1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA BOGOTA D.C. Diciembre 12 de 2007 2 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ APROBADO ----------------------------------------------Dr JAIRO CUERVO A. DIRECTOR -----------------------------------------------ING. AGRÓNOMO OMAR GUTIÉRREZ JURADO ------------------------------------------------MARIA XIMENA RODRIGUEZ Ph. D ASESOR ---------------------------------------------MARCO HELI FRANCO MSc. JURADO 4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) contra Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ APROBADO --------------------------------------------------------------Dra. ANGELA UMAÑA Decana Académica Facultad de Ciencias ----------------------------------------------------------------Dra. JANETH ARIAS Directora de Carrera Microbiología Agrícola y Veterinaria 5 DEDICATORIA A Dios que siempre ha estado presente en mi vida. A los que ya no están y siempre me acompañan. A mis padres. 6 AGRADECIMIENTOS A mis padres Edgar y Ligia que siempre estuvieron presentes en este largo camino y que me mostraron las cosas importantes de la vida. A mis hermanitos Andrés, Camilo y Laura por su buena energía y compañía. A Alejandrito que en los momentos difíciles siempre estuvo dándome ánimo y haciendo parte de los felices. A todas aquellas personas que siempre confiaron en mí, Sonia y Gabriel. Al Doctor Jairo Leonardo Cuervo por su apoyo y paciencia para la realización de este trabajo. A Maria Ximena Rodríguez por su comprensión, colaboración y tiempo. A Carolina Parra por su amistad, apoyo, ayuda incondicional y desinteresada. A todas las personas que hacen parten, de una o de otra manera del Laboratorio de Biología del Suelo de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia. 7 TABLA DE CONTENIDO TABLA DE CONTENIDO 1. 2. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.5.1 2.5.1.1 2.5.1.2 2.5.1.3 2.5.1.4 2.5.1.5 2.5.2 2.5.2.1 2.5.2.2 2.5.2.3 2.5.2.4 2.5.2.5 2.5.3 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.3.3 2.5.3.4 2.5.3.5 2.6 2.6.1 3. 3.1 3.2 4. 4.1 4.2 5. 5.1 5.1.1 5.1.1.1 5.1.2 5.1.2.1 6.1.2 6. 6.1 6.1.1 6.2 6.2.1 INTRODUCCIÓN MARCO TEÓRICO Fungicidas Biológicos Generalidades del Cultivo de Tomillo (Thymus vulgaris) Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimun basilicum Control contra Hongos Fitopatógenos en Plantas Aromáticas Hongos Fitopatógenos de Plantas Aromáticas Generalidades de Botrytis cinerea Descripción básica Huéspedes y Especialización Enfermedad Epidemiología Control Generalidades de Fusarium oxysporum Descripción básica Especialización de huéspedes Síntomas de enfermedad Ciclo de enfermedad Epidemiología y control Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum Descripción básica Huéspedes Enfermedad Epidemiología Control Extracción de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) Métodos de extracción FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Formulación del Problema Justificación OBJETIVOS Objetivo General Objetivos Específicos MATERIALES Y MÉTODOS Diseño de la investigación Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) Pruebas In Vitro Técnica de Crecimiento Radial Prueba de Invernadero RESULTADOS Y DISCUSIÓN Prueba In Vitro Técnica de Crecimiento Radial Prueba de Invernadero Función Curativa 11 13 13 15 17 18 19 23 23 23 23 24 24 24 24 24 25 25 26 27 27 28 28 28 29 30 31 35 35 35 37 37 37 38 38 38 38 39 39 40 43 43 43 51 52 8 6.2.2 7. 8. 9. 10. Función Preventiva CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS ANEXOS 53 55 56 57 64 9 RESUMEN Los extractos vegetales forman una parte muy importante en la agroecología, ya que estos benefician al medio ambiente, combatiendo organismos fitopatógenos, sin recurrir a agentes químicos. El objetivo principal de este estudio es el de evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum), haciendo que cultivos enteros se pierdan debido a la baja calidad y a la muerte total de las plantas. El estudio se desarrollo en los laboratorios y en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia. En esta investigación, se evaluó el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) a concentraciones de 150, 250 y 500g/L con dos tiempos de tratamiento térmico (15 y 30 min). Las pruebas realizadas fueron In vitro; se obtuvo un medio de cultivo con los extractos y se evaluó la tasa de crecimiento radial de los hongos, El tratamiento de 500 g/L y 30 minutos fue el que obtuvo mejores resultados, se le adicionó a plantas de albahaca inoculadas con Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum. En la prueba de Invernadero se evaluó la actividad del el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) en forma preventiva y curativa o de control de la enfermedad, se estimó el porcentaje de incidencia y severidad. Después de ser evaluados los resultados se obtuvo que el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) puede disminuir el crecimiento de Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum. Y al adicionarse sobre las plantas inoculadas se redujo la expresión de los síntomas de las enfermedades. 10 ABSTRACT The vegetal extracts makes a very important role in the Agro-ecology, they benefit to the environment and to the entire ecosystem around, fighting Infectious diseases in plants caused by Phyto-pathogens organisms, without using any kind chemical agents. The intention of this analysis is to estimate the fungicide action of the Thyme (Thymus vulgaris) extract in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum, this fungus are able to cause diseases in the Basil (Ocimum basilicum), which can cause serious damage in this herb, resulting in loss of yield and thus profit. The entire investigation was developed in the greenhouses and laboratories of the Department of Agronomy of the Universidad Nacional de Colombia. In this investigation was evaluate the Thyme (Thymus vulgaris) extract in concentrations of 150, 250 y 500g/L in different times of boiling (15 and 30 minutes). The related examinations were made In vitro; using this extracts, there was obtained a Growth medium, at the same time, the radial grown rate of the fungus was evaluated, later, the treatment with better results was added to the sick Basil (Ocimum basilicum), previously inoculated with Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum. During the tests was seen the reactions and activities of the Thyme (Thymus vulgaris) extract, in a preventive, curative, control and healthy way for the Basil (Ocimum basilicum); the percentage of incidence and severity was measured. After a large and punctual examination of the results, we can conclude that the Thyme (Thymus vulgaris) extract can change the growth of the Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum in the Basil (Ocimum basilicum) for good, giving better results in a preventive way than a curative way. 11 1. INTRODUCCIÓN La agricultura ecológica, orgánica o biológica enmarca todos los sistemas agrícolas que promueven la producción sana y segura de fibras y alimentos, desde el punto de vista ambiental, social y económico. Está basada en un sistema de producción sostenible, en el cual no se hace uso de fertilizantes, herbicidas o pesticidas químicos, u otras sustancias toxicas que pueden llegar a causar algún daño a la salud humana, animal y al medio ambiente. Dicho de otra forma, la agricultura ecológica trabaja bajo el concepto de producción sostenible y competitividad, sin deterioro de los recursos naturales, con un fin muy claro, el crecimiento económico y del mejoramiento de la calidad de vida de la población. La agricultura ecológica aboga por una producción más limpia, libre de sustancias perjudiciales tanto para las personas como para el medio ambiente, y puede en algunos casos representar una mejora en la ganancia del productor. En la actualidad se han ido desarrollando diferentes formas de contribuir a la conservación del medio ambiente en el área agrícola con productos biológicos, estos productos evitan o excluyen insumos externos de síntesis químicas que empobrecen el suelo contrarrestando la acción de las poblaciones de organismos benéficos, disminuyendo los nutrientes para las plantas y contaminando fuentes de agua. El Manejo Integrado de Plagas es un método para combatir poblaciones no deseadas siendo responsable con el medio ambiente. Existen productos biológicos que pueden llegar a ser muy efectivos para el control de plagas. Se conocen sustancias extraídas de plantas que tiene un efecto antifúngico contra la población dañina y sin contaminación del recurso suelo y agua. La Albahaca (Ocimum basilicum) es una de las plantas aromáticas más cultivada y comercializada debido a su importancia medicinal y culinaria. Esta a su vez sufre ataques de hongos fitopatógenos, los más representativos son Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum que llevan a veces a 12 perdidas hasta de un 100% de la producción de este cultivo por su agresividad al atacar. Teniendo conocimiento de la problemática del cultivo de la Albahaca (Ocimum basilicum) se utilizó un antifúngico natural, extracto acuoso de Tomillo (Thymus vulgaris) que es una planta reconocida por sus propiedades terapéuticas y cuyas partes aéreas ya han sido estudiadas comprobándose la existencia de sustancias en ella con actividad antifúngica. 