i Módulo 1.A Higiene Parecería innecesario señalar la importancia

Módulo 1.A
Higiene
Parecería innecesario señalar la importancia que tiene el manejo sanitario de los
alimentos. Se sabe bien que cada año ocurren miles de casos de infecciones,
intoxicaciones o toxiinfecciones, transmitidas por ellos y que una proporción
considerable tiene un desenlace fatal. Estos problemas de salud causan también
pérdidas económicas por ausentismo e incremento en el costo de los servicios de
atención médica. Todo esto sucede debido a que, a pesar de los esfuerzos
desarrollados por las autoridades de los servicios de salud, todavía hay volúmenes
considerables de productos alimenticios que llegan al consumidor contaminados a
causa de un manejo deficiente.
El saneamiento de los alimentos significa eliminar o controlar en forma efectiva los
microorganismos presentes en ellos y en todo aquello con lo que entren en contacto.
La presencia numerosa de bacterias indica que algo no se hizo bien al prepararlos o
sea, que se manipularon deficientemente.
Pero la higiene en su manejo depende no solamente de la legislación al respecto o del
equipo utilizado. El papel que desempeñan quienes preparan y quienes sirven
alimentos continuará siendo de gran responsabilidad, pues actúan directamente sobre
el aparato digestivo de millones de consumidores. Ambos influyen decisivamente en
el grado de salud pública de un país.
La inocuidad de los alimentos, es producto de muchas acciones directas e indirectas,
dentro de las cuales los aspectos relativos al manejo higiénico, así como el monitoreo
a través del muestreo y análisis tanto de superficies vivas e inertes como del
ambiente, son de suma importancia. La tendencia actual en la industria transformadora
de los alimentos, es implementar planes y programas de análisis de riesgos y puntos
críticos de control (siglas en inglés HACCP), y es requisito entrenar a los obreros en
buenas prácticas de limpieza e higiene, e instruir un sistema de monitoreo para
asegurarse de que se están siguiendo las instrucciones para reducir el riesgo de
contaminación. El HACCP es un enfoque moderno cuya pretensión primaria consiste
en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su consumo. Por lo
tanto es de suma importancia el conocer metodologías analíticas adecuadas para
efectuar (o bien solicitar a laboratorios de apoyo) el análisis de superficies inertes,
vivas y medio ambiente y, con base en los resultados analíticos, conocer las
condiciones de operación reales que prevalecen en la industria. El análisis de estos
resultados permitirá mantener o bien emitir e implementar medidas correctivas
oportunas cuya finalidad es la obtención de productos alimenticios dentro de
estándares de calidad y seguridad alimentaria.
A continuación se presenta el significado de algunos términos en el tema del manejo
higiénico de los alimentos:
a. Contaminación cruzada: Proceso por el que los microorganismos son trasladados
por medio de personas, equipos, materiales, de una zona sucia o contaminada a
una zona limpia.
b. Contaminación: Es la presencia de cualquier material extraño en los productos
alimenticios que origina que sean inadecuados para el consumo.
c. Control de calidad: Significa un procedimiento planificado y sistemático para tomar
todas las acciones necesarias para prevenir que los alimentos sean adulterados
i
dentro del significado de la legislación del país correspondiente.
d. Higiene de los alimentos: Todas las medidas necesarias para garantizar la
inocuidad e higiene de los alimentos en todas las fases, desde su cultivo,
producción o manufactura hasta su consumo final.
e. Higiene: Parte de la medicina que tiene por concepto la conservación de la salud y
los medios para prever las enfermedades; limpieza es la primer regla de la Higiene.
f. Higiénico: Libre de niveles nocivos de microorganismos y contaminantes.
g. Limpio: libre de suciedad visible.
h. Saneamiento: Significa tratar adecuadamente las superficies de contacto con los
alimentos aplicando un proceso que sea efectivo para destruir las células
vegetativas de los microorganismos de importancia en salud pública y para reducir
substancialmente el número de otros microorganismos indeseables, sin afectar
adversamente el producto o la seguridad del mismo para los consumidores.
i. Sanidad: Significa sano y consiste en conservar la calidad de los productos
mediante métodos físicos (frío, calor), químicos (sal, ácidos, conservadores, etc.)
manteniendo todas sus propiedades nutrimentales inalterables.
Referencias:
Pascual, M. R & Calderón, V. (2000). Microbiología Alimentaria. Metodología
analítica para alimentos y bebidas. 2ª. Ed. Diaz de Santos. Madrid, España.
Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products.
American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.
(1972). Técnicas sanitarias en el manejo de los alimentos. ed. Pax-México. México,
D. F.
Harrigan, W. F. & Park, R. W. A. ((1991). Making safe food: A management guide
for microbiological quality. Academic Press. U.K.
Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Prácticas de
Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos
fijos.
Norma Mexicana NMX-F.605-NORMEX-2000. Alimentos Manejo Higiénico en el
Servicio de Alimentos Preparados para la Obtención del Distintivo H.
Norma Oficial Mexicana NOM-120-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Práctias de
Higiene para el Proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.
ii
Objetivos:
•
Determinar microorganismos viables en superficies inertes y vivas/ambiente, con o
sin tratamiento de higiene.
•
Detectar la presencia de microorganismos indicadores de contaminación de los
alimentos.
•
Aplicar métodos de enumeración adecuados, según la superficie-ambiente que se
vaya a analizar.
•
Relacionar la estimación de la cifra de microorganismos presentes en la
superficie/ambiente, con la calidad del producto procesado o manipulado, para
concluir acerca de posibles efectos para la salud del consumidor.
•
Explicar el efecto de sustancias desinfectantes utilizadas en los procesos de
higiene de superficies.
•
Comparar la efectividad de diferentes sustancias desinfectantes utilizadas en los
procesos de higiene de superficies.
Ejercicio:
1. Con base en bibliografía, qué grupo o grupos de microorganismos se sugiere
analizar en las superficies que estarán en contacto durante el proceso del
alimento que se le asignó.
