RESOLUCIÓN OIV/OENO 340/2010 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD β-GLUCANASA (ß 1-3, ß1-6)EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS LA ASAMBLEA GENERAL Visto el artículo 2, apartado 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó de la Organización Internacional de la Viña y el Vino Tras conocer los trabajos del grupo de expertos «Especificidad de los productos enológicos», DECIDE, a propuesta la Comisión II «Enología», completar el capítulo II del Código Internacional de las Prácticas Enológicas con las técnicas de análisis y de control siguientes: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ß-GLUCANASA (ß 1-3, ß 1-6) EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS 1. ÁMBITO DE APLICACIÓN Materias primas comerciales. que contengan enzimas con actividad β-glucanasa y preparaciones 2. FUNDAMENTO El método de análisis se basa en la determinación cuantitativa de la glucosa liberada por la enzima, cuya actividad se quiere medir, a partir de una solución patrón de glucano Schizophyllum sp. común. 2.1 Definición de las unidades: La unidad β-glucanasa (β-Glu-U) se define como la cantidad de azúcares reductores (en forma de glucosa) que se liberan en condiciones de laboratorio con 1 gramo (o 1 mililitro) de enzima por minuto. 2.2 Papel de la enzima Durante el desarrollo de Botrytis cinerea sobre las uvas infectadas, lo que se conoce como podredumbre gris o noble, el hongo excreta un β-1,3-glucano en el que cada tres unidades de glucosa hay una glucosilada en β-1,6. (Fig. 1). Este glucano es muy similar al glucano sintetizado por Schizophyllum sp. común. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 1 2.3 Fundamento de la medida La actividad enzimática libera glucosa que, en medio básico, produce la reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. El fenol aumenta la sensibilidad de la reacción. El hidrogenosulfito de sodio fija la coloración. 3. MATERIAL 3.1 Espectrofotómetro y cubetas de 1 cm de paso óptico 3.2 Baño María 40°C, 100°C 3.3 Agitador magnético estándar 3.4 Agitador magnético múltiple, a 300 rpm 3.5 Recipientes de medida (matraces aforados, vasos de precipitados, matraces de Erlenmeyer, etc.) 3.6 Becher Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 2 3.7 Micropipetas 3.8 Cronómetro 3.9 Homogeneizador ultrasónico 3.10 Pehachímetro 4. REACTIVOS Y SUSTANCIAS 4.1 Sustrato Disolución madre de glucano facilitada por la Universidad de Braunschweig1 y cuya concentración de glucano ha sido determinada por dicha institución. 4.2 Sustancias puras 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 Ácido cítrico (monohidrato) (CAS N° 5949-29-1) Hidróxido de sodio (CAS N° 1310-73-2) Tartrato de sodio y de potasio (CAS N° 304-59-6) Metabisulfito de sodio Na2O5S2 (CAS N° 7681-57-4) Fenol (CAS N° 108-95-2) Glucosa anhidra Ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico (3,5-dinitrosalicílico) (CAS N° 609-99-4) Agua destilada 4.3 Disoluciones 4.3.1 Disolución de hidróxido de sodio 1 M En un matraz aforado, disolver 4,0 g de hidróxido de sodio (4.2.2) con agua destilada (4.2.8) y enrasar. 4.3.2 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l En un matraz aforado de 500 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (4.2.1) con 400 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8). 4.3.3 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,1 mol/l En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (4.2.1) con 900 ml de agua destilada (4.2.8). Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8). 4.3.4 Disolución valorante: reactivo de color ácido dinitrosalicílico (DNS) con fenol Se prepara a partir de las disoluciones A, B y C siguientes: 4.3.4.1 Disolución A Pesar 154,2 g de tartrato de sodio y de potasio (4.2.3) en un vaso de precipitados de 800 ml y disolver totalmente en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Añadir 9,7 g de hidróxido de sodio (4.2.2). 4.3.4.2 Disolución B En un vaso de precipitados de 2000 ml, disolver totalmente 5,3 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico (4.2.7) en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Los mejores resultados se obtienen con el homogeneizador ultrasónico. 4.3.4.3 Disolución C 1 Prof. Dr. Udo Rau, Technical University Braunschweig, Department of Biochemistry and Biotechnology Spielmannstr. 