13 2. MARCO TEORICO 2.1 FUNGICIDAS BIOLÓGICOS Los Hongos constituyen el grupo más importante entre los agentes causales de tipo infectivo que provocan enfermedades de las plantas. El número exacto de hongos fitopatógenos se desconoce, pero se estiman en un número superior a las diez mil especies, pertenecientes a diversas categorías taxonómicas (Asocolflores, 1995). El uso de Productos Naturales es tan antiguo como la humanidad. Los productos naturales son de naturaleza muy variada, desde sustancias biológicamente activas de origen marino, exudados de raíz y los más explorados, aquellos provenientes de plantas. La química orgánica estudia la estructura, transformación y efectos biológicos de los metabolitos secundarios presentes en diferentes organismos. Debido a sus propiedades y principios activos se están aplicando en medicina moderna, cosmetología, farmacéutica, biotecnología y últimamente con contribución muy prometedora en la agricultura ecológica (Fonnegra y Jiménez 2006). En la naturaleza existen de 250.000 a 500.000 especies vegetales, de las cuales se estima que al menos el 10% han sido estudiados en sus aspectos químicos y propiedades biológicas. Como se mencionó anteriormente, esta temática no es nueva, se había dejado en el olvido por un largo periodo de tiempo y recientemente, el interés ha sido renovado valorando la diversidad de estructuras químicas en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos (Piñol, 2001). Los productos de origen vegetal han sido, en las últimas dos décadas, mayormente estudiados en su parte química, con énfasis en los metabolitos secundarios, los cuales están implicados en el control biológico contra patógenos o plagas, y en ciertos casos, activando procesos de defensa en la planta, brindando una protección preventiva (Kagale et al. 2004). Los metabolitos secundarios, son sustancias de bajo peso molecular, no son comunes en todas las plantas y por el contrario, pueden ser una expresión de la individualidad química de un organismo. Los productos del proceso fundamental de la fotosíntesis proporcionan los intermediarios biosínteticos necesarios para 14 dar lugar a la formación de los metabolitos secundarios, haciéndose evidente la interconexión entre productos del metabolismo primario con el secundario (Gil, 2002). Los compuestos fenólicos sencillos (hidroxibenzoicos o hidroxicinámicos), son metabolitos secundarios comunes en las plantas con propiedades fungicidas. Las cumarinas clasificadas como antifúngicas y antibacteriana. Los conjugados de fenilpropanoides con aminas, se incorporan a la pared celular vegetal para aumentar su rigidez e impedir la entrada de los patógenos. En cuanto a las fitoalexinas, estas son sintetizadas por las plantas, después de la infección y en actividad inhibitoria de microorganismos patógenos, se han identificado un grupo importante, por ejemplo, la pisatina, la cual es un flavonoide sintetizado por el guisante, Pisum sativum, como reacción a la infección por hongos, siendo esta la primera fitoalexina aislada y caracterizada (Gil, 2002). Por otro lado, aquellas que hacen parte de la respuesta hipersensible, como es el caso de algunos compuestos pertenecientes a los grupos de los alcaloides, los terpenoides y los fenilpropanoides, participan activamente eliminando directamente al microorganismo patógeno y/o restringiendo su invasión al resto de la planta. Al mismo tiempo, otros metabolitos secundarios contribuyen a destruir las especies reactivas de oxígeno que son tóxicas para la misma célula vegetal, las cuales se sintetizan durante las etapas tempranas de la respuesta de defensa. Es así, como algunos metabolitos secundarios constituyen una parte importante de la respuesta de la defensa de las plantas sometidas al ataque por patógenos (Sepúlveda et al. 2003). Existen varios reportes en la literatura en donde registran plantas con actividad fungicida, como es el caso de Allium sativum, la cual contiene como compuesto activo aliína un aminoácido sulfurado; el aceite esencial de hojas de orégano mexicano (Lipp iagraveolens), presenta fenoles timol y carvacol que son los principales componentes que le confieren poder antibacteriano y antifúngico (Kagale et al. 2004). (Cymbopogon citratus), El aceite esencial obtenido desde hojas de limón que es rico en citral, myrceno, dipenteno, methylheptenona, ciertos alcoholes, y ácidos volátiles, presento actividad antifúngica, contra Mycosphaerella fijiensis en bioensayos realizados in vitro (Obledo et al. 2004). 15 En Colombia evaluaron el efecto biofungicida de Momordica charantia, Awinglea glutinosa, Salvia officinalis, Carica papaya, Azadirachta indica y Jatropha sp. Utilizando como adherente natural el aceite de Ricinus comunis, los autores encontraron que hubo respuesta de sensibilidad del hongo a los tratamientos, sin embargo el químico presentó los mejores resultados en todas las variables (Marín et al. 2006). En el caso del patosistema pepino-Podosphera xanthii, causante del mildeo polvoso, al ser tratado con un inductor exógeno, proveniente de las hojas de malsana (Reynoutria sachalinensis), se observó rápidamente la síntesis de una fitoalexina, C-glycosdsil conocida como cucumarina, la cual se acumula en el sitio de penetración del hongo, jugando un papel importante en el bloqueo, colonización y supervivencia del patógeno. Se reporto la lignificación de la pared celular y el aumento en actividad de las enzimas quitinasas, peroxidasas y β-1,3 glucanasas (Fofana et al. 2005). Los efectos fungicidas in vitro de los Aceites esenciales de plantas aromáticas contra Fusarium sp ha sido determinados por la capacidad inhibitoria en el crecimiento del fitopatógeno con estos productos (Fernández y Vega 1990). Los extractos provenientes del cedro blanco (Hiba arborvitae) inhiben la germinación de esporas de Botrytis cinerea (Hernández y Bautista 2007); y el crecimiento micelial Sclerotinia sclerotiorum aplicados a diferentes concentraciones (Zapata et al. 2003). 2.2 GENERALIDADES DEL CULTIVO DE TOMILLO (Thymus vulgaris) El tomillo (Thymus vulgaris) pertenece de la familia Lamiaceae. Es una planta aromática, vivaz, leñosa, muy polimorfa, de 10 a 40 cm de altura, con numerosas ramas leñosas, erectas, compactas, parduzcas o blanco-aterciopeladas. Las hojas de 3 a 8 mm son lineares, oblongas, sentadas o brevemente pediceladas, opuestas, tomentosas, sin cilios, con el pecíolo o sus márgenes revueltos hacia abajo y blanquecinas por su envés. Las flores son axilares y agrupadas en la extremidad de las ramas, formando una especie de capitulo Terminal, a veces, con inflorescencia interrumpida; las brácteas son verde grisácea; el cáliz, algo giboso, con pelos duros, con tres dientes en el labio superior, cortos, casi iguales y dos en el inferior, muy agudos, mas largos , con pelos es sus bordes y de color 16 rojizo; la corola, un poco mas larga que el cáliz, con el labio superior erguido y el inferior trilobulado y de color blanquecino o rosado; los cuatro estambres sobresalen de la corola. El fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón (Gil, 2002). Es una especie muy variable, tanto en su fenología como en la composición química de su aceite, en la que ya se han detectado siete quimotipos. Debido a esto ha dado lugar a confusiones taxonómicas en este género, en el que se han considerado como especies distintas, a sus variedades o ecotipos (Fonnegra y Jiménez 2006). Su hábitat son países de cuenca mediterránea occidental, sobre suelos secos y soleados. Es abundante en el este, centro y sur de la península y en Baleares. Crece sobre suelos calizos, arcillosos y menos frecuentes en silicios. La latitud es de 0 a 1.800 m. El clima más favorable para su cultivo es templado, templadocalido y de montaña. Resiste bien a las heladas y sequías, pero no el encharcamiento ni exceso de humedad ambiente. Aunque prefiere los suelos ricos y calcáreos, se adapta a los arcillosos, ligeros y silicios. Prefiere la exposición a medio día. Su reproducción puede hacerse por semillas o vegetativamente, por división de pies o por esquejes (Latorre,1999). Las enfermedades que puede atacar el cultivo, se destaca sobre la parte aérea, a veces, un amarillamiento de hojas, de algunas ramas, de la parte superior, debido a un ataque de nematodos fitófagos, a nivel de las raíces. Una invasión generalizada conduce a la desaparición de la totalidad de los pies