2. ¿Cuáles son los límites o especificaciones microbiológicas recomendadas en
bibliografía especializada para considerar una superficie apta para manejar
higiénicamente el alimento?
3. ¿Y para considerar un ambiente limpio para manejar higiénicamente el
alimento?
4. ¿A qué nicho de consumidores se recomendaría la utilización de las sustancias
desinfectantes y por qué?.
5. ¿Qué medidas propone para disminuir la carga microbiana de un ambiente que
ponga en riesgo la calidad higiénica del alimento?
6. Qué otras técnicas conoce para realizar el análisis de superficies?
7. Los resultados obtenidos ¿concuerdan con lo que usted esperaba? Explique.
iii
ANALISIS DE SUPERFICIES INERTES.
OBJETIVO.
Este procedimiento proporciona las reglas para la toma y análisis de superficies inertes
por los métodos del hisopo, esponja, enjuague total y placa por contacto ó Rodac.
GENERALIDADES.
La higiene los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el evitar
la contaminación ocupa lugar relevante. Cada fuente de contaminación que puede
actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de
métodos especiales para lograr su control. Así ocurre con el agua, los manipuladores,
equipo, envases, superficies de trabajo, etc.
En el caso del equipo, éste puede ser un vehículo pasivo de microorganismos, o
puede constituirse en la base material sobre la cual, debido a un aseo deficiente,
entren en actividad y lleguen a introducirse, por millares, en el alimento.
La calidad sanitaria de los alimentos, depende de la materia prima utilizada en su
preparación y de las condiciones higiénicas en que han sido elaborados, manejados y
conservados, incluyendo todas las superficies que están en contacto con ellos.
Dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar
equipo costoso, pueden perderse si la limpieza y desinfección en general, y
específicamente en los puntos críticos, no se realiza adecuadamente y/o si no se
evalúa su eficiencia correctamente.
Existen procesos de lavado y desinfección, que utilizan sustancias y condiciones de
tratamiento propios para cada necesidad, en las distintas ramas de la industria de
alimentos. Cuando las normas o recomendaciones para su aplicación se siguen con
acierto, los resultados son claramente satisfactorios. El establecimiento de sistemas
de higiene (lavado y sanitización) adecuados del equipo, debidamente programados y
en manos de personal responsable y adiestrado, debieran ser una exigencia, motivo
de supervisión especial, dentro de cada industria y por parte de la autoridad sanitaria
competente. El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar
satisfactoriamente la eficiencia de estos procesos. Para evaluar la eficiencia de la
limpieza y saneamiento de las superficies, se han desarrollado métodos y propuesto
normas basadas en el número total de microorganismos por unidad de superficie.
Existen muchos métodos para tal efecto, el recuento de microorganismos viables en el
equipo tratado es sencillo y confiable, aunque necesariamente requiere de tiempo para
disponer de los resultados.
Los métodos pueden aplicarse ya sea para buscar microorganismos indicadores, o un
género especial, cuando se trate de un problema particular.
Existen varios procedimientos, dentro de los cuales describiremos los más usuales:
PROCEDIMIENTO
iv
MÉTODO DEL HISOPO.
Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas.
Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril,
humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área
determinada para finalmente suspenderla en el diluyente.
Siguiendo las instrucciones del método y contando con un valor normativo, es posible
decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre una superficie. Hay que
tomar en consideración la representatividad que ofrece este ensayo para sugerirlo a
una planta o a un proceso particular.
PRUEBA
LIMITE PERMITIDO
Mesofílicos aerobios
Coliformes totales
< 400 UFC/cm2 o unidad
< 200 UFC/cm2 o unidad
Fuente: Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994. Prácticas de Higiene y Sanidad en la preparación de alimentos
que se ofrecen en establecimientos fijos.
MATERIAL
• Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL de solución diluyente.
• Hisopos estériles en sobres de papel manila o tubos de ensayo. Se pueden
conseguir en forma comercial.
• Plantillas de papel aluminio de 12,0 cm por lado con un cuadro de 5,0 x 5,0 cm
recontado en el centro y esterilizadas dentro de papel manila.
TOMA DE LA MUESTRA.
Muestreo de superficies.
Colocar la plantilla o bien delimitar un área aproximada de 5,0 x 5,0 cm ó 10,0 x 10,0
cm sobre la superficie que se va a muestrear. Sacar el hisopo asépticamente.
Si la superficie está seca, humedecer el hisopo en la solución diluyente y presionar
contra la pared del frasco o tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso
de líquido, en caso contrario no es necesario hacer esto.
Con el hisopo inclinado, frotar la superficie delimitada por la plantilla en 3 sentidos
diferentes (horizontal, vertical y oblicuo). Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper
la parte que estuvo en contacto con los dedos.
Este método también puede utilizarse para buscar patógenos, substituyendo la
solución diluyente por el caldo de cultivo adecuado.
Muestreo de utensilios de comedor.
Utilizar tubos con l0,0 mL. Tomar un hisopo, mojarlo en la solución diluyente y exprimir
el exceso de líquido sobre la pared del tubo. Tomar la muestra del utensilio con el
hisopo tratando de tomar de la superficie que está en contacto con el alimento o con la
boca. Regresar el hisopo al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los
dedos. Una vez tomada la muestra, se procede a hacer el recuento, por el método
más adecuado, generalmente cuenta en placa, con los medios de cultivo
recomendados para el grupo bajo estudio.
v
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Superficies.
Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las
colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre cm2
de la superficie. Los resultados se expresan como UFC/cm2.
Utensilios de comedor.
Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la
solución diluyente de muestreo. Informar UFC/utensilio.
MÉTODO DE LA ESPONJA.
Esta técnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en
áreas grandes. Se utilizan esponjas estériles de espuma de poliuretano generalmente
de 13,0 x 7,5 x 4,0 cm (o de dimensiones requeridas) y bolsas de plástico
transparentes estériles de las dimensiones necesarias.
