con δ C 38,0 (CH 2 ) y 39,7 (CH 2 ), que por sus desplazamientos sugieren que se encuentran cercanos a heteroátomos; ocho señales son debidas a carbonos tipo metino con δ C 71,9 (CH), 72,4 (CH), 74,0 (CH), 115,3 (CH), 115,7 (CH), 116,8 (CH), 123,4 (CH) y 147,2 (CH), que de acuerdo a sus desplazamientos las tres primeras corresponden a carbonos alifáticos oxigenados y las restantes corresponden a f1 (ppm) 4.5 Capítulo 2 91 carbonos olefínicos y/o aromáticos; seis corresponden a carbonos cuaternarios con δ C 79,1 (C), 127,7 (C), 145,7 (C), 148,5 (C), 169,7 (C) y 180,8 (C), siendo las dos últimas OH 7' 9' O 5' 8' 3 4 4' 2' O 3' OH C-9’ OH HO 6' 1' 39.7 38.0 79.1 74.0 72.4 71.9 116.8 115.7 115.3 127.7 123.4 148.5 147.2 145.7 RMN13C 169.7 180.8 señales características de carbonos carbonílicos de tipo ácido. 2 5 1 6 7 OH O OH C-3’ C-1’ C-4’ C-8’ C-7 C-1 6C DEPT 135 C-7’ C-6’ C-5’ C-5 C-4 C-2’ C-3 8 CH 2 CH2 C-6 C-2 190 180 170 160 150 140 Figura 2-44 Espectro RMN 130 120 110 100 90 f1 (ppm) 80 70 60 50 40 30 20 10 13 C y DEPT 135 del compuesto Zr-14 (CD 3 OD-D 2 O, 100 MHz) Las señales con δ C 38,0 (CH 2 ), 39,7 (CH 2 ), 71,9 (CH), 72,4 (CH), 74,0 (CH), 79,1 (C) y 180,8 (C), son consistentes con el fragmento de ácido quínico, el cual se caracteriza por la presencia de un ciclo de seis átomos de carbono con un carbono carboxílico y cuatro carbonos alifáticos oxigenados. Las señales con δ C 115,3 (CH), 115,7 (CH), 116,8 (CH), 123,4 (CH), 127,7 (C), 145,7 (C), 147,2 (CH), 148,5 (C) y 169,7 (C), son consistentes con lo analizado en RMN 1H y sugieren la presencia de un fragmento similar al del ácido caféico (Sun et al., 2006), que se caracteriza por la presencia de un anillo aromático trisustituido con dos sustituyentes oxigenados y otro correspondiente a una cadena insaturada de tres átomos de carbono con un grupo carboxilo. 0 92 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Con el espectro HMQC (Figura 2.45) se estableció la conectividad de cada hidrógeno con el carbono al que está unido, por ejemplo en el espectro se observan las conectividades del protón en δ H 7,48 (d, J = 15,9 Hz, 1H) con el carbono en δ C 147,2 (CH), del protón en δ H 5,30 (dt, J = 10,9; 10,9; 4,9 Hz, 1H) con el carbono en δ C 71,9 (CH) y de los protones en δ H 2,11 (m, 4H) con los carbonos en δ C 38,0 (CH 2 ) y 39,7 (CH 2 ). Las correlaciones observadas en el espectro de HMQC se ilustran en la Figura 2.45. 30 40 50 60 70 90 100 OH H HO H O H H OH H O OH OH 110 OH H O 120 130 140 150 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 Figura 2-45 Espectro HMQC para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 400 MHz). Mediante el experimento HMBC (Figura 2.46) se realizó la ubicación de los sustituyentes, la confirmación de los fragmentos propuestos y la asignación de los carbonos cuaternarios. De este modo, por ejemplo, se confirmó la presencia de los fragmentos de ácido caféico y de ácido quínico que por las correlaciones observadas a tres enlaces entre los protones del anillo aromático con δ H 6,87 (da, J = 8,0 Hz, 1H) y 7,00 (sa, 1H) con el carbono aromático en δ C 148,5 (C), y el cual a su vez correlaciona con el hidrógeno en δ H 3,80 (dd, J = 9,6; 2,7 Hz, 1H) del fragmento de ácido quínico, f1 (ppm) 80 Capítulo 2 93 permitieron unir el fragmento de ácido quínico por la posición 4 al hidroxilo ubicado en la posición 4’ del ácido caféico. Algunas correlaciones observadas en el espectro de HMBC se ilustran en la Figuras 2.46 y 2.47. 40 50 60 70 80 90 110 120 130 140 150 160 170 180 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Figura 2-46 Espectro HMBC para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 400 MHz). OH H H OH OH O OH H H O OH H O OH Figura 2-47 Principales correlaciones HMBC para el compuesto Zr-14 La estereoquímica de los carbonos C-4, C-5 y C-3 fue establecida por el experimento NOESY (Figura 2.48). En el espectro se observa correlación entre los hidrógenos H-4 y f1 (ppm) 100 94 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. H-5 (δ 3,80 (dd, J = 9,6; 2,7 Hz, 1H) y 4,26 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-5)), pero no fue observada correlación de estos hidrógenos con H-3 (δ 5,30 (dt, J = 10,9; 10,9; 4,9 Hz, 1H)). De acuerdo a lo observado en NOESY, a las multiplicidades y constantes de acoplamiento observadas entre H-4 y H-5, se puede establecer que estos hidrógenos están en posiciones ecuatoriales; por lo tanto H-3 está en posición trans respecto a H-4 y H-5. 2.0 O 2.5 HO OH 3.0 3.5 H O H 4.0 H H HO 4.5 H OH 5.0 H OH HO f1 (ppm) H 5.5 O 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 f2 (ppm) 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 Figura 2-48 Espectro NOESY para el compuesto Zr-14 (CD 3 OD:D 2 O, 300 MHz). Por análisis de EMAR la fórmula molecular fue establecida como C 16 H 17 O 9 (m/z 353,0890 [M-H]-, calculado para C 16 H 17 O 9 , 353,0873) y es consistente con el resultado del análisis espectroscópico realizado. En el espectro de masas obtenido (Figura 2.49) además de observarse el ión molecular, se observa el ión con m/z 191,0563 [M-163]originado por la pérdida de la unidad de ácido caféico. El análisis realizado por EMAR confirma la estructura propuesta para el compuesto Zr-14. Capítulo 2 95 Intens. x105 -MS, 1.54min #92 353.0890 3 2 1 191.0563 421.0633 341.0878 0 150 200 250 300 350 400 450 m/z Figura 2-49 Espectro de masas de alta resolución obtenido por ESI en modo negativo para el compuesto Zr-14. Teniendo en cuenta que los centros quirales presentes en la molécula del compuesto Zr14 provienen del residuo de ácido quinico, se decidió determinar la rotación óptica de este compuesto con el objetivo de comparar el signo de la rotación obtenido con los reportados para el ácido quínico y derivados para de este modo establecer la estereoquímica de todos los centros quirales del compuesto Zr-14. La rotación óptica determinada fue [α]20 – 33,6 (c 1.0, MeOH), y por comparación con los signos reportados 𝐷 R para el ácido quínico y derivados (Jung et al., 2011; Jassbi, 2003; Dürüst et al., 2001), permitió la identificación del compuesto Zr-14 como ácido (1s n ,3R,4s n ,5R)-4-{4-[(E)-2carboxietenil]-2-hidroxifenoxi}-1,3,5-trihidroxiciclohexanocarboxílico denominado ácido (-)-rigidunoico y para el que no se han encontrado reportes en la literatura (Figura 2.50). OH OH HO O OH O OH O OH Figura 2-50 Estructura del ácido (-)-rigidunoico Zr-14 En la familia Rutaceae se encuentran ampliamente distribuidos compuestos de tipo fenilpropano, al igual que en diferentes especies del género Zanthoxylum, aunque no es común encontrar fenilpropanos unidos a derivados del ácido shikimico, similares a Zr-14 (Braga et al., 2012; Chen et al., 2012; Ito et al., 2000; Adesina et al., 1998). Teniendo en cuenta la estructura y de acuerdo a los metabolitos aislados en este trabajo se puede 96 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. deducir que Zr-14 es originado por los precursores ácido caféico y ácido quínico, sustancias que se unen posiblemente por un mecanismo biosintético similar al que se lleva a cabo cuando se produce la O-glicosilación. Estos dos precursores mencionados, también participan en la biosíntesis de metabolitos secundarios como: lignanos, cumarinas y alcaloides quinolínicos (Dewick, 2009), sustancias que también fueron aisladas de la corteza de Z. rigidum. DATOS ESPETROSCÓPICOS COMPUESTOS CONOCIDOS AISLADOS DE CORTEZA DE Z. rigidum Tabla 2-15 Datos espectroscópicos para la mezcla de lignanos savinina Zr-4 e isosavinina Zr-5 7 O 7 9 3 1 O 9´ 5 1´ 1 O O 7´ O 9 3 9´ 5 1´ Zr-4 O O 7´ 5´ O O Estado físico Sólido verde O 3´ Zr-5 Savinina Zr-4 y 2,3-di(3',4'metilenodioxIbencil)-2-buten-4-olido Zr-5 O O 3´ 5´ Nombre: Fórmula molecular Peso C 20 H 16 O 6 y C 20 H 18 O 6 352,3 y 354,4 g/mol Datos para Zr-4 (desde la mezcla) = RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 7,49 (sa, 1H, H-7’), 7,07 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-6’), 7,03 (sa, 1H, H-2’), 6,87 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-5’), 6,72 (d, J = 7,91 Hz, 1H, H-5), 6,66 (sa, 1H, H-2), 6,63 (d, J = 7,91 Hz, 1H, H6), 6,04 (s, 2H, 3’-4’-OCH 2 O), 5,93 (d, J = 2,1 Hz, 2H, 3-4-OCH 2 O), 4,24 (m, 2H, H-9), 3.73 (sa, 1H, H-8), 2,98 (dd, J = 4,4, 14,2 Hz, 1H, H-7a), 2,58 (dd, J = 10,1, 14,2 Hz, 1H, H-7b); RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 172,4 (C-9’), 149.1 (C-3), 148,3 (C-3’), 147,9 (C-4), 146,5 (C-4’), 137,2 (C-7’), 131,4 (C-1), 128,1 (C-1’), 126,0 (C-6), 125,8 (C-8’), 122,0 (C-6’), 109.1 (C-5), 108,7 (C-5’), 108,6 (C-2), 108,4 (C-2’), 101,6 (OCH 2 O), 101,0 (OCH 2 O), 69,5 (C-9), 39,8 (C-7), 34,1 (C-8). Datos para Zr-5 (desde la mezcla): RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 174,6 (C-9´), 159,7 (C-8),148,1 (C-5), 147.8 (C-5´), 146.8 (C-4), 146.2 (C-4´), 131.6 (C-1), 129,3 (C-1´), 126,7 (C-8’),121.5 (C-6), 121,4 (C-6´), 109.0 (C-2), 108.8 (C-2´), 108.6 (C-7), 108.3 (C-7´), 101.1 (OCH 2 O), 100,9 (OCH 2 O), 71.1 (C-9), 33,2 (C-7), 29,2 (C-7´). Datos reportados en la literatura para Zr-4: Shieh et al., 1990 y para Zr-5: Almtorp et al., 1991. 6.66 6.64 6.62 1´ 7´ 1´ O 3´ 5´ O O O 3.00 2.99 2.97 2.96 O 3.60 3.61 0.95 1.93 9´ 5 O 5´ H-6 H-6´ 7´ O O 3´ H-2 H-5 H-5´ 1 9´ 5 9 3 O O O H-2´ 7 9 1 2 OCH2O 2.61 2.58 2.57 2.55 6.74 6.72 6.88 6.86 7.08 7.06 7.03 7 3 O OCH2O (3’-4’) 3.00 2.99 2.97 2.96 2.61 2.58 2.57 2.55 3.60 4.25 7.08 7.06 7.03 6.88 6.86 6.74 6.72 6.66 6.64 6.03 5.93 5.92 97 7.49 7.48 Capítulo 2 H-7b H-7a H-9 9.0 8.5 8.0 6.5 6.0 5.5 f1 (ppm) 5.0 4.5 3.5 1.00 1.00 0.97 4.0 0.95 0.33 7.0 1.95 7.5 1.92 2.61 1.98 1.00 3.64 9.5 0.98 0.33 H-7´ 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 1 RMN13C 7 O 39.8 37.5 69.4 109.1 108.7 108.6 108.4 101.7 101.0 131.4 128.1 126.0 125.8 122.0 137.2 172.4 149.1 148.3 147.9 146.5 Figura 2-51 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) de la mezcla de Zr-4 y Zr-5. 9 3 7 O 1 O 1 9´ 5 1´ 7´ 9 3 O O O 9´ 5 O 1´ 7´ 3´ 5´ O 3´ 5´ O O O O C-9’ C-9’ C-8 DEPT 135 C-8 C-6’ C-7’ C-9 C-7’ OCH2O C-9 170 160 150 140 130 Figura 2-52 Espectro de RMN 120 13 110 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 30 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) de la mezcla de Zr-4 y Zr-5. 98 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-16 Datos espectroscópicos y constantes físicas para flindersina Zr-6 Nombre: 4' 5' 5 Estado físico 4 1' 2 7 N H 8 Solido amarillo pálido 2' O 3' 6 Flindersina Zr-6 Fórmula molecular C 14 H 13 NO 2 Peso molecular 227,1 g/mol Punto de fusión 183 – 185 °C (CHCl 3 ) O EM-IE: m/z (%) = 227 (67), 212 (100), 198 (20), 183(18). IR: ν (cm-1) = 3050 (N-H), 1720 (C=O), 1650 (C=C), 1590 (C=C), 1270 (C-O), 1115 (C-O) RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 7,88 (dd, J = 8,0 y 1,0 Hz, 1H, H-8), 7,46 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-7), 7,37 (d, J = 8,1 Hz, H-5), 7,18 (t, J = 7,5 Hz, H-6), 6,77 (d, J = 10,0 Hz,1H, H-1’), 5,55 (d, J = 10,0 Hz, 1H, H-2'), 1,53 (s, 6H, H-4' y H-5') RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 162,6 (C-2). 157,7 (C-4), 137,9 (C-8a), 130,8 (C-7), 126,1 (C-1'), 122,4 (C-5), 122,1 (C-6), 117,1 (C-2'), 116,1 (C-8), 115,2 (C-3), 105,7 (C-4a), 79,1 (C-3'), 28,3 (C-4', 5'). 1.53 5.56 5.54 H-4’ y H-5’ 6.78 6.76 7.20 7.18 7.16 7.48 7.47 7.45 7.39 7.37 7.47 7.45 7.39 7.20 7.18 7.16 6.78 6.76 7.88 7.88 7.86 7.86 7.88 7.88 7.86 7.86 Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Cuca et al., 1998. 4' 5' O H-8 H-6 H-7 5 H-5 6 H-1’ 7.8 7.7 7.6 7.4 7.3 7.2 f1 (ppm) 7.5 1.00 1.05 0.98 1.20 1.12 8 7.9 7.1 7.0 6.9 6.8 2' 1' 2 7 8.0 3' 4 N H O 6.7 8.5 8.0 7.5 7.0 6.04 1.07 1.00 1.11 0.98 1.05 1.20 H-2’ 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) 1 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 Figura 2-53 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-6. 1.5 1.0 0.5 28.3 79.0 130.8 137.9 RMN13C 117.1 116.1 115.2 99 126.1 122.4 122.1 Capítulo 2 4' 5' O 5 4 6 1' 2 7 C-3’ C-4’ y C-5’ 2' 3' N H 8 O C-1’ C-3 C-8a C-4a C-4 DEPT 135 C-5 y C-6 C-7 C-2’ C-8 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 Figura 2-54 Espectro de RMN 95 90 85 80 f1 (ppm) 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-6. Tabla 2-17 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-dimetilmatairesinol Zr-7 O 7 9 3 1 O Nombre: O 9´ 5 1´ 7´ O 3´ 5´ O O Estado físico Fórmula molecular (+)-dimetilmatairesinol Zr-7 Aceite incoloro C 22 H 26 O 6 Peso molecular 386,4 g/mol Rotación óptica [α]20 : + 20,1 (c 1.0, CHCl 3 ) 𝐷 IR: ν = 3030 (=C-H), 2935 (C-H), 1740 (C=O), 1608 (C=C), 1512 (C=C), 1480 (C=C), 1251 (C-O), 1190 (C-O) cm-1. RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 6,66 (m, 6H), 4,11 (sa, 1H, H-9a), 3,84 (sa, 13H, H-9b; 4OCH 3 ), 2,93 (sa, 2H, H-7’), 2,54 (m, 4H, H-7; H-8; H-8’). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 178,6 (C-9’), 148,9 (C-3; C-3’), 147,8 (C-4; C-4’), 130,4 (C-1), 130,1 (C-1’), 121,3 (C-6’), 120,5 (C-6), 112,3 (C-2’), 111,7 (C-2), 111,2 (C-5’), 111,0 (C-5), 71,2 (C-9), 55,8 (OCH 3 ), 46,5 (C-8’), 41,0 (C-8), 38,1 (C7’), 34,4 (C-7). Datos espectroscópicos descritos en la literatura Arimotto et al., 1996; Gomes Heleno et al., 2006. 100 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 7 O 1 O 9´ 5 2.58 2.49 9 3 O 2.93 3.84 3.82 6.75 6.67 6.55 6.47 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 1´ 7´ OCH3 O 3´ 5´ O O H aromáticos H-7’ H-7; H-8 y H-8’ 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) 4.0 3.5 4.51 2.06 0.94 5.91 8.0 13.92 H-9a 3.0 2.5 1.5 2.0 1 41.0 38.1 34.4 46.5 55.8 71.2 112.3 111.7 111.2 111.0 121.3 120.5 130.4 130.1 148.9 147.8 147.8 178.6 Figura 2-55 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-7. RMN13C O 7 9 3 1 O O 9´ 5 1´ 7´ C-9’ O C-1 C-1’ 3´ 5´ O O DEPT 135 OCH3 C-6 C-6’ C-7’ C-9 190 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-56 Espectro de RMN 110 100 f1 (ppm) 13 90 80 70 60 50 40 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-7. C-7 30 1.0 Capítulo 2 101 Tabla 2-18 Datos espectroscópicos y constantes físicas para γ-fagarina Zr-8 3 11 Estado físico 5 10 7 12 N Sólido amorfo de color amarillo pálido. 6 2 O γ-fagarina Zr-8 Nombre: O 9 8 O Formula molecular C 13 H 11 NO 3 Peso molecular 229,2 g/mol Punto de fusión 140-141°C (CHCl 3 ) EM-IE: m/z (%) = 229 (96), 228 (58), 214 (100), 200 (43), 199 (10). IR: ν (cm-1) = 1640 (C=N), 1568 (C=C), 1500 (C=C), 1256 (C-O), 1090 (C-O) RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 7,84 (dd, J = 8,6; 1,0 Hz, 1H, H-5), 7,64 (d, J=2,8 Hz, 1H, H-2), 7,35 (t, J=8,1 Hz, 1H, H-6), 7,08 (d, J=2,8 Hz, 1H, H-3), 7,06 (d, J= 7,7 Hz, 1H, H-7), 4,44 (s, 3H, 4-OCH 3 ), 4,08 (s, 3H, 8-OCH 3 ) RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 163,3 (C-12), 156,9 (C-4), 154,6 (C-8), 143,9 (C-2), 137,6 (C-9), 123,5 (C-6), 119,7 (C11), 114,1 (C-5), 107,7 (C-7), 104,6 (C-3), 103,9 (C-10), 59,0 (4-OCH 3 ), 56,0 (8-OCH 3 ). 4.08 4.44 7.86 7.85 7.83 7.83 7.65 7.64 7.37 7.36 7.33 7.08 7.07 7.07 7.05 Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Cuca et al., 1998; Ito et al., 1998. 7.08 7.07 7.07 7.05 7.37 7.36 7.33 7.65 7.64 7.86 7.85 7.83 7.83 OCH3 (4) O 3 OCH3 (8) 11 10 5 6 2 H-2 N 9 8 O 7.7 7.6 7.4 7.5 f1 (ppm) 2.11 1.03 0.97 H-7 1.00 7.8 7 12 H-6 H-5 7.9 O H-3 7.2 7.3 7.1 7.0 H-3 H-2 H-6 H-5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 f1 (ppm) 1 5.0 4.5 3.11 3.07 2.11 1.03 0.97 1.00 H-7 4.0 3.5 3.0 2.5 Figura 2-57 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-8 2.0 1.5 1.0 102 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 56.0 59.0 107.7 104.6 103.9 114.1 119.7 123.5 137.5 143.9 RMN13C 156.9 154.6 163.2 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. O 3 11 10 5 6 2 O 7 12 N C-4 C-8 C-10 C-11 C-9 8 O OCH3 (4) C-12 9 DEPT 135 OCH3 (8) C-6 C-5 C-7 C-3 C-2 170 180 160 150 140 130 120 Figura 2-58 Espectro de RMN 110 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 30 20 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-8 Tabla 2-19 Datos espectroscópicos y constantes físicas para skimmianina Zr-9 Nombre: O 3 11 10 Estado físico 5 7 12 N Solido amorfo de color amarillo-verdoso. 6 2 O Skimmianina Zr-9 9 8 O O Formula molecular C 14 H 13 NO 4 Peso molecular 319,3 g/mol Punto de fusión 177-179°C (CHCl 3 ) EM-IE: m/z (%) = 259 (97), 258 (21), 244 (100), 230 (43), 228 (10). IR: ν (cm-1) = 1620 (C=N), 1575 (C=C), 1509 (C=C), 1270 (C-O), 1098 (C-O) RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 8,01 (d, J = 9,4 Hz, 1H, H-5), 7,58 (d, J=2,8 Hz, 1H, H-2), 7,23 (d, J=9,4 Hz, 1H, H-6), 7,04 (d, J=2,8 Hz, 1H, H-3), 4,43 (s, 3H, 4-OCH 3 ), 4,10 (s, 3H, 8-OCH 3 ), 4,03 (s, 3H, 7-OCH 3 ). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 164,4 (C-12), 157,2 (C-4), 152,1 (C-9), 143,0 (C-2), 141,5 (C-7), 141,0 (C-8), 118,1 (C-5), 114,9 (C-11), 112,1 (C-6), 104,6 (C-3), 102,0 (C-10), 61,6 (8-OCH 3 ), 59,0 (4-OCH 3 ), 56,8 (7-OCH 3 ). Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Liu et al., 2009; Cuca et al., 1998. 4.11 4.03 4.43 7.24 7.22 7.04 7.04 7.58 7.58 103 8.03 8.00 Capítulo 2 O 7.04 7.04 7.24 7.22 7.58 7.58 8.03 8.00 3 11 10 7 N 12 OCH3 (4) OCH3 (8) H-2 7.7 7.8 7.4 7.6 7.5 f1 (ppm) H-2 H-5 7.3 8 O 0.98 1.17 2.27 1.09 0.80 0.93 0.10 0.85 0.86 7.9 8.0 O 9 OCH3 (7) H-3 H-6 6 2 O H-5 5 7.2 7.1 7.0 H-6 9.5 9.0 8.5 7.5 8.0 7.0 6.5 6.0 5.5 f1 (ppm) 5.0 2.86 2.92 3.00 2.97 3.08 3.09 2.27 1.09 0.98 1.17 0.91 0.93 0.85 0.86 H-3 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 1 61.6 59.0 56.8 104.6 118.1 114.9 112.1 143.0 141.5 152.1 157.2 RMN13C 164.3 Figura 2-59 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-9. O 3 11 10 5 6 2 O 7 12 N O 9 OCH3 (4) 8 O C-9 C-12 C-4 C-11 C-8 C-10 DEPT 135 OCH3 (8) C-5 C-2 OCH3 (7) C-3 C-6 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-60 Espectro de RMN 110 13 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-9. 30 20 104 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 2-20 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-siringaresinol Zr-10. Nombre: O 3´ 9 1 5 7 O Aceite amarillo pálido Formula molecular 5´ O H H O Estado físico OH O 7´ 1´ (+)-siringaresinol Zr-10 C 22 H 26 O 8 Peso molecular 9´ 418.4 g/mol [α]25 : 𝐷 Rotación óptica HO +42.1°(c 0.40, CHCl 3 ) IR: ν (cm-1) = 3420 (O-H), 2942 (C-H), 1605 (C=C), 1519 (C=C), 1464 (C=C), 1420 (H-C-H), 1380 (H-C-H),1230 (C-O), 1110 (C-O) cm-1. 3 O RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 6,57 (s, 4H, H-2, H-6, H-2’, H-6’), 5,56 (sa, 2H, OH), 4,73 (d, J = 4,2 Hz, 2H, H-7, H-7´), 4,27 (dd, J = 9.0, 6.8 Hz, 2H, H-9 eq , H-9´ eq ), 3,90 (m, 2H, H-9 ax , H-9´ ax ), 3,89 (s, 12H, OCH 3 ), 3,09 (m, 2H, H-8, H-8´). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 147,1 (C-3, C-5, C-3’, C-5’), 134,3 (C-4, C-4’), 132,1 (C-1, C-1’), 102,7 (C-2, C-6, C-2’, C6’), 86,0 (C-7, C-7´), 71,8 (C-9, C-9´), 56,4 (OCH 3 ), 54,3 (C-8, C-8´). 3.89 4.28 4.27 4.26 4.73 4.72 5.56 6.57 3.09 3.09 Datos descritos en la literatura: El-Hassan et al., 2003; Ayres y Loike, 1990. 3´ 4 OCH3 3.89 4.28 4.27 4.26 4.73 4.72 3.09 3.09 9 5´ O H 1 5 OH O 7´ 1´ H O O 7 O 9´ HO H-7 H-7´ O 2.2 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 H-9 H-9´ 5.0 4.5 f1 (ppm) 1 H-8 H-8´ 4.0 2.2 14.8 4.1 8.0 H-7 H-7´ 2.0 OH 1.9 H-2 H-6 H-2´ H-6´ 1.8 1.8 1.9 14.8 H-9 H-9´ 8.5 3 H-8 H-8´ 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 Figura 2-61 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Zr-10. 1.0 0.5 71.8 86.0 134.3 132.1 147.1 RMN13C 56.3 54.3 105 102.7 Capítulo 2 3´ 9 1 5 OH 5´ O H H O OCH3 O 7´ 1´ O 7 O 9´ HO O C-3 y C-5 C-3’ y C-5’ 3 C-7 y C-7’ C-4 y C-4’ C-1 y C-1’ DEPT 135 C-2 y C-6 C-2’ y C-6’ C-8 y C-8’ C-9 y C-9’ 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 Figura 2-62 Espectro de RMN 100 95 90 85 f1 (ppm) 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Zr-10. Tabla 2-21 Datos espectroscópicos y constantes físicas para cafeato de etilo Zr-11 Nombre: O 6 Estado físico 7 5 9 O 1' 2' Cafeato de etilo Zr-11 Sólido amorfo de color naranja pálido. Formula molecular C 11 H 12 O 4 2 HO OH Peso molecular 208,1 g/mol Punto de fusión 166-167°C (Acetona) IR: ν (cm ) = 3343 (OH), 2955 (C-H), 1704 (C=O), 1600 (C=C), 1545 (C=C), 1255 (C-O), 1098 (C-O). -1 RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 7,53 (d, J = 15,9 Hz, 1H, H-7), 7,16 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2), 7,03 (dd, J = 8,2; 2,0 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-5), 6,27 (d, J = 15,9 Hz, 1H, H-8), 4,18 (c, J= 7,1 Hz, 2H, H-1’), 1,26 (t, J= 7,1 Hz, H2’). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 168,4 (C-9), 149,6 (C-4), 147,2 (C-3), 146,5 (C-7), 128,5 (C-1), 123,5 (C-6), 117,3 (C5), 116,7 (C-8), 116,0 (C-2), 61,5 (C-1’), 15,6 (C-2’). Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Xiang et al., 2011; Zhang et al., 2012. 106 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 1.26 4.20 4.19 4.17 4.15 6.29 6.25 6.88 6.86 7.16 7.16 7.55 7.51 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. O 6 7 5 9 O 1' 2' 2 HO H-2’ OH H-1’ H-2 H-8 H-5 H-7 9.0 8.5 7.5 8.0 7.0 6.5 4.4 2.