atacados. El responsable principal es Meloidogyne hapla. La única lucha posible es la desinfección de suelos y mediante la multiplicación vegetativa, recurrir a los pies sanos. No se debe implantar el cultivo de tomillo en parcelas donde se ha detectado presencia de nematodos. La defoliación y el amarilleo confirmado después de la floración, son fenómenos naturales, que no deben confundirse con enfermedades (Gutierrez, 1996) La composición química de las ramas contiene flavonoides, derivados del apigenol y del luteolol; ácidos fenolitos, caféico, rosmarínico, clorogénico; ácidos triterpénicos, ursólico y oleanoico; saponinas; contiene también elementos minerales. El aceite esencial contiene carvacrol y timol (aunque las plantas 17 españolas, apenas contienen timol) en porcentaje del 20 al 70%, según las razas; también contiene p-cimeno, terpinenos, linalol, borneol y sus esteres acéticos, cíñelo, geraniol, cariofileno. En Francia se han encontrado hasta la fecha, siete quimiotipos diferentes de Thymus vulgaris (Fonnegra y Jiménez 2006). La mayoría del aceite comercial de tomillo es extraído de Thymus zygis. Los principales componentes del aceite de tomillo son mostrados en la TABLA Nº 1. Los aceites ricos en timol son producidos en grandes cantidades y son valorados por su aroma. Se observan las variaciones en la composición del aceite debido a diferentes quimiotipos reconocidos. Se reportan rendimientos de aceite entre 0.5 – 1.5%. TABLA Nº 1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de diferentes quimiotipos de Thymus zygis. QUIMIOTIPO QUIMIOTIPO QUIMIOTIPO QUIMOL CARVACROL LINALOL Y - terpineno 9.9 11.9 0.2 P – cimeno 18.9 20.8 1.5 Linalol 3.2 4.1 79.0 Timol 49.8 0.8 0.9 Carvacrol 2.0 43.9 1.1 COMPUESTO Fuente: Proyecto Hierbas Aromáticas. UNAL 2.3 Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimum basilicum). La albahaca (Ocimum basilicum) es una planta herbáceas, anual, de tallos erectos y ramificados, que alcanza de 30 a 50 cm de altura. Las hojas de 2 a 5 cm son opuestas, pecioladas, aovadas, lanceoladas y ligeramente dentadas. Las flores son blancas o ligeramente purpúreas, dispuestas en espigas alargadas, axilares, en la parte superior del tallo o en los extremos de las ramas. El fruto esta formado por cuatro aquenios pequeños lisos (Latorre, 1999). 18 Es originaria Persia y Asia menor, se ha extendido su cultivo por las regiones templadas, sobre todo los países de la cuenca mediterránea. Su multiplicación puede ser por semilla o por siembra directa durante 15 días a una temperatura de 20 a 25ºC (Jarvis, 1981). En plena floración de la planta cuando se estima a obtener su aceite se recolecta se corta a unos 15cm del suelo con el fin de preservar las yemas basales de los tallos. La albahaca produce aceite esencial, de color amarillo rico en linalol, metil chavicol y eugenol, con rendimientos aproximados de 0.6%(en peso fresco) y 1.2 % (en peso seco) (Espitia, 2004). 2.4 Control contra hongos fitopatógenos en plantas aromáticas El método tradicional para el control de hongos en plantas aromáticas, ha sido las prácticas culturales, dirigida a reducir la fuente de inóculo del patógeno y forma parte de un programa de manejo integrado de la enfermedad. En este sentido, el establecimiento de un buen sistema de drenaje, la remoción de las hojas viejas en el suelo junto con la poda sanitaria, se han utilizado durante años como estrategias para reducir la densidad del inóculo, sin dejar de lado, un adecuado programa de fertilización. Se ha propuesto el establecimiento de altas densidades de siembra, con el fin de generar un micro y mesoclima al interior de la plantación, creando condiciones desfavorables para el patógeno (Rosales et al. 2002). El método de control químico, es el más ampliamente utilizado, se establece dentro de un programa normal de rotación entre fungicidas, sistémicos y protectantes, a lo largo del ciclo del cultivo. De acuerdo a Marín y Romero (1998), los fungicidas para el control de esta enfermedad se pueden agrupar en tres categorías, con base en su modo de acción: fungicidas de contacto o protectantes, de acción sistémica local y fungicidas sistémicos. En cuanto a los fungicidas protestantes, estos son utilizados de forma alternada con fungicidas sistémicos, estos últimos, son aplicados con aceites o emulsiones como adherente (Romero, 2006). En la búsqueda de nuevas alternativas para el control de enfermedades de platas aromáticas, se tienen algunas aproximaciones en el control biológico, 19 tendiente a reducir el inóculo de la enfermedad, utilizando microorganismos, que en buena medida actuarían como antagonistas o en competencia contra los hongos fitopatógenos (Patiño et al. 2006; Gutiérrez, 1996). A pesar de los avances, el empleo de estos microorganismos y el como hacerlos eficientes para uso masivo, esta aún poco desarrollado, máxime que una de las limitantes en su aplicación es la efectividad disminuida causada por el efecto negativo de factores ambientales, los cuales pueden alterar la supervivencia, actividad y vida útil de estos en la superficie de la hoja. La importancia de los metabolitos secundarios en control, se ve claramente en los trabajos con extractos de plantas, en donde se han evidenciado como potentes productos antifúngicos, antibacterianos, estimuladores del desarrollo fisiológico de la planta o activando los mecanismo de defensa contra plagas y enfermedades (Kagale, 2004). 2.5 Hongos fitopatógenos de plantas Aromáticas En Estragón (Artemisa dracunculus) la principal enfermedad es la roya del estragón, Puccinia dracunculina, que hace su aparición en los meses donde hay elevadas temperaturas y la es humedad imperante (Gómez, 2004). En la Albahaca sólo dos enfermedades de origen biótico de importancia han sido descritas para esta especie, ambas causadas por patógenos que representan un amplio rango de hospederos afectando otros cultivos (Goto, 1990). El Tizón, este es ocasionado por el hongo Botrytis cinerea, constituye el principal problema patológico que afecta la parte aérea de las plantas de este cultivo. Su presencia se manifiesta inicialmente como manchas foliares marrón, que al crecer pueden comprometer toda la hoja. Es común observar la aparición de moho gris sobre el tejido afectado, lo que facilita el diagnóstico. El desarrollo del agente causal de esta enfermedad se ve favorecido, como ya se ha señalado, por condiciones de alta humedad y agua libre sobre el follaje, siendo particularmente susceptible el tejido senescente. De aquí que sea importante favorecer la aireación dentro del cultivo para evitar que el agua se acumule en hojas por periodos prolongados. Otras medidas culturales también indicadas 20 para esta enfermedad en otros cultivos son válidas para albahaca. Así es importante la eliminación de hojas o cualquier tejido muerto o senescente y evitar exceso de fertilización nitrogenada (Gil, 2002). Pudriciones radicales y de corona, causadas por hongos de los géneros Pythium spp., Rhizoctonia spp. Phytophthora spp. y Fusarium sp., los que producen necrosis y podredumbre del sistema radical y corona, asociado a clorosis y marchites de las plantas. Las raíces pierden su color blanco característico, adquiriendo una coloración marrón. La principal vía de llegada de estos patógenos al cultivo es a través de sustrato, bandejas, agua, solución nutritiva, tanques y cañerías contaminados. De aquí, que una medida de control fundamental la constituya el asegurar la limpieza de todas estas posibles fuentes de inóculo del hongo. De igual manera se debe evitar la contaminación con suelo de todos los componentes del sistema o recipientes que se vayan a utilizar (Gómez, 2004). En la Menta a existencia de enfermedades afecta el estado sanitario de los cultivos y por lo tanto reducen la producción de materia verde y aceite esencial. La enfermedad de mayor importancia en la Argentina para las mentas es la roya (Puccinia menthae Pers) que, ataca a hojas y tallo, se caracteriza por la aparición de pústulas amarillas que luego oscurece a tonos marrones (Goto, 1990). Cuando el ataque es muy intenso puede provocar la caída de las hojas. El control de esta enfermedad es difícil, en general se recomienda adelantar la cosecha cuando se prevé un ataque severo (Latorre, 1999). El marchitamiento es, una enfermedad producida por el hongo (Verticillum sp), que se caracteriza porque las hojas se toman amarillas, la planta crece con dificultad y termina por morir en poco tiempo, especialmente si el clima es seco (Goto, 1990). La antracnosis es causada por el hongo Sphaceloma mendiak, se caracteriza por la aparición de manchas, grises con bordes marrón-rojizos en las hojas 21 jóvenes, que pueden extenderse a, los brotes, provocando la caída de las primeras y la muertes de los segundos (Gutiérrez, 1996). En Orégano (Pelcthranthus amboinicus), el ataque del tizón foliar (Alternaria