Consiste en pasar la esponja sobre toda la superficie del equipo o utensilio que se va a
muestrear pudiendo estimar de esta manera el contenido microbiano de toda la
superficie y no únicamente de dimensiones limitadas.
La bolsa de plástico se invierte a modo de guante sobre la mano del muestreado,
haciendo que la parte interna pase a ser la externa y con la mano así protegida, se
toma una esponja retirándola de la envoltura de papel manila.
Se humedece la esponja con un poco de la solución diluyente estéril y se frota
completamente toda la superficie que se va a muestrear. Terminando el muestreo, se
vuelve la bolsa a su posición original quedando la esponja en su interior y se adiciona
el resto del volumen de la solución diluyente a la bolsa que plástico que contiene la
esponja y se homogeniza exprimiendo repetidamente la esponja. Esta suspensión
será considerada como la muestra directa y a partir de ella se harán las diluciones
necesarias.
Las superficies y utensilios a muestrear pueden ser de forma y tamaño muy diverso,
tales como, mesas, tablas de picar (tratando de llegar a las hendiduras y esquinas),
utensilios de comedor (tomar muestra de la superficie del utensilio con excepción del
mango, prestando atención a la parte interna como es el caso de los tenedores entre
diente y diente), vasos, platos (tomar la superficie expuesta a los alimentos, incluyendo
el borde que está en contacto con los labios del usuario), manos (la palma de la mano
y parte interna y externa de cada uno de los dedos), etc.
MATERIAL
• Esponjas de poliuretano o de celulosa de dimensiones apropiadas a la superficie
que se va a muestrear. Envueltas individualmente en papel manila y esterilizadas
en autoclave a 121ºC por 30 min. Se pueden conseguir en forma comercial
estériles. Bolsas Whirlpack con esponja.
• Frascos con tapa de rosca con 50,0 mL o 100,0 mL (o el volumen necesario).de
solución diluyente estéril.
vi
• Bolsas de plástico estériles de la dimensión necesaria.
TOMA DE LA MUESTRA
Sacar la esponja utilizando la bolsa invertida a manera de guante, humedecerla con la
solución diluyente y frotar vigorosamente con la esponja el área de muestreo .
Regresar la esponja a la bolsa de plástico y verter el resto del líquido diluyente. Cerrar
la bolsa y homogenizar exprimiendo repetidamente la esponja.
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Contar las colonias y calcular el número de UFC/mL multiplicar por el volumen del
diluyente y reportar por unidad de superficie (cm2) o por utensilio.
MÉTODO DE PLACA POR CONTACTO, RODAC (Replicate Organism Detection
and Counting).
Este método se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e
impermeables. Idealmente la placa se debe utilizar sobre superficies que han sido
previamente saneadas y desinfectadas, ya que en lugares con un alto grado de
contaminación, resultará un crecimiento masivo en las placas que dificultará los
recuentos.
En el caso de muestreo de superficies previamente tratadas con desinfectante, es
necesario que se agregue al medio de cultivo un agente neutralizante adecuado, por
ejemplo, lecitina para neutralizar compuestos cuaternarios de amonio, y polisorbato
80 para neutralizar desinfectantes fenólicos.
En superficies en las que se sospeche que se encuentran un poco más contaminadas
se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos. La selección
del sitio al azar permitirá comparaciones adicionales y eliminará posibles
interferencias.
MATERIAL
• Las placas RODAC se pueden obtener en forma comercial.
• Cuando se preparan en el laboratorio, deben vaciarse de 15,0 -16,0 mL de agar
para cuenta estándar en cajas de petri desechables. (El agar en la placa debe
quedar ligeramente convexo en la superficie del centro, para poder hacer contacto
adecuado con la superficie.
• Se pueden emplear medios de cultivo para determinar indicadores o bien
patógenos.
TOMA DE MUESTRA
Quitar la tapa de plástico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie,
mediante movimiento rotatorio uniforme, presionar sobre la parte de atrás de la placa
para efectuar el contacto. Colocar de nuevo la tapa e incubar en posición invertida 2448 h a 35+/-1ºC.
vii
CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Efectuar la lectura a las 24 h para prevenir crecimiento incontable, en caso de
observar crecimiento pobre incubar 24 h más.
Se cuentan las colonias y se informa el número por placa o por cm2, dividiendo el
número de colonias, entre la superficie de contacto de la caja.
Debido a que la interpretación es relativa, cada laboratorio o industria, deberá
establecer sus propios valores que constituyen un área limpia. El Comité sobre
contaminación microbiana de superficies de laboratorios de la APHA establece los
siguientes límites:
No. colonias por placa Rodac
0-25
25-50
50 ó más
Calidad
bien
regular
pobre
MÉTODO DE ENJUAGUE TOTAL
Este método se emplea para tomar muestras de objetos pequeños como son
cucharas, tenedores, biberones, etc. o para el muestreo de superficies interiores de
envases, botellas y bolsas de plástico, etc.
MATERIAL
• Frascos de boca ancha con 50,0 mL de solución diluyente, o con la cantidad
necesaria según el tamaño del objeto que se va a muestrear.
• Bolsas de plástico estériles de tamaño adecuado al objeto que se va a muestrear.
TOMA DE MUESTRA
Utensilios.
Sumergir la superficie de los utensilios que estén en contacto con la boca (cucharas,
tenedores, etc.) en frascos de boca ancha con la solución diluyente o bien, verter la
solución dentro de una bolsa estéril, colocar el objeto que se va a muestrear, enjuagar
perfectamente bien el objeto y regresar el líquido al frasco inicial.
Superficies interiores.
Introducir en el envase o bolsa que se va a muestrear 10,0 mL o el volumen adecuado
de solución diluyente.
Enjuagar haciendo correr el líquido por toda la superficie, agitar bien.