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H-6 6.0 5.5 5.0 4.5 f1 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1 15.6 61.5 117.3 116.7 116.0 128.5 123.5 RMN13C 149.6 147.2 146.5 168.4 Figura 2-63 Espectro de RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para Zr-11. O 6 7 5 9 O 1' 2' 2 HO C-5, C-8 y C-2 OH C-3 C-9 C-4 C-2’ C-1 DEPT 135 C-6 C-7 C-1’ 210 200 190 180 170 160 150 140 130 Figura 2-64 Espectro de RMN 120 13 110 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 30 20 C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para Zr-11. 10 0 Capítulo 2 107 Tabla 2-22 Datos espectroscópicos y constantes físicas para 7-hidroxicumarina Zr-12 Nombre: 5 4 6 7-hidroxicumarina Zr-12 Estado físico 3 Sólido amorfo de color amarillo. Formula molecular 1 HO O 8 O C9H6O3 Peso molecular 162,0 g/mol Punto de fusión 225-227°C (descomposición) IR: ν (cm-1) = 3180 (OH), 1718 (C=O), 1680 (C=C), 1574 (C=C) 1238 (C-O), 1130 (C-O). RMN 1H (400 MHz, acetona-d 6 ): δ 7,87 (d, J = 9,5 Hz, 1H, H-4), 7,51 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-5), 6,85 (dd, J = 8,5; 2,3 Hz, 1H, H-6), 6,76 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-8), 6,17 (d, J = 9,5 Hz, 1H, H-3). RMN 13C (100 MHz, acetona-d 6 ): δ 163,0 (C-2), 162,1 (C-7), 157,9 (C-9), 145,7 (C-4), 131,4 (C-5), 114,7 (C-6), 113,8 (C3), 113,6 (C-10), 104,2 (C-8). 5 6.18 6.16 6.86 6.85 6.84 6.83 6.76 6.75 7.52 7.50 7.88 7.86 Datos espectroscópicos descritos en la literatura: Kim et al., 2006. 4 6 3 1 HO O 8 O H-3 H-5 H-8 H-4 9.0 8.8 8.6 8.4 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 f1 (ppm) 1 6.8 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H-6 6.6 6.4 6.2 6.0 5.8 Figura 2-65 Espectro de RMN H (acetona-d 6 , 400 MHz) para Zr-12. 5.6 5.4 5.2 108 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 104.2 114.7 113.8 113.8 131.4 145.7 RMN13C 157.9 162.1 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 5 4 6 3 1 HO C-5 C-7 O 8 C-10 O C-6 C-9 C-2 DEPT 135 C-4 C-3 C-8 210 200 190 170 180 160 150 140 Figura 2-66 Espectro de RMN 130 120 110 f1 (ppm) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 13 C y DEPT 135 (acetona-d 6 , 100 MHz) para Zr-12 Tabla 2-23 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ácido (-)-rigidunoico Zr-14 Nombre: Estado físico OH 9' O 7' 1' 6' 3 4' 3' OH O 1 5 OH sólido amorfo de color amarillo-verdoso Formula molecular OH HO Ácido (-)-rigidunoico Zr-14 7 OH O C 16 H 18 O 9 Peso molecular 354,1 g/mol Punto de fusión 250°C (Descomposición) Rotación Optica [α]20 D – 33,6 (c 1.0, MeOH) Datos EMAR Masa calculada para C 16 H 17 O 9 353,0873 observada 353,0890 IR: ν (cm-1) = 3415 (OH), 2919 (C-H), 2851 (C-H), 1660 (C=O), 1645 (C=O), 1600 (C=C), 1498 (C=C), 1450 (H-C-H), 1250 (C-O), 1231 (C-O). RMN 1H (400 MHz, CD 3 OD-D 2 O): δ 7,48 (d, J = 15,9 Hz, 1H, H-7’), 7,00 (sa, 1H, H-2’), 6,87 (da, J = 8,0 Hz, 1H, H-6’), 6,76 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-5’), 6,23 (d, J = 15,9 Hz, 1H, H-8’), 5,30 (td, J = 10,9; 10,9; 4,9 Hz, 1H, H-3), 4,26 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-5), 3,80 (dd, J = 9,6; 2,7 Hz, 1H, H-4), 2,09 (m, 4H). RMN 13C (100 MHz, CD 3 OD-D 2 O): δ 180,8 (C-7), 169,7 (C-9’), 148,5 (C-4), 147,2 (C-7’), 145,7 (C-3), 127,7 (C-1’), 123,4 (C-6’), 116,8 (C-5’), 115,7 (C-2’), 115,3 (C-8), 79,1 (C-1), 74,0 (C-4), 72,4 (C-5), 71,9 (C-3), 39,7 (C-2), 38,0 (C-6). Elucidación estructural por análisis espectroscópico descrita en las páginas 88 – 96 Capítulo 2 109 2.2.4 Estudio fitoquímico de la corteza de O. longifolia El estudio fitoquímico de la corteza de O. longifolia, permitió el aislamiento e identificación de ocho sustancias (Figura 2.67), entre las que se encuentran dos sesquiterpenoides (ácido 11,13-dihidrocostuso Ol-1 y kudtdiol Ol-7), una lactona (litsealiicolido C Ol-2), tres sesquiterpenlactonas ((+)-longifolina Ol-4, (+)- hidroxiatractilólido Ol-5 y ocotealactol Ol-6) y dos esteroles (sitosterol Ol-3 y sitosterol-3O-glicósido Ol-7). De los ocho compuestos aislados, el compuesto denominado (+)longifolina Ol-4 no presenta reportes previos en la literatura. Todos los metabolitos aislados e identificados en la corteza de O. longifolia se reportan por primera vez para la especie, siendo este trabajo el primer reporte de la composición química de la corteza de O. longifolia. Los tipos de metabolitos encontrados han sido previamente reportados en especies de la familia Laureaceae, estando así estos resultados de acuerdo con la quimiotaxonomía de la familia. O HO O O OH Ol-2 Ol-1 HO Ol-3 OH O OH O O O O O OH OH Ol-6 Ol-5 Ol-4 HO OH Ol-7 Glu-O Ol-8 Figura 2-67 Metabolitos aislados de la corteza de Ocotea longifolia. Los metabolitos de tipo esteroidal y sesquiterpénico han sido ampliamente reportados en la familia Lauraceae y de igual forma en el género Ocotea (Garcez et al., 2010; Chavez et al., 1995; Pereira et al., 1995), pero las sesquiterpenlactonas no se han reportado 110 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. ampliamente como constituyentes químicos de especies de Ocotea, solo se tiene un reporte de la presencia de una sesquiterpenlactona conocida como ocotealactol en la corteza de O. guianensis (Roque et al., 1978). Dichas sustancias se encuentran ampliamente distribuidas en especies de los géneros Linderia, Litsea, Neolitsea y Laurus, pertenecientes a la familia Lauraceae (Jullianti et al., 2012; Sumioka et al. 2011; Gan et al., 2009; Barla et al., 2007; Ohno et al., 2005; Li, 1992), donde en los tres primeros géneros se han encontrado principalmente sesquiterpenlactonas lineales, mientras que en el género Laurus se han reportado sesquiterpenlactonas angulares. De acuerdo a los estudios filogenéticos realizados para la familia Lauraceae, se encuentra que la especie objeto de estudio pertenece al complejo Ocotea, el cual se encuentra dentro del clado Persea-Laurae (Chanderbali et al., 2001). La información anterior sugiere que en principio se esperaba encontrar que los componentes químicos de la corteza de O. longifolia fueran del mismo tipo que los que se han reportado para diversas especies que pertenecen al complejo Ocotea. En esta investigación en la especoe O. longifolia se encontraron metabolitos de tipo sesquiterpenlactona, sustancias que no corresponden a compuestos comúnmente encontrados como constituyentes químicos de especies de los géneros pertenecientes al complejo Ocotea (Endlicheria, Ocotea, Aniba, Kubitzkia, Licaria, Pleurothrium, Paraia, Nectandra, Aiouea, Dicypellium y Umbellularia), pero sí han sido encontrados en especies pertenecientes al complejo Laureae, que también se encuentra dentro del clado Persea-Laureae. Los resultados de este estudio pueden llegar a tener relevancia quimiotaxónomica para el género Ocotea y en general para la familia Lauraceae, pues este es el segundo reporte de metabolitos tipo sesquiterpenlactona en especies de este género y por lo tanto en el complejo Ocotea. Los compuestos Ol-1 a Ol-8 fueron elucidados por métodos espectroscópicos (RMN 1D y 2D, IR, EM), por comparación con los datos descritos en la literatura y/o por cocromatografía en CCD con muestras auténticas. A continuación se describe la elucidación estructural del compuesto Ol-4. Los datos espectroscópicos y constantes físicas de los compuestos conocidos se presentan de manera resumida en las Tablas 2.24 a 2.29, y adicionalmente en las Figuras 2.76 a 2.85 donde se muestra los espectros de RMN 1H y 13C de dichos compuestos. Capítulo 2 111 Elucidación estructural del compuesto Ol-4. El compuesto Ol-4 es un aceite amarillo pálido. Su espectro IR tomado en película se caracteriza por presentar señales indicativas de la presencia de un grupo carbonílico tipo γ-lactona (señal intensa en 1742 cm-1, características de estiramientos C=O), de grupos alifáticos (señales en 2850-2940 cm-1 por tensiones C-H y en 1450, 1380 cm-1 por flexiones en el plano H-C-H) y de alquenos (señales en 3040-3070 y 1650-1630 cm-1 debidas a las tensiones =C-H y C=C en alquenos, respectivamente). La rotación óptica determinada fue [α]20 +23,1 (c 0.50, CHCl 3 ). 𝐷 P Su espectro RMN 1H (Figura 2.68) presenta señales entre δ H 1,00 y 6,00 que integran para 17 protones y que indican que el compuesto es alifático insaturado. En el espectro se destacan las señales desplazadas a campo bajo que sugieren hidrógenos sobre carbonos con hibridación sp2 o unidos a heteroátomos en δ 5,03 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H) y 5,72 (s, 1H). De estas, las señales en δ 5,03 (d, J = 1,4 Hz, 1H) y 5,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H) de acuerdo al desplazamiento, multiplicidad y constante de acoplamiento sugieren la presencia de un doble enlace terminal. También en el espectro se observan señales de hidrógenos para dos grupos metilo en δ 1,26 (s, 3H) y en δ 2,00 (s, 3H). En los espectros RMN 13 C y DEPT 135 (Figura 2.69) se observan señales para 15 carbonos, de las cuales dos corresponden a carbonos tipo metilo con δ 8,4 (CH 3 ) y 22,6 (CH 3 ) corroborando lo observado en RMN 1H; cuatro señales debidas a carbonos tipo metileno con δ 22,2 (CH 2 ), δ 36,7 (CH 2 ), 40,9 (CH 2 ) y 109,4 (CH 2 ), corroborando esta última la presencia de un doble enlace terminal; tres señales son debidas a carbonos tipo metino con δ 52,3 (CH), 63,6 (CH) y 120,0 (CH), que de acuerdo a sus desplazamientos las dos primeras corresponden a carbonos alifáticos cerca a heteroátomos y la última a un carbono olefínico; seis corresponden a carbonos cuaternarios con δ 38,4 (C), 122,5 (C), 145,6 (C), 146,6 (C), 148,0 (C) y 171,2 (C). La señal en 171,2 (C) soporta la presencia de un grupo γ-lactona observado en IR. También del análisis de RMN 13 C y DEPT 135 se deduce que el compuesto presenta tres dobles enlaces, uno terminal, uno parcialmente sustituido y otro totalmente sustituido (Silverstein y Webster, 1996). 112 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 1.26 1.70 1.67 2.42 2.39 2.39 2.38 2.19 2.00 5.22 5.22 5.16 5.16 5.03 5.02 5.72 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. CH3 (14) 14 O 7 O 1.70 1.67 5 2.00 12 3 2.19 9 2.42 2.39 2.39 2.38 1 CH3 (13) H 15 OH 13 H-5 H-2 H-3 2.5 2.4 H-1 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 f1 (ppm) 1.8 1.7 1.6 1.5 H-9 CH(15b) H-6 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 f1 (ppm) 3.5 3.0 2.5 2.0 4.86 5.34 1.24 1.47 3.53 1.18 1.07 1.05 1.10 1.00 CH(15a) 1.5 1.0 0.5 0.0 1 Figura 2-68 Espectro RMN H para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz). Las señales de RMN 13 C junto con el análisis EMAR con ESI en modo positivo conducen a la fórmula pseudomolecular C 15 H 19 O 3 (m/z 247,1346 [M+H]+, calculado para C 15 H 19 O 3 , 247,1334), consistente con 7 grados de insaturación. El análisis realizado sugiere que el compuesto corresponde a una sesquiterpenlactona de tipo eudesmanólido que es coherente con lo reportado en la familia Lauraceae para este tipo de compuestos, donde este tipo de metabolitos se han reportado principalmente en los géneros Linderia, Neolitsea y Laurus (Jullianti et al., 2012; Sumioka et al. 2011; Gan et al., 2009; Barla et al., 2007; Ohno et al., 2005; Li, 1992). 8.4 22.6 22.2 40.9 38.4 36.7 52.6 63.5 109.4 122.5 119.9 148.1 146.5 145.6 13 RMN C 113 171.2 Capítulo 2 C-10 6C C-4 C-11 C-8 C-7 C-12 2 CH3 14 DEPT 135 1 9 12 3 5 C-14 O 7 O C-6 3 CH C-13 C-5 C-9 H 15 OH 13 4 CH2 C-1 C-3 C-15 180 170 160 150 140 130 120 Figura 2-69 Espectro de RMN 110 100 90 f1 (ppm) 80 70 60 50 40 C-2 30 20 10 0 13 C y DEPT 135 del compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 100 MHz) El análisis de los espectros COSY, HMQC Y HMBC permitió asignar las señales de hidrógeno y carbono en la estructura y elucidar totalmente el compuesto Ol-4 como una sesquiterpenlactona de tipo eudesmanólido hidroxilada en C-6. Con el espectro HMQC (Figura 2.70), se realizó la conectividad de cada hidrógeno con el carbono al cual está unido, por ejemplo en el espectro se observan las conectividades de los protones en δ H 5,03 (d, J = 1,4 Hz, 1H) y 5,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H) con el carbono en δ C 108,4 (CH 2 ), que soporta la presencia de un doble enlace terminal; del protón en δ H 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H) con el carbono en δ C 63,6 (CH) y del protón en δ H 2,19 (sa, 1H) con el carbono en δ C 52,3 (CH), correlaciones que confirman la presencia de un grupo hidroxilo en la molécula. Las correlaciones observadas en el espectro HMQC se ilustran en la Figura 2.70. 114 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 0 10 20 30 40 50 60 80 90 100 f1 (ppm) 70 110 120 130 140 150 160 170 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 f2 (ppm) 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Figura 2-70 Espectro HMQC para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) El espectro COSY 1H-1H (Figura 2.71) permitió establecer la correlación escalar existente entre los protones en δ H 2,19 (sa, 1H, H-5) y 5,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-15) que contribuyó a la ubicación del grupo hidroxilo en C-6 y que fue confirmada por las correlaciones observadas en HMBC entre los protones con δ H 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H6) y los carbonos con δ C 38,4 (C-10), 145,6 (C-4) y 148,1 (C-7), que a su vez permitieron ubicar el doble enlace terminal en las posiciones 4 y 15, y el doble enlace sustituido en las posiciones 7 y 11. Capítulo 2 115 0 O O 1 H OH H 2 3 f1 (ppm) H 4 5 6 7 6.0 5.5 5.0 4.5 1 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1 Figura 2-71 Espectro COSY H- H para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) Adicionalmente las correlaciones en HMBC entre los protones con δ H 5,72 (s, 1H) y los carbonos con δ C 40,9 (CH 2 -1), 52,3 (CH-5) y 148,0 (C-7) permitieron ubicar la otra insaturación en las posiciones 8 y 9 del núcleo base. De manera similar fueron ubicados los dos grupos metilos en las posiciones 11 y 14. Las correlaciones observadas en el espectro HMBC se presentan en las Figuras 2.72 y 2.73. O O H OH Figura 2-72 Principales correlaciones observadas en HMBC para el compuesto Ol-4. 116 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Figura 2-73 Espectro HMBC para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 400 MHz) La estereoquímica de C-5, C-6 y C-10 fue establecida por el experimento NOESY (Figura 2.74). Se observa correlación entre los hidrógenos H-5 y H-6 (δ 2,19 (sa, 1H, H-5) y 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-6)), pero no fue observada correlación de estos con los hidrógenos del grupo CH 3 ubicado sobre el C-10 (1,26 (s, 3H)). De acuerdo a lo observado en NOESY, a las multiplicidades y constantes de acoplamiento observadas entre δ 2,19 (sa, 1H, H-5) y 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-6), se puede establecer que los hidrógenos H-5 y H6 están en posiciones ecuatoriales; por lo tanto el grupo CH 3 -14 estaría en posición trans respecto a H-5 y H-6. Capítulo 2 117 O OH O H H 1.0 1.5 2.0 2.5 3.5 f1 (ppm) 3.0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 f2 (ppm) 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 Figura 2-74 Espectro NOESY para el compuesto Ol-4 (CDCl 3 , 300 MHz) La estereoquímica absoluta fue asignada teniendo en cuenta las correlaciones establecidas con el experimento NOESY y el valor de la rotación óptica. De esta forma la estructura de Ol-4 fue establecida como la de una sesquiterpenlactona lineal tipo eudesmanólido identificada como (4S,8aS)-4-hidroxi-3,8a-dimetil-5-metilidene- 4a,5,6,7,8,8a-hexahidronafto[2,3-b]furan-2-(4H)-ona, que fue denominada (+)-longifolina (Figura 2.75). O O H OH Figura 2-75 Estructura de (+)-longifolina Ol-4 118 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. DATOS ESPETROSCÓPICOS COMPUESTOS CONOCIDOS AISLADOS DE CORTEZA DE O. longifolia Tabla 2-24 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ácido 11,13-dihidrocustoso Ol-1 Nombre: 14 Estado físico 9 1 5 3 Ácido 11,13-dihidrocustoso Ol-1 Aceite amarillo Formula molecular 7 C 15 H 24 O 2 13 11 Peso molecular 236,2 g/mol Rotación óptica [α]20 : +22,3 (c 0.50, CHCl 3 ) 𝐷 H 12 15 HO O RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 4,73 (d, J = 1,5, 1H, H-15a), 4,44 (d, J = 1,5, 1H, H-15b), 2,36 (m, 3H, H-11; H-3), 2,02 (m, 2H, H-6), 1,80 (da, J = 11,8, 1H, H-5), 1,58 (m, 4H), 1,27 (m, 6H), 1,20 (d, J = 7,0, 3H, H-13), 0,71 (s, 3H, H-15). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 182,5 (C-12), 150,9 (C-4), 105,4 (C-15), 49,6 (C-5), 45,3 (C-11), 41,8 (C-1), 40,9 (C-7), 40,8 (C-9), 36,9 (C-3), 36,0 (C-10), 27,0 (C-6), 26,1 (C-8), 23,5 (C-2), 16,2 (C-14), 13,9 (C-13). 0.71 1.27 1.21 1.19 1.58 1.82 1.79 2.02 2.36 2.36 4.44 4.44 4.73 4.73 Datos descritos en la literatura: Bohlmann y Jakupovic, 1979; Dreyer, 1987. 14 9 1 5 3 7 13 11 H 12 15 HO O H-14 H-13 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 f1 (ppm) 1 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 Figura 2-76 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-1 1.2 2.82 3.89 1.86 2.98 4.2 1.10 H-5 H-11 H-3 0.94 1.00 H-15 1.0 0.8 0.6 0.4 29.7 27.0 26.1 23.5 49.5 45.3 41.8 40.9 40.9 36.9 36.0 150.9 182.5 RMN13C 16.2 13.9 119 105.4 Capítulo 2 14 9 1 5 3 7 13 11 H 12 15 HO C-10 O C-6, C-8 y C-2 C-11 C-4 C-12 DEPT 135 C-13 C-15 C-5 C-7 C-1 C-15 190 170 180 160 150 140 130 120 Figura 2-77 Espectro de RMN 110 C-9 100 f1 (ppm) 90 80 70 60 50 40 C-3 30 20 10 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-1 Tabla 2-25 Datos espectroscópicos y constantes físicas para Litsealiicolido C Ol-2 O O 1 16 14 12 10 8 6 5 3 OH Nombre: Litsealiicolido C Ol-2 Estado físico Aceite amarillo pálido Formula molecular C 17 H 28 O 3 Peso molecular 280,2 g/mol Rotación óptica [α]20 : +37,2 (c 0.50, CHCl 3 ) 𝐷 EM-IE: m/z (%): 262 (30) [M-H 2 O], 237 (63), 219 (10), 140 (25) 123 (43),110 (35), 97 (30), 83 (28), 70 (100), 57 (45), 43 (35). IR: ν (cm-1) = 3420 (OH), 2965 (C-H), 2920 (C-H), 1780 (C=O), 1678 (C=C), 1615 (C=C), 1420 (H-C-H), 1388 (H-C-H). RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 7,11 (td, J = 8,0; 8,0; 2,1 Hz, 1H, H-6), 5,26 (sa, 1H, H-3), 4,97 (m, 1H, H-5a), 4,74 (m, 1H, H-5b), 2,53 (dd, J = 14,8; 7,3 Hz, 1H, H-7a), 2,45 (dd, J = 14,8; 7,3 Hz, 1H, H-7b),1,55 (m, 2H, H-8), 1,26 (m, H-16), 0,90 (t, J = 6,8 Hz, 3H, H-17). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 166,6 (C-1), 157,7 (C-4), 150,2 (C-6), 127,3 (C-2), 91,3 (C-5), 66,5 (C-3), 31,9 (C-15), 29,7 (C-7), 29,6 (C-8), 29,6 (C-9), 29,5 (C-10), 29,5 (C-10), 29,4 (C-11), 29,3 (C-12), 28,3 (C-13), 28,3 (C-14), 22,7 (C-16), 14,1 (C-17). Datos descritos en la literatura: Cheng et al., 2010. 120 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 14 12 10 8 0.91 0.90 0.88 1.28 O 1 16 2.50 2.47 5.28 4.98 4.97 4.97 4.97 4.75 4.74 4.74 7.13 7.12 7.11 7.10 7.09 7.08 O 1.55 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 5 3 OH 6 H-17 7.5 8.0 6.5 7.0 4.5 f1 (ppm) 5.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 4.8 22.8 2.5 1.0 1.0 5.5 6.0 2.4 H-7 1.0 0.9 8.5 H-5 H-3 H-6 1.5 1.0 0.5 1 RMN13C O 14 12 10 8 14.1 31.9 29.7 29.7 29.6 29.6 29.5 29.4 29.4 29.3 28.3 22.7 66.5 O 1 16 77.3 77.0 76.7 91.3 127.3 150.2 157.7 166.6 Figura 2-78 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-2 5 3 OH 6 C-17 C-4 C-2 C-1 DEPT 135 C-3 C-6 C-5 170 160 150 140 130 120 110 100 Figura 2-79 Espectro de RMN 90 80 f1 (ppm) 13 70 60 50 40 30 20 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-2 10 Capítulo 2 121 Tabla 2-26 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-longifolina Ol-4 Nombre: (+)-longifolina Ol-4 Estado físico Aceite amarillo 14 1 Formula molecular O 9 O 12 3 5 7 Peso molecular Rotación óptica H OH 15 13 C 15 H 18 O 3 Datos EMAR 246,1 g/mol [α]20 : 𝐷 +23,1 (c 0.50, CHCl 3 ) Masa calculada para C 15 H 19 O 3 247,1334 observada 247,1346 IR: ν (cm-1) = 3392 (O-H), 2850-2940 (C-H), 1742 (C=O), 1620 (C=C), 1450 (H-C-H), 1388 (H-C-H),1235 (C-O) cm-1. RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 5,72 (s, 1H, H-9), 5,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-15a), 5,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-6), 5,03 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-15b), 2,40 (m, 1H, H-1a), 2,19 (sa, 1H, H-5), 2,07 (m, 1H, H-1b), 2,00 (s, 3H, H-13), 1,61 (m, 4H, H-2 y H-3), 1,26 (s, 3H, H-14). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 171,2 (C-12), 148,1 (C-7), 146,5 (C-8), 145,6 (C-4), 122,5 (C-11), 119,9 (C-9), 109,4 (C15), 63,5 (C-6), 52,6 (C-5), 40,9 (C-1), 38,4 (C-6), 36,7 (C-3), 22,6 (C-14), 22,2 (C-2), 8,4 (C-13). Elucidación estructural por análisis espectroscópico descrita en las páginas 111– 117. Tabla 2-27 Datos espectroscópicos y constantes físicas para (+)-hidroxiatractilólido Ol-5 Nombre: Estado físico 14 1 OH H 15 Solido cristalino de color crema C 15 H 18 O 3 O 9 O 5 3 Formula molecular (+)-hidroxiatractilólido Ol-5 12 7 13 Peso molecular 246,1 g/mol Rotación óptica [α]20 : + 48.1 (c 1.0, CHCl 3 ) 𝐷 IR: ν (cm-1) = 3392 (O-H), 2850-2940 (C-H), 1742 (C=O), 1620 (C=C), 1450 (H-C-H), 1388 (H-C-H),1235 (C-O) cm-1 RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 4,85 (s, 1H, H-15a), 4,58 (s, 1H, H-15b), 2,60 (dd, J = 13,2; 3,2 Hz, 1H, H-2a), 2,40 (m, 2H, H-3a,: H-2b), 2,30 (d, J = 13,7 Hz, 1H, H-9a), 1,99 (m, 1H, H-5), 1,83 (sa, 1H, H-14), 1,78 (s, 3H, H-13) 1,62 (m. 4H, H-1 y H-6), 1,51 (d, J = 13,7 Hz, 1H, H-9b),1,02 (s, 3 H, H-14). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 172,6 (C-12), 161,2 (C-7), 148,6 (C-4), 121,9 (C-11), 106,8 (C-15), 103,8 (C-8), 51,7 (C5), 51,2 (C-9), 41,3 (C-1), 36,7 (C-10), 36,1 (C-3), 24,6 (C-2), 22,3 (C-6), 16,5 (C-14), 8,1 (C-13). Datos descritos en la literatura: Hikino et al., 1964; Endo et al., 1979. 122 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 14 1.02 1.99 1.84 1.83 1.78 1.78 1.63 1.62 2.62 2.61 2.59 2.58 OH 1 O 9 O 5 3 4.58 4.85 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 12 H-13 7 H H-14 13 15 H-3a y H-2b H-15a H-9a H-15b 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 0.92 2.03 1.16 4.5 4.0 f1 (ppm) 3.5 3.0 2.5 3.24 7.5 8.0 1.40 1.04 2.87 3.08 1.32 8.5 1.04 1.00 H-2a 2.0 1.0 1.5 0.5 0.0 1 8.1 16.5 24.6 22.3 41.3 36.7 36.1 51.7 51.2 121.9 148.6 161.2 172.6 RMN13C 106.8 103.8 Figura 2-80 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-5 C-10 C-4 C-8 C-11 C-7 C-12 14 DEPT 135 1 OH O 5 3 H C-14 O 9 12 7 13 15 C-9 C-15 190 180 170 160 C-13 C-5 150 140 130 120 110 Figura 2-81 Espectro de RMN 100 90 f1 (ppm) 13 80 70 60 50 C-1 C-3 C-6 C-2 40 30 20 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-5. 10 0 Capítulo 2 123 Tabla 2-28 Datos espectroscópicos y constantes físicas para ocotealactol Ol-6 Nombre: Ocotealactol Ol-6 Estado físico 14 Formula molecular OH 1 O 9 12 OH +26.1°(c 0.5, CHCl 3 ) IR: ν (cm-1) = 3402 (O-H), 2850-2940 (C-H), 1745 (C=O), 1610 (C=C), 1448 (H-C-H), 1378 (H-C-H),1225 (C-O) cm-1. 13 15 264,1 g/mol [α]20 : 𝐷 Rotación óptica 7 H C 15 H 20 O 4 Peso molecular O 5 3 Solido cristalino de color crema RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 5,20 (sa, 1H, H-15a), 5,08 (sa, 1H, H-6), 4,96 (sa, 1H, H-15b), 2,35 (m, 2H, H-9b, H-5), 1,98 (m, 1H, H-9a), 1,83 (s, 3H, H-13), 1,74 (sa, 1H, H-1a) 1,60 (m, 4H), 1,23 (s, 3H, H-14), 1,19 (m, 4H). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 172,4 (C-12), 157,2 (C-7), 146,3 (C-4), 123,0 (C-11), 109,4 (C-15), 104,7 (C-8), 66,7 (C6), 54,7 (C-5), 51,2 (C-9), 44,0 (C-10), 36,8 (C-1), 36,3 (C-3), 22,1 (C-2), 20,0 (C-14), 8,1 (C-13). 1.97 1.96 1.83 1.74 1.62 1.57 1.56 1.23 1.19 1.18 2.35 3.21 5.20 5.20 5.08 4.96 4.95 Datos descritos en la literatura: Roque, 1978. H-13 14 1 OH O 9 O 5 3 12 H-14 7 H OH 13 15 H-9a y H-5 H-6 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.0 3.5 f1 (ppm) 1 3.0 2.5 2.0 1.5 Figura 2-82 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-6 4.45 1.98 4.5 1.14 2.89 1.12 4.26 H-15b 1.00 0.98 0.96 H-15a 1.0 0.5 124 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia 8.1 22.1 20.0 44.0 36.8 36.3 54.7 51.1 66.7 109.4 104.7 123.0 146.3 157.2 RMN13C 172.4 (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. C-10 C-4 C-11 C-7 C-12 C-6 C-8 DEPT 135 14 1 OH O 9 C-14 O 5 3 7 H OH 13 15 C-9 C-1 C-3 C-2 C-15 190 180 170 160 C-13 C-5 12 150 140 130 120 110 Figura 2-83 Espectro de RMN 100 90 f1 (ppm) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 13 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-6 Tabla 2-29 Datos espectroscópicos y constantes físicas para kudtdiol Ol-7 Nombre: 14 1 3 Estado físico HO 9 5 7 11 Aceite incoloro Formula molecular C 15 H 26 O 2 12 OH Peso molecular Rotación óptica 15 kudtdiol Ol-7 13 238,2 g/mol [α]20 : 𝐷 +33.6 (c 1.0, CHCl 3 ) IR: ν (cm-1) = 3420 (O-H), 2964-2840 (C-H), 1648 (C=C), 1364 (C-O), 1135 (C-O) RMN 1H (400 MHz, CDCl 3 ): δ 4,73 (sa, 1H, H-15a), 4,42 (sa, 1H, H-15b), 3,56 (m, 2H, H-12), 2,32 (m, 1H, H-5), 2,01 (m, 2H, H-3), 1,80 (m, 2H, H-6), 1,62 (m, 4H), 1,27 (m, 5H), 1,16 (s, 3 H, H-13), 0,72 (s, 3 H, H-14). RMN 13C (100 MHz, CDCl 3 ): δ 151,0 (C-4), 105,3 (C-15), 74,8 (C-11), 68,6 (C-12), 49,8 (C-5), 45,0 (C-7), 41,8 (C-1), 41,0 (C-9), 36,9 (C-3), 36,0 (C-10), 25,3 (C-6), 23,5 (C-2), 21,4 (C-8), 20,3 (C-13), 16,3 (C-14). Datos descritos en la literatura: J. de Pascual et al., 1978; Bohlmann y Jakupovic, 1979, Barrero et al., 2009. 0.72 2.01 1.99 1.81 1.78 1.62 1.61 1.27 1.16 1.15 1.12 4.42 4.42 3.64 3.61 3.49 3.46 2.33 2.30 125 4.73 4.72 Capítulo 2 H-13 14 1 3 5 H-14 HO 9 7 11 12 OH 13 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 f1 (ppm) 3.5 2.5 3.0 2.0 5.43 3.11 1.34 3.38 H-6 4.39 H-3 1.72 H-5 2.38 1.96 H-12 0.85 1.00 H-15a H-15b 1.36 15 1.5 1.0 0.5 0.0 1 25.3 23.5 21.4 20.3 16.3 49.8 45.0 41.8 41.0 36.9 36.0 68.6 74.8 105.3 RMN13C 151.0 Figura 2-84 Espectro de RMN H (CDCl 3 , 400 MHz) para Ol-7 14 1 3 HO 9 5 7 12 11 OH 15 C-14 C-5 13 C-10 C-4 C-11 DEPT 135 C-13 C-7 C-9 C-15 170 160 150 140 130 120 110 Figura 2-85 Espectro de RMN C-12 100 13 90 f1 (ppm) 80 70 C-1 60 50 40 C-6 C-8 C-2 C-3 30 C y DEPT 135 (CDCl 3 , 100 MHz) para Ol-7 20 10 126 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 2.2.5 Estudio de la actividad antialimentaria de los compuestos aislados La actividad fagodisuasiva de los metabolitos secundarios aislados de hojas y madera de C. capitellata y de las cortezas de Z.rigidum y O. longifolia fue evaluada con un ensayo de no elección realizado con pequeños discos de harina tratados con las sustancias de interés. Los índices de disuasión alimentaria causados sobre S. zeamais y T. castaneum después de ser alimentados con dieta tratada con los compuestos a unas concentraciones de 100 y 300 ppm se presentan en la Tabla 2.30. Tabla 2-30 Resultados de la actividad antialimentaria sobre S. zeamais y T. castaneum de los metabolitos secundarios aislados. MUESTRA eudesm-11-en-4α-ol HCc-1 Mezcla β-sitosterol HCc-2 y estigmasterol HCc-3 biochanina A HCc-4 formononetina HCc-5 Mezcla 3,4-dihidroxibenzaldehído HCc-6 y ácido compsoneurico HCc-7 kaempferol-3-O-(2″,4″-di-trans-p-coumaroil)rhamnósido HCc-8 (-)-compsoneurósido HCc-9 azfelina HCc-10 glicósido de 3-O-sitosterol HCc-11 Mezcla β-sitosterol MCc-1 y estigmasterol MCc-2 megislactona MCc-3 Mezcla 2´,4´-dihidroxi-6´-metil-3,4metilenodioxidihidrochalcona MCc-4 y 2´,4´dihidroxi-6´-metil-3-hidroxi-4metoxidihidrochalcona MCc-5 1-(2,3-dihidroxifenil)-3-(3,4metilenodioxifenil)propano MCc-6 1-(2,3-dihidroxi-6-metoxifenil)-3-(3,4metilenodioxifenil)propano MCc-7 cinchonaina Ic MCc-8 cinchonaina Id MCc-9 lupeol Zr-1 lupenona Zr-2 IDA (%) T. castaneum 67,2 ± 8,7 58,2 ± 6,0 66,1 ± 6,1 54,8 ± 5,2 69,6 ± 4,5 54,1 ± 7,3 71,2 ± 8,5 59,9 ± 5,4 30,3 ± 2,8 21,8 ± 3,9 52,0 ± 8,4 41,8 ± 4,9 40,3 ± 3,2 31,5 ± 2,6 46,3 ± 8,0 44,1 ± 7,4 39,0 ± 8,8 36,2 ± 9,3 54,8 ± 5,2 66,1 ± 6,1 59,9 ± 8,0 40,7 ± 6,8 CONCENTRACIÓN (ppm) 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 S. zeamais 53,6 ± 4,5 33,3 ± 8,3 24,4 ± 1,1 12,5 ± 5,6 39,3 ± 8,2 20,8 ± 6,9 36,3 ± 3,7 29,4 ± 0,6 24,7 ± 1,1 15,2 ± 1,6 34,7 ± 4,5 23,8 ± 4,3 51,9 ± 1,6 44,8 ± 1,9 35,0 ± 2,1 28,4 ± 5,5 20,8 ± 2,6 14,9 ± 3,6 24,4 ± 1,1 12,5 ± 5,6 37,6 ± 5,5 21,1 ± 6,4 300 44,2 ± 4,0 68,9 ± 6,0 100 28,1 ± 5,5 54,8 ± 6,4 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 45,5 ± 1,0 30,7 ± 2,0 55,4 ± 2,0 38,3 ± 2,5 42,9 ± 2,1 34,0 ± 4,1 28,1 ± 4,0 16,2 ± 2,3 22,4 ± 0,4 18,5 ± 0,5 33,3 ± 2,9 61,6 ± 1,0 52,5 ± 4,5 67,8 ± 8,5 39,0 ± 1,7 26,0 ± 6,8 24,3 ± 6,4 23,7 ± 3,4 18,1 ± 2,6 24,2 ± 2,1 20,5 ± 1,5 36,7 ± 4,3 Capítulo 2 127 betulina Zr-3 Mezcla de savinina Zr-4 y 2,3-di(3',4'metilenodioxibencil)-2-buten-4-olido Zr-5 flindersina Zr-6 (+)-dimetilmatairesinol Zr-7 γ-fagarina Zr-8 skimnianina Zr-9 (+)-siringaresinol Zr-10 cafeato de etilo Zr-11 umbeliferona Zr-12 monopalmitato de glicerilo Zr-13 ácido (-)-rigidunoico Zr-14 ácido 11,13-dihidrocostuso Ol-1 litsealiicolido C Ol-2 β-sitosterol Ol-3 (+)-longifolina Ol-4 (+)-hidroxiatractilólido Ol-5 ocotealactol Ol-6 kudtdiol Ol-7 glicósido de 3-O-sitosterol Ol-8 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 300 100 25,4 ± 3,2 61,4 ± 1,0 23,8 ± 4,3 33,0 ± 2,3 19,1 ± 2,5 45,5 ± 2,6 27,4 ± 3,0 41,9 ± 1,5 29,7 ± 2,6 27,7 ± 1,0 14,5 ± 1,1 32,3 ± 1,5 27,4 ± 3,0 25,1 ± 2,5 11,9 ± 2,0 51,8 ± 3,0 41,9 ± 3,7 46,5 ± 5,2 39,3 ± 3,5 40,9 ± 2,5 29,7 ± 5,5 55,8 ± 3,7 39,3 ± 1,5 50,2 ± 0,6 46,5 ± 4,3 48,5 ± 1,0 43,2 ± 1,1 31,4 ± 1,5 25,7 ± 8,6 59,4 ± 2,0 43,2 ± 8,3 45,2 ± 5,5 35,6 ± 2,0 47,9 ± 4,9 39,3 ± 4,0 57,4 ± 2,0 51,2 ± 0,6 21,3 ± 1,6 15,4 ± 3,1 26,0 ± 4,3 52,2 ± 8,9 52,0 ± 8,4 19,2 ± 6,4 18,6 ± 1,7 39,0 ± 7,8 26,6 ± 1,0 35,0 ± 2,0 39,5 ± 3,5 37,3 ± 3,4 24,3 ± 6,4 27,1 ± 5,1 39,5 ± 4,3 29,9 ± 5,2 37,9 ± 4,3 45,9 ± 2,9 20,1 ± 2,2 47,2 ± 3,8 28,9 ± 2,9 44,0 ± 2,9 23,9 ± 2,6 52,2 ± 2,9 29,6 ± 2,9 42,1 ± 5,8 44,0 ± 1,1 50,3 ± 4,7 32,1 ± 1,9 51,6 ± 4,7 44,0 ± 1,1 47,8 ±6,6 30,8 ± 1,1 50,9 ± 6,8 38,4 ± 6,1 43,4 ± 6,8 14,5 ± 6,1 42,1 ± 4,4 23,9 ± 1,1 38,0 ± 7,2 35,2 ± 8,5 Los resultados presentados en la Tabla 2.30 muestran que la mayoría de las sustancias evaluadas sobre las dos plagas de almacén causaron efectos fagodisuasivos bajos (50% < IDA > 20%) y moderados (70% < IDA > 50%) con las dosis evaluadas. También se puede observar que de las dos plagas tratadas, T. castaneum fue la que sufrió mayores efectos fagodisuasivos cuando el alimento fue tratado con las sustancias de interés. De las 37 sustancias evaluadas, 15 presentaron actividad antialimentaria moderada sobre T. castaneum y solo 9 presentaron una actividad similar sobre S. zeamais. En las Figuras 2.86 y 2.87 se presentan las estructuras de las sustancias que fueron activas sobre T. castaneum y S. zeamais respectivamente. 128 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. OH HO HO HCc-3 HCc-2 HCc-1 OH HO O HO OH O O HO HCc-4 O OH O HCc-5 O OH O O O O O O HO O OH O OH O O HCc-8 O O OH Ol-2 Ol-5 OH O OH OH OH HO O OH O O OH HO 12 5 O MCc-3 OH Zr-14 Zr-3 HO OMe O OH HO O O OMe + OH OH O MCc-5 MCc-4 HO OMe MCc-6 MCc-5 O HO O O O OH MCc-6 O OH MCc-7 Figura 2-86 Metabolitos secundarios que exhibieron actividad antialimentaria moderada sobre adultos de T. castaneum Al observar las estructuras de los compuestos que presentaron un efecto fagodisuasivo moderado sobre T. castaneum es posible notar que una amplia variedad de sustancias pueden inhibir considerablemente la alimentación de este insecto, por lo tanto no se puede decir que una entidad estructural específica o que sustancias con ciertos patrones de sustitución sean las responsables de los efectos fagodisuasivos causados en el Capítulo 2 129 insecto. Es importante resaltar que la formonetina HCc-5 fue la única sustancia que causó un efecto fagodisuasivo fuerte sobre T. castaneum a una concentración de 300 ppm. Entre las sustancias activas se encuentran flavonoides, esteroles, terpenos, lactonas y diarilpropanos, donde la mayoría de los metabolitos activos promisorios contra T. castaneum fueron aislados de hojas y madera de C. capitellata. O O HO HO O OH HCc-1 OH O O O O OH O HO O OH MCc-8 HCc-9 OH O OH OH HO O O O HO OH HO O OH OH OH Zr-11 Zr-14 Zr-3 O HO O OH HO O OH Ol-4 Ol-1 Ol-7 Figura 2-87 Metabolitos secundarios que causaron un efecto fagodisuasivo moderado en adultos de S. zeamais. Ahora, al observar las estructuras presentadas en la Figura 2.87 que corresponden a las sustancias que presentaron los mayores efectos antialimentarios en S. zeamais es posible notar que las sustancias activas también son diversas a nivel estructural, encontrando que entre dichas sustancia se hallan sesquiterpenpoides, triterpenoides, derivados de ácido caféico y diarilpropanos. De los sesquiterpenoides que exhibieron actividad antialimentaria sobre S. zeamais, es posible deducir que la presencia del núcleo eudesmano en este tipo de metabolitos secundarios es necesaria para que se presente el efecto antialimentario, pues los 4 sesquiterpenoides que presentaron actividad sobre este insecto tienen en común la presencia del núcleo eudesmano en su estructura. Otra característica estructural que 130 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. puede estar relacionada con la actividad antialimentaria causada por estas sustancias es la presencia del doble enlace terminal que aparece en todos los compuestos sesquiterpénicos activos, como puede verse en las estructuras de los sesquiterpenos mostradas en la Figura 2.87. Vale la pena resaltar que las sesquiterpenlactonas Ol-5 y Ol-6 que también tienen un núcleo de tipo eudesmano y el doble enlace terminal exhibieron un IDA superior al 45% sobre S. zemais, hecho que confirma que las características estructurales mencionadas anteriormente están relacionadas con la actividad antialimentaria causada en adultos de S. zeamais. Los resultados de la actividad antialimentaria sobre el gorgojo del maíz también sugieren que los compuestos tipo fenilpropanoide o derivados de ácido con unidades C 6 -C 3 tienden a causar efectos inhibitorios en la alimentación de estos insectos, pues los dos compuestos aislados que contienen en su estructura una unidad C 6 -C 3 proveniente de ácido caféico o cinámico (Zr-9 y Zr-20) presentaron actividad antialimentaria moderada sobre S. zeamais; por lo tanto, la presencia de la unidad C 6 -C 3 parece estar relacionada directamente con esta actividad. Comparando ahora la actividad exhibida por los 4 extractos etanólicos de las tres especies vegetales trabajadas (Tabla 2.1) con los resultados de actividad antialimentaria de los metabolitos aislados, es posible afirmar que se encontró por lo menos uno de los metabolitos responsables de la actividad presentada por cada extracto. Para el caso de los extractos de hojas de C. capitellata (IDA = 56,3%), madera de C. capitellata (IDA = 50,4%) y corteza de O. lonfifolia (IDA = 54,1%) se encontraron metabolitos secundarios que exhibieron actividad antialimentaria comparable a la obtenida con el extracto que los contenía; mientras que para el extracto de corteza de Z. rigidum, que presentó un efecto antialimentario fuerte (IDA = 76,9%), las sustancias activas obtenidas de éste presentaron una actividad antialimentaria moderada, hecho que conlleva a pensar que la fuerte disuasión alimentaria que causó el extracto sobre los adultos de S. zeamais puede deberse a efectos sinérgicos y/o aditivos de la actividad que presenta cada metabolito secundario contenido en el extracto. De acuerdo con los resultados encontrados, se aprecia que es posible reducir notablemente el grado de alimentación de los insectos plaga con varios de los Capítulo 2 131 compuestos aislados en la investigación fitoquímica de las especies objeto de estudio. Los efectos fagodisuasivos causados por los compuestos activos pueden influir negativamente en la reproducción de los adultos, en la emergencia, crecimiento y desarrollo de las nuevas generaciones de insectos, efectos que solo podrían se causados por la falta de alimento, pues no se observó mortalidad de los insectos después de ingerir el alimento tratado. Los resultados obtenidos en este estudio de actividad antialimentaria sobre S. zeamais y T. castaneum contribuyen al conocimiento de las propiedades biológicas de las muestras evaluadas, confirman y complementan los resultados obtenidos por otros investigadores y constituyen el primer reporte de efectos fagodisuasivos sobre insectos de productos almacenados para la mayoría de las sustancias ensayadas. La actividad antialimentaria preliminar exhibida por varios de los compuestos evaluados los hace promisorios para continuar con ensayos de actividad más específicos, con el objetivo de obtener resultados más completos que permitan determinar si dichas sustancias pueden llegar a convertirse en nuevos agentes fitosanitarios y/o en compuestos plantilla para el diseño de nuevos agroquímicos para el control de plagas de productos almacenados. 3. Composición química y actividad insecticida de aceites esenciales obtenidos de algunas especies de las familias Lauraceae, Myristicaceae y Rutaceae Actualmente, la protección de productos almacenados frente al ataque de insectos plaga se realiza casi exclusivamente a través de la utilización de fumigantes, debido a que estas sustancias permiten controlar un amplio espectro de plagas de almacén gracias a la capacidad de los gases de penetrar a través de los empaques, paredes y otras áreas lo cual sería complicado mediante otras técnicas (Stefanazzi, 2010; Ducom, 2006). Sin embargo, la mayoría de los productos utilizados para tal fin han tenido que ser retirados del mercado debido a serios inconvenientes tales como contaminación del medio ambiente, presencia de residuos en los alimentos, costos elevados y efectos negativos sobre la salud humana (Navarro, 2006). Estas razones han hecho a iniciar la búsqueda de nuevos fumigantes que permitan controlar las plagas sin causar problemas de contaminación ambiental y de salud pública; y para este fin los productos obtenidos de las plantas pueden ser una buena alternativa. Las plantas producen una amplia gama de compuestos orgánicos que parecen no estar relacionados directamente con su desarrollo, pero que tienen importantes funciones ecológicas, entre las que se destacan: 1) proteger a las plantas de depredadores y organismos patógenos; 2) atraer insectos polinizadores o dispersores de semillas; 3) regular los procesos de evaporación de agua y 4) ser útiles como mecanismos de defensa y de comunicación con otros organismos (alelopatía) (Taiz y Zeiger, 2002). Actualmente, la investigación en productos naturales ha tomado gran impulso en la búsqueda de sustancias con propiedades insecticidas, con el fin de encontrar soluciones 134 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. económicas y de bajo impacto ambiental para el control de plagas. Principalmente se reporta el uso de aceites esenciales de diferentes especies vegetales como insecticidas (Rajendran y Sriranjini, 2008; Kim et al., 2003; Enan, 2001; Lamiri et al., 2001; Kétïa, et al., 2000; Regnalut-Roger, 1997). En la naturaleza, los aceites esenciales (AE) juegan un papel importante en la protección de las plantas, actuando como agentes antimicrobianos, insecticidas y como antialimentarios de herbívoros; además, son sintetizados por las plantas para atraer a algunos insectos polinizadores y para controlar la pérdida de agua (Bakkali et al., 2008). Con base en estas propiedades, los AE se han empleado a nivel medicinal, a nivel agrícola y en la industria cosmética y de alimentos (Lock de Ugaz, 1988). El uso de AE como insecticidas para proteger cereales y legumbres especialmente de los insectos plaga de almacén es una práctica tradicional en muchos países de Asia y África, pues es un método económico para la protección de las semillas almacenadas en los hogares y en pequeñas granjas (Shaaya et al., 1997). En la actualidad, las propiedades que exhiben estas sustancias, incluyendo su elevada volatilidad, han sido tenidas en cuenta para el desarrollo de estrategias de control de plagas que afectan a cultivos y productos de interés económico y alimentario, empleandolos como fumigantes. Las investigaciones enfocadas en el uso de AE como fitosanitarios han establecido una relación directa entre la resistencia de las plantas a diferentes plagas y la secreción de aceites esenciales, encontrando que las plantas más eficientes para el control de insectos son las plantas aromáticas (RegnaultRoger, 1997). Hasta el momento, es escasa la información disponible respecto a los mecanismos de acción de los AE sobre los insectos; sin embargo, se conoce que algunos aceites o sus constituyentes producen síntomas específicos que sugieren efectos neurotóxicos (Isman, 2006; Kostyukovsky et al., 2002). Muchos aceites también resultan ser tóxicos a través del contacto directo o mediante la penetración al organismo por vía respiratoria (López et al., 2008; Kordali et al., 2006; Negahban et al., 2007; Shaaya et al., 1997); otros afectan la fisiología nutricional de los insectos ya sea modificando su comportamiento (antialimetarios) Capítulo 3 135 o produciendo efectos tóxicos luego de la ingestión (Benzi et al., 2009; Pungitore et al., 2005; Huang et al., 2000); y otros AE han demostrado ser altamente efectivos por su acción repelente (Nerio et al., 2010; Ukeh et al., 2009; Ogendo et al., 2008). Todas estas observaciones permiten deducir que los AE presentan una amplia gama de actividades sobre los insectos, razón por la que podrían ser utilizados como agentes fitosanitarios ambientalmente seguros para el control de plagas, pues es de esperarse que los compuestos obtenidos de plantas tengan como ventaja, sobre los fumigantes comerciales, que posean baja toxicidad para mamíferos y rápida degradación (Philogéne et al., 2003). Las familias Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae se caracterizan por tener especies con importante contenido de aceites esenciales, razón por la cual estas especies pueden ser fuente de compuestos bioactivos con acción fumigante, que tal vez en un futuro puedan ser empleados como agentes fitosanitarios para el control de plagas y enfermedades a nivel agrícola. De la familia Myristicaceae se han adelantado algunos estudios de actividad insecticida, encontrándose que el aceite esencial de hojas de la especie Myristica fragrans (conocida como nuez moscada) presenta una significativa actividad insecticida contra Acanthoscelides obtectus (Regnault-Roger, 1997), Tribolium castaneum, Sitophilus zeamais (Huang et al, 1997), Lymantria dispar (Kostic et al., 2013), S. oryzae (Kim y Park, 2008) y Lycoriella ingenua (Park et al., 2008). En diferentes especies de la familia Rutaceae también se han realizados estudios enfocados en la búsqueda de sustancias con actividad insecticida. Por ejemplo, el aceite esencial de Citrus bergamia ha presentado actividad repelente sobre diferentes plagas de almacén (Cosimi et al., 2009); el aceite esencial de la cáscara del fruto de C. aurantium presentó actividad tóxica y repelente sobre adultos de Meligethes aeneus (Pavela, 2011); los aceites esenciales de hojas de Clausena anisata y C. dentata han presentado actividad larvicida sobre diferentes especies de mosquitos vectores de enfermedades tropicales (Govindarajan et al., 2010; Rajkumar y Jebanesan, 2010). Los aceites esenciales de diversas especies del género Zanthoxylum también han sido evaluados como insecticidas, encontrando que los aceites obtenidos de Z. piperitum (Kamsuk et al., 2006), Z. limonella (Koul et al., 2008), Z. 136 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. articulatum (Feitosa et al., 2007) y Z. armatum (Tiwary et al., 2007) han exhibido actividad insecticida sobre diferentes insectos portadores de enfermedades. Para los aceites esenciales de hojas y frutos de Z. schinifolium se reporta que han presentado actividad insecticida contra el gorgojo del maíz, S. zeamis (Wang et al., 2011). De otra parte, los aceites esenciales de especies de la familia Lauraceae han demostrado poseer interesantes propiedades insecticidas, como es el caso de varias especies del género Cinnamomun que han mostrado excelente actividad insecticida contra S. oryzae y Callosobruchus chinensis (Kim et al., 2003). El aceite esencial de Litsea cubeba también ha presentado actividad insecticida frente a plagas de almacén como S. zeamais y T. castaneum (Liu et al., 2007). En este capítulo, se presenta la composición química de los aceites esenciales de diferentes especies de las familias Myristicaceae, Rutaceae y Lauraceae y su evaluación como posibles agentes fitosanitarios para el control de Sitophilus zeamais, S. oryzae y Tribolium castaneum. 