alternata) que si bien no se manifiesta severamente, es la enfermedad que reviste mayor importancia, ya que causa el deterioro del producto. Se manifiesta desde, el ápice hacia la base de la planta en forma de manchas foliares que se localizan principalmente en las hojas superiores. En ataques severos se produce la muerte de la planta. La predisponen la sucesión de días lluviosos, elevada humedad y temperatura (Gil, 2002). Dentro de la enfermedades fúngicas se nombra Phythophthora cryptogea que produce necrosis a nivel del cuello de la raíz se caracteriza por un importante deterioro de las plantas, ramas secas y las hojas presentan manchas amarillas, marrones y negras, este hongo , se presenta en primavera en especial en suelos húmedos y compactados (Gómez, 2004). El orégano puede ser atacado por una podredumbre debido al desarrollo de Botrytis cinerea y por Puccinia rubsaameni. Para el caso de la mejorana se menciona a su vez el ataque de Puccinia menthae, así como Septoria origanicola var. Mejorana ambas afectan al sistema fotosintético de las plantas (Gómez, 2004). Una de las más importantes enfermedades del orégano es debida a Colletotrichum spp causante de necrosis foliares que deprecian la calidad de la producción en verde. Los síntomas que se observan primero son unas pequeñas manchas pardas sobre las hojas y los tallos. Al extenderse progresivamente por la lámina foliar, las áreas necróticas coalescentes producen el total marchitamiento de las hojas, que caen finalmente. Dos han sido las especies de Colletotrichum aisladas del orégano: Colletotrichum dematium y Colletotrichum gloeosporioides, ambos fueron aislados y cultivados en PDA (Patata-DextrosaAgar) dando dos tipos diferentes de colonias (Latorre, 1999). De igual forma se ha descrito un hongo perteneciente a la familia de la Pythiaceas, Phythophthora cryptogea, presente igualmente sobre romero, tomillo 22 y salvia, que provoca unas necrosis a nivel del cuello y de las raíces. El marchitamiento del pie de las plantas afectadas se caracteriza por la presencia de ramas secas y de hojas con manchas amarillas, pardas y negras. El hongo está presente en los suelos húmedos y compactos, propensos a los encharcamientos (Gutiérrez, 1996). También se ha podido observar sobre cultivos de orégano un oidio causado por Erysiphe galeopsidis el cual provoca unas manchas blancas sobre los tallos y las hojas de las plantas enfermas (Gómez, 2004). Otros agentes causantes de enfermedades de origen fúngico en el orégano son Botrytis cinerea y una roya, Puccinia rubsaameni. Ambos parasitan al orégano y le causan podredumbres (Goto, 1990). El Damping-off en Salvia (Pluchea odorata) causado por Pythium debaryanum y Pellicularia filamentosa. En los semilleros, donde las plantas están bastante apiñadas y bajo muchas condiciones algunos de los plantones muertos pueden ser la consecuencia de la acción de alguno de estos hongos. El control que se puede realizar hoy por hoy es difícil pero se recomienda la solarización de los suelos como prevención (Apablaza, 1999). Manchas en las hojas es causado por Cercospora salviicola y Ramularia salviicola. Arrancar y destruir las primeras hojas manchadas frecuentemente es utilizado como método de control preventivo (Gamboa, 1998). Muchas especies de royas atacan principalmente a especies silvestres de Salvia. Algunas de las más comunes son Puccinia caulicola, P. farinacea, y P. salviicola. Raramente se aplican métodos de control (Apablaza, 1999). 2.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea 2.5.1.1 Descripción básica Botrytinia se diferencia de Sclerotinia por tener una medula esclorotial más compacta, gelatinizada y un anamorfo en Botrytis. El telemorfo puede encontrarse en el campo, aun que predomina el anamorfo Botrytis cinerea. Los esclerocios varían de forma y tamaño, pero normalmente son al menos de 3 mm 23 de diámetro; para que se produzcan apotecios se necesita un periodo de almacenamiento en frío; los tallos de los apotecios llegan a 3 cm de longitud y a 1-2 mm de grueso; los discos son cóncavos , pardo amarillentos y de hasta 8mm de diámetro. Las ascas son cilíndricas, las ascosporas elipsoidales a fusiformes, y uninucleadas. Los conidióforos son mas o menos rectos, ramificados, pardos, pero mas pálidos cerca del ápice; las ramas terminales producen conidias lisas, unicelulares, obobales o elipsoidales, hialinas a pardo claro o, en masa, pardo grisáceo (Elad y Volpin, 1999). 2.5.1.2 Hospedero y especialización Es un parasito inespecífico que ataca un amplio numero de especies vegetales (hortícola, ornamentales, cultivos extensivos, frutales) especialmente anuales; también ataca a plántulas de árboles forestales. Puede comportarse como patógeno y como saprofito. Aunque entre los aislados existen variaciones notables de morfología cultural y de agresividad, no se ha encontrado especialización respecto al huésped (Smith 2002). 2.5.1.3 Enfermedad Produce una podredumbre blanda (podredumbre gris), marchitez súbita o lesiones pardas. El hongo infecta a las plantas casi exclusivamente a partir de tejidos colonizados muertos o senescentes o a través de heridas; puede causar muerte de plántulas en pre y post emergencia (ornamentales, hortícolas, árboles forestales); en tallos y pecíolos aparecen lesiones pardas que se extienden lentamente por los tejidos del tallo. Sobre las hojas se desarrollan lesiones pardas, a veces hidrópicas, que se extienden con rapidez, especialmente en condiciones húmedas (Avila, 1993). 2.5.1.4 Epidemiología El hongo sobrevive principalmente sobre restos vegetales infectados; aunque ciertos aislados producen esclerocios in Vitro, no se conoce bien su papel en vivo; puede infectar a la semilla. La principal fuente del inóculo son conidias dispersadas por viento y lluvia (salpicaduras); las alternancia de humedad relativa elevadas y bajas parecen favorecer la liberación de las conidias; también puede dispersarse por el viento y la lluvia y constituyen la base de un inóculo 24 saprofitito importante que se adhiere a las superficies mojadas de las plantas (Bayona, 1996). 2.5.1.5 Control Los problemas de resistencia a fungicidas y en este caso, la falta de especificidad del huésped, la enfermedad puede extenderse fácilmente de un cultivo a otro (Doss, 1995). 2.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum 2.5.2.1 Descripción básica Esta especie, la mas importante del género Fusarium, en PDA las colonias tiene un aspecto variable que depende de la cepa; en general el micelio aéreo ye el medio cambia de color a distintos tonos desde violeta a morado oscuro; si abundan los esporodoquios las colonias puede aparecer crema o naranja. Las microconidias, siempre presentes, son oval-elipsoides, mono o bicelulares, y se forman en fialidas cortas no ramificadas, nunca en cadena, pero agrupadas en falsos capítulos. Las macroconidias, normalmente 3-5 septadas, son fusoides, ligeramente curvadas y a menudo tienen una célula basal pedicelada; se forman al principio en fialidas individuales, luego en esporodoquios. Las clamidosporas son solitarias o están en cadenas cortas (Agrios, 1998). 2.5.2.2 Especialización de hospedero F. oxysporum es predominantemente un saprofito abundante y activo del suelo y de materia orgánica. Además algunas cepas tienen una actividad patogénica específica, pero constituyen una porción muy pequeña de la población total del suelo aunque causan enfermedades importantes en los cultivos. Algunas están poco especializadas y causan muerte de plántulas, necrosis o podredumbres; sin embargo las formas responsables de las marchitez vasculares son las más importantes. Causan perdidas en plantas pertenecientes a todas las familias importantes de angiospermas (a excepción de las Gramineae) en regiones templadas o tropicales (Smith 2002). 25 2.5.2.3 Síntomas de la enfermedad Los síntomas de la marchitez fusárica varían según el huésped, el patotipo y las condiciones de infección; en general las hojas mas viejas muestran al principio un aclarado vascular leve, clorosis de la lamina o marchitez, y estos síntomas progresan posteriormente a las hojas jóvenes, a menudo iniciándose unilateralmente en algunas en correspondencia con una infección localizada en parte del sistema vascular de raíz y tallo; las partes afectadas de la planta empardecen. En el tallo aparecen estrías longitudinales necróticas que se extienden hacia el ápice; los síntomas internos pueden verse a simple vista en secciones de raíz, tallo y pecíolo. El empardecimiento comienza en el tejido vascular y se extiende al córtex en las fases tardías de la infección. La marchitez se desarrolla con especial rapidez en la floración o fructificación. En los cultivos aparecen en focos que se extienden gradualmente, causando la muerte prematura de las plantas afectadas. Debido a la consecuencia respecto al control y a la posibilidad de conjunción con otras enfermedades es importante comprobar los síntomas de las marchiteces debidas a Fusarium (Mazzanti, 1994). 