Regresar el contenido de los envases al frasco.
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
viii
Contar las colonias y expresar las UFC/utensilio o envase, tomando en cuenta el
volumen del diluyente y si se efectuaron diluciones posteriores.
ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS PARA LOS CUATRO MÉTODOS ANTERIORES.
Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri
marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada.
Agregar el medio de cultivo seleccionado:
• Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios
• Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir una
doble capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primera capa, para
crear condiciones de anaerobiosis.
• Agar papa dextrosa acidificado para cuenta de hongos y levaduras. Acidificar a un
pH de 3.5 +/- 0,1 con ácido tartárico estéril a 10,0% (aproximadamente 1,4 mL de
ácido tartárico por cada 100,0 mL del medio).
SUPERFICIES
Contar todas las colonias que se desarrollen en las cajas, hacer el cálculo de las
colonias por mL, multiplicar por el volumen de diluyente empleado y dividirlo entre los
cm2 de la superficie.
Los resultados se expresan en UFC/cm2.
EJEMPLO
Si se tomó la muestra de 4 superficies de 25,0 cm2 c/u en un volumen de 10,0 mL de
diluyente, multiplicar el número de colonias x 10 y dividir el resultado entre 100 para
obtener las UFC/cm2.
UTENSILIOS DE COMEDOR
Hacer el cálculo del número de colonias por mL, multiplicar el volumen total de la
solución diluyente de muestreo y sacar promedio dividiendo entre el número de
utensilios muestreados para informar UFC/utensilio.
BIBLIOGRAFIA
Manual of Food Quality Control. 12. Quality assurance in the food control
microbiological laboratory. FAO. Rome, 1991.
Manual de prácticas. Curso: Toma y manejo de muestras para análisis
bacteriológico. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1992.
Standard methods for the examination of dairy products. APHA. 16 th. 1992.
Procedimiento para el examen microbiológico de superficies y utensilios. Secretaría
de Salud. Laboratorio Nacional de Salud Pública. México 1990.
ix
Medios de Cultivo
Agua Peptonada
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
1,0 g
8,5 g
1,0 L
Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la
solución a pH de 7,0, con solución de hidróxido de sodio 1,0 N; distribuir en
matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a
121°C±1°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y
el pH de la solución deben ser iguales a los iniciales.
Bilis rojo violeta, agar
Peptona de carne
Extracto de levadura
Cloruro de sodio
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua destilada
7,0 g
3,0 g
5,0 g
10,0 g
1,5 g
0,03 g
0,002 g
13,0 g
1,0 L
Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua,
posteriormente ajustar el pH a 7,4±0.1 y esterilizar en condiciones suaves: 30 minutos
en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento.
Principio de acción
La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra
en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el
desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se
presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura
química básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno.
Métodos Estándar para, agar
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Dextrosa
Agar
x
5,0 g
2,5 g
1,0 g
15,0 g
Agua destilada
1,0 L
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para
disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo
con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando
se necesite.
Principio de acción
La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas
complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura
proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los
microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo que
no contiene inhibidores.
Papa dextrosa agar
Infusión de papa, (a partir de 200g de papa)
Dextrosa
Agar
Agua destilada
4,0 g
20,0 g
15,0 g
1,0 L
Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación de los
polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar, calentar el
medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C±1°C, después
acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1, con ácido tartárico al 10% previamente esterilizado (1.4
mL de ácido tartárico por cada 100,0 mL de medio de cultivo). Después de adicionar el
ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un potenciómetro.
Principio de acción
A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa que
éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias,
sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las
levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%,
adicionando a cada litro de medio de cultivo 14,0 mL del ácido.
xi
ANALISIS DE SUPERFICIES VIVAS.
OBJETIVO
Monitorear las manos del personal que realice manipulaciones en cualquier punto de
la cadena de transformación de los alimentos.
MATERIAL
METODO DEL HISOPO
•
•
Tubos con tapón de rosca conteniendo 10,0 mL de solución diluyente.
Hisopos estériles en sobres de papel manila o tubos de ensayo.
conseguir en forma comercial.
Se pueden
PROCEDIMIENTO
a) METODO DEL HISOPO.
Esta técnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas.
Consiste en frotar un aplicador de madera u otro material de algodón (hisopo) estéril,
humedecido con la solución diluyente que recoge la flora microbiana en un área
determinada para finalmente suspenderla en el diluyente.
Siguiendo las instrucciones del método y contando con el siguiente valor normativo,
NOM-093-SSA1-1993. Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos
que se ofrecen en establecimientos fijos.
a) Manos de personal
Cuenta total de Mesofílicos aerobios
< 3 000 UFC/manos
< 1 500 UFC/mano
Cuenta de coliformes totales
< 10 UFC/manos
< 5 UFC/mano
es posible decidir sobre el nivel de contaminación que prevalece sobre las manos del
operario.
Tomar un hisopo y sumergirlo en la solución diluyente retirando el exceso de líquido.
Limpiar bien la superficie de la palma de la mano, así como la superficie interna de
dedos y uñas. Repetir la operación tomando muestra de la otra mano. Regresar el
hisopo nuevamente al tubo y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.
Transferir volúmenes de 1,0 mL y 0,1,0 mL o diluciones de la muestra a cajas de Petri
marcadas con la clave, fecha, medio de cultivo y dilución inoculada.
Agregar el medio de cultivo seleccionado:
• Agar triptona extracto de levadura para cuenta de mesofílicos aerobios
• Agar bilis rojo violeta para cuenta de organismos coliformes totales. Añadir doble
capa del mismo medio de cultivo una vez solidificada la primer capa.
xii
CÁLCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS
METODO DEL HISOPO
Superficie de manos
Calcular el número de colonias por mano o manos, multiplicando por el volumen de
diluyente empleado y dividirlo entre 2 en el caso de haber muestreado ambas manos.