3.1 Metodología 3.1.1 Análisis químico de los aceites esenciales Material Vegetal Las especies Ocotea longifolia Kunth (COL 522892), Zanthoxylum monophyllum (Lam.) P. Wilson (COL 517520), Zanthoxylum fagara (L.) Sarg. (COL 522891) y Zanthoxylum rigidum Humb. & Bonpl. ex Willd. (COL 519810) fueron colectadas en enero de 2008 en el municipio de Icononzo (Tolima). Las muestras vegetales fueron colectadas por el Químico M.Sc. Wilman Delgado. La especie Virola carinata. (COL 563244) fue colectada en Puerto López (Meta) por el Químico M.Sc. Wilman Delgado. Zanthoxylum rhoifolium Lam. (COL 522896) fue colectado en febrero de 2008 en el municipio de Fusagasugá, Cundinamarca, Colombia. La muestra fue colectada por el Químico Ph.D. Oscar Patiño. Capítulo 3 137 Extracción de Aceites Esenciales El material fresco (2 Kg aprox.) de cada especie fue sometido a destilación por arrastre con vapor durante 2 horas. Los aceites esenciales obtenidos fueron secados sobre sulfato de sodio anhidro y almacenados entre 0-5 ºC, para su posterior análisis. Preparación de la Muestra Las muestras de aceites esenciales para el análisis CG-EM se prepararon disolviendo 25,0 μL de AE en n-hexano hasta un volumen final de 1,0 mL. Las curvas de calibración con los monoterpenos y monoterpenoides se construyeron a partir de soluciones stock entre 2000 ppm y 100 ppm de cada monoterpeno. Se prepararon soluciones de diferentes concentraciones (2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 200 ppm, 50 ppm y 5 ppm) que fueron analizadas por CG/FID. Los monoterpenos y monoterpenoides de referencia empleados fueron: α-terpinoleno, δ-3-careno, α-felandreno, 1,8-cineol, γ-terpineno, α-terpineno y (+)-limoneno. Análisis por CG-EM La separación y análisis de los aceites esenciales se llevó a cabo por CG-EM empleando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890AGC con detector selectivo a masas Hewlett Packard 5973. El espectrómetro de masas fue operado a 70 eV en modo full scan y los espectros de masas fueron adquiridos entre 35 y 450 m/z. La separación en la columna apolar se hizo con una columna capilar RTX-5MS (60 m × 0,25 mm × 0,25 micras), con inyección en modo Split (20:1) por 1,5 minutos. Las temperaturas de la cámara de ionización, el inyector y la línea de transferencia fueron 185, 250 y 285 °C, respectivamente. La temperatura en el horno fue programada como sigue: desde 50°C (2 min) hasta 160°C (5 min) a 4 °C/min, posteriormnte la temperatura se aumento hasta 220°C (5 min) a 2,5 °C/min, y finalmente un aumento hasta 280 °C (5 min) a 8 °C/min, para un tiempo total de corrida de 74 min. Se inyectó 1 μL de cada solución analizada. 138 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Para el análisis de los aceites esenciales con la columna polar se empleó una columna capilar Carbowax (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm), con inyección en modo Split (20:1) por 1,5 minutos. Las temperaturas de la cámara de ionización, el inyector y la línea de transferencia fueron 185, 250 y 285 °C, respectivamente. La temperatura en el horno fue programada como sigue: desde 40°C (5 min) hasta 250°C (10 min) a 4 °C/min, para un tiempo total de corrida de 68 min. Se inyectó 1 μL de cada solución analizada. Determinación de los Componentes de los Aceites Esenciales La determinación de los constituyentes químicos fue basado en la comparación de los espectros de masas y los índices de retención con los obtenidos de las librerías Wiley 138 L, NBS 75KL, SDBS y NIST 0.8 y los publicados por Adams, 1995. Los índices de retención (IK) se calcularon de acuerdo a lo reportado en la literatura y teniendo en cuenta los tiempos de retención de una serie homóloga de patrones de hidrocarburos desde C10 hasta C26, corridos en el CG-EM bajo las mismas condiciones operacionales que los AE. Análisis por CG/FID Las curvas de calibración construidas con los monoterpenos se realizaron en el equipo Agilent Technologies 7890AGC con columna capilar (RTX-5MS, 60 m × 0,25 mm × 0,25 micras) directamente acoplado a un detector de ionización de llama (FID) a 300 °C. Las condiciones de análisis fueron: temperatura del inyector 250 °C; columna: 50 °C (5 min) hasta 144 °C 8 °C/min (0 min), posteior aumento hasta 190 °C 3 °C/min (0 min), aumentando finalmente hasta 280 °C 8 °C/min (10 min); split 20:1 durante 2 min. Se empleó helio como gas portador con flujo constante de 1 mL/min. Se inyecta 1 µL de la solución a analizar. 3.1.2 Ensayos de actividad insecticida Cría de Insectos S. zeamais se obtuvo de una colonia mantenida en el Laboratorio de Productos Naturales del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá. Los insectos se alimentan de granos de maíz libres de insecticidas. El pie de cría es mantenido Capítulo 3 139 en la oscuridad bajo condiciones de humedad y temperatura controladas en una cámara de cultivo (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). S. oryzae se obtuvo de una cría stock mantenida en el Laboratorio del Equipo de Fitoquímicos Naturales del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Agropecuario (IMIDA). Los insectos se alimentan con granos de arroz libres de insecticidas y se mantiene en una cámara de cultivo bajo condiciones de temperatura y humedad controladas (24 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). T. castaneum se obtuvo de una cría stock mantenida en el Laboratorio del Equipo de Fitoquímicos Naturales del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Agropecuario (IMIDA). Los insectos se alimentan con harina de trigo mezclada con levadura de cerveza (95/5 %P/P) y se mantiene en una cámara de cultivo bajo condiciones de temperatura y humedad controladas (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). Los insectos adultos de las tres especies, entre 10-15 días de edad, fueron utilizados para los ensayos de actividad insecticida. Ensayo de Actividad Fumigante Para determinar la toxicidad volátil de los aceites esenciales y de 9 compuestos (monoterpenos y monoterpenoides), se emplearon dosis de aceite entre 0,5 - 11 µL (22,7 500 μL/L aire) y 0,2 - 2 µL (20 - 90 mg/L aire) de los compuestos puros, cantidades que fueron aplicadas en a discos de papel filtro Wathman 1 de 2 cm de diámetro colocados en un vial de cristal de 1,5 mL de volumen colocado a su vez en otro vial de mayor tamaño (22 mL), tapado con tapón rosca, junto con 10 insectos de la especie a ensayar. En el caso de T. castaneum no hubo contacto entre los insectos y el disco donde se había aplicado el producto. Para las especies del género Sitophilus se ensayaron dos situaciones, una como la descrita anteriormente, en la que se producía un contacto entre los insectos y el disco, y otra en la que se evitaba el contacto cubriendo la parte superior del vial pequeño con tela de visillo (Pascual-Villalobos et al., 2004). Como controles positivos se emplearon Fosfamin ® con fosfina como ingrediente activo (100 μg/L aire) y Nuvan 50 ® que contiene clorvox como 140 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. ingrediente activo (50 μL/L aire). El control negativo se realizó de la misma manera, pero sin la aplicación de ninguna sustancia. El ensayo se realiza bajo condiciones controladas de temperatura y humedad (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). Cada ensayo se realizó por triplicado. La mortalidad de los insectos fue determinada a las 24 h. Los insectos se consideraron muertos cuando no se observa movimiento de las patas y/o de las antenas cuando se hace una punción al insecto con un alfiler entomológico. El análisis probit fue usado para determinar los valores de CL 25 , CL 50 y CL 75 (Finney, 1971). Ensayo de Actividad Antialimentaria Para determinar la actividad antialimentaria de los aceites esenciales y de los monoterpenos se empleo el método de discos de harina (Xie et al., 1996) con algunas modificaciones. La harina de trigo (1,0 g) se agitó con ayuda de ultrasonido en 5 ml de agua destilada para formar una suspensión harina-agua, posteriormente se adicionaron 2 gotas de Tween 20. Alícuotas de 200 μL de esta suspensión (después de ser agitada) se colocaron en el centro de una caja de Petri de plástico formando discos. Los discos se dejaron secar a temperatura ambiente por 24 horas y posteriormente se transfirieron a una incubadora para equilibrarlos a 27 °C y 65-70% HR durante 48 h. Cada disco harina pesaba entre 36 y 39 mg. Una vez secos los discos, se impregnaron con 50 μL de la solución stock de los aceites esenciales (500 ppm) o compuestos puros (300 ppm y 100 ppm), preparadas en una mezcla etanolaceite de oliva (85:15). El etanol se deja evaporar por 5 minutos. Los discos se colocaron en viales de plástico para pesarlos, posteriormente se ubican dentro de cada vial diez (10) insectos sin sexar, y se pesa el conjunto vial-disco-insectos. Todos los insectos empleados en el ensayo se mantuvieron sin alimento por 24 horas antes de su uso. El montaje del experimento se dejó en la cámara de cultivo durante 3 días (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). Las mismas cantidades de la mezcla etanol:aceite de oliva fueron aplicadas para producir los discos control. Como control positivo se empleo el extracto etanólico de semillas de Neem. Para cada ensayo se realizaron cuatro (4) replicas. Los Índices de Disuasión Alimentaria (IDA) se calcularon comparando los resultados obtenidos con el alimento tratado con los observados con el alimento sin tratar, empleando la siguiente fórmula (Liu et al., 2007): 𝐼𝐷𝐴 = 100 × � 𝐶−𝑇 � 𝐶 Capítulo 3 141 Ensayo de Toxicidad por Contacto La toxicidad por contacto de los aceites esenciales sobre adultos de S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum se determinó aplicando tópicamente sobre el tórax dorsal de los insectos diferentes dosis de aceite esencial (0,1 – 0,2 μL). Como control se emplearon insectos sin tratar. Tanto los insectos tratados y los insectos control fueron transferidos a viales de vidrio (10 insectos/ vial) que contienen alimento. Los viales se mantienen en la cámara de cultivo bajo condiciones de temperatura y humedad controladas (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). Cada ensayo se realiza por triplicado. La mortalidad de los insectos se determina a las 24 y 96 horas después de iniciado el ensayo (Lui et al., 2007). Los porcentajes de mortalidad se calculan con la fórmula de corrección de Abbot: %𝑀𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = 100 × � Ensayo de Actividad Repelente 𝑀𝐶 − 𝑀𝑇 � 𝑀𝐶 Para evaluar la repelencia de los aceites esenciales se empleo un bioensayo de elección. La mitad de los discos de papel de filtro de 9 cm de diámetro (Whatman 1) fueron tratados con 500 μL de soluciones en acetona de los aceites esenciales (0.063 – 0,0252 µL/cm2), posteriormente se dejo evaporar el solvente por un período de 3 minutos en una cabina de extracción. La mitad de la parte inferior de una caja de Petri se cubrió con el papel de filtro tratado, mientras que la otra mitad se cubrió con la mitad de un disco de papel de filtro impregnado con acetona. Diez adultos sin sexar fueron puestos en el centro de la caja de Petri, se cerró la caja y se selló con parafilm. El número de insectos presentes en las dos mitades de los discos de papel se registró después de 2 y 24 horas del inicio del ensayo. Se realizaron cinco réplicas para cada concentración evaluada, ensayando 50 adultos de cada insecto por concentración de aceite. El ensayo se realiza bajo condiciones controladas de temperatura y humedad (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR). El Porcentaje de Repelencia (PR) se calculó empleando la siguiente fórmula: PR = (C-T) / (C +T) x 100, donde C = número de insectos en la zona no tratada y T = número de insectos en el área tratada (Nerio et al., 2009). Como control positivo se empleó el repelente comercial Stay Off® que tiene como principio activo una formulación al 15% de IR3535 (etil-3-(N-acetil-N-butilamino)-propionato), evaluado con las mismas concentraciones que los aceites esenciales. 142 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Ensayo de Inhibición de la Reproducción de Tribolium castaneum – Efecto posttratamiento Para determinar el efecto de los aceites esenciales y de los monoterpenos en la reproducción de T. castaneum, se sexaron los insectos en estado de pupa. Las pupas hembras y macho se pusieron en dieta nueva, manteniendo separadas las hembras de los machos. Una vez emergidos los adultos, los machos y las hembras, por aparte, se sometieron al ensayo de toxicidad fumigante empleando como concentración de tratamiento la CL 50 determinada para los aceites y monoterpenos en el primer ensayo descrito. Pasadas las 24 horas del ensayo de actividad fumigante, se seleccionaron las hembras y los machos sobrevivientes para formar las siguientes parejas: 1) H Tratada +M Tratado , 2) H SinTratar +M Tratado , 3) H tratada +M SinTratar y 4) H SinTratar + M SinTratar (pareja control). Cada pareja se ubicaba en un vaso de plástico con dieta. Por 5 días se permite que la hembra y el macho estén en contacto con el objetivo de que copulen y la hembra deposite los huevos sobre el alimento. Pasados los 5 días, se retiran los insectos adultos y se hace el conteo del número de huevos. 10 días después del conteo de los huevos (a los 15 días de iniciado el ensayo), se cuenta el número de larvas y/o huevos presentes en cada vaso de dieta. A los 25, 35 y 45 días después de iniciado el ensayo, se continúa haciendo el conteo de número de insectos en cada estado: adulto, pupa, larva y/o huevo. Para cada pareja, con cada una de las sustancias evaluadas, se hicieron 10 replicas. El ensayo se realiza bajo condiciones controladas de temperatura y humedad (27 ± 1 °C y 65 ± 5 % HR), manteniendo los vasos de dieta en la cámara de cultivo (Vayias y Athanassiou, 2004). 3.1.3 Estudio de inhibición acetilcolinesterasa. in-vitro e in-vivo de la General Para medir la aparición de color se utilizó un espectrofotómetro UV-Visible PharmaSpec UV1700 Shimadzu. Se emplearon celdas de cuarzo y las lecturas se realizaron a 25 °C y 412 nm por un periodo de 15 minutos. Capítulo 3 143 Los monoterpenos, el ioduro de acetiltiocolina (AcTCh), el DTNB (ácido ditionitrobenzoico) y la acetilcolinesterasa comercial (electric eel) fueron suministradas por Sigma Aldrich Química S.A. La bacitracina y el hidrocloruro de benzamidina fueron suministrados por Acros Organics. Extracción de la enzima Para la extracción de la enzima se pesaron 1,8 g de adultos de S. oryzae vivos, los cuales fueron triturados en un mortero junto con 10 mL de una solución de buffer fosfato (0,1 M, pH= 8) que contiene 0,1% P/V de bacitracina y 0,3% P/V de hidrocloruro de benzamidina. Una vez triturados los insectos, se centrifuga la suspensión obtenida por 90 minutos a 18.912 rpm manteniendo la temperatura a 4 °C. Después de centrifugar, se filtra la solución sobre lana de vidrio para retirar los residuos de los insectos. El extracto enzimático obtenido se almacena a 0 °C, para su posterior uso en los ensayos de inhibición de la acetilcolinesterasa (Keane y Ryan, 1999). Método de Ellman Para el estudio de la inhibición de la acetilcolinesterasa se siguió el método de Ellman (Ellman et al., 1961). Se evaluó la inhibición que provocan los tres aceites esenciales activos en el ensayo de actividad fumigante y 3 monoterpenos (α-felandreno, δ-3-careno y αterpinoleno) sobre la enzima acetilcolinesterasa extraída de adultos de la especie S. oryzae. Se utilizó como sustrato el ioduro de acetiltiocolina (AcTCh), el cual por hidrólisis enzimática produce un mercaptano que en presencia del ácido ditionitrobenzoico (DTNB) da lugar a dos compuestos; uno de ellos, el ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, cromóforo de intenso color amarillo que presenta su máximo de absorción a 412 nm. La reacción de inhibición se realizó en las celdas de cuarzo del espectrofotómetro. El volumen total de la reacción fue de 3 mL. Cada celda contenía: 1,5 mL de buffer fosfato 0,1 M pH=8, 1 mL de solución del aceite esencial (50 – 200 ppm) o terpénica (0,5 – 2 mM), 200 μL de sustrato (1-10 mM), 200 μl de DTNB (10 mM) y 100 μl de extracto enzimático. Las lecturas de la actividad enzimática se registraron a 412 mn a una temperatura de 25 °C, por 144 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. un periodo de 15 minutos. Los blancos se realizaron de la siguiente manera: 2,4 mL de buffer fosfato 0,1 M pH=8, 100 μL de etanol, 200 μL de sustrato (1-10 mM), 200 μl de DTNB (10 mM) y 100 μL de extracto enzimático (0,5 U/mL). Cada ensayo se realizó por duplicado. Ensayo in-vivo para determinar el efecto de aceites esenciales y monoterpenos sobre la actividad enzimática de la acetilcolinesterasa En este ensayo se utilizaron insectos adultos de S. oryzae y se evaluó el efecto del aceite esencial de hojas de O. longifolia y de los monoterpenos α-felandreno, δ-3-careno y αterpinoleno. Para determinar el efecto in vivo de estas sustancias sobre la acetilcolinesterasa, los adultos de S. oryzae fueron tratados por un período de 24 h con las concentraciones CL 25 , CL 50 y CL 75 determinadas en el ensayo de toxicidad volátil para cada sustancia. Se trataron 900 insectos con cada concentración. Pasadas las 24 horas, se extrajo la enzima de los insectos vivos y muertos resultantes después del ensayo de toxicidad volátil. La actividad enzimática de la enzima extraída se determinó por el método de Ellman descrito anteriormente. Como control se utilizó la enzima obtenida de 900 insectos adultos que no fueron tratados. Análisis estadístico Los datos se presentan como media ± 1DE. La significancia estadística fue determinada por las pruebas de Duncan y Tukey; el análisis de varianza ANOVA se utilizó para determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre los resultados obtenidos en ensayos de actividad insecticida. La significancia estadística fue aceptada a P < 0,05. Capítulo 3 145 3.2 Resultados y discusión 3.2.1 Composición química de los aceites esenciales Se realizó el estudio de los metabolitos secundarios volátiles presentes en siete (7) aceites esenciales obtenidos de seis especies pertenecientes a las familias Rutaceae, Lauraceae y Myristicaceae. En la Tabla 3.1 se relacionan los rendimientos de extracción de los aceites esenciales y las constantes físicas determinadas para cada aceite. Los mayores rendimientos de extracción se obtuvieron a partir de hojas de O. longifolia (1,75%) y frutos de Z. monophyllum (0,88%), mientras que el rendimiento más bajo se obtuvo partiendo de hojas de Z. rigidum (0,07%). Tabla 3-1 Rendimientos y constantes físicas de los aceites esenciales. ACEITE Frutos de Z. rhoifolium Frutos Z. monophyllum Frutos Z. fagara Hojas Z. fagara Hojas Z. rigidum Hojas