2.5.2.4 Ciclo de la enfermedad Las marchiteces debidas a Fusarium son enfermedades típicas del suelo, y en el la principal fuente del inóculo son los restos vegetales infectado; las clamidosporas pueden resistir de forma inactiva durante varios años y germinar al disponer de nutrientes, por ejemplo la proximidad de partes jóvenes de raíces. La clamidospora germinada da lugar a inóculo al gormar hifas, conidias y clamidosporas; en este aspecto las cepas del patógeno se comportan igual que otras especies de Fusarium (Agrios, 1998). En la rizosfera hay una competencia intensa con otros microorganismos y en particular con otros Fusarium; aunque muchas cepas de F. oxysporum son capaces de penetrar en los tejidos corticales de la raíz las cepas especificas de huésped son las únicas capaces de penetrar al tejido vascular y causar marchitez; la penetración tiene lugar principalmente en la zona de elongación de la raíz y puede facilitarse por heridas y por ataque de nematodos; desde el punto de penetración el hongo se extiende hacia arriba por los vasos xilematicos 26 mediante crecimiento miceliar y formación de microconidias que se transportan en la corriente transpiratoria (Latorre, 1999). En estadíos posteriores puede extenderse al tejido adyacente causando necrosis visibles exteriormente. La patogénesis esta relacionada con el bloqueo de los vasos y la formación de enzimas y toxinas. Los Fusarium causantes de marchitez pueden también invadir y colonizar plantas que no son huéspedes, en las que causan síntomas leves; estos portadores asintomáticos contribuyen al transporte y multiplicación del inóculo (Smith, 2002). 2.5.2.5 Epidemiología y control Los Fusarium patogénicos causantes de marchiteces, que tiene una importancia primordial en muchos cultivos (excepto cereales), puede dispersarse en el suelo, polvo, agua de riego o por plantas infectadas (pero rara vez por semilla); los agentes mas importantes en la practica son el suelo y el material de multiplicación vegetativa, que deben someterse a controles fitosanitarios para impedir la dispersión. Aunque las clamidosporas son muy resistentes es posible utilizar termoterapia en bulbos y tratamientos desinfectantes en el suelo que, sin embargo, tiene a ser mas bien ineficaces en suelo in situ, dado que incluso pequeñas cantidades de inóculo residual pueden ser acusa de ataques importantes y que el inóculo que permanece en zonas profundas colonizará de nuevo con rapidez la zona desinfectada, en la que existe un vació microbiológico (Smith, 2002). En los sistemas intensivo de cultivo las raíces se desarrollan en un volumen limitado de sustrato, que puede mantenerse en un principio libre de F. oxysporum, sin embargo debe evitarse la re-infestación con plantas, polvo o agua de riego. Algunos suelos son supresivos para las marchiteces debidas a Fusarium, debido a que un alto nivel de competencia con otros microorganismos impide que las formas especiales ataquen a las plantas cultivadas en ellos; este efecto supresito puede incluso trasferirse a otros suelos y establecerse allí, lo que abre perspectivas a un control microbiológico (Agrios, 1998). Dado que suelo ácidos con deficiencias en potasio; y fertilización con Nitrógeno amonico tiende a favorecer la enfermedad, el encalado, la fertilización potasita y el uso de nitrato reducen a veces las perdidas. Otros factores que favorecen las 27 marchiteces por Fusarium son las temperaturas elevadas, el crecimiento rápido y la transpiración intensa, pero no son fáciles de alterar sin afectar directamente la producción. El éxito inicial del control con fungicidas sistémicos (benzimidazoles) fue de corta duración al aparecer con rapidez cepas resistentes de F. oxysporum. Las principales perspectivas para el control residen de hechos en la mejora de cultivares resistentes, de los que se dispone comercialmente para la amatoria de huéspedes importantes; tales cultivares pueden ser muy resistentes solo a algunas razas o ser ampliamente tolerantes a distintas razas, en algunos casos pueden dar buen resultado injertar sobre patrones con un buen nivel de resistencia de base amplia (Polanco, 2004). 2.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum 2.5.3.1 Descripción básica El hongo crece rápidamente en cultivo produciendo un micelio algodonoso blanco, abundante, en el que se desarrollan esclerocios negros hasta de 1 cm. de diámetro, con una superficie ligeramente punteada, que a menudo exudan gotitas de liquido en atmósferas saturadas en hipocótilos Sclerotinia sclerotiorum se han descrito dos tipos morfológicamente distintos de hifas: Hifas infecciosas intercelulares anchas (diámetro medio 17µm) orientadas predominantemente en paralelo al eje longitudinal de hipocótilo, que se forman al principio, apareciendo el segundo tipo morfológico: hifas que se ramifican con un diámetro medio de 8.5 µm y que se desarrollan sub-apicalmente a partir de las hifas de infección, se ramifican abundantemente y se penetra en el huésped inter e intracelularmente. En las colonias viejas se forman a menudo microconidias fialidicas unicelulares cuyo papel en el ciclo vital, si es que lo tiene, no se ha aclarado, aunque en distintas ocasiones se ha supuesto que se pueden funcionar como espermatidas y se ha señalado su germinación in Vitro. No hay Macroconidias. Los esclerocios tienen germinación miceliogénica y carpogénica; en el primer caso dan lugar a hifas vegetativas y en segundo, a apotecios que tiene forma de copa, son pardo-amarillento de hasta 10 mm de diámetro, sobre un tallo cilíndrico liso que se origina del esclerocio. Las ascas son cilíndricas clavadas de hasta 130 x 10 µ, con 8 esporas. Las ascosporas son uniseriadas y elípticas de 9-13 x 4-6.5 µ (Smith, 2002). 28 2.5.3.2 Hospederos S. sclerotiorum es uno de los patógenos con una gama de huéspedes más amplia, se señala como huéspedes a 225 géneros de 64 familias de plantas superiores, principalmente angiospermas. Es especialmente frecuente el parasitismo a las Solanaceae, Cruciferae, Umbeliferae, Compositae, Curcubitaceae y Leguminoseae. En raras ocasiones ataca a plantas leñosas, a gramíneas y a cereales. Se ha demostrado que son capaces de atacar una amplia gama de huéspedes (Agrios, 1998). 2.5.3.3 Enfermedad S. sclerotiorum causa en una amplia gama de huéspedes una podredumbre blanda progresiva de tejidos no lignificados; los daños son especialmente frecuentes en tallos de plantas herbáceas y en órganos de almacenamiento de hortícola; también causa lesiones de hojas, pero solo si las condiciones para su extensión son muy favorables. En distintos cultivos se dan nombre distintos a la enfermedad, siendo generalizado el del mal del esclerocio. Son rasgos característicos la formación de lesiones extensas blandas, normalmente de color claro y el crecimiento de un tapiz miceliar blanco algodonoso sobre la superficie y en el interior de las cavidades del huésped; posteriormente se forma en las cavidades medulares de los tallos y de los pecíolos esclerocios negros prominentes cuya aparición es un carácter diagnostico fiable. El primer síntoma notable en plantas infectadas en el eje principal cerca del nivel del suelo suele ser un marchitamiento, al que sigue rápidamente un colapso total y el encamado (Purdy, 1999). 2.5.3.4 Epidemiología Los esclerocios constituyen el principal medio de supervivencia; su supervivencia en el suelo es muy variable, pero se considera seis-ocho años el límite superior. El micelio también puede sobrevivir en las semillas, lo que tiene poca importancia epidemiológica. En una amplia gama de condiciones la germinación miceliogénica tiene poca importancia debido a que en el suelo no estéril la extensión saprofítica es limitada; sin embargo cuando se encuentran próximos los esclerocios y las plantas susceptibles pueden tener lugar infecciones devastadoras del suelo (Adams, 1999). 29 Una condición para la germinación carpogénica es que haya habido un periodo de helada que rompa la dormicíon y a continuación temperaturas mayores y humedades altas; en las altitudes templadas los apotecios maduran típicamente; los estipes de los apotecios se alargan en respuesta a la luz y las ascosporas se dispersan por el viento; al aterrizar sobre huéspedes potenciales necesitan durante 16-24 horas agua para germinar; pueden germinar en un intervalo de temperatura desde 0-25º C, con un óptimo a 15-20 ºC (Smith, 2002). También parece que para la infección se necesita una base exógena de nutrientes. Los tejidos heridos, muertos o senescentes se colonizan con facilidad y sirven como una base nutritiva, desde la que puede tener lugar la infección de tejidos sanos (Adams, 1999). Las ascosporas germinales producen apresorios que pueden variar desde formas lobuladas simples a cojinetes ramificados complejos; la penetración normalmente es directa a través de la cutícula, ayudada por una importante disolución pectolítica y celulolítica de la estructura de la estructura celular del huésped. Al descomponerse el huésped los esclerocios vuelven al suelo o pueden distribuirse por las operaciones culturales, la recolección el pastoreo, etc. (Agrios, 1998). En la mayoría de las regiones la ausencia de un estadio conídico y las limitaciones ambientales para la formación de apotecios reducen a un ciclo único anual de infección (Smith, 2002). 