Reportar como UFC/superficie de mano.
BIBLIOGRAFIA
Procedimiento para el Examen Microbiológico de Superficies y Utensilios. Secretaria
de Salud. Dirección General de Epidemiología. Laboratorio Nacional de Salud Pública.
México 1990
xiii
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE
INTRODUCCION
La eliminación adecuada de los microorganismos constituye una fase importante en la
higiene de las plantas que elaboran alimentos, esto se puede considerar como uno de
los problemas principales en la presencia de enfermedad para los consumidores, en
donde el alimento es el vehículo del microorganismo patógeno.
Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo mal saneado, constituyen una
fuente importante de microorganismos patógenos para los alimentos, por lo que es
necesaria la utilización de algunos desinfectantes en estas fuentes de contaminación.
La utilización de sustancias como desinfectantes sobre los microorganismos
patógenos es de gran interés, el conocer el metabolismo microbiano para entender los
mecanismos de acción de los desinfectantes y sus implicaciones prácticas, ha dado
lugar a mucha información a fin de desarrollar un concepto más claro, sobre todo de la
acción de los desinfectantes más comúnmente utilizados en la Microbiología de los
Alimentos.
1.- Mecanismos de acción de los desinfectantes comúnmente usados en la
industria alimentaria. La reacción de los desinfectantes con los constituyentes
celulares puede involucrar reacciones de óxido-reducción, hidrólisis, formación de
sales, transposición con algunos grupos como los de las proteínas, adsorción en la
interface, etc., lo anterior puede suceder en partes fundamentales de los
microorganismos: lesión a la membrana celular, lesión al núcleo, a los genes y en
consecuencia inhibición de las enzimas.
2.- Lesión a la membrana celular: Algunos desinfectantes, como compuestos
nitrogenados, fosforados, y los detergentes rompen la barrera osmótica permitiendo la
salida de los componentes celulares metabólicamente activos, destruyendo con esto a
los microorganismos. Otros desinfectantes como el peróxido de hidrógeno o los
compuestos halogenados ejercen su acción antimicrobiana al reaccionar con los
compuestos de la membrana citoplasmática.
3.- Lesión al núcleo y a los genes: Algunos agentes tienen afinidad particular por los
núcleos o genes de las células microbianas, por ej. Se tiene a los colorantes básicos,
como el cristal violeta, los cuales reaccionan con los ácidos nucleicos de las
nucleoproteínas quizás para la formación de sales.
Los desinfectantes que presentan metales pesados reaccionan con los grupos
sulfhidrilo (-SH) de las nucleoproteínas inhibiendo la acción enzimática, interrumpiendo
con esto el crecimiento microbiano.
Cualquier lesión en los genes se traduce en inhibición de las enzimas que los regulan.
Los compuestos como desinfectantes que inhiben a las enzimas se encuentran en el
ácido nitroso el cual desamina a ciertas bases del DNA, como a la adenina a la que
convierte en hipoxantina, la citosina en uracilo y la guanina en xantina.
En este grupo están algunos agentes alquilantes como el óxido de etileno,
etilenmetasulfónico y las mostazas nitrogenadas, los cuales actúan por la alquilación
de uno o más de los átomos de nitrógeno de las bases del ácido desoxirribonucleico
(DNA), causando anomalías en el apareamiento de las bases en la hélice del DNA y
también la pérdida posiblemente de una de las bases.
Otro grupo de antimicrobianos que reacciona con el DNA y que lo hacen
intercalándose entre los pares de las bases son el bromuro de etilo y la proflavina.
Los desinfectantes del cloro, iodo y las sales cuaternarias de amonio son los más
comúnmente utilizados en la industria de alimentos, presentando ventajas y
xiv
desventajas sobre su utilización. A continuación se mencionan algunas de ellas de los
tres grupos de desinfectantes.
DESINFECTANTES
VENTAJAS
HIPOCLORITO
(oxidación de enzimas esenciales
IODOFOROS
(inactivación de proteínas
por iodinación)
-
SALES CUATERNARIAS
DE AMONIO
(Tenso activo, rompe
membrana
celular,
inactiva enzimas
-
xv
DESVENTAJAS
Barato
Fáciles de aplicar en
pequeñas cantidades
Se
usa
en
concentración de 10
ppm
Tiempo de exposición
corto (2 min 100 ppm)
Actúa contra esporas
Compatible
con
detergentes aniónicos
Se usa en contracción
de 200 ppm
No presenta olor ni
sabor
No mancha
No son irritantes
Tienen
cualidades
humectantes
y
de
penetración
Actúa sobre bacterias,
hongos y virus
Esta incorporado a un
detergente tensoactivo
aniónico no iónico o
catiónico
Estables en polvo seco
o en pasta
Sin olor
No es corrosivo
No es irritante de la piel
Tiene poder residual
Se
usa
en
una
concertación de 200
ppm de NH4
Es más activo en
presencia de materia
orgánica
Es
efectivo
contra
microorganismos Gram
positivos
y
Gram
negativos
-
-
-
Es corrosivo
Se inactiva por materia
orgánica
Deja olor y sabor
desagradable
No
actúan
contra
esporas bacterianas
Más claro que el
hipoclorito.
Se inactiva por materia
orgánica
Actividad
antibacteriana limitada
No es efectivo contra
esporas ni muchos
virus
Es neutralizado por
jabones
Pueden
crecer
microorganismos en él
Deja
película
en
superficies
OBJETIVOS:
Conocer la acción de los agentes destinados para la limpieza y desinfección de
equipo, utensilios, superficies, etc., en una planta procesadora de alimentos.
Evaluar la acción de los agentes destinados para lavado y/o desinfección de frutas y
verduras.
Conocer técnicas utilizadas para evaluar la eficiencia de los desinfectantes.
Evaluar la acción de procesos de lavado y/o sanitización o combinación de ellos.