O. longifolia Hojas Virola carinata FAMILIA Rutaceae Lauraceae Myristicaceae % RENDIMIENTO 0,46 0,88 0,55 0,18 0,07 1,75 0,42 DENSIDAD RELATIVA (25°C) 0,8941 0,9277 0,9630 0,9083 ND* 0,8758 0,8409 ÍNDICE DE REFRACCIÓN (25°C) 1,4479 1,4770 1,4992 1,4977 ND* 1,4864 1,4955 * Constantes físicas No Determinadas (ND) debido a consistencia resinosa del aceite esencial. Todos los aceites esenciales se analizaron por CG-EM en dos columnas, una polar: DBCARBOWAX y otra apolar: RTX-5. La determinación de los componentes de los aceites se realizó con base en criterios cromatográficos (IK) y espectroscópicos (EM, IE, 70 eV). El análisis por CG-EM de los aceites esenciales permitió la determinación de 66 sustancias, donde los metabolitos secundarios volátiles identificados en cada aceite esencial corresponden al 80-99% de la composición total y los componentes no identificados corresponden principalmente a sesquiterpenos. En la Tabla 3.2 se presentan los componentes determinados en cada uno de los aceites esenciales, según su orden de elución en la columna DB-5, con sus respectivos índices de retención y cantidades relativas determinadas con el detector selectivo a masas. Tabla 3-2 Composición química relativa de los aceites esenciales I K* N° COMPUESTOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 α-Tujeno α-Pineno Canfeno Sabineno β-Pineno β-Myrceno α-Felandreno δ-3-Careno α-Terpineno o-Cimeno Limoneno β-Felandreno 1,8-Cineol Z-β-Ocimeno E-β-Ocimeno γ-Terpineno Trans-4-thujanol α-Terpinoleno Cis-4-thujanol 2-Ciclohexen-1-ol Terpinen-4-ol α-Terpineol Dihidroneoisocarveol Acetato de sabineno hidratado Geraniol 2-Undecanona δ-Elemeno α-Cubebeno α-Copaeno Acetato de geranilo β-Elemeno γ-Cariofileno α-Gurjuneno β-Cariofileno α-Cariofileno γ-Elemeno α-Humuleno Alloaromadendreno DB-5 929 937 950 978 983 990 1002 1009 1016 1023 1032 1034 1037 1044 1053 1065 1072 1091 1100 1125 1176 1191 1229 1254 1256 1294 1337 1359 1375 1387 1398 1404 1409 1417 1422 1433 1453 1459 DB-WAX Frutos Z. rhoifolium 1024 1019 1119 1107 1163 1177 1147 1185 1250 1195 1165 1200 1224 1216 1230 Frutos Z. monophyllum 1,6 3,1 Frutos Z. fagara Área (%) Hojas Z. fagara 2,9 0,1 4,6 4,1 2,8 0,2 6,6 5,6 0,9 0,5 0,8 0,1 59,0 0,8 1,0 0,9 1,4 21,5 9,2 0,5 0,7 2,5 6,3 0,5 9,2 0,6 3,5 3,5 1,2 0,4 1500 1649 1826 Hojas V. carinata 0,5 0,9 4,7 3,6 0,7 0,4 0,9 0,5 0,2 0,2 0,2 0,6 1,4 0,1 0,7 0,8 1,3 0,8 0,7 0,4 74,0 1,9 0,3 0,7 0,3 0,8 1,8 2,2 2,9 0,1 4,9 0,3 0,1 2,2 61,5 0,6 1,7 1593 1630 1809 1680 1648 Hojas O. longifolia 0,4 4,0 0,2 25,7 1276 1475 1432 1462 1480 1678 1491 Hojas Z. rigidum 0,4 0,1 0,4 0,4 0,9 1,2 0,3 0,8 1,0 2,7 5,3 2,8 0,4 0,2 1,5 0,5 0,3 0,5 1,6 1,6 2,7 0,1 14,1 2,0 0,4 0,2 0,7 Capítulo 3 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 β-Cadineno γ-Muuroleno Germacreno D (+)-epi-biciclosesquifelandreno β-Salineno Biciclogermacreno Valenceno Germacreno A α-Muuroleno γ-Cadineno Isobutiralo de geranilo α-Panasinseno δ-Cadineno Cadina-1,4-dieno α-Cadineno Elemol Germacreno B Trans-1-nerolidol Germacreno D-4-ol (-)-Espatulenol Guaiol 10-α-Eudesm-4-en-11-ol γ-Eudesmol Hinesol tau-muurolol Torreyol β-Eudesmol α-Cadinol 5-Neo-cedranol Acetato de cariofileno E,E-Farnesol Acetato de α-bisabolol Acetato de E,E-farnesilo Monoterpenos Sesquiterpenos TOTAL 147 1470 1474 1479 1481 1485 1488 1491 1495 1499 1510 1514 1519 1522 1529 1533 1547 1552 1560 1573 1576 1601 1623 1631 1637 1640 1644 1649 1654 1680 1701 1725 1794 1850 ------- 1790 1701 1690 1644 1699 1705 1787 20,8 9,3 2,3 0,4 6,0 3,1 1,5 5,8 11,1 12,2 0,5 0,5 0,8 2,5 1,4 0,4 1730 1775 3,7 3,3 15,8 2,0 3,2 4,1 0,4 0,4 8,4 0,8 0,5 21,1 17,0 2,7 0,9 0,8 1,3 3,2 5,2 1,0 3,6 8,2 5,1 0,6 1,7 0,2 1,5 5,3 0,3 1,8 1765 2030 1692 2040 0,9 2060 1,2 1,9 0,3 2066 2208 2092 2212 2215 1,6 0,4 0,9 4,1 2279 1,3 ------- 1,6 13,1 0,8 80,2 17,0 97,2 71,7 18,6 90,3 0,2 0,3 7,1 87,6 94,7 1,0 1,1 0,8 0,5 0,8 4,8 0,4 13,6 73,5 87,1 14,9 69,1 84,0 93,1 5,6 98,7 66,2 26,4 92,6 Como se observa en la Tabla 3.2 los monoterpenos representan más del 70% de la composición química de los aceites de frutos de Z. rhoifolium (80,2%), frutos de Z. monophyllum (71,7%), hojas de O. longifolia (93,1%) y hojas de V. carinata (66,2%), y menos del 15% de la composición de los aceites esenciales de frutos de Z. fagara (7,1%), hojas de Z. fagara (13,6%) y hojas de Z. rigidum (14,9%), siendo los sesquiterpenos los componentes mayoritarios de estos tres últimos aceites, representando el 87,6%, 73,5% y 69,1% de la composición total, respectivamente. Los cinco aceites esenciales extraídos de especies del género Zanthoxylum presentan diferencias apreciables en cuanto a la composición química, sin embargo, los constituyentes volátiles encontrados han sido previamente reportados en otras especies de este género (Moura et al., 2006). En el aceite esencial de frutos de Z. rhoifolium fue posible determinar la presencia de ochos compuestos, siendo componentes mayoritarios: β-myrceno (59,0%), βfelandreno (21,5%), germacreno D (9,3%) y biciclogermacreno (3,1%). La abundancia de monoterpenoides y sesquiterpenoides en este aceite esencial está de acuerdo a lo presentado en una investigación previa de la composición química del aceite esencial de frutos de Z. rhoifolium (Gonzaga et al., 2003). Sin embargo, la composición química encontrada en esta investigación fue diferente a la reportada por Gonzaga, particularmente respecto a los constituyentes mayoritarios, sugiriendo una variabilidad considerable en la composición química de las muestras vegetales estudiadas, debido a la influencia del ambiente químico y ecológico en el que se encuentra cada planta (Spitaler et al., 2006). De las 33 sustancias determinadas en el aceite de frutos de Z. monophyllum, los componentes mayoritarios fueron sabineno (25,7%), 1,8-cineol (9,2%), trans-4-thujanol (9,2%) y cis-4-thujano (6,3%). El aceite esencial de frutos Z. fagara contiene principalmente germacreno D-4-ol (21,1%), elemol (8,4%), α-cadinol (8,2%), germacreno D (6,0%), biciclogermacreno (5,8%), tau-muurolol (5,2%) y 5-neo-cedranol (5,1%). En el aceite esencial de hojas de Z. rigidum se pudo determinar la presencia de 28 compuestos, siendo los Capítulo 3 149 constituyentes mayoritarios α-pineno (4,1%), β-pineno (5,6%), β-cariofileno (4,9%), γelemeno (14,1%), germacreno D (12,2%), α-muuroleno (15,8%) y β-eudesmol (4,8%). Los componentes mayoritarios encontrados en el aceite de hojas de Z. fagara son: δcadineno (17,0%), germacreno D (13,1%), biciclogermacreno (11,1%), β-pineno (6,6%), βcariofileno (5,3%) y tau-muurolol (5,3%). En este aceite se pudieron determinar 20 compuestos, siendo los sesquiterpenos las sustancias más abundantes. El carácter sesquiterpénico de este aceite esencial está de acuerdo con uno de los reportes bibliográficos que describe la composición del aceite de hojas de Z. fagara, en este caso obtenido por hidrodestilación (Pino et al., 2005), pero la composición química encontrada en este trabajo es cuantitativamente diferente. En otra investigación se reporta que el aceite esencial de hojas de Z. fagara obtenido por arrastre con vapor está compuesto principalmente por monoterpenoides (Setzer et al., 2005). Para el aceite esencial de hojas de O. longifolia se encuentra que los monoterpenos son los componentes más abundantes, representando el 93,1% de la composición total. De las 22 sustancias identificadas en el aceite, los componentes mayoritarios fueron α-felandreno (4,7%), α-terpinoleno (74,0%) y δ-3-careno (3,6%). El aceite esencial de O. longifolia es netamente de tipo terpenoide, coincidiendo con la naturaleza de los aceites esenciales de diferentes especies de Ocotea de Costa Rica (Chaverri et al., 2011; Chaverri y Cicció, 2007; Takaku et al., 2007; Chaverri y Cicció, 2005). Algunas especies del género Ocotea tienen características químicas diferentes a las encontradas para el aceite de hojas de O. longifolia. Diferentes estudios de los aceites esenciales de especies de Ocotea de Sur América y de África, indican que dichos aceites se caracterizan por la presencia de fenilpropanoides como safrol, O-metileugenol, cinamaldehídos y otros derivados de ácido benzoico (Guerrini et al., 2006; Pino et al, 2004; Menut et al., 2002; Lorenzo et al., 2001), que son los compuestos volátiles con olores distintivos de dichas especies, como es el caso del olor y sabor a canela del aceite esencial de hojas de O. quixos (Bruni et al., 2004). En el aceite esencial de hojas de V. carinata se logró determinar la presencia de once compuestos, entre monoterpenos y sesquiterpenos. Los componentes mayoritarios 150 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. corresponden a E-β-ocimeno (62,1%) y β-cadineno (20,8%). Son pocos los reportes sobre la composición química de aceites esenciales de especies del género Virola, y en estos se indica que dichos aceites contienen principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, y en menor proporción fenilpropanoides. En el aceite esencial de hojas de V. carinata no se pudieron identificar compuestos de tipo fenilpropanoide, como los que han sido encontrados en otras especies del género (Lopes et al., 1999; Lopes et al., 1997). Este trabajo constituye el primer reporte de la composición química de los aceites esenciales de frutos de Z. monophyllum, frutos de Z. fagara, hojas de Z. rigidum y hojas de O. longifolia. Los perfiles cromatográficos obtenidos para cada aceite esencial en la columna RTX-5 se encuentran en el Anexo A. Con el objetivo de evaluar la aplicabilidad de los aceites esenciales como insecticidas, se realizó un ensayo de toxicidad fumigante de los aceites sobre tres plagas de almacén: S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum, a una concentración máxima de 500 μL/L aire, para seleccionar los aceites con promisoria actividad. En la Tabla 3.3 se presentan los resultados de la actividad insecticida evaluada, expresados en porcentajes de mortalidad. Tabla 3-3 Resultados del ensayo de toxicidad fumigante de los aceites esenciales sobre tres plagas de almacén ACEITE ESENCIAL Hojas O. longifolia Hojas V. carinata. Hojas Z. rigidum Hojas Z. fagara Frutos Z. fagara Frutos Z. monophyllum Frutos Z. rhoifolium % Mortalidad a las 24 h de tratamiento (500 μL/L aire) * S. zeamais S. oryzae T. castaneum 70 ± 0 c 76 ± 6 a 100 ± 0 a 80 ± 7 b 76 ± 9 a 88 ± 5 b 0±0e 0±0c 6±5d 0±0e 0±0c 0±0d 0±0e 0±0c 0±0d 90 ± 0 a 82 ± 5 a 94 ± 6 ab 35 ± 5 d 36 ± 6 b 28 ± 8 c * Media ± 1DE de las tres repeticiones Los resultados del ensayo de actividad fumigante indican que tres de los siete aceites esenciales evaluados presentan actividad insecticida promisoria, pues exhiben porcentajes de mortalidad superiores al 60% a la dosis evaluada, siendo la especie T. castaneum la más sensible al tratamiento con los aceites esenciales. Los aceites de hojas de O. longifolia, Capítulo 3 151 hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum corresponden a las sustancias con las que se obtuvieron los mejores resultados de actividad insecticida. Debido a que estos tres aceites son interesantes para continuar con estudios de actividad insecticida más específicos, se decidió hacer un estudio para identificar algunos de los compuestos responsables de la actividad insecticida exhibida por los tres aceites esenciales mencionados anteriormente. Para ello, se adquirieron algunos de los componentes de tipo monoterpeno o monoterpenoide presentes en los aceites esenciales, siendo importante resaltar que solo fue posible adquirir los componentes mayoritarios del aceite esencial de hojas O. longifolia y uno de los componentes mayoritarios del aceite de frutos de Z. monophyllum, correspondiendo las demás sustancias a los componentes minoritarios. En total fueron 8 los compuestos que se adquirieron, que corresponden a: α-terpinoleno, δ-3-careno, α-felandreno, α-terpineno, γterpineno, β-mirceno, (+)-limoneno y 1,8-cineol. El objetivo de adquirir los compuestos puros era determinar la actividad fumigante de cada uno a una concentración máxima de 90 mg/L aire sobre las tres plagas de almacén y posteriormente cuantificar los compuestos activos en cada uno de los aceites esenciales en los que estuvieran presentes. En la Tabla 3.4 se presentan los resultados de la evaluación de la toxicidad fumigante de los nueve compuestos puros, evaluados a una concentración de 90 mg/L aire. Tabla 3-4 Resultados del ensayo de toxicidad fumigante de los compuestos puros sobre tres plagas de almacén COMPUESTO α-terpinoleno δ-3-careno α-felandreno α-terpineno γ-terpineno β-mirceno (+)-limoneno 1,8-cineol % Mortalidad a las 24 h de tratamiento (90 mg/L aire) * S. zeamais S. oryzae T. castaneum 73 ± 6 b 80 ± 0 d 97 ± 6 ba 80 ± 0 ba 83 ± 6 dc 90 ± 0 bc 77 ± 6 ba 87 ± 6 bdc 100 ± 0 a 90 ± 0 ba 97 ± 6 ba 87 ± 6 c 87 ± 6 ba 90 ± 0 bac 97 ± 6 ba 0±0c 0±0e 10 ± 0 d 83 ± 6 ba 87 ± 6 bdc 100 ± 0 a 97 ± 6 a 100 ± 0 a 100 ± 0 a * Media ± 1DE de las tres repeticiones Los resultados del ensayo de toxicidad fumigante realizado con los compuestos puros sobre las tres plagas de almacén indican que siete de los nueve compuestos evaluados causaron 152 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. mortalidades superiores al 70% sobre los insectos del género Sitophilus y mortalidades superiores al 85% en T. castaneum, siendo β-mirceno el compuesto inactivo. Teniendo en cuenta los resultados de actividad insecticida obtenidos con los nueve compuestos evaluados, se decidió hacer la cuantificación de α-terpinoleno, δ-3-careno, αfelandreno, α-terpineno, γ-terpineno, (+)-limoneno y 1,8-cineol que fueron las sustancias activas. Para realizar la respectiva cuantificación de los compuestos mencionados, se construyó una curva de calibración con cada uno de los compuestos, empleando en cada caso ocho concentraciones comprendidas entre 5 y 2000 ppm (Las curvas de calibración construidas con cada compuesto se encuentran en el Anexo B). En la Tabla 3.5 se presentan los resultados de la cuantificación de los compuestos activos en los aceites esenciales de frutos de Z. monophyllum, hojas de O. longifolia y hojas de V. carinata. Tabla 3-5 Concentración (ppm) de los compuestos puros activos en los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum. COMPUESTO α-terpinoleno δ-3-careno α-felandreno α-terpineno γ-terpineno (+)-limoneno 1,8-cineol CONCENTRACIÓN (% P/V) * Frutos Hojas Z. monophyllum O. longifolia 0,73 ± 0,02 55,59 ± 0,12 --2,33 ± 0,06 0,92 ± 0,02 3,94 ± 0,08 1,32 ± 0,05 1,18 ± 0,04 2,56 ± 0,04 0,79 ± 0,04 --1,43 ± 0,06 8,39 ± 0,06 --- Hojas V. carinata ----------1,59 ± 0,05 --- * Media ± 1DE de las tres repeticiones Una vez caracterizados los siete aceites esenciales estudiados y realizada la cuantificación de los componentes presentes en los aceites con actividad fumigante sobre las tres plagas de almacén, se continuó trabajando con las sustancias activas, realizando ensayos de actividad insecticida más específicos. Capítulo 3 153 3.2.2 Toxicidad fumigante de los aceites esenciales y de los monoterpenos y monoterpenoides activos Los toxicidad fumigante de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum y de los siete compuestos activos fue evaluada sobre las tres plagas de almacén empleando diferentes dosis de cada sustancia. Los resultados de este estudio se presentan en las Tablas 3.6 y 3.7, donde se reportan los valores de CL 50 . En la Tabla 3.6 se observa que los aceites esenciales tienen CL 50 inferiores a 300 µL/L aire, siendo el aceite de frutos de Z. monophyllum la sustancia más activa sobre las dos especies del género Sitophilus, mientras que el aceite de hojas de O. longifolia presentó la actividad fumigante más fuerte sobre adultos de T. castaneum (CL 50 = 36,0 µL/L aire). La actividad fuimigante de estos aceites está directamente relacionada con su composición química, pues al estar compuestos principalmente por sustancias volátiles y lipofílicas como los monoterpenoides, pueden penetrar en los insectos rápidamente e interferir en sus funciones fisiológicas (Negahban et al., 2006), siendo ésta la posible razón de la acción fumigante que están ejerciendo sobre los tres insectos plaga evaluados. Tabla 3-6 Concentraciones letales (CL 50 ) de los aceites esenciales de O. longifolia, V. carinata y Z. monophyllum (24 horas) sobre tres plagas de almacén. Aceite Hojas O. longifolia Frutos Z. monophyllum Hojas V. carinata S. zeamais 280,5 (212,2 – 350,3) 73,3 (69,8 – 79,2) 125,8 (101,2 – 172,5) CL 50 (µL/L aire) (LC* 95%) S. oryzae T. castaneum 271,3 36,0 (205,5 – 364,1) (33,6 – 38,4) 59,7 69,8 (53,9 – 65,3) (65,9 – 73,9) 185,7 75,6 (149,0 – 221,5) (71,5 – 80,4) * Entre paréntesis se encuentra el rango de Límite de Confianza del 95% La Tabla 3.7 resume los resultados de actividad fumigante de los siete monoterpenoides y monoterpenos presentes en los aceites esenciales. 154 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Tabla 3-7. Concentraciones letales (CL 50 ) de monoterpenos y monoterpenoides (24 horas) sobre tres plagas de almacén. Compuesto α-terpinoleno δ-3-careno α-felandreno α-terpineno γ-terpineno (+)-limoneno 1,8-cineol S. zeamais 80,6 (74,9 – 102,2) 57,6 (51,8 – 62,7) 72,7 (61,9 – 85,4) 56,2 (52,9 – 60,2) 45,9 (41,9 – 50,9) 41,4 (35,6 – 46,4) 28,3 (22,3 – 34,5) CL 50 (mg/L aire) * S. oryzae 77,3 (68,9 – 99,2) 47,3 (43,2 – 51,9) 69,3 (59,9 – 83,4) 48,0 (42,7 – 56,3) 43,2 (39,4 – 47,3) 39,4 (34,9 – 44,6) 24,9 (19,6 – 29,4) T. castaneum 37,1 (34,1 – 40,2) 44,0 (39,0 – 50,4) 25,6 (22,6 – 28,3) 28,8 (26,5 – 31,9) 24,2 (21,1 – 27,2) 22,8 (19,9 – 25,6) 33,9 (30,9 – 36,7) * Entre paréntesis se encuentra el rango de Límite de Confianza del 95% Los efectos tóxicos del aceite esencial de frutos de Z. monophyllum pueden ser atribuidos a la presencia de algunas sustancias nocivas para coleópteros como: 1,8-cineol, terpinen-4-ol, α-terpineno (Kordali et al., 2006; Lee et al., 2001), α-terpinoleno, α-felandreno (Park et al., 2003) y γ-terpineno (Kim et al., 2010; Lee et al., 2004), compuestos que han causado mortalidades superiores al 70% en especies del género Sitophilus y/o Tribolium a dosis inferiores a 50 mg/ L aire. La actividad fumigante del aceite de Z. monophyllum también está relacionada con la presencia de sabineno, pues esta sustancia es el componente mayoritario de dicho aceite, y además en un estudio de actividad insecticida realizado con este compuesto sobre S. zeamais se encontró que el sabineno causa un efecto tóxico fuerte sobre estos insectos (CL 50 = 9,2 mg/ L aire) (Wang et al., 2011). Debido a que con la CL 50 del aceite esencial de Z. monophyllum no se alcanzan a aplicar las CL 50 de los monoterpenos y monoterpenoides responsables de la actividad insecticida, es posible afirmar que la toxicidad fumigante del aceite es el resultado de la acción sinérgica de los compuestos activos y posiblemente de otras sustancias que ayudan a potenciar la actividad. La actividad fumigante del aceite esencial de hojas O. longifolia puede ser atribuida a la presencia de (+)-limoneno (Fang et al., 2010; Lee et al., 2001), α-terpinoleno, α-felandreno, Capítulo 3 155 α-terpineno y γ-terpineno, sustancias que han mostrado poseer importantes propiedades insecticidas contra diversos insectos plaga de almacén, incluidos los insectos evaluados en este trabajo. La actividad de este aceite esencial también se debe a la presencia del monoterpeno δ-3-careno, sustancia para la cual no se han reportado estudios de actividad insecticida sobre los insectos de almacén objeto de estudio, pero que ha exhibido actividad insecticida contra larvas de Aedes aegypti (Cheng et al., 2009) y sobre larvas y adultos del gorgojo de la papa Leptinotarsa decemlineata (Kordali et al., 2007). En este trabajo se reporta por primera vez la actividad fumigante del δ-3-careno contra S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum. Con la CL 50 determinada para el aceite de O. longifolia se logra aplicar una concentración superior a la CL 50 determinada para el α-terpinoleno, y concentraciones mucho menores a la CL 50 de (+)-limoneno, α-felandreno, α-terpineno y γ-terpineno, lo que indica que la actividad fumigante presentada por el aceite esencial de hojas de O. longifolia se debe principalmente al efecto tóxico del α-terpinoleno sobre los insectos, y que las demás sustancias contribuyen en menor medida a dicho efecto. El hecho de que con la CL 50 del aceite se obtenga una concentración superior a la CL 50 del α-terpinoleno, sugiere también la posible presencia de efectos antagonistas de algunos componentes del aceite esencial. La toxicidad exhibida por el aceite de hojas de V. carinata puede atribuirse a la presencia de Z-β-ocimeno (Sosa et al., 2012; Ogendo et al., 2008) y (+)-limoneno, compuestos que han presentado actividad insecticida promisoria sobre diferentes plagas de productos almacenados. Teniendo en cuenta la CL 50 encontrada para este aceite esencial, se tiene que al aplicar esta cantidad la concentración de Z-β-ocimeno y (+)-limoneno que se obtiene es muy inferior a la CL 50 reportada y encontrada para estas sustancias, indica que la fuerte acción fumigante del aceite está relacionada con la presencia de