7, 38106 Braunschweig - Germany Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 3 En un vaso de precipitados de 100 ml, disolver 4,2 g de fenol (4.2.5) en 50 ml de agua destilada (4.2.8). Añadir 1 g de hidróxido de sodio (4.2.2) y, una vez disuelto totalmente, 4,2 g de bisulfito de sodio (4.2.4) y volver a mezclar. 4.3.4.4 Disolución de glucosa al 0,3 % Poner 300 mg de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 100 ml, disolver en agua destilada (4.2.8) y enrasar. 4.3.4.5 Reactivo DNS con fenol Mezclar las disoluciones A y C con la B en un vaso de precipitados de 2000 ml y tapar con papel de aluminio. Antes de utilizar, conservar al resguardo de la luz durante al menos 3 días. Trasvasar el reactivo a un frasco de vidrio ambar. Puede conservarse durante un mes en un lugar oscuro y a una temperatura de entre 15 °C y 20 °C. Cada vez que se vuelve a preparar un reactivo y antes de cada medición, deberá realizarse hay que realizar un calibrado antes de proceder al análisis de la enzima. Antes de cada uso, se han de añadir 3 ml de glucosa al 0,3 % (4.3.3.4) a 200 ml del reactivo DNS con fenol. 4.3.5 Glucano en disolución al 0,1 %, pH 4,0 Pesar la cantidad exacta de disolución madre de glucano (4.1) necesaria para obtener una concentración final de 1 g/l. La disolución final de sustrato debe contener un 50 % de solución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l (4.3.2). Para obtener 100 ml de disolución a partir de una disolución madre de glucano (4.1) que contenga 5,2 g/l, se toman 19,2 g y se pesan en un vaso de precipitados de 100 ml. Se añaden 50 ml de la solución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l. Para obtener una mezcla homogénea, se remueve durante al menos 15 minutos. Una vez la disolución esté bien homogeneizada, se ajusta el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (4.3.1). Posteriormente, se transfiere la disolución a un matraz aforado de 100 ml y se enrasar con agua destilada (4.2.8). Las disoluciones madres de glucano se almacenan a temperatura ambiente. Si se utiliza una nueva disolución madre de glucano, se ha de determinar el factor de sustrato (Gf o factor de glucano) mediante la enzima estándar. El factor Gf resulta indispensable para comparar los resultados obtenidos con disoluciones madres distintas. El factor Gf se calcula a partir de una fórmula con los valores medidos teniendo en cuenta que la actividad enzimática estándar es de 10000 β-Glu U/g (véase el apartado correspondiente al cálculo de la actividad enzimática). 4.4 Preparaciones enzimáticas 4.4.1 Disolución enzimática estándar de glucanasa: Se disuelven 0,5 g de la preparación enximática estandar de glucanasa en 25 ml de la disolución tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l) (4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (4.2.8). 4.4.2 Para el resto de preparaciones enzimáticas: Se toma 1 ml de la preparación enzimática, o 0,5 g si se trata de una preparación sólida en polvo o granulado. Se disuelve en 25 ml de la disolución tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l) (4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (4.2.8). Si los valores de absorción son demasiado altos o demasiado bajos (intervalo de absorbancia 0.1-0.6), deberá realizarse una dilución adecuada. La disolución de enzimas deberá contener un 25 % de disolución tampón de citrato (4.3.3). Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 4 5. PROCEDIMIENTO 5.1 Blanco de reactivo En un matraz aforado de 50 ml, añadir 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4) a 3 ml de agua destilada (4.2.8) y calentar durante 10 minutos en un baño María en ebullición. Enfriar el matraz durante 5 minutos en hielo. Introducirlo después en el baño María a 20 °C y añadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. 5.2 Curva de calibrado de la glucosa (con reactivo DNS con fenol) Disolver 2,00 g de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 200 ml y enrasar con agua destilada (4.2.8). A partir de esta disolución, preparar la serie de disoluciones siguiente: N.° 1 2 3 4 5 6 7 V solución patrón / 100 ml 2 ml 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 30 ml 40 ml glucosa/100 ml 20 mg 50 mg 100 mg 150 mg 200 mg 300 mg 400 mg glucosa (µg) en la muestra (0,5 ml) 100 µg 250 µg 500 µg 750 µg 1000 µg 1500 µg 2000 µg Pipetear 0,5 ml de cada disolución de la serie y ponerlos en matraces aforados de 50 ml. Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4) y 2,5 ml de agua destilada (4.2.8). Calentar los matraces durante 10 minutos exactos en un baño María en ebullición. Enfriar durante 5 minutos en un baño de hielo. Introducir los matraces en un baño María a 20 °C y añadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene sólo reactivo). Representar en una gráfica la cantidad de glucosa en cada disolución de la serie frente a los valores de absorción a 515 nm (Fig. 2). La curva de calibrado se debe elaborar el mismo día, antes de cada análisis de la enzima. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 5 Figura 2 5.3 Determinación del blanco de las enzimas Pipetear 0,5 ml de las disoluciones enzimáticas (4.4.1 o 4.4.2) y ponerlos en matraces aforados de 50 ml. Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4). Mezclar con esmero y añadir 2,5 ml de la disolución de sustrato (4.3.5). Mezclar bien agitando los matraces con la mano. Calentarlos en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos. Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C. Añadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene sólo reactivo). 5.4 Medida de la actividad de las preparaciones enzimáticas Para cada muestra, disponer 10 ml de sustrato (4.3.5) en un matraz de Erlenmeyer y calentar durante 5 minutos en un baño María a 40 °C. Para homogeneizar las muestras se ha de utilizar un agitador magnético múltiple a 300 rpm. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 6 Transcurridos 5 minutos, se añaden 2 ml de las disoluciones enzimáticas (4.4.1 o 4.4.2) al primer matraz e inmediatamente después se pone en marcha un cronómetro. A continuación, añadir las disoluciones enzimáticas restantes a los demás matraces espaciando las adiciones 30 segundos. Agitar las muestras a 300 rpm a lo largo de toda la reacción. Tras exactamente 15 minutos, se pipetean 3 ml de la primera mezcla y se transfieren a un matraz aforado de 50 ml con 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4). Repetir la operación con todas las mezclas, dejando transcurrir 30 segundos entre cada transferencia. Calentar en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos, respetando los 30 segundos de diferencia entre muestra y muestra. Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C. Añadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene sólo reactivo). La diferencia de absorbancia entre el blanco de las enzimas y el valor obtenido tras la reacción debe estar entre 0,1 y 0,6 unidades. Si los valores quedan por encima del intervalo de la curva de calibrado, repetir el experimento realizando diluciones que se adapten a las enzimas. Para cada muestra, proporcionar la medida del blanco de la enzima y los dos valores obtenidos al medir por duplicado la absorbancia tras la reacción. Estos dos valores han de ser cercanos. 6. Cálculos Para calcular la actividad se utiliza la media. La actividad enzimática de una preparación enzimática se calcula con la fórmula siguiente: Actividad β-Glu-U por gramo o mililitro = (G × 200)/(15 × E) × 1/Gf Nkat/g o ml = (Activité β-Glu-Unité/g o ml) X (1000/60) G es la cantidad de azúcares reductores liberados, es decir, la media de los azúcares reductores liberados (que se calcula a partir de los dos valores de absorbancia obtenidos tras la reacción) menos el blanco (expresado en microgramos de glucosa a partir de la curva de calibrado). E es la cantidad (en gramos o mililitros) de enzima diluida en 100 ml 200 corresponde al factor de dilución 15 corresponde al tiempo de reacción Gf es el factor de glucano ( a calcular) Ejemplo: Enzima Enzima estándar β-glucanasa de Penicillium funiculosum Valor medido 1 2 0,621 0,618 0,417 0,416 Blanco (enzima) E Glucosa (µg) 0,415 0,503 662 β-Glu-U por gramo o miligramo 10325 0,023 1 1249 9799 Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 7 Cálculo del Gf : 1 realizar la medición con el primer sustrato y la enzima estándar (Valor 1) 2 realizar la medición con el nuevo sustrato y la enzima estándar (Valor 2) Cálculo : Valor 1 / Valor 2 7. Bibliografía Bertrand A. Determination de l'activite β-glucanase de Botrytis des preparations enzymatiques OIV FV 1263 Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 8