PROCEDIMIENTO:
Cortar la cantidad necesaria para efectuar evaluaciones de una verdura o fruta cruda
sucia, lavada, desinfectada o combinaciones de estas condiciones. Aproximadamente
50,0 g. Utilizar coladera, tabla y un cuchillo limpio para realizar estas operaciones.
1. PRODUCTO SUCIO (sin lavar ni desinfectar)
Tomar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia y colocar en un frasco de dilución con
90,0 mL de solución diluyente (dilución 10 –1) practicar diluciones hasta 10-4 o las que
el técnico analista juzgue convenientes, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente.
Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como
grupos de microorganismos se quiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y
enfriado según corresponda.
Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –4 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y
10 –1 a10 –3 para coliformes totales.
2. PRODUCTO LAVADO
Depositar 10,0 g de la verdura o fruta cruda y sucia en una coladera y lavarla con una
solución jabonosa preparada con detergente en polvo o líquido, enjuagar con
suficiente agua del grifo y depositar los 10,0 g de la verdura o fruta (lavada) en un
matraz con 90,0 mL de solución diluyente (dilución 10-1) y realizar diluciones hasta 10-3
o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas, en tubos con 9,0 mL de
solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas
placas de petri como grupos de microorganismos se requiera determinar y verter el
medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda.
Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y
10 –1 a10 –2 para coliformes totales.
3. PRODUCTO LAVADO Y DESINFECTADO
Preparar un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las
indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda lavada.
Procedimiento.- Escurrir la solución diluyente del matraz 10-1 de la verdura o fruta
(producto lavado) del paso anterior. Sumergir en la solución desinfectante durante el
tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0 g (lavados y
desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solución diluyente (diluyente 10-1) y
realizar diluciones hasta 10-2 o las diluciones que el técnico analista juzgue adecuadas,
en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar alícuotas de 1,0
mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de microorganismos se requiera
determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado según corresponda.
Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –2 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y
10 –1 para coliformes totales.
PRODUCTO DESINFECTADO (sin lavar)
Preparar el desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las
indicaciones del producto. Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta cruda sucia.
Procedimiento.- Sumergir 10,0 g de la verdura o fruta sucia en una solución
desinfectante durante el tiempo indicado en el marbete del producto. Escurrir los 10,0
xvi
g (desinfectados) y adicionar nuevamente 90,0 mL de solución diluyente (diluyente 10) y realizar diluciones hasta 10-3 o las diluciones que el técnico analista juzgue
adecuadas, en tubos con 9,0 mL de solución diluyente. Para cada dilución tomar
alícuotas de 1,0 mL, depositar en tantas placas de petri como grupos de
microorganismos se requiera determinar y verter el medio de cultivo fundido y enfriado
según corresponda.
Sugerido: Probar diluciones 10 –1 a10 –3 para la cuenta total de mesofílicos aerobios y
10 –1 a 10 –2 para coliformes totales.
1
NOTA: En cada uno de los casos (sucia, lavada, desinfectada y/o lavada y
desinfectada) se utilizarán las diluciones adecuadas según la experiencia del técnico
analista, empleando los medios correspondientes para cada uno de los grupos
estudiados, y además se pueden realizar las combinaciones que se requieran, es
decir, evaluar el desinfectante sobre la superficie o el producto mismo, habiendo
previamente lavado o no o las condiciones seleccionadas.
INCUBACION
Mesófilos aerobios-Agar cuenta estándar. Incubar a 35± 2/48 ± 2 h.
Organismos coliformes totales-Agar bilis y rojo violeta. Añadir doble capa una vez
solidificada la primera capa. Incubar a 35± 2 /24 ± 2 h.
Hongos y levaduras – Agar papa dextrosa acidificado. Incubar a 26± 2/3-5 días.
Incubar a la temperatura y tiempos señalados para cada uno de los grupos
microbianos.
INTERPRETACIÓN
Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los recuentos para obtener el % de
reducción o efectividad.
Interpretación: el producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9% de
reducción en el tiempo de contacto, dosis y bajo las recomendaciones descritas en el
marbete de cada producto.
EXPRESIÓN Y CÁLCULO DE RESULTADOS.
Utilizar la siguiente fórmula para expresar el % de reducción en cada una de las
etapas, sucia, lavada, desinfectada y/o lavada/desinfectada:
% de Reducción = 100 – B x 100
A
A = Cuenta inicial
B = Cuenta final obtenida
Ejemplo 1:
Cuenta total de mesofílicos aerobios:
Cuenta inicial (sucia)
90 x 104 UFC/g
:Con solución desinfectante
cuenta obtenida (desinfectada)
8 x 102 UFC/g
% de Reducción = 100 – 8 x 102 x 100 = 99.9 %
90 x 104
Ejemplo 2:
Cuenta de grupo colfirme total:
xvii
Cuenta inicial (sucia)
70 x 103 UFC/g
Lavada y desinfectada:
cuenta obtenida (lavada y desinfectada)
10 UFC/g
% de Reducción = 100 – 10 x 100 = 99.9 %
70 x 103
BIBLIOGRAFÍA
Instituto Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
Departamento de Microbiología. Manual de Laboratorio de Microbiología Sanitaria.
Association of Official Analytical Chemist. (1995). Official Methods of Analysis. 16 th
Ed. AOAC 960,09. Arlington, VA.
Instituto Mexicano del Seguro Social. (1990). Actividades Antimicrobianas de
Sanitizantes, Germicidas y Detergentes. México, D. F.
Banwart G. S. (1979). Microbiología Básica de los alimentos. Ed. Bellaterra. España.
Frobisher, Hinsdill, Crabtree, (1974). Fundamentals of Microbiology. Ed. W. B.
Saunders Company. USA.