estos dos compuestos y que puede deberse también a un efecto tóxico que tenga el componente mayoritario (E-βocimeno) sobre los insectos y/o al efecto sinérgico que puede existir entre las sustancias activas presentes en el aceite esencial. Como se observa en la Tabla 3.7, en este trabajo se verificó la actividad fumigante de la mayoría de los compuestos a los que se les puede atribuir la actividad insecticida exhibida por los aceites esenciales. Es importante resaltar que de los siete compuestos encontrados 156 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. activos, el 1,8-cineol fue el monoterpeno más activo contra S. oryzae (CL y S. zemais (CL castaneum (CL 50 50 50 = 24,9 mg/L aire) = 28,3 mg/L aire); y (+)-limoneno la sustancia más activa contra T. = 22,8 mg/L aire). Adicional a la determinación del efecto fumigante de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum sobre tres plagas de almacén, se realizó un estudio del comportamiento de los insectos por un período de 8 horas, mientras eran tratados con las CL 50 de los aceites, con el objetivo de determinar si estas sustancias causaban un efecto “knockdown”. Las observaciones se registraron después de 1, 3, 6 y 8 horas de haber iniciado el tratamiento con el aceite esencial, tomando como muestra 100 insectos para el tratamiento con cada aceite. Con los insectos del género Sitophilus se obtuvieron las siguientes observaciones generales, que fueron comunes para los tres aceites esenciales: • 1 Hora: Todos los insectos están vivos. La mayoría están aglomerados a un lado del vial, ubicándose unos sobre otros. No suben por las paredes del vial. Su movimiento es rápido, pero no muy coordinado. Tienen dificultad para reincorporarse. Algunos insectos se encuentran dentro del vial de menor tamaño. • 3 Horas: Todos los insectos siguen vivos. El movimiento es lento. La mayoría se encuentran boca-arriba y les cuesta mucho trabajo reincorporarse. Algunos tienen la mandíbula un poco inclinada hacia el abdomen. Los movimientos de la mayoría son descoordinados. • 6 Horas: Siguen vivos todos los insectos. No pueden permanecer por mucho tiempo en pie. Algunos insectos solo mueven las patas y la cabeza cuando son estimulados. Es más evidente la dificultad que poseen los insectos para caminar y reincorporarse. • 8 Horas: Todos vivos. El 90% están boca-arriba y presentan mucha dificultad para levantarse. Aproximadamente el 60% mueve las patas y la cabeza solo cuando son estimulados. Algunos presentan movimientos aleatorios y repentinos, como si estuvieran convulsionando. El 30% de los insectos tiene las patas flexionadas y no pueden Capítulo 3 157 estirarlas con facilidad. Siguen aglomerados a un lado del vial. El 10% que puede caminar lo hace lentamente. Es importante resaltar que tanto S. zeamais como S. oryzae al ser tratados con el aceite de hojas de O. longifolia, después de seis horas presentan una secreción amarilla en la parte baja del abdomen y en la mandíbula. De acuerdo a las observaciones realizadas sobre el comportamiento de los insectos durante las primeras 8 horas del ensayo de toxicidad fumigante, es posible afirmar que los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum no tienen efecto “knockdown” sobre los insectos del género Sitophilus estudiados, pero a medida que avanza el tiempo de exposición de los insectos a cada aceite esencial se hacen más evidentes los efectos tóxicos de dichas sustancias, hasta llegar al punto de inmovilizar los insectos sin causar aún su muerte. Para el caso de T. castaneum, se encontraron las siguientes observaciones, comunes para los tres aceites esenciales, durante las 8 primeras horas del ensayo de toxicidad fumigante empleando la CL 50 de cada aceite: • 1 Hora: Todos los insectos están vivos. Presentan dificultad para ponerse en pie. Su movimiento es rápido, pero descoordinado. • 3 Horas: Todos los insectos siguen vivos. El movimiento es lento. Algunos presentan movimientos intermitentes que solo se producen cuando se mueve fuertemente el vial. Aproximadamente el 30% de los insectos tienen la cabeza ligeramente inclinada hacia el abdomen. Siguen presentando dificultad para dar la vuelta. • 6 Horas: Siguen vivos todos los insectos. Aproximadamente el 50% de los insectos no pueden caminar, moviendo solo las patas cuando son estimulados. El otro 50% camina lentamente y detienen su marcha constantemente. Algunos insectos que no pueden caminar presentan una evidente inflamación en el abdomen que se nota a simple vista, pues sale de los élitros. • 8 Horas: Todos los insectos vivos. Los insectos que pueden caminar, caminan hacia atrás con mucha dificultad y en zig-zag. El 70% de los insectos solo se mueven al ser 158 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. estimulados por el movimiento fuerte del vial y están boca-arriba. Se les nota inflamado el abdomen y tienden a tomar una coloración café oscura en el abdomen y tórax. Las anteriores observaciones indican que los aceites esenciales estudiados no tienen un efecto “knockdown” en adultos de T. castaneum, pero es evidente que a medida que pasa el tiempo el abdomen de los insectos se inflama (saliéndose de los élitros) y que su comportamiento cambia continuamente, síntomas que son causados por los efectos tóxicos de los aceites esenciales en esta plaga. Los resultados hasta aquí presentados indican que los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum son sustancias con acción fumigante promisoria para el control de insectos plagas como S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum, las cuales no ejercen efectos “knockdown” en los insectos tratados. El estudio de actividad fumigante realizado en este trabajo sobre las tres plagas de almacén corresponde al primer reporte de actividad insecticida de los aceites esenciales evaluados. 3.2.3 Toxicidad por contacto de los aceites esenciales Independiente de la variabilidad química de los aceites esenciales, el efecto tóxico de estas sustancias depende también de la vía de entrada al insecto. Los aceites pueden actuar sobre el organismo al ser inhalados por vía respiratoria, absorbidos a través de la cutícula y/o al ser ingeridos con la dieta. Con el objetivo de determinar si la mortalidad observada en el ensayo de toxicidad fumigante era causada por el efecto nocivo de los vapores del aceite o era producida por algún tipo de contacto del insecto con el aceite, se evaluó la toxicidad por contacto de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre las tres plagas de almacén. En la Tabla 3.8 se presentan los resultados del ensayo de toxicidad por contacto obtenidos con los tres aceites sobre las tres plagas, expresados como % mortalidad. Capítulo 3 159 Tabla 3-8 Resultados de toxicidad por contacto para los aceites esenciales de hojas O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre tres plagas de almacén. ACEITE Hojas O. longifolia Frutos Z. monophyllum Hojas V. carinata Cantidad Aplicada (µL) % Mortalidad S. zeamais 24 h 96 h % Mortalidad S. oryzae 24 h 96 h % Mortalidad T. castaneum 24 h 96 h 0,20 17 ± 6 c 80 ± 0 a 10 ± 0 bc 80 ± 0 a 7±6a 13 ± 5 a 0,15 13 ± 5 dc 63 ± 5 bc 7±6c 50 ± 0 c 0±0b 3 ± 3 ba 0,10 3±5e 27 ± 6 f 0±0c 17 ± 6 e 0±0b 0±0b 0,20 33 ± 5 a 53 ± 5 dc 27 ± 6 a 47 ± 6 c 0±0b 10 ± 0 ba 0,15 20 ± 0 bc 47 ± 6 de 10 ± 0 bc 40 ± 0 dc 0±0b 3 ± 3 ba 0,10 10 ± 0 dce 40 ± 0 e 7±6c 33 ± 5 d 0±0b 0±0b 0,20 33 ± 5 a 73 ± 5 ba 33 ± 5 a 67 ± 6 b 0±0b 3 ± 3 ba 0,15 30 ± 0 ba 60 ± 0 c 20 ± 0 ba 50 ± 0 c 0±0b 3 ± 3 ba 47 ± 6 de 10 ± 0 bc 40 ± 0 dc 0±0b 3 ± 3 ba 0,10 20 ± 0 bc * Media ± 1DE de las tres repeticiones Como se observa en la Tabla 3.8, después de 24 horas de aplicados los aceites esenciales (tres dosis diferentes) sobre el tórax de los adultos de T. castaneum, S. zeamais y S. oryzae, se encuentra que los porcentajes de mortalidad son bajos y no comparables con los observados en el ensayo de actividad fumigante, lo que indica que el contacto de los insectos con el aceite no es el causante de su muerte. Adicionalmente, como se mencionó en la metodología, para el caso de T. castaneum en el ensayo de toxicidad fumigante no se permitió el contacto de los insectos con el papel que contenía el aceite, lo que confirma que la muerte de los insectos fue causada por la inhalación de los aceites esenciales. Para el caso de los insectos del género Sitophilus se evaluaron dos condiciones, una en la que el insecto podía entrar en contacto con el papel que contenía el aceite y otra, en la que se hizo una modificación, evitando que el insecto entrara en contacto con el aceite, y en ambas situaciones se obtuvieron los mismos valores de CL 50 con los tres aceites, hecho que confirma que el efecto tóxico de los aceites es principalmente causado por la inhalación de los vapores de los aceites. El insecto más susceptible al contacto con los aceites esenciales fue S. zeamais, seguido de S. oryzae, mientras que T. castaneum mostró ser bastante resistente al contacto con los aceites esenciales, obteniéndose solo una mortalidad del 6,7% con la máxima dosis aplicada del aceite del hojas de O. longifolia, y mortalidades nulas con los otros dos aceites. Pasadas 160 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 96 horas después de aplicados los aceites, se aprecia que la mortalidad de los insectos del género Sitophilus aumenta considerablemente, obteniéndose las mortalidades más altas con el aceite esencial de hojas de O. longifolia. En el caso de T. castaneum la mortalidad también aumenta a las 96 horas, sin embargo los valores de % de mortalidad siguen siendo muy bajos (<15%). La baja mortalidad observada en los adultos de T. castaneum puede deberse a que en la cutícula de este insecto es más resistente a ser traspasada por lo compuestos tóxicos presentes en los aceites, lo cual podría explicarse por la presencia sustancias que tienen la capacidad de solubilizar y retener dichos compuestos evitando que ingresen al organismo, hecho que debería verificarse experimentalmente mediante un análisis de la cutícula de los tres insectos plaga. Los resultados de toxicidad por contacto de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre S. oryzae, S. zeamais y T. castaneum presentados en este trabajo constituyen el primer reporte de esta actividad para los aceites mencionados. 3.2.4 Actividad repelente de los aceites esenciales La búsqueda de alimento, la selección de lugares adecuados para la oviposición, la búsqueda de pareja y la respuesta a sustancias atrayentes y/o repelentes por parte de los insectos depende en gran medida de la quimiorrecepción a distancia (olfato) y de contacto (gusto). Debido a esto, el comportamiento de los insectos depende más de las señales químicas que de otro tipo de estímulo (Dahanukar et al., 2005). Con el objetivo de determinar si los aceites esenciales tienen efectos atrayentes o repelentes sobre los insectos plaga objeto de estudio, se evaluó la actividad repelente de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata empleando el método de área de preferencia. En la Tabla 3.9 se presentan los resultados de actividad repelente obtenidos con los tres aceites esenciales, expresados como % de repelencia. Capítulo 3 161 Como se observa en la Tabla 3.9, todos los aceites esenciales presentaron alguna actividad repelente sobre las tres plagas de almacén, siguiendo una directa relación dosis-respuesta. El aceite esencial de hojas de V. carinata presentó la mayor actividad repelente sobre las tres plagas, exhibiendo porcentajes de repelencia (%R) superiores a 55% en las dos primeras horas de ensayo, y %R superiores a 65% a las 24 horas de iniciado el ensayo. El efecto repelente más fuerte de este aceite esencial se presentó sobre los adultos de T. castaneum, mientras que los adultos de S. oryzae fueron los insectos sobre los que tuvo el menor efecto repelente. Los resultados obtenidos con el aceite esencial de hojas de V. carinata en los dos tiempos de exposición estudiados fueron similares, encontrándose efectos repelentes ligeramente mayores a las 24 horas. Los %R obtenidos con este aceite esencial fueron mejores que los obtenidos con el repelente comercial IR3535 en todas las concentraciones evaluadas. Tabla 3-9 Resultados de la actividad repelente de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia, frutos de Z. monophyllum y hojas de V. carinata sobre tres plagas de almacén ACEITE Concentración (%) S. zeamais 2h 24 h 52 ± 8 bc 48 ± 8 c 0,252 Hojas 42 ± 8 c 38 ± 5 dc 0,126 O. longifolia 26 ± 9 de 20 ± 0 fe 0,063 40 ± 0 dc 32 ± 8 de 0,252 Frutos 24 ± 9 fe 18 ± 5 fg 0,126 Z. monophyllum 10 ± 7 f 6±5g 0,063 82 ± 5 a 0,252 72 ± 5 a Aceite hojas 66 ± 6 b 0,126 60 ± 0 ba V. carinata 50 ± 7 c 0,063 46 ± 6 bc 0,252 48 ± 9 bc 40 ± 7 dc IR3535 0,126 18 ± 5 fe 14 ± 5 fg 0,063 12 ± 5 fe 10 ± 7 fg * Media ± 1DE de las cinco repeticiones % REPELENCIA S. oryzae 2h 24 h 42 ± 5 cb 38 ± 5 b 32 ± 5 cd 24 ± 6 c 20 ± 0 ef 14 ± 6 dc 28 ± 5 ed 22 ± 5 c 12 ± 8 f 8±5d 0±0g - 20 ± 0 e 56 ± 9 a 66 ± 9 a 48 ± 8 b 40 ± 0 cb 24 ± 6 c 20 ± 0 ef 44 ± 6 b 38 ± 8 b 14 ± 5 f 12 ± 5 dc 10 ± 6 gf 6±5d T. castaneum 2h 24 h 86 ± 6 b 92 ± 5 ba 52 ± 5 e 58 ± 5 e 30 ± 10 f 36 ± 6 f 100 ± 0 a 100 ± 0 a 80 ± 7 bc 84 ± 6 bc 60 ± 7 de 66 ± 9 e 100 ± 0 a 100 ± 0 a 92 ± 5 ba 100 ± 0 a 60 ± 7 de 68 ± 8 de 80 ± 7 bc 76 ± 5 dc 70 ± 7 dc 68 ± 5 de 50 ± 7 e 44 ± 6 f El aceite esencial de frutos de Z. monophyllum fue el aceite que presentó el menor efecto repelente sobre los insectos del género Sitophilus, obteniéndose %R iguales o inferiores a 40% en todas las concentraciones evaluadas, siendo menores que los valores encontrados para estas dos plagas con el repelente comercial IR3535, obteniendo los mayores %R después de dos horas de tratamiento. Es importante resaltar que con este aceite, a la mínima concentración evaluada, mostró propiedades atrayentes de los adultos de S. oryzae 162 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. después de 24 horas de exposición a esta sustancia. Para el caso de T. castaneum, el aceite de frutos de Z. monophyllum también exhibió una fuerte actividad repelente con todas las concentraciones de aceite evaluadas, obteniendo %R superiores a los encontrados para este insecto con el repelente comercial IR3535. Con el aceite esencial de hojas de O. longifolia se obtuvo una actividad repelente moderada sobre S. zemais y S. oryzae, presentando porcentajes de repelencia menores o iguales a 52% con las tres concentraciones evaluadas, tanto a las 2 como a las 24 horas, obteniéndose efectos repelentes similares a los causados por el repelente comercial. Para el caso de T. castaneum, el aceite esencial causó altos porcentajes de repelencia (≥ 85%) a la máxima concentración evaluada tanto a las 2 como a las 24 horas. Con las otras dos concentraciones, la actividad repelente del aceite fue moderada. Con el aceite de hojas de O. longifolia se obtienen efectos repelentes más fuertes sobre T. castaneum que los causados por el repelente comercial. Los efectos repelentes de los aceites esenciales de hojas de O. longifolia y frutos de Z. monophyllum se redujeron en algunos casos con el paso del tiempo, lo que podría deberse a que los efectos protectores de estos aceites se desvanecen rápidamente debido la volatilización de los principios activos, pues como se pudo observar en la Tabla 3.2, estos aceites están compuestos principalmente por monoterpenoides de bajo peso molecular altamente volátiles, lo que facilita su difusión y dilución continua en las corrientes de aire circundantes (Caballero-Gallardo et al., 2011; Nerio et al., 2010; Oyedele et al., 2002). Por esta razón en la literatura (Nerio et al., 2010) se propone que las formulaciones basadas en aceites esenciales para el control de insectos se preparen con matrices que permitan la liberación controlada de las sustancias de interés, para de esta forma reducir las pérdidas de los principios activos y prolongar los efectos repelentes. Los resultados de actividad repelente obtenidos con los tres aceites esenciales sobre las tres plagas de almacén constituyen el primer reporte de actividad repelente de los aceites evaluados e indican que estas sustancias presentan promisoria actividad repelente sobre los insectos, en algunos casos ejerciendo una mayor actividad que el producto comercial Capítulo 3 163 IR3535, lo que los convierte en una posible alternativa frente a los productos comerciales para el control de las tres plagas objeto de estudio. 3.2.5 Actividad antialimentaria de los aceites esenciales y de algunos monoterpenos Las sustancias antialimentarias se caracterizan por modificar el comportamiento de los insectos provocando la disuasión de la alimentación (actividad antialimentaria o fagodisuasiva). La definición anterior, excluye a las sustancias que inhiben la alimentación de los insectos al actuar sobre el sistema nervioso central (después de la ingestión o por absorción), y a sustancias que tienen toxicidad sub-letal para el insecto (Koul et al., 2005). La actividad fagodisuasiva de las sustancias puede clasificarse como nula, débil, moderada o fuerte teniendo en cuenta los valores de los índices de disuasión alimentaria (IDA) de acuerdo a los criterios establecidos por Liu y colaboradores (2007), que se presentan a continuación: % IDA < 20% - No disuasión alimentaria 50% > % IDA ≥ 20% + Disuasión alimentaria débil 70% > % IDA ≥ 50% ++ Disuasión alimentaria moderada % IDA ≥ 70% +++ Disuasión alimentaria fuerte Para evaluar la actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales y de tres monoterpenos se empleó un ensayo de no elección realizado con pequeños discos de harina. Los índices de disuasión alimentaria causados sobre S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum después de ser alimentados con dieta tratada con los monoterpenos (100 y 300 ppm) y los aceites esenciales de hojas de V. carinata, frutos de Z. monophyllum y hojas de O. longifolia (1000 y 500 ppm) se presentan en la Tabla 3.10. Es importante resaltar que no se obtuvo mortalidad de los insectos con los tres aceites esenciales y los tres monoterpenos evaluados durante las 72 horas que duró el ensayo, lo que indica que ninguna de las sustancias evaluadas causa efectos tóxicos post-ingesta en los insectos plaga objeto de estudio. 164 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. En la Tabla 3.10 se observa que el aceite esencial de frutos de Z. monophyllum a la máxima concentración evaluada (1000 ppm) causa los mayores efectos fagodisuasivos sobre los tres insectos, produciendo índices de disuasión alimentaria (IDA) inferiores a 45% en los insectos del género Sitophilus, valores que corresponden a una actividad antialimentaria débil, mientras que sobre adultos de T. castaneum se obtuvo un IDA de 71,3% indicando una actividad antialimentaria fuerte. Cuando la concentración de este aceite esencial disminuye en el alimento (500 ppm), la actividad disminuye drásticamente, a tal punto que la actividad antialimentaria pasa de débil a nula en el caso de S. oryzae y S. zeamais, y de fuerte a débil en el caso de adultos de T. castaneum. Tabla 3-10 Resultados de actividad fagodisuasiva de los aceites esenciales y monoterpenos sobre tres plagas de almacén. ÍNDICE DISUASIÓN ALIMENTARIA - IDA (%) * CONCENTRACIÓN (ppm) S. zeamais S. oryzae T. castaneum Aceite hojas O. longifolia 1000 40,0 ± 1,1 c 47,0 ± 1,4 b 32,6 ± 0,2 dc 500 27,5 ± 0,8 d 34,5 ± 0,6 c 25,6 ± 0,3 def Aceite frutos Z. monophyllum 1000 44,7 ± 1,3 b 42,5 ± 1,2 b 71,4 ± 0,3 a 500 8,7 ± 0,4 g 5,4 ± 0,2 f 30,7 ± 0,2 dc Aceite hojas V. carinata 1000 27,1 ± 0,7 d 25,4 ± 0,8 d 36,3 ± 0,8 c 500 15,4 ± 0,8 f 12,8 ± 0,7 e 26,7 ± 0,6 de 300 20,8 ± 1,7 e 24,8 ± 3,7 d 18,1 ± 4,2 gf 100 13,9 ± 1,5 f 15,9 ± 2,5 e 12,9 ± 1,5 gh 300 45,7 ± 2,7 b 43,1 ± 4,4 b 20,7 ± 4,7 gef 100 43,7 ± 2,4 cb 42,6 ± 3,4 b 13,1 ± 3,2 gh 300 28,1 ± 0,9 d 29,3 ± 1,7 dc 19,3 ± 2,4 gef 100 8,9 ± 1,0 g 10,5 ± 3,0 fe 8,5 ± 1,6 h 500 60,1 ± 3,0 a 55,5 ± 4,5 a * Media ± 1DE de las cuatro repeticiones 46,7 ± 8,3 b SUSTANCIA α-terpinoleno α-felandreno δ-3-careno Extracto Neem El aceite esencial de hojas de V. carinata fue el aceite que causó el menor efecto fagodisuasivo sobre los tres insectos, presentando una actividad antialimentaria débil a la máxima concentración evaluada, siendo más activo sobre T. castaneum. Con este aceite también se encuentra que al disminuir la concentración, la actividad disminuye considerablemente. Capítulo 3 165 Para el caso del aceite esencial de hojas de O. longifolia se encuentra que también presenta actividad antialimentaria débil sobre las tres plagas de almacén, causando los mayores efectos fagodisuasivos sobre adultos de S. oryzae (IDA = 47,0%) a las dos concentraciones evaluadas. Con este aceite esencial también se observa una clara y directa relación dosisrespuesta, pero en este caso al disminuir la dosis de 1000 a 500 ppm no se pierde completamente la actividad como en el caso de los otros dos aceites esenciales, pues la actividad sigue siendo débil sobre las tres plagas. Debido a que fue posible conseguir comercialmente los componentes mayoritarios de este aceite, que corresponden a αterpinoleno, δ-3-careno y α-felandreno, decidimos evaluar la actividad fagodisuasiva de estas sustancias para determinar si eran responsables de la actividad antialimentaria exhibida por el aceite esencial de O. longifolia. Como se observa en la Tabla 3.10, los tres monoterpenos presentaron actividad antialimentaria débil sobre los insectos del género Sitophilus a la concentración de 300 ppm, siendo α-felandreno el compuesto más activo y α-terpinoleno el menos activo. Para el caso de T. castaneum se encontró que se obtuvo una actividad antialimentaria muy débil con α-felandreno a la concentración de 300 ppm, mientras que no se registró actividad fagodisuasiva con los otros dos monoterpenos. La actividad antialimentaria de α-terpinoleno y δ-3-careno también presenta una directa relación dosisrespuesta con los tres insectos; y para α-felandreno se encuentra que al disminuir la concentración de este compuesto en el alimento la actividad antialimentaria se mantiene. Los anteriores resultados indican que la actividad antialimentaria que presenta el aceite esencial de hojas de O. longifolia sobre S. oryzae y S. zeamais esta dierctamente relacionada con la presencia de α-terpinoleno, δ-3-careno y α-felandreno en este aceite, pues estos tres compuestos causaron algún grado de inhibición de la alimentación de dichos insectos. Para el caso de T. castaneum, es posible inferir que de los tres monoterpenos evaluados sólo el αfelandreno parece estar relacionado con la débil actividad antialimentaria que presentó el aceite sobre esta plaga. De acuerdo con los resultados encontrados, se puede notar que es posible reducir notablemente el grado de alimentación de los insectos plaga con los tres aceites esenciales a una concentración de 1000 ppm y con α-felandreno a una concentración de 300 ppm, hecho que puede influir posteriormente en la reproducción de los adultos y/o en la 166 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. emergencia, crecimiento y desarrollo de las nuevas generaciones de insectos, efectos que solo podrían se causados por la falta de alimento, más no por la toxicidad de los aceites y monoterpenos, ya que no se observó mortalidad de los insectos después de ingerir el alimento tratado durante los tres días que duro el ensayo. El estudio de actividad antialimentaria sobre S. zeamais, S. oryzae y T. castaneum realizado en este trabajo, corresponde al primer reporte de efectos fagodisuasivos sobre insectos de productos almacenados de los aceites de hojas de V. carinata, frutos de Z. monophyllum y hojas de O. longifolia, y de los compuestos α-terpinoleno, δ-3-careno y α-felandreno. 