2.5.3.5 Control El control químico se ha dirigido tanto a inhibir el desarrollo de los esclerocios como a proteger las plantas contra la infección por ascosporas; lo primero se ha intentado con distintos esterilizantes de suelo y con fungicidas de amplio espectro (Smith, 2002). El control biológico con antagonistas microbianos que colonizan los esclerocios parece que pueda resultar prometedor en el futuro. Los métodos culturales de control deben utilizarse con cuidado: el realizar labores profundas en dos años sucesivos puede reexponer esclerocios viables enterrados, y la rotación de 30 cultivos tiene un valor limitado, dado la amplia gama de huéspedes (Adams, 1999). 2.6 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS Las plantas poseen una variedad de mezclas de compuestos bioactivos tales como lípidos, grasas, fotoquímicos, fragancias, pigmentos y sabores que son ampliamente utilizados en la agroindustria alimentaría y no alimentaría, en la industria Farmacéutica y en la industria cosmética. Para separar estos compuestos (solutos) de la fase sólida, ésta se pone en contacto con una fase líquida, ambas fases entran en contacto íntimo y el (los) soluto(s) se difunde(n) desde el sólido a la fase líquida, lo que permite una separación de los componentes de su estructura natural original. Este proceso se conoce como lixiviación y para realizarlo existen varios métodos. Un proceso importante es la lixiviación de azúcar de las remolachas con agua caliente. Otros procesos muy utilizados consisten en la extracción de aceites vegetales, en los cuales se emplean disolventes orgánicos como hexano, acetona y éter, para extraer aceites de maní, soja, semillas de lino, ricino, girasol o algodón (Geankoplis, 1999). Los métodos tradicionales de extracción requieren altos tiempos de residencia y grandes cantidades de solvente. Estos métodos se basan en la selección del solvente asociado con el uso de calor y/o agitación e incluyen el soxhlet, la hidrodestilación y maceración mezclada con agua, alcohol o grasa caliente. El soxhlet es una técnica estándar y la principal referencia para evaluar el rendimiento de otros métodos de extracción sólido – líquido (Luque de Castro y García-Ayuso, 1998). De un tiempo a esta parte se han desarrollado varias técnicas nuevas para la extracción de solutos de matrices sólidas, entre ellas se tiene: la extracción asistida con ultrasonido (Vinatoru, 2001), la extracción asistida con microondas (Kaufmann y Christen, 2002), la extracción con solvente acelerado (Kaufmann y Christen, 2002; Smith, 2002) y la extracción con fluidos supercríticos (Brunner, 2005; Rozzi y Singh, 2002), con el objeto de acortar el tiempo de extracción, 31 disminuir el consumo de solvente, aumentar el rendimiento de extracción y mejorar la calidad del extracto. Se empezará describiendo los métodos de extracción con soxhlet y con fluidos supercríticos, también se citaran algunos resultados comparativos entre estos dos métodos y finalmente se mostrarán algunas de las aplicaciones agroindustriales con fluidos supercríticos FSC, con el objeto de continuar la divulgación que ya se viene haciendo de éste método y de sus bondades entre los académicos e industriales de nuestros países latinoamericanos. 2.6.1 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN 2.6.1.1 EXTRACCION CON SOXHLET Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta: la selección del solvente, la matriz sólida y las condiciones de operación. 2.6.1.1.1 Selección del solvente Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el mejor balance de varias características deseables: alto límite de saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente de extracto y bajo costo (Dahlstrom et al., 1999). Cada solvente diferente produce extractos y composiciones específicos (Zarnowski y Suzuki, 2004). El solvente más ampliamente utilizado para extraer aceites comestibles de las plantas es el hexano. El hexano tiene un rango en el punto de ebullición bastante estrecho, de aproximadamente 63–69 0C y es un excelente solvente de los aceites en lo que se refiere a su solubilidad y facilidad de recuperación. Sin embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexano comercial, está ubicado como el número uno en la lista de los 189 contaminantes del aire más riesgosos por la Agencia Americana de Protección del ambiente (Mamidipally y Liu, 2004). 32 El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del medioambiente, la salud, y a preocupaciones de seguridad. Se usó d-cineno y hexano en la extracción de aceite a partir del salvado de arroz y se observó que el d-cineno extrajo una cantidad significativamente superior de aceite que el hexano bajo cualquier serie dada de condiciones (Mamidipally y Liu, 2004). También se ha utilizado agua para extraer el aceite del salvado de arroz a un valor del pH de 12. El aceite extraído con agua tuvo un volumen más bajo de ácido graso libre y un color más claro que el obtenido con hexano (Hanmoungjai et al., 2000). Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperación debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces se agrega un co-solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además, se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Li et al., 2004). 2.6.1.1.2 Características de la matriz La extracción con Soxhlet depende fuertemente de las características de la matriz y de las dimensiones de las partículas puesto que la difusión interna puede ser el paso limitante durante la extracción. Para la extracción total de las grasas de las semillas oleaginosas, se realizó una extracción de 2-h obteniendo un rendimiento del 99% cuando la dimensión de las partículas era 0.4 mm, mientras que fue necesaria una extracción de 12-h para obtener una eficacia similar si la dimensión de las partículas era 2.0 mm (Luque-Garcia y Luque de Castro, 2004). 2.6.1.1.3 Condiciones de operación: Durante la extracción con Soxhlet, el solvente se recupera normalmente por evaporación. Las temperaturas de extracción y evaporación tienen un efecto significativo en la calidad final de los productos. Además, se ha encontrado que el aceite del salvado de arroz extraído con d-cineno era ligeramente más oscuro comparado con el aceite extraído con hexano, probablemente debido a las mayores temperaturas de extracción y evaporación al usar d-cineno como solvente. Las altas temperatura de ebullición para la recuperación del solvente 33 pueden disminuirse usando evaporación flash o separación por membrana para recuperar el solvente (Mamidipally y Liu, 2004). 2.6.1.1.4 Comparación Soxhlet y CO2 SC La extracción con Soxhlet es una técnica bien establecida. Entre sus ventajas, por encima de otros nuevos métodos como la extracción ayudada con ultrasonido, la ayudada con microondas y la extracción con fluidos supercríticos está la de tener bastantes aplicaciones industriales, buena reproduci-bilidad y eficacia, y menor manipulación del extracto. Sin embargo, comparada con CO2SC, el método Soxhlet es una técnica anticuada y consumidora de tiempo y de solvente. En la extracción de aceites de rosa silvestre (Rosa canina L), utilizando n-hexano con soxhlet se consumieron 180 minutos para extraer 48.5 g/kg, mientras que con CO2SC a 35 ºC y 250 bar, se consumieron 35 minutos para extraer 57.2 g/kg, cuando se le agrego propano (cosolvente) al CO2SC a 28O ºC y 100 bar se consumieron 35 minutos para obtener 66.8 g/kg (Szentmihalyi et al., 2002). Algunos solventes usados con el Soxhlet convencional se han cuestionado recientemente debido a su toxicidad (n-hexano). El uso de solventes no tóxicos como el CO2 supercrítico y el agua están en el orden del día. 2.6.1.2 EXTRACCION CON FSC Un fluido supercrítico es cualquier sustancia a una temperatura y presión por encima de su punto crítico termodinámico. Tiene la propiedad de difundirse a través de los sólidos como un gas, y de disolver los materiales como un líquido. Adicionalmente, puede cambiar rápidamente la densidad con pequeños cambios en la temperatura o presión. Estas propiedades lo hacen conveniente como un sustituto de los solventes orgánicos en los procesos de extracción. Los fluidos supercríticos (FSC) tienen la capacidad de extraer ciertos compuestos químicos con el uso de determinados solventes específicos bajo la combinación de temperatura y presión (Brunner, 2005; Rozzi y Singh, 2002). El CO2 es el fluido supercrítico más utilizado debido a que es no tóxico, no inflamable, no corrosivo, incoloro, no es costoso, se elimina fácilmente, no deja 34 residuos, sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura y por tanto, se pueden separar compuestos termolábiles, se puede obtener a partir de procesos de fermentación alcohólica y ayuda a prevenir la degradación térmica de ciertos componentes químicos del alimento cuando son extraídos (Brunner, 2005; Hurtado, 2002; Rosa y Meireles, 2005). Las ventajas de los fluidos supercríticos son: (Bruner, 2005; Hurtado, 2002; Sánchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Zkal et al., 2005). 