Gamboa, H. J. & Vela, A. H. (1985). Mecanismo de acción de los desinfectantes
comúnmente usados en las plantas de alimentos. Trabajo de Microbiología de
alimentos. Laboratorio de M. Sanitaria. IPN:
Reddrish, G. F. (1961). Antiseptics, Desinfectants, Fungicides, and Chemical and
Physical sterilization. Lea and Febiger 2a. ed. USA.
xviii
MONITOREO DEL MEDIO AMBIENTE.
OBJETIVO
El monitoreo e identificación de los microorganismos del ambiente permitirá conocerlos
y probar que desinfectantes o germicidas pueden atacarlos para controlar las áreas, ya
sean cuartos limpios, de preparación estériles o no estériles, y cualquier área de
interés particular.
EQUIPO Y MATERIAL
• Incubadora a diferentes temperaturas.
• Microscopio.
• Cuenta colonias.
• 1 placa de agar cuenta estándar
• 1 placa de agar bilis y rojo violeta
• 1 placa de agar papa y dextrosa
PROCEDIMIENTO
NOTA: Medios de cultivo.- El medio de cultivo de donde se aíslan principalmente los
microorganismos ambientales, es Agar Cuenta Estándar Tripticaseina. Se utiliza Agar
Sabouraud o Agar Papa Dextrosa, para la investigación específica de hongos y
levaduras, Agar BRV, para la investigación del Grupo Coliforme y agares selectivos y/o
diferenciales para patógenos.
Técnica de sedimentación en placa.- Las placas con los medios de cultivo para
monitoreo de los 3 grupos de microorganismos indicadores, se exponen al medio
ambiente seleccionado, retirando la tapa de cada placa y colocando ésta boca abajo.
Se sugiere colocar las placas con los medios de cultivo lo más cercanas entre sí, para
que la calidad del medio ambiente monitoreado sea homogénea. Después de 15
minutos de exposición, las placas se tapan e incuban a 35 + 2 ºC/48 + 2 h. (bacterias)
o 26 + 2 ºC / 3-5 días (hongos y levaduras). Considerar que el volumen de aire
monitoreado tras exponer durante 15 minutos las placas con los medios de cultivo,
equivale a 1 m3.
Efectuar el cómputo por placa de medio de cultivo utilizado para cada grupo
microbiano. Reportar el cómputo de cada grupo microbiano en UFC/m3. Opcional:
después de registrar características de desarrollo y morfología colonial, hacer un frotis
(ver al mismo tiempo, consistencia de colonia, color, bordes, elevación, tamaño). Teñir
con Gram y cuando sea necesario con otro colorante. Observar al microscopio.
Las observaciones microscópicas, identificarán si son microorganismos Gram positivos
ó Gram negativos, a veces se observan mezclados de una sola colonia, cocos Gram
negativos con bacilos de diferentes tamaños Gram positivos, negativos ó amorfos.
xix
LÍMITE MÁXIMO PERMITIDO EN MEDIO AMBIENTE
Prueba
Límite permitido
Mesofílicos aerobios
Coliformes totales
Hongos y levaduras
≤ 15 UFC/m3
0 UFC/ m3
3
≤ 15 UFC/m (para la sumatoria de ambos
cómputos)
Fuente: Standard Methods for the examination of Dairy Products.
BIBLIOGRAFIA
Manual of Food Quality Control. 12. Quality Assurance in the Food Control
Microbiological Laboratory. FAO.- Rome, 1991.
Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16 th Ed. (1992). Robert T.
Marshall, Ph D, Editor. APHA, Washington D. C.
Garantía de Calidad de los Laboratorios de Microbiología Alimentaria. Organización
Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Yolanda Ortega
Dávalos. Fernando Quevedo. Copyright 1991. México, D. F.
xx
PRUEBA DEL RETO MICROBIANO.
OBJETIVO
El método se basa en determinar el porcentaje de reducción de un número
determinado de microorganismos, cuando se pone en contacto con un germicida bajo
condiciones de pruebas específicas.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Matraces Erlenmeyer de 250,0 mL, boca ancha con tapa de rosca.
Probetas graduadas.
Pipetas serológicas y bacteriológicas.
Tubos de ensayo sin labio de 20,0 x 150,0 mm.
Cajas Petri.
Frasco cuadrado de dilución de boca ancha con tapas de vinilo o baquelita.
Baño de agua controlado a 25 ºC.
Gradillas para los tubos
Asa de 4,0 mm de diámetro y de 5,0-7,0 cm de longitud con porta asa.
MICROORGANISMOS DE PRUEBA
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 6538
ATCC 11229
ATCC 15442-2
Nota.- Determinar su resistencia al fenol cada tres meses. La resistencia de E.coli
debe ser similar a la de S.typhi con base en la sección 960,09 del AOAC (1995) y la de
S.aureus equivalente a las especificadas para este microorganismo en la sección
960,09 del AOAC (1995) p.70-71.
PROCEDIMIENTO
1. Conservación y preparación de los microorganismos de prueba.
Conservar las cepas del microorganismo, resembrándolas quincenalmente en tubos
de 16,0 x 125,0 mm de agar nutritivo inclinado.
Incubar a una temperatura de 35-37 ºC por un periodo de 20-24 horas.
Posteriormente mantener los cultivos en refrigeración.
Antes de realizar la prueba, efectuar 2 resiembras diarias consecutivas, incubando en
las condiciones indicadas anteriormente.
A partir de estos cultivos, resembrar 5 tubos de 22 x 175mm que contengan 12,0 mL
de agar nutritivo inclinado e incubar bajo las condiciones antes señaladas. Recuperar
xxi
el crecimiento de cada tubo con 1,5 mL de solución salina estéril 0,85 % y estandarizar
la suspensión en condiciones asépticas al 9,0% de transmitancia a 580,0 nm ó 10,0%
de transmitancia a 650,0nm para obtener un promedio de cuenta bacteriana de 10,2 x
109 UFC/mL.
Verificar por cuenta en placa, conservando la suspensión original en refrigeración.
2. Preparación de la muestra.
Usar el producto a la concentración señalada por el fabricante (directo o diluido).