3.2.6 Efecto de los aceites esenciales y de algunos monoterpenos en la reproducción de T. castaneum Las sustancias esterilizantes o inhibidoras de la reproducción son sustancias químicas que detienen o afectan negativamente la capacidad reproductiva evitando la producción de óvulos o esperma, ya sea causando la muerte de los espermatozoides y los óvulos después de que hayan sido producidos, por la producción de mutaciones letales, o porque dañan gravemente el material genético en el esperma y óvulos (Collins, 2006). La información sobre el efecto de sustancias naturales quimioesterilizantes en insectos de productos almacenados es limitado (Khater, 2012; Papachristos y Stamopoulos, 2002; Fields et al., 2001; RegnaultRoger y Hamraoui, 1995). La búsqueda de sustancias quimioesterilizantes es de interés para los programas integrados de control de plagas, pues con estas sustancias es posible evitar la proliferación de las plagas e interrumpir su ciclo de vida, y además reducir la posibilidad de aparición de resistencia por parte de las plagas. Teniendo en cuenta las anteriores consideraciones, y con el objetivo de evaluar los efectos post-tratamiento de los aceites de hojas de O. longifolia, hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum y de tres monoterpenos en adultos de T. castaneum, se estudió el efecto de estas sustancias en la reproducción y ciclo de vida de T. castaneum, luego de que hembras y machos por separado se trataran con la CL 50 de cada una de las sustancias evaluadas. En la Tabla 3.11 se presentan los resultados de las cuatro lecturas del número de huevos y/o insectos (larva, pupa o adulto) que se obtuvieron para cada una de las parejas formadas con Capítulo 3 167 los adultos de T. castaneum (hembras y machos) tratados, durante los 45 días que duro el estudio de los efectos post-tratamiento. Tabla 3-11 Resultados del estudio del efecto post-tratamiento de adultos de T. castaneum con las CL 50 de los aceites esenciales y monoterpenos. Muestra Pareja CONTROL M st y H st H trat. y M trat. H trat. y M st # de huevos y/o insectos 5 días 15 días 25 días 35 días 45 días 61 H 45 L 10 A + 35 P 45 A 45 A 48 H 29 L 18 A + 11 P 29 A 29 A 53 H 42 L 20 A + 22 P 42 A 42 A H st. y M trat H trat. y M trat. H trat. y M st 46 H 35 L 19 A + 16 P 35 A 35 A 8H -- -- -- -- 7H 5L 3A+2P 5A 5A H st. y M trat H trat. y M trat. H trat. y M st 18 H 9L 2A+7P 9A 9A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 22 H 6L 1A+5P 6A 6A α-terpinoleno (37,1 mg/ L aire) H st. y M trat H trat. y M trat. H trat. y M st 18 H 12 L 3A+9P 12 A 12 A 24 H 18 L 5 A + 13 P 18 A 18 A 21 H 11 L 2A+9P 11 A 11 A δ-3-careno (44,0 mg/ L aire) H st. y M trat H trat. y M trat. H trat. y M st 3H 1L 1P 1A 1A 13 H 10 L 10 P 10 A 10 A 17 H 8L 8P 8A 8A α-felandreno (25,6 mg/ L aire) H st. y M trat H trat. y M trat. H trat. y M st 15 H 9L 9P 9P 9A 35 H 25 L 25 P 15 A + 10 P 25 A H st. y M trat 45 H 30 L 30 P 10 A + 20P 30 A Aceite hojas O. longifolia (36,0 μg/ L aire) Aceite frutos Z. monophyllum (69,8 μg/ L aire) Aceite hojas V. carinata (75,6 μg/ L aire) En la tabla anterior se observa que el ciclo de vida de T. castaneum se lleva a cabo en 35 días, de acuerdo a los resultados obtenidos con el control. Teniendo en cuenta lo anterior, se encuentra que con los tres aceites esenciales y con los monoterpenos α-terpinoleno y δ-3careno el tiempo del ciclo de vida de T. castaneum no se ve afectado, pues al igual que en el control, la emergencia de los adultos se obtiene a los 35 días. Para el caso de α-felandreno se observa que el ciclo de vida del insecto se alarga en un período de 10 días, pues a los 35 días solo han emergido entre el 20% y el 50% de los adultos, obteniéndose la emergencia 168 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. total de adultos a los 45 días. En la Tabla 3.11 también se observa que con todas las sustancias con las que fueron tratados los insectos hembras y machos de T. castaneum se logra inhibir en algún grado la oviposición, siendo el aceite de hojas de V. carinata la sustancia que más inhibe este proceso. Los resultados obtenidos con el aceite esencial de hojas de O. longifolia indican que este aceite inhibe moderadamente la oviposición de T. castaneum cuando se han tratado las hembras y los machos y cuando solo han sido tratados los machos. Cuando se tratan solo las hembras con el aceite, la inhibición de la oviposición es baja. De acuerdo a lo anterior, se puede deducir que el efecto del aceite sobre los machos es mayor que sobre las hembras, hecho que se evidencia al comprar los resultados obtenidos para la pareja H st + M trat con los de la pareja H trat + M st , pues se observa que la inhibición de la oviposición con la primera pareja es superior al 20%, mientras que con la segunda la inhibición es del 13%. Cuando los insectos hembra y macho son tratados, la inhibición de la oviposición es similar a la obtenida con la pareja en la que solo el macho fue tratado. Para el caso de los monoterpenos mayoritarios del aceite esencial de hojas de O. longifolia, se encuentra que con δ-3-careno la inhibición de la oviposición es superior a 70% para las tres parejas, siendo el monoterpeno más activo. Con el α-terpinoleno los porcentajes de inhibición son ≥ 60% para las tres parejas analizadas. El α-felandreno resultó ser el monoterpeno que menos inhibe la oviposición, obteniéndose los mejores resultados con la pareja formada por los dos insectos tratados (inhibición del 75,5%). Con el aceite esencial de frutos de Z. monophyllum se logró obtener una inhbición de la oviposición superior al 72% para las tres parejas estudiadas. Comparando los resultados obtenidos con las tres parejas con los obtenidos para la pareja control, se encuentra que tanto la hembra como el macho sufren serias afectaciones en su capacidad de reproducirse, pero las hembras son las que más tienen afectada su fecundidad, pues al comparar el número de huevos puestos por la hembra de la pareja H st + M trat con los de la pareja H trat + M st, se observa que para la primera pareja se obtiene una mayor oviposición (inhibición del 72,1%), mientras que para la segunda pareja se obtiene una inhibición del 88,5%. Capítulo 3 169 El aceite esencial de hojas de V. carinata inhibió completamente la oviposición de las hembras de las parejas conformadas por H trat + M st y H trat + M trat , e inhibió en un 63,9% la oviposición de la hembra de la pareja H st + M trat . De acuerdo a los resultados anteriores, es posible inferir que la fecundidad de la hembra es la que se ve más afectada al ser tratada con la CL 50 de este aceite esecial. Los porcentajes mencionados anteriormente se calculan de acuerdo al número de huevos puestos por la hembra en cada pareja analizada comparados con los huevos puestos por la hembra de la pareja control. Analizando ahora la fertilidad o viabilidad de los huevos puestos por la hembra de cada una de las 3 parejas analizadas después de que los insectos fueran tratados con la CL 50 de los tres aceites esenciales y los tres monoterpenos, se encuentran los resultados que aparecen en la Figura 3.1, en donde se muestra el porcentaje de eclosión de los huevos correspondientes a cada pareja de acuerdo a la sustancia con la que fueron tratados los insectos, comparando en todos los casos con el porcentaje de eclosión de los huevos correspondientes a la pareja control que tienen un porcentaje de eclosión del 73,8%. En la Figura 3.1A se observa que cuando las hembras y los machos fueron tratados con la CL 50 de cada sustancia evaluadas, se reduce apreciablemente la fertilidad de los huevos. Con el aceite de O. longifolia el porcentaje de eclosión se reduce un 13%, y con los componentes mayoritarios de este aceite la reducción del porcentaje de eclosión se da de la siguiente manera: con α-terpinoleno se reduce en 7%, con δ-3-careno se reduce un 40% y con α-felandreno el % de eclosión se reduce en 13%. De acuerdo con los resultados anteriores, se puede afirmar que los tres componentes mayoritarios del aceite de O. longifolia contribuyen en el efecto negativo sobre la fecundidad y la fertilidad que ejerce esta sustancia en adultos de T. castaneum. Observando ahora el porcentaje de eclosión encontrado para el aceite de Z. monophyllum se encuentra que no hubo eclosión de los huevos, lo que indica que este aceite además de inhibir fuertemente la oviposición también es responsable de la infertilidad de los pocos huevos que la hembra de T. castaneum es capaz de poner cuando se tiene la pareja conformada por el macho y hembra tratados. El porcentaje nulo de 170 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. eclosión obtenido con el aceite de hojas de V. carinata era de esperarse, pues esta sustancia inhibió completamente la oviposición en la pareja conformada por hembra y macho tratados. A % ECLOSIÓN % de eclosión de los huevos correspondientes a las parejas en las que hembra y macho han sido tratados 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SUSTANCIA B % ECLOSIÓN % de eclosión de los huevos correspondientes a las parejas en las que solo la hembra ha sido tratada 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SUSTANCIA % de eclosión de los huevos correspondientes a las parejas en las que solo el macho ha sido tratado % ECLOSIÓN C 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SUSTANCIA Capítulo 3 171 Figura 3-1 Graficas de lo resultados del efecto de los aceites esenciales y monoterpenos en la eclosión de los huevos. A) resultados para la pareja H trat + M trat ; B) resultados para la pareja H trat + M st ; C) resultados para la pareja H st + M trat Los resultados presentados en la Figura 3.1B correspondientes al efecto de los aceites y monoterpenos en la viabilidad de los huevos ovipositados por las hembra de las parejas en las que solo ha sido tratada la hembra con la sustancia de intéres, indican que a pesar de que la oviposición se redujo con las seis sustacias evaluadas, el porcentaje de eclosión de los huevos obtenido para el tratamiento con los aceites esenciales de hojas de O.longifolia y frutos de Z. monophyllum y con los tres monoterpenos, no presento diferencias significativas con el porcentaje de eclosión de los huevos puestos por la hembra de la pareja control. Estos resultados sugieren que el hecho de que la fecundidad de la hembra se reduzca por la acción de las sustancias mencionadas (posiblemente por inhibir la producción de óvulos), no implica que los huevos ovipositados sean inviables. Para el caso del aceite esencial de hojas de V. carinata, se esperaba que el porcentaje de eclosión fuer igual a 0,0%, pues como se observa en la Tabla 3.12, no hubo oviposición de la hembra de la pareja H trat + M st . En la Figura 3.1C se observa que la viabilidad de los huevos que oviposita la hembra de las parejas en las que el macho ha sido tratado disminuye significativamente con los aceites esenciales de hojas de V. carinata y frutos de Z. monophyllum y con los tres monoterpenos evaluados. En este caso con el aceite de V. carinata se obtiene el porcentaje de eclosión más bajo (27,3%), mientras qe con α-felandreno la fertilidad de los huevos se reduce solo en un 7% respecto al control. Teniendo en cuenta los resultados observados en la Figura 3.1B y 3.1C, es posible intuir que se afecta más la calidad de los espermatozoides cuando el macho esta expuesto a estas sustancias que la calidad de los óvulos cuando la hembra es tratada, pues para el último caso no se observó reducción el los porcentajes de eclosión. Es importante resaltar que al tratar los machos con el aceite esencial de hojas de O. longifolia no se observa reducción del porcentaje de eclosión de los huevos con respecto al control. Observando nuevamente los resultados mostrados en la Tabla 3.12 se puede ver que una vez eclosionados los huevos, el desarrollo de los insectos no se ve interumpido en la todas las parejas analizadas, pues el número de adultos emergidos es igual al número de huevos viables, lo que indica que el efecto inhibitorio de la reproducción causado por las sustancias 172 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. evaluadas se evidencia en la inhibición de la oviposición y en la disminución del % de huevos viables. La implicación práctica de anteriores hallazgos es que cuando T. castaneum está expuesto a los vapores de los aceites esenciales y monoterpenos evaluados, se puede lograr un control satisfactorio aún cuando algunos insectos sobrevivan al tratamiento. 3.2.7 Estudio de inhibición in-vitro de la acetilcolinesterasa (AChE) La acción de los aceites esenciales y de sus componentes en los insectos podría ser neurotóxica, causando síntomas similares a los producidos por pesticidas organofosforados y carbamatos (Isman, 2000), hecho que está relacionado con la inhibición de AChE (Ryan y Byrne, 1988). Teniendo en cuenta estas consideraciones y con el objetivo de conocer el posible mecanismo de acción de las sustancias que exhibieron promisoria actividad fumigante sobre las tres plagas de almacén, se estudió la inhibición de la AChE causada por los aceites de frutos de Z. monophyllum, hojas de V. carinata y O. longifolia y los monoterpenos α-terpinoleno, δ-3-careno y α-felandreno. Para el estudio de la inhibición de la enzima se empleó el método de Ellman, siguiendo la reacción enzimática que se presenta en la Figura 3.2. H2O + (CH3)3N-CH2CH2-S-CO-CH3 Inhibidor (CH3)3N-CH2CH2-S + CH3COO + 2H AChE OH HO + O O DTNB O2N S S NO2 HO O S O O2N HO + O2N Figura 3-2 Reacción enzimática – Método Ellman S-S-CH2CH2-N(CH3)3 Capítulo 3 173 El comportamiento cinético de la reacción esta descrito por la ecuación de Michaelis-Menten, que relaciona la velocidad de reacción con la concentración del sustrato: 𝑉= 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝐾𝑀 + [𝑆] En la Figura 3.3 se presentan los resultados obtenidos al representar la velocidad frente a la concentración de sustrato cuando la reacción enzimática (con la enzima extraída del insecto) se lleva a cabo en presencia de un inhibidor (aceite esencial o monoterpeno) a diferentes concentraciones. En las gráficas mostradas en la Figura 3.3 se encuentra que se obtienen curvas bien definidas de forma sigmoidea, lo que confirma que la reacción enzimática estudiada presenta una cinética Michaeliana, en donde conforme va amentando la concentración de sustrato aumenta también la velocidad de reacción. En las gráficas también es posible notar que al aumentar la concentración del inhibidor disminuye apreciablemente la actividad enzimática, observando claras diferencias entre las velocidades de reacción obtenidas para el control y las obtenidas con las sustancias empleadas como inhibidores a diferentes dosis. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos sobre los efectos de cada uno de los inhibidores en la AChE, se calcularon las concentraciones inhibitorias 50 (CI 50 ) para cada sustancia evaluada. En la Tabla 3.12 se presentan los valores de CI 50 para los tres aceites y los tres monoterpenos evaluados como inhibidores de la AChE obtenida de S. oryzae. 174 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Figura 3-3 Gráficas de velocidad vs concentración de sustrato para diferentes concentraciones de inhibidor (aceites esenciales y monoterpenos) para la AChE extraída de S. oryzae. De los aceites esenciales evaluados, el aceite de hojas de V. carinata fue que el causó la mayor inhibición de la enzima a las concentraciones evaluadas, exhibiendo una CI 50 = 43,82 ppm. El efecto causado por este aceite puede deberse a la presencia de compuestos como α-pineno, β-pineno y limoneno, monoterpenos que han producido efectos inhibitorios sobre la Capítulo 3 175 enzima AChE obtenida de diferentes fuentes (Arruda et al., 2012; Aazza et al., 2011; Miyazawa y Yamaguji, 2005). Este es el primer reporte de la actividad inhibitoria de la AChE para el aceite esencial de hojas de V. carinata. Tabla 3-12 Inhibición de la actividad de la AChE causada por los aceites esenciales y monoterpenos (CI 50 ) SUSTANCIA EVALUADA Aceite frutos Z. monophyllum Aceite hojas V. carinata Aceite hojas O. longifolia δ-3-careno α-terpinoleno α-felandreno CI 50 * 228,85 ± 33,85 ppm 43,82 ± 3,23 ppm 96,11 ± 2,91 ppm 0,45 ± 0,13 mM 2,26 ± 0,37 mM 1,30 ± 0,07 mM * Media ± 1DE de las repeticiones Observando ahora los resultados obtenidos con el aceite esencial de hojas de O. longifolia y con los tres monoterpenos mayoritarios de dicho aceite, se encuentra que tanto el aceite como los compuestos puros (δ-3-careno, α-terpinoleno y α-feladreno) inhiben la enzima, siendo el δ-3-careno el compuesto que mayor efecto inhibidor exhibió (CI 50 = 0,45 mM); por lo tanto es posible afirmar que estos tres monoterpenos son responsables de la actividad exhibida por el aceite esencial. En estudios previos sobre el poder inhibitorio de la acetilcolinesterasa por diferentes monoterpenos biciclícos, se reportó que el δ-3-careno inhibió fuertemente la AChE extraída de eritrocitos bovinos (Miyazawa y Yamaguji, 2005). La actividad inhibitoria exhibida por el aceite de O. longifolia también puede estar relacionada con la presencia de α-pineno, β-pineno, γ-terpineno y limoneno, monoterpenos que han mostrado poseer efectos inhibidores sobre la enzima AChE (Öztürk, 2012; Aazza et al., 2011; Lopéz y Pascual-Villalobos, 2010). Los resultados descritos anteriormente constituyen el primer reporte del efecto inhibidor de la AChE por parte del aceite esencial de hojas de O. longifolia y de los monoterpenos α-terpinoleno y α-felandreno. El aceite de frutos de Z. monophyllum (CI 50 = 228,85 ppm) fue el aceite que causó la menor inhibición de la enzima extraída de S. oryzae, pues para alcanzar una inhibición del 50% de la actividad enzimática fue necesario utilizar concentraciones más altas que las empleadas con los aceites de O. longifolia y V. carinata. Los componentes mayoritarios del aceite de Z. 176 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. monophyllum, sabineno y 1,8-cineol, han presentado promisoria actividad inhibitoria de la AChE (Menechini et al, 2009; Aazza et al., 2011, Orhan et al., 2008), así como algunos monoterpenos y monoterpenoides minoritarios de este aceite como son: α-pineno, αfelandreno, α-terpineno, γ-terpineno, α-terpinoleno y terpinen-4-ol. Teniendo en cuenta las anteriores consideraciones se esperaba que este aceite presentara un fuerte efecto inhibidor de la enzima, pero no se observó