1. Poseen alto coeficiente de difusión y viscosidad más baja que los líquidos; 2. Ausencia de tensión superficial, la cual aumenta la operación de extracción dada la rápida penetración de estos al interior de los poros de la matriz heterogénea; 3. La selectividad durante la extracción puede ser manipulada dada la variación de las diferentes condiciones de operación temperatura y presión afectando la solubilidad de varios componentes en el fluido supercrítico; 4. La extracción con fluidos supercríticos no deja residuos químicos; 5. La extracción con CO2 supercrítico permite su fácil recuperación por procesos de reciclaje. El CO2 supercrítico también ha sido usado en innumerables aplicaciones industriales que incluyen diferentes campos como: alimentos, agricultura, acuicultura, pesticidas, procesos microbianos, petroquímica y farmacéutica (Brunner, 2005; Sánchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Vagi et al., 2005). 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Existe una gran incidencia de hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los cultivos de Albahaca (Ocimum basilicum) tipo exportación, en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad nacional de Colombia, sede Bogotá. La enfermedades producidas por estos hongos fitopatógenos han ocasionado pérdidas en la producción hasta de un 60%, debido a una considerable baja de la calidad del producto, la disminución de la productividad del cultivo y llegando incluso la pérdida total de las plantas. Para evitar el control químico de estos hongos se propone un manejo natural integrado del extracto acuoso de Tomillo (Thymus vulgaris), que es conocido por tener propiedades antifúngicas, pero no ha sido evaluado sobre estos hongos de gran importancia en el cultivo de la Albahaca. 3.2 JUSTIFICACIÓN El control de patógenos con aceites esenciales y extractos de plantas aromáticas es un campo poco explorado en nuestro país, aunque por muchos años haya habido evidencia del conocimiento de las propiedades de las plantas aromáticas y sus múltiples usos. El empleo de estas plantas y sus componentes han sido de una forma artesanal. Aprovechando la problemática generada en cultivos de Albahaca (Ocimum basilicum) tipo exportación, por hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; nos lleva a pensar que esta problemática también afecta a los productores de plantas aromáticas en nuestro país. La necesidad de buscar alternativas que sean viables para productores nos da la pauta para evaluar la acción antifúngica del extracto de de la planta aromática de Tomillo (Thymus vulgaris), que beneficiaría en el futuro a un gran número de 36 productores y comercializadores, ya que se daría a conocer un método para combatir los agentes causales de las enfermedades de la Albahaca (Ocimum basilicum), y esto a su vez contribuiría al estudio del manejo biológico de las enfermedades fitopatológicas La importancia de esta investigación va encaminada a la búsqueda de nuevos productos biológicos que se pueden generar a un menor costo, y lo más importante es que tienen un efecto menos agresivo que los productos químicos en el medio ambiente. 37 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo General Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum). 5.2 Objetivos Específicos • Obtener extractos acuosos de Tomillo (Thymus vulgaris). • Probar las propiedades antifúngicas del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum in vitro aislados de albahaca (Ocimum basilicum). • Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) inoculadas con Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum en pruebas de invernadero. 38 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Diseño de la investigación El proyecto se realizó dentro de las instalaciones de los Laboratorios de Biología del Suelo y en los Invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Este procedimiento se realizó con extracto de Menta (Mentha spicata) pero no hubo ninguna inhibición de crecimiento para los hongos, por eso se realizó con tomillo, ya que no todos las plantas tienen los mismos principios activos. Los extractos acuosos se realizaron con concentraciones de 150, 250 y 500 g/L de extracto Tomillo en agua, el tratamiento térmico se realizó con tiempos de 15 y 30 min de ebullición respectivamente, ya que en los tiempos 0, 45 y 60 min no se observó inhibición de ningún tipo. La tasa de crecimiento se midió los días 2, 5 y 7. 5.1.1 Obtención de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) Se recolectaron plantas de Tomillo (Thymus vulgaris) de 10 semanas de edad del Invernadero Nº 2 de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, las cuales se cortaron con tijeras de podar, dejando ramas de 2 centímetros sobre el eje principal de la planta. Posteriormente se pesaron y se procesaron en una picadora de cocina marca Oster. Se utilizó 150 gramos, 250 gramos y 500 gramos respectivamente de material vegetal fresco de Tomillo, pesados en Balanza analítica marca Petller P 5000, ya molido se le practicó un prelavado con solución de hipoclorito de sodio al 0,2% por 2 minutos y luego 4 lavados con agua destilada estéril; se agregaron 1000ml de agua doblemente destilada y esterilizada y se licuaron por separado hasta obtener una mezcla homogénea en licuadora industrial marca Oster por 5min. Posteriormente se dispuso a ebullición cada concentración por 15, 30 y 45 minutos, se filtró utilizando cuatro capas de gasa estéril y luego se utilizó bomba al vacío con papel de filtro estéril para la última filtración. El extracto obtenido se dejo enfriar, se dispuso en frascos herméticos Schott y se llevó a refrigeración en oscuridad a 4 ºC hasta su utilización (Bianchi et al. 1997). 39 5.1.2 Prueba in vitro Las cepas de los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum; fueron aisladas anteriormente de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) enfermas en el Laboratorio de Biología del Suelo de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Las cepas se conservaron en Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®). 5.1.2.1 Evaluación de la Inhibición del Crecimiento Radial La evaluación de la actividad del extracto, contra hongos se hizo por medio de la medición del halo del crecimiento del hongo respecto al control negativo. Se preparó Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) como indica el fabricante, 39 gramos en 1000 mL de agua destilada estéril, se dispuso a esterilización en autoclave de marca All American a 121 ºC por 15 minutos y luego se dispuso en cajas de Petri estériles 50% de Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) y 50% de las diferentes concentraciones del extracto con los diferentes tiempos de ebullición, se dejó solidificar y se llevaron a refrigeración a 4 ºC hasta su posterior utilización (Ramírez 1998). Para la siembra se usaron rodajas de 3 mm de diámetro de colonias de los hongos fitopatógenos de ocho días de edad que se cortaron con un sacabocados. Para colocar la rodaja con el micelio en contacto con el medio de cultivo en el centro de la caja se utilizaron palillos de madera de 10 centímetros de largo y 2 milímetros de grosor puntiagudos esterilizados con calor seco. Las cajas se sellaron y etiquetaron y se incubaron a 26 ºC. Para la evaluación de los hongos fitopatógenos se utilizó el procedimiento de crecimiento radial midiendo el diámetro de la colonia a los dos, cinco y siete días después de la inoculación (Martínez 1999). Como control positivo se utilizó un producto comercial que tiene como componente activo Propamocarb-HCl, que se le adicionó al Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) como indica la casa comercial y como control negativo se utilizó Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) para todos los hongos fitopatógenos. 