UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA NOMBRE:

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
NOMBRE: Estefanía Fienco
CURSO: 9°
REACTIVACION DE CEPAS
El procedimiento se fundamenta en la reactivación de los cultivos de referencia certificados
(liofilizados o congelados), a través de la utilización de medios de cultivo específicos, incubando a
la temperatura y tiempo establecido para cada microorganismo.
PROCEDIMIENTO DE Reactivación del cultivo de referencia:
1. Reactivar los cultivos de referencia certificados (liofilizados o congelados), siguiendo las
instrucciones indicadas por el proveedor.
2. Preparar subcultivos en fase estacionaria, en tubos de agar tripticasa soya e incube a la
temperatura y tiempo adecuado.
3. Subcultivar en medio sólido y líquidos selectivos y no selectivos.
4. Registrar las características morfológicas y fisiológicas (utilice métodos convencionales y/o
rápidos para la identificación de microorganismos).
5. Elaborar cultivos de reserva a partir del cultivo obtenido en el punto 2 y preservar. Se
deben rotular con el nombre del microorganismo, número de identificación (ATCC) y
fecha. Mantener los registros del número de cultivos de reserva preparados por lote.
6. Elaborar los cultivos de trabajo subcultivando uno de los cultivos de reserva. Identificar
con el nombre del microorganismo y el número de lote.
7. Registrar la información.
TECNICAS DE AISLAMIENTO
 El método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de
siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la
superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les
denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se
van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el
asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la
misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se
logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado,
permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles
 Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de su siembra en placa.
Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se
puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por
mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por
mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez,
pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la
suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita
vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A
continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten
en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las
colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en
placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar,
extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el
agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban
hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad
de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado
sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el
proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener
un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen
cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.
SELECCIÓN Y PROPAGACIÓN
 Medios definidos
Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido
preparado a partir de compuestos químicos puros.
Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus
inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para
preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos
los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.
 Medios complejos
Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a
partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la
leche), levaduras o soja.
Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja.
 Medios diferenciales
Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo.
 Medios selectivos-diferenciales
Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo
de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella yShigella, bacterias
entéricas (del intestino) que causan disenterías.
 Medios de enriquecimiento
Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir
de una población mixta de gran tamaño.
PRESERVACION
LIOFILIZACIÓN:
Es un proceso de desecación desde el estado congelado
 Agente crioprotectores:
 leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o
20% P/V
 pueden adicionarse Aditivos como inositol
CONGELACION A BAJAS TEMPERATURAS:
 Agentes crioprotectores:
 leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o
20% P/V
 Puden adicionarse Aditivos como inositol
 Glicerol al 10%
 Caldo BHI con glicerol al 20%
Las temperaturas de congelación deseables es de -70 o -80°C o menores temperaturas. A
temperaturas más altas como -20°C no es ideal pero tal vez sea la única forma posible. Es
preferible a -40°C.
ENVASE: Uso de criovial o tubo estéril.
VIABILIDAD
Se evalúa mediante la enumeración (cuenta indirecta) de las colonias que aparecen sobre el
medio, después de sembrar una serie de diluciones sucesivas de la suspensión original e
incubándolas, durante el tiempo necesario. El porcentaje de viabilidad, se determina mediante la
relación del número de bacterias viables determinadas al tiempo del muestreo, con respecto a
aquellas determinadas al inicio del período de conservación.
PRUEBAS BIOQUIMICAS Y DETERMINACION DEL GENERO Y ESPECIE DE LA CEPA
Identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico:
1) Obtener un cultivo puro
2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así
la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la
agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.
3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos
empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos,
quimioautótrofos, quimioheterótrofos.
4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual
of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas
primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia
a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa,
oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy
movilidad.
TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE
BATERIAS HETERÓTROFAS
tinción gram
(cultivo
fresco)
–
forma
coco
coco
coco
coco
bast bast bast bast bast bast bast bast coc
ón
ón
ón
ón
ón
ón
ón
ón
o
agrupación
racim racim caden tetrad
os
os
as
as
par
es
+
+
+
–
+
+
–
+
+
+
–
+
+
+
–
+
crecimiento
aerobio
+
–
+
+
+
+
+
+
+
crecimiento
anaerobio
–
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
–
esporas
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
–
–
movilidad
–
–
–
–
–
+o
–
+o-
+
–
catalase
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
–
–
+
+
–
–
O
F
F
O
+o– +o– +o– +o–
–
+
+
oxidase
fermentación
de
glucosa a
acido
oa
acido+gas
–
+
+
+
+
+ (o
–)
+
–
O/F
Micrococcus
Staphylococc
us
X
X
Streptococcu
s
X
Lactococcus
X
Enterococcus
X
Leuconostoc
X
Pediococcus
X
Aerococcus
Lactobacillus
Clostridium
Bacillus
Alcaligenes
Pseudomona
s
Enterobacteri
as
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Aeromonas
X
Chromobacte
rium
X
Neisseria
X
5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán
del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de
triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)
BIBLIOGRAFÍA:
 http://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:7yOoWWBrsq4J:www.senasa.go.cr/senasa
web/Documentos/Lanaseve/Calidad/julio-


2009/Procedimientos_especificos_modificados/21-01-10/IA-MBA-PE-014/IA-MBA-PE014.doc+reactivacion+de+cepas&hl=es&gl=ec&pid=bl&srcid=ADGEESi8jhwXC6ZY6EXndtzSzn0oRsUJ5GLKuZ3GzLq96lZT0vpWFbMkikC3WAz41dUiUb5yZLsV866I_PT75kjBW9
Pf2_c9ncmioo7SiPaZoyKiz0WnkDm5sktHs1lp_Rb1BNXe5vP&sig=AHIEtbSLkuk5KWGSF2MWVI9UwRDTQSPZw
http://es.scribd.com/doc/14173131/5-Tecnicas-Basicas-Para-El-Cultivo-deMicroorganismos
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioPruebasBioquimicas.htm