un efecto inhibitorio fuerte, como se puede evidenciar en los resultados descritos. Lo anterior conduce a concluir que los demás compuestos presentes en el aceite pueden estar ejerciendo un efecto antagonista o que no se está presentando un efecto aditivo de la actividad exhibida por lo monoterpenos activos presentes en el aceite de frutos de Z. monophyllum. Estos resultados constituyen el primer reporte de actividad inhibitoria de la AChE causada por el aceite esencial de frutos de Z. monophyllum. Para calcular los parámetros cinéticos de la enzima en cada uno de los casos evaluados, se hizo la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten empleando la representación de Lineweaver-Burk como herramienta gráfica: 1� = 𝐾𝑀� 1 𝑉 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 + �𝑉𝑚𝑎𝑥 En esta linealización se representa gráficamente 1/V frente a 1/[S], obteniéndose una recta cuya abscisa en el origen corresponde a –1/K M , la ordenada en el origen es 1/V max y la pendiente es igual a K M /V max . De esta forma, a partir de los datos experimentales se calcularon gráficamente los valores de K M y V max para la AChE. Cuando existe inhibición enzimática se hallan los valores de aparentes de K M y V max , que corresponden a valores que incluyen los correspondientes efectos del inhibidor y que varían con la concentración de éste, contrario a lo que ocurre con los valores de K M y V max de la enzima cuando no está presente el inhibidor, los cuales se mantienen constantes. Las variaciones de los valores de las constantes cinéticas, así como la representación de Lineweaver-Burk permiten identificar el tipo de inhibición que está causando sobre la AChE cada una de las sustancias evaluadas. Capítulo 3 177 Figura 3-4 Representaciones de Lineweaver-Burk para diferentes concentraciones de inhibidor (aceites esenciales y monoterpenos). En la Figura 3.4 se presentan las gráficas obtenidas al representar los inversos de la velocidad de reacción frente a los inversos de la concentración de sustrato para diferentes concentraciones de cada una de las 6 sustancias evaluadas como inhibidores. En general, las gráficas muestran que la pendiente de la recta que corresponde a la enzima control es 178 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. menor en todos los casos, y que conforme va aumentando la concentración de inhibidor se hace mayor la pendiente. Observando el comportamiento de las gráficas se encuentra que los tres aceites esenciales y los monoterpenos α-terpinoleno y δ-3-careno producen una inhibición enzimática mixta, pues las tres rectas se cortan en puntos diferentes a la intersección en el eje X o en el eje Y, hecho que indica que estos inhibidores se unen tanto a la enzima (E) como al complejo enzima-sustrato (ES), interfiriendo con la unión del sustrato a la enzima, hecho que se evidencia con un aumento en el valor de K M ; además dificulta la actividad del complejo ES causando una disminución en el valor de la V max (Nelson y Cox, 2004). Para el α-felandreno se observa que las tres rectas se cortan en el intercepto con el eje Y, hecho que indica que esta sustancia ejerce una inhibición no competitiva, donde el inhibidor puede interactuar con la enzima libre y con el complejo ES sin afectar la afinidad aparente de la enzima por el sustrato, es decir, que se mantiene constante el valor de K M pero causa una disminución de la V max a medida que aumenta la concentración de inhibidor (Mikkelsen y Cortón, 2004). Con el objetivo de verificar mediante los valores de las constantes cinéticas reales y aparentes los tipos de inhibición causados por cada una de las sustancias evaluadas, se calcularon los valores de K M y V max para cada caso, valores que se presentan en la Tabla 3.13. Los valores de las constantes cinéticas de la reacción enzimática en presencia y ausencia de inhibidor confirman que todas las muestras evaluadas exhiben una inhibición reversible, donde los aceites esenciales de hojas de V. carinata, frutos de Z. monophyllum y hojas de O. longofolia, junto con los monoterpenos α-terpinoleno y δ-3-careno causan una inhibición mixta sobre la AChE extraída de S. oryzae; mientras que el monoterpeno α-felandreno origina una inhibición enzimática de tipo no competitivo. Capítulo 3 179 Tabla 3-13 Valores de K M y V max para diferentes concentraciones de las seis sustancias evaluadas como inhibidores de la AChE extraída de Sitophilus oryzae SUSTANCIA Control Aceite O. longifolia Control Aceite V. carinata Control Aceite Z. monophyllum Control α-felandreno Control α-terpinoleno Control δ-3-careno CONCENTRACIÓN 0 ppm 50 ppm 100 ppm 0 ppm 50 ppm 100 ppm 0 ppm 100 ppm 200 ppm 0 mM 0,5 mM 2,0 mM 0 mM 0,5 mM 2,0 mM 0 mM 0,5 mM 2,0 mM K M (mmol/L) 1,206 1,392 1,439 1,254 2,566 3,065 0,799 0,885 1,000 1,662 1,641 1,699 1,036 1,073 1,204 1,471 8,261 10,000 V max (mmol/ min*mL) 0,0246 0,0172 0,0130 0,0250 0,0105 0,0055 0,0211 0,0167 0,0132 0,0275 0,0210 0,0060 0,0226 0,0197 0,0125 0,0254 0,0112 0,0066 Ahora, teniendo en cuenta la estructura de los tres monoterpenos evaluados como inhibidores de la AChE, podemos afirmar que la presencia del biciclo en el δ-3-careno (CI 50 = 0,45 mM), que fue el compuesto más activo, es importante para que se presente una fuerte inhibición de la enzima. Comparando ahora la estructura del α-felandreno (CI 50 = 1,30 mM) con la del α-terpinoleno (CI 50 = 2,26 mM), encontramos que la única diferencia entre estos dos compuestos es la ubicación de los dobles enlaces, donde el α-felandreno posee dos enlaces dobles endocíclicos conjugados, mientras que el α-terpinoleno tiene un doble enlace endocíciclico y uno exocíclico no conjugados; y de acuerdo a los resultados obtenidos con estos dos compuestos podemos concluir que los compuestos con dobles enlaces endocíclicos conjugados causan mayor efecto inhibidor de la AChE, y que los dobles enlaces exocíclicos causan una disminución en la actividad inhibitoria de la enzima. La acetilcolinesterasa (AChE) juega un papel importante en las sinapsis colinérgicas esenciales para los insectos y animales superiores. La inhibición de esta enzima causa la acumulación de acetilcolina en las sinapsis, manteniendo la membrana post-sináptica en un estado de estimulación permanente, lo que resulta en una falta general de coordinación en el 180 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. sistema neuromuscular, y que finalmente puede conllevar a la muerte (Rattan, 2010). De acuerdo con los resultados mostrados sobre los efectos de los aceites esenciales y monoterpenos objeto de estudio sobre la AChE estraída de S. oryzae, se encuentra que estas sustancias ejercen una inhibición reversible de la acetilcolinesterasa, efecto que está directamente relacionado con el comportamiento descoordinado de los insectos observado durante el tiempo que están expuestos a estas sustancias, lo que permite concluir que uno de los mecanismo de acción de estas 6 sustancias es la inhibición de la enzima AChE. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los aceites esenciales y los monoterpenos al ser sustancias altamente volátiles y lipofílicas pueden penetrar dentro de los insectos rápidamente e interferir en varias de sus funciones fisiológicas, lo que conlleva a que estas sustancias puedan tener diferentes mecanismos de acción que generalmente son difíciles de identificar. Por esta razón, otros modos de acción que pueden exhibir las sustancias evaluadas es el bloqueo de los receptores GABA (reduciendo la inhibición neuronal y causando la hiper-excitación del sistema nervioso central, convulsiones y la muerte) y la inhibición de los receptores octopaminérgicos que desempeñan un papel clave como neurotransmisores, neuromoduladores y neurohormonas en invertebrados (Rattan, 2010). 3.2.8 Estudio de inhibición in-vivo de la acetilcolinesterasa Teniendo en cuenta que para validar la inhibición in vitro de la AChE exhibida por alguna sustancia se debe demostrar mediante un ensayo apropiado el efecto in vivo que causa dicha sustancia sobre el organismo de interés (Keane y Ryan, 1999), se desarrolló un ensayo in vivo para confirmar el efecto inhibitorio de la AChE observado in vitro con los aceites esenciales y monoterpenos. En este caso solo se pudo determinar el efecto in vivo del aceite esencial de hojas de O. longifolia y de los monoterpenos δ-3-careno, α-terpinoleno y α-felandreno, debido a que eran las únicas sustancias de las que se tenía una cantidad suficiente para realizar el ensayo in vivo sobre adultos de S. oryzae. Para realizar el estudio de inhibición de la actividad de la AChE in vivo, se determinaron en primer lugar las concentraciones letales 25 y 75 (CL 25 y CL 75 ) sobre S. oryzae, en el ensayo de toxicidad fumigante, para cada una de las sustancias que iban a ser probadas en el Capítulo 3 181 ensayo in vivo. En la Tabla 3.14 se presentan las CL 25 , CL 50 y CL 75 para el aceite de hojas de O. longifolia, δ-3-careno, α-terpinoleno y α-felandreno. Tabla 3-14. Concentraciones letales del aceite esencial de hojas de O. longifolia y de los monoterpenos δ-3-careno, α-terpinoleno y α-felandreno sobre S. oryzae. SUSTANCIA Aceite O. longifolia α-terpinoleno δ-3-careno α-felandreno CL 25 (μL/ L aire)* CL 50 (μL/ L aire)* CL 75 (μL/ L aire)* 118,51 (62,87 – 163,57) 62,21 (49,34 – 74,42) 46,05 (39,46 – 50,42) 56,83 (46,80 – 65,77) 271,33 (205,47 – 364,11) 98,74 (82,04 – 132,26) 55,24 (50,46 – 60,55) 82,07 (70,98 – 98,80) 621,19 (442,86 – 1228,95) 156,71 (120,29 – 266,56) 66,26 (60,46 – 77,61) 118,54 (98,52 – 162,27) * Entre paréntesis se encuentra el rango de Límite de Confianza del 95% Una vez determinadas las CL 25 , CL 50 y CL 75 , se trataron 900 insectos con cada una de las concentraciones letales de las cuatro sustancias por un período de 24 horas. Al finalizar el tiempo expisición de los insectos a cada uno de los fumigantes, se procedió a extraer la enzima AChE de los insectos tratados (incluyendo vivos y muertos) para determinar el efecto que tubo cada sustancia a determinada concentración sobre la actividad de la enzima. Para determinar la actividad enzimática de la AChE extraída de los insectos tratados y sin tratar se empleo el método colorimétrico de Ellman. En la Figura 3.5 se presentan los resultados obtenidos al representar la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato cuando la reacción se llevo a cabo con cada una de las enzimas extraídas de los insectos tratados y sin tratar. 182 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Figura 3-5 Gráficas de velocidad vs concentración de sustrato para la AChE extraída de S. oryzae luego del tratamiento con la CL 25 , CL 50 y CL 75 de 4 inhibidores (aceite esencial de hojas de O. longifolia, α-terpinoleno, α-felandreno y δ-3-careno) En los resultados mostrados en la Figura 3.5 se observa una tendencia a disminuir la actividad de la AChE con las tres dosis evaluadas in vivo de cada inhibidor, comparado con la actividad de la AChE control. En general, de acuerdo con los resultados mostrados en las gráficas de Velocidad vs [S], se puede decir que las 4 sustancias evaluadas inhiben la acetilcolinestersa in vivo, siendo la inhibición dependiente de la concentración de inhibidor con la que se traten los insectos. Estos resultados sugieren que después de tratar a S. oryzae con las diferentes concentraciones letales, las sustancias evaluadas logran alcanzar el cerebro del insecto e inhibir la AChE, hecho que es consistente con la inhibición de la enzima evidenciada en el ensayo in vitro. Por lo anterior, se puede concluir que los monoterpenos α-terpinoleno, α- Capítulo 3 183 felandreno y δ-3-careno son los responsables de la inhibición in vivo e in vitro que causa el aceite esencial de hojas de O. longifolia, ya que se encontró que estos compuestos también son capaces de inhibir la enzima en ambos casos. Es importante anotar que en el ensayo in vivo se esperaba encontrar un comportamiento similar al observado en el ensayo in vitro, pero en este caso se encuentra que la inhibición que se obtiene in vivo con las diferentes concentraciones del aceite y del α-terpinoleno es mayor que la observada en el ensayo in vitro, mientras que con el δ-3-careno se obtiene una inhibición in vivo menor que la observada en el ensayo in vitro. El efecto observado con δ-3careno conllevan a pensar que la inhibición in vivo de la AChE causada por esta sustancia puede estar produciendo un efecto compensatorio en el insecto, hecho que conlleva a que éste sintetice una mayor cantidad de enzima en respuesta a su propia inhibición. Otra razón por la que se puede estar disminuyendo la actividad del δ-3-careno in vivo es que dicha sustancia puede estar siendo metabolizada por el insecto antes de alcanzar el cerebro, teniendo así una menor cantidad disponible de sustancia capaz de inhibir la AChE (Perry et al., 2002). Los anteriores resultados confirman que el mecanismo de acción del aceite esencial de hojas de O. longifolia, y de los monoterpenos α-terpinoleno, α-felandreno y δ-3-careno es la inhibición de la AChE, y constituyen el primer reporte del efecto inhibitorio de la AChE in vivo para estas 4 sustancias. 4. Conclusiones El presente estudio realiza un aporte a las investigaciones en fitoquímica y propiedades biológicas de las familias Myristicaceae, Lauraceae y Rutaceae presentes en Colombia, mediante el aislamiento y caracterización de los metabolitos presentes en hojas y madera de C. capitellata, corteza de O. longifolia y Z. rigidum; la caracterización química de los aceites esenciales de algunas especies de estas familias; y la evaluación de la actividad insecticida sobre plagas de almacén. Los resultados obtenidos en esta investigación permiten concluir: • El trabajo fitoquímico desarrollado en C. capitellata contribuye al conocimiento químico de la especie y del género, pues no hay reportes fitoquímicos previos para éstos. Mediante este trabajo se aisló un nuevo compuesto denominado (-)compsoneurósido HCc-9 junto con 19 compuestos conocidos, los cuales pueden tener relevancia quimiotaxonómica para el género y la familia Myristicaceae. • El estudio fitoquímico desarrollado en la corteza de Z. rigidum permitió el aislamiento de una nueva sustancia denominada ácido (-)-rigidunoico Zr-14 y de trece compuestos conocidos correspondientes a tres alcaloides, cuatro lignanos, una cumarina, tres triterpenos, un monoglicérido y un derivado de ácido caféico, siendo trece de éstos reportados por primera vez para la especie, contribuyendo de esta forma a las investigaciones químicas en el género Zanthoxylum. • La investigación fitoquímica llevada a cabo en la corteza de O. longifolia condujo al aislamiento de una nueva sesquiterpenlactona denominada (+)-longifolina Ol-4 junto con 7 compuestos conocidos entre los que se encuentran sesquiterpenos, lactonas, Capítulo 4. 185 sesquiterpenlactonas y esteroles. Todos los metabolitos aislados se reportan por primera vez para la especie. Estas susntancias pueden tener importancia químiotaxonómica para el género, principalmente las sesquiterpenlactonas, pues este tipo de compuestos no se han reportado ampliamente es especies del complejo Ocotea. • El presente trabajo también contribuyó a la caracterización química de aceites esenciales de especies pertenecientes a las familias Lauraceae, Rutaceae y Myristicaceae, siendo este el primer reporte de la composición química de los aceites esenciales de frutos de Z. monophyllum, frutos de Z. fagara, hojas de Z. rigidum, hojas de O. longifolia y hojas de V. carinata. • Esta investigación también hace aportes al conocimiento de las propiedades biológicas de especies de las familias Lauraceae, Rutaceae y Myristicaceae, por medio de la evaluación de la actividad antialimentaria sobre T. castaneum y S. zeamais de extractos y compuestos puros aislados de C. capitellata, Z. rigidum y O. longifolia, encontrándose que la mayoría de los compuestos que exibhieron actividad sobre las dos plagas causaron efectos fagodisuasivos entre bajos (50% < IDA > 20%) y moderados (70% < IDA > 50%), siendo T. castaneum el insecto más susceptible. • El screening de toxicidad fumigante sobre 3 plagas de almacén de 7 aceites esenciales obtenidos de diferentes especies de las familias Rutaceae, Lauraceae y Myristicaceae permiten concluir que solo los aceites de hojas de V. carinata., hojas de O. longifolia y frutos Z. monophyllum exhiben toxicidad fumigante contra las tres plagas causando mortalidades superiores a 70%, actividad que se debe principalmente al efecto nocivo que tienen sus vapores, pues no se evidenció una mortalidad importante al ser evaluados como repelentes, antialimentarios y tóxicos por contacto. • Se pudo determinar que α-terpinoleno, α-felandreno, δ-3-careno, α-terpineno, γterpineno, limoneno y 1,8-cineol son algunos de los compuestos responsables de la 186 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. actividad insecticida que presentan los aceites esenciales de hojas de V. carinata., hojas de O. longifolia y frutos Z. monophyllum, resultados que no han sido previamente reportados para algunos de estos compuestos. • Se determinó que uno de los posibles mecanismos de acción de los aceites de hojas de V. carinata., hojas de O. longifolia y frutos Z. monophyllum sobre T. castaneum consiste en inhibir la reproducción de los adultos sobrevivientes luego de ser tratados con la CL 50 de cada sustancia, observándose la mayor inhibición con el aceite de hojas de V. carinata. • El estudio de la inhibición de la acetilcolinestresa obtenido de S. oryzae permite concluir que el efecto tóxico de los aceites y monoterpenos (α-terpinoleno, αfelandreno, δ-3-careno) se puede deber a la inhibición que causan estas sustancias en la enzima, donde los aceites de hojas de V. carinata., hojas de O. longifolia y frutos Z. monophyllum y los monoterpenos α-terpinoleno y δ-3-careno producen una inhibición reversible mixta, mientras que el compuesto α-felandreno causa una inhibición enzimática no competitiva. • El estudio in vivo de la inhibición de la AChE realizado con el aceite de O. longifolia y los monoterpenos mayoritarios de este aceite permite confirmar que el mecanismo de acción de estas sustancias sobre S. oryzae está directamente relacionado con la inhibición reversible de la enzima. Anexos. 187 A. Perfiles cromatográficos obtenidos para los aceites esenciales en la columna RTX-5MS 188 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de hojas de Virola carinata. Anexos. 189 Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de frutos de Zanthoxylum fagara. 190 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de hojas de Zanthoxylum fagara. Anexos. 191 Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de hojas de Zanthoxylum rigidum. 192 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de frutos de Zanthoxylum monophyllum. Anexos. 193 Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de frutos de Zanthoxylum rhoifolium. 194 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. Perfil cromatográfico obtenido para el aceite esencial de hojas de Ocotea longifolia. Anexos. 195 B. Curvas de calibración construidas para la cuatificación de los siete monoterpenoides activos Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 196 Curva de calibración para el δ-3-careno 140000000 y = 63131x - 3E+06 R² = 0,988 120000000 Área del pico 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 -20000000 0 500 1000 1500 2000 2500 Concentración (ppm) Curva de calibración para el α-terpinoleno 140000000 120000000 y = 59088x - 1E+06 R² = 0,993 Área del pico 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 500 1000 1500 Concentración (ppm) 2000 2500 Anexos. 197 Curva de calibración para el β-felandreno 100000000 y = 47945x - 2E+06 R² = 0,999 Área del pico 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 500 -20000000 1000 1500 2000 2500 Concentración (ppm) Curva de calibración para el α-terpineno 140000000 120000000 y = 60019x - 3E+06 R² = 0,997 Área del pico 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 -20000000 0 500 1000 1500 Concentración (ppm) 2000 2500 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 198 Curva de calibración para el γ-terpineno 140000000 120000000 y = 65902x - 5E+06 R² = 0,994 Área del pico 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 -20000000 0 500 1000 1500 2000 2500 Concentración (ppm) Curva de calibración para el 1,8-cineol 120000000 100000000 y = 54417x - 3E+06 R² = 0,996 Área del pico 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 -20000000 500 1000 1500 Concentración (ppm) 2000 2500 Anexos. 199 Curva de calibración para el Limoneno 160000000 140000000 y = 69262x - 5E+06 R² = 0,996 120000000 rea del pico 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 -20000000 0 500 1000 1500 Concentración (ppm) 2000 2500 200 Estudio fitoquímico de Compsoneura capitellata (Myristicaceae), Zanthoxylum rigidum (Rutaceae) y Ocotea longifolia (Lauraceae) y evaluación de su posible aplicación como biocontroladores de Sitophilus sp. 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