Medir exactamente y por duplicado 99,0 mL del producto o su dilución.
Transferir a un matraz Erlenmeyer de 250,0 mL, estéril con tapón de rosca.
Preparar otros 2 matraces con solución reguladora de fosfatos diluida estéril, los
cuales se emplean para determinar el número inicial de microorganismos: (Matraz con
99,0 mL (solución reguladora de fosfatos) + 1,0 mL de cultivo estandarizado (10,2 x
109 UFC/mL= 75-125 x 106 UFC/mL) = Control “Cuenta Inicial”.
3. Inoculación.
Agitar el matraz y suspender la agitación justamente antes de la inoculación para que
en el momento de la misma, aún exista un movimiento residual y así facilitar la
incorporación del inóculo.
Inocular individualmente 1,0 mL de la suspensión del microorganismo en el centro y
sobre la superficie del líquido, evitando tocar con la pipeta el cuello o las paredes del
matraz durante la inoculación.
Agitar y exactamente a los 30 segundos de la inoculación, transferir 1,0 mL del cultivo
expuesto a 9 mL de la solución neutralizante; mezclar y transferir alicuotas de 1,0 mL y
0,1 a cajas petri estériles por dulicado agregar de 12,0-15,0 mL de medio agar para
métodos estándar con neutralizador (C).
Homogeneizar, solidificar, invertir e incubar las placas durante 48 horas a 35-37 ºC.
4. Determinación de la cuenta inicial.
Transferir 1,0 mL de la suspensión microbiana (1,.2 x 109) a 99,0 mL de la solución
amortiguadora de fosfatos diluida y efectuar una lectura de 580,0 nm esperando que
dé 9,0 % y a 680,0 dé 10,0 % .
Hacer las diluciones decimales necesarias para obtener placas que contengan entre
30 y 300 colonias por placa de la dilución inicial (1:100) hacer diluciones 1:99 (aprox.).
Colocar alícuotas de 1,0 mL por duplicado de cada dilución en cajas de petri estériles y
de la última dilución, transferir alícuotas de 1,0mL y 0,10 mL por duplicado.
Agregar 12,0-15,0 mL de agar para métodos estándares solidificar.
Invertir e incubar las placas 48 horas a 35-37ºC.
Después del periodo de incubación de todas las placas (control de inóculo y del
producto), contar las UFC y ver el por ciento de reducción del producto. Para que la
prueba sea válida, el número de microorganismos en la suspensión del matraz 1:100,
debe estar entre 75 y 125 x 106 UFC/mL.
Para muestras que se analicen cada día, deben correrse paralelamente con un testigo
del inóculo en igualdad de condiciones.
5. Interpretación.
El producto debe cumplir con el valor de efectividad de 99,0 y 99.9,0 % de reducción a
los 30 segundos de contacto.
xxii
EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
% de Reducción = 100 - B x 100
A
En donde,
A = Cuenta inicial
B = Cuenta obtenida
Ejemplo 1:
S aureus
En germicida A
Cuenta Inicial
Cuenta Obtenida
% de reducción = 100 - 8 x 102 x 100
90 x 106
90 x 106
8 x 102
= 99,999%
Ejemplo 2:
S.aureus
Cuenta Inicial
90 x 106
En germicida B
Cuenta Obtenida
8 x 103
% de reducción = 100 - 8 x 103 x 100 = 99,98%
90 x 106
Ejemplo 3:
S. aureus
Cuenta Inicial
110 x 106
En germicida B
Cuenta Obtenida
50 x 104
4
% de reducción = 100 - 50 x 10 x 100 = 99,55%
110 x 106
BIBLIOGRAFÍA
AOAC Official Methods of Analysis. 1995 Sección 960,09 16th Ed. p.70-71.
Actividades Antimicrobianas de Sanitizantes, Germicidas y Detergentes IMSS-1990.
xxiii
MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES
Agar Nutritivo
Extracto de carne
Peptona de gelatina
Agar
Agua destilada
pH final 5,8 +/- 0,2
3,0 g
5,0 g
15,0 g
1,0 L
Métodos Estándar para, agar
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Dextrosa
Agar
Agua destilada
5,0 g
2,5 g
1,0 g
15,0 g
1,0 L
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para
disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo
con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando
se necesite.
Medios de agar para cuenta estándar, con neutralizante.
Igual que agar para métodos estándar, excepto que hay que adicionar 25,0 mL de
solución neutralizante y preparar.
Pesar y re suspender la cantidad de cada uno de los medios indicados por el
fabricante para un litro de agua. Disolver por calentamiento hasta ebullición durante
un minuto. Envasar de acuerdo a las necesidades y esterilizar a 121 ºC durante 15
minutos.
Solución neutralizante
Azolecitano (lecitina de soya)
Polisorbato 80
Solución amortiguador de fosfatos 0,25 M
40,0 g
280,0 g
1,25 mL
Mezclar los ingredientes, disolverlos en agua destilada hasta obtener un volumen final
de un litro; ajustar el pH a 7,2 y distribuir en porciones de 9,0 y 99,0 mL. Esterilizar a
121 ºC durante 15 minutos.
xxiv
Solución amortiguadora de Fosfatos 0,25 M.
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4)
Agua destilada.
En un matraz volumétrico disolver el KH2PO4 en 500,0 mL de agua destilada ajustar el
pH a 7,2 +/- 0,1 utilizando solución de NaOH 0,1 N.
Llevar al aforo con agua destilada, mezclar y distribuir en porciones de 100 mL
esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos y conservar en refrigeración.
Solución amortiguadora de fosfatos diluida.
Tomar 1,25 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0,25 M y transferirla a un
matraz volumétrico de 1,0 L. Llevar al aforo con agua destilada. Mezclar y distribuir
en tubos y matraces proporciones de 9,0 y 99,0 mL respectivamente esterilizar a 121
ºC durante 15 min.
xxv