40 Para todas las concentraciones y los tiempos al igual que para los controles se hizo 4 repeticiones para obtener datos representativos estadísticamente. Se midió el diámetro en milímetros de la zona de crecimiento del hongo en cuatro direcciones a intervalos de dos días tomando como resultado el valor promedio de estas mediciones. Este ensayo se realizó cuatro veces por duplicado determinándose el porcentaje de crecimiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo para el extracto acuoso: Diámetro del crecimiento del hongo En el extracto X 100 % de crecimiento = ------------------------------------------------------Diámetro del control negativo % de inhibición = 100-% de crecimiento Los resultados obtenidos se evaluaron considerándose activo los extractos que presentaron un porcentaje de crecimiento menor o igual al 80 y un porcentaje de inhibición mayor o igual al 20 (Márquez et al. 2007). 5.1.3 Prueba de Invernadero Se sembraron en un banco de propagación en los invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; 200 semillas de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum), las semillas se obtuvieron en Semicol Ltda. Estas semillas se dispusieron en bandejas plásticas con turba estéril sin nutrientes, se les proporcionó riego con aspersor cada dos días y al paso de 30 días se realizaron los dos ensayos simultáneos: La inoculación de la turba con Fusarium oxysporum se realizó tomando 1000 gramos de turba por el hongo fitopatógeno, esta turba se esterilizó en autoclave a 121ºC por 15 min. Se tomaron cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) con este hongos con 10 días de edad, se dispusieron perlas de vidrio estériles con 20 ml de tween 80, se hicieron movimientos circulares para desprender las esporas por 3 min, se realizaron conteos de esporas (del 41 inóculo) en cámara de Neubauer antes de iniciar el proceso para obtener una concentración inicial, este inóculo se mezcló con 500 ml de agua destilada estéril y se llevó a una concentración de 1 x 107 esporas / ml. Para inocular la turba con Fusarium oxysporum, se tomó 1000 gramos de turba estéril en empaques individuales y flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7 días a 26ºC, se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004). El inóculo de Sclerotinia sclerotiorum y Botrytis cinerea, se realizó tomando esclerocios de los hongos con 10 días de edad en medio PDA, se dispusieron 50 esclerocios en dos porciones de 1000 gramos de turba estéril en empaques flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7 días a 26ºC. Se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004). Se tomó 2000 gramos adicionales de turba estéril para los controles, sin patógenos. Al cabo de 7 días de la inoculación de la turba, las plantas de Albahaca (Ocimum basilicum) de 30 días de edad se transplantaron a recipientes de poliestireno expandible de 4 onzas. Se le proporcionó 100 gramos de turba inoculada con los tres hongos fitopatógenos respectivamente a cada recipiente, y la turba estéril se dispuso 4 recipientes para el control positivo y 4 para el negativo. A las plantas se les dispuso una bolsa de plástico para crear un micro ambiente húmedo por 72 horas. Después de la siembra se regaron con aspersor cada dos días por 15 días. Cuando se evidenció crecimiento micelial sobre la turba, se les proporcionó a cada planta por aspersión 20 mL de las diferentes concentraciones utilizadas en el ensayo in vitro tendrían efecto antifúngico, cada dos días por 15 días más. A cada una de las plantas restantes se aplicó 20 mL por aspersión de las diferentes concentraciones del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) y a los 10 días se inóculo la turba con Sclerotinia sclerotiorum (5 esclerocios / 100 gramos de turba). El riego fue cada dos días con aspersor por 15 días. 42 Se midió el porcentaje de la planta afectada. Como referencia se usó una tabla de incidencia y severidad de la enfermedad. Como control se tomaron plantas sin aplicación de los extractos. Se tomó por cada tratamiento 4 repeticiones. Se realizó el análisis estadístico utilizando el programa SAS. 43 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 PRUEBA IN VITRO 6.1.2 EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL Muchas plantas han sido aceptadas para su uso antifúngico porque en su análisis químico y evaluación farmacológica han demostrado que contienen un principio especial, (Zapata et al., 2003) la búsqueda es muy intensa en casi todo el mundo y se basa en explorar el parentesco sistemático con plantas curativas ya reconocidas que han servido para hallar otras nuevas; o bien se han descubierto por casualidad o por validación sistémica de la flora de una región (Romero et al., 2006). Las concentraciones a las cuales se produjo la inhibición son altas con respecto a otros estudios hechos con diferentes tipos de plantas; sin embargo, se debe tener en cuenta que se está trabajando con extractos crudos que contienen otros metabolitos o impurezas sin actividad antifúngica. Dada la extensa variedad de la flora y los numerosos principios activos que en ella se encuentran, es muy probable que de esta fuente puedan aislarse moléculas novedosas y eficaces para ser usadas como antimicóticos; dado que en la literatura revisada no se encontraron reportes de estudios fitoquímicos que aislaran o implicaran una sustancia química en particular con efectos antifúngicos, no es posible, por el momento, definir la naturaleza química de los compuestos bioactivos de esta especie. A partir de tomillo fresco se han aislado Carvacrol (2-hidroxi -p. cimeno) y P- cimenol (Isopropil-tolueno) a las cuales se les ha encontrado actividad antifúngicas (Espitia, 2004). En nuestra población existe una amplia tradición en el uso empírico de plantas con fines medicinales (Marín et al., 2006); es por tanto, muy importante validar a través de la experimentación, la eficacia y seguridad de las múltiples especies vegetales utilizadas. 44 Los extractos acuosos de tomillo en las concentraciones empleadas tienen efecto inhibitorio sobre las tres cepas evaluadas. Mediante la prueba de comparar el comportamiento en conjunto de todos los tratamientos se encuentran diferencias significativas entre todos los tratamientos. Según lo descrito por Vokou et al. (1993) y Daferera et al. (2003), tomillos de diferentes orígenes geográficos mostraron que los componentes mayoritarios son el carvacrol, en la mayoría de las muestras estudiadas, el timol, en un número menor de casos, o una sumatoria de estos dos compuestos fenólicos conformando entre el 50 y 90% del total. Como componentes secundarios están descriptos en estos trabajos, el p-cimeno y al terpineno en todas las muestras analizadas. La capacidad antifúngica podría ser atribuida a la presencia de los compuestos monoterpénicos fenólicos, principalmente timol y carvacrol. Se ha informado la reactividad de los grupos hidroxilofenólicos, formando enlaces puentes de hidrógenos con sitios activos de ciertas enzimas (Farag et al., 1989). Además estos compuestos atacan la membrana citoplasmática del microorganismo destruyendo la capacidad selectiva y permitiendo el escape de componentes intracelulares (Nychas, 1995) lo que sumado a su capacidad de inactivar enzimas, explicaría la actividad contra el desarrollo fúngico. Un ejemplo de este comportamiento son los datos obtenidos de la administración del extracto acuoso de tomillo, en estos ensayos, donde se encontró correlación entre los días de administración y la acción inhibitoria. En las siguientes figuras los resultados de la evaluación de la actividad antifúngica del extracto acuoso, se aprecia el crecimiento de los hongos patógenos y se evidencia la respuesta de inhibición de los extractos junto con los controles ensayados 45 % Porcentaje de Crecim iento según concentración 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 5 7 Día Conc. 150 Conc. 250 Conc. 500 Desv. Std. FIG.1. Porcentaje de Crecimiento según concentración En la Figura 1 se observa que la concentración de extracto acuoso de 500g/L fuel el que obtuvo menor crecimiento (60%) en los días de evaluación, en los días 5 y 7 se mantuvo el porcentaje de crecimiento de los hongos, esto comparado con la concentración de 150 g/L que obtuvo un crecimiento del 90% en el día 5. % Porcentaje de Crecim iento según Tiem po 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 5 7 Día 15 min. 30 min. Desv. Std. FIG.2.Porcentaje de crecimiento según tiempo. El extracto con el tratamiento térmico de 30 min fue el que obtuvo un menor porcentaje de crecimiento de los hongos 63% el día 5 y el día 7 un 58 % de crecimiento; el tratamiento térmico de 15 min obtuvo un crecimiento de los hongos más alto 80% en el día 5 y 72% el día 5 respectivamente (Figura2). 46 Porcentaje de Crecimiento según Especie 120 100 % 80 60 40 20 0 2 5 Día Fusarium oxysporum Sclerotinia sclerotiorum 7 Botrytis cinerea Desv. Std. FIG.3. Porcentaje de Crecimiento según especie. B. cinerea tuvo un mayor crecimiento en los tres días evaluados, F. oxysporum en el día 5, tuvo un porcentaje de crecimiento del 52%, mientras que B. cinerea tuvo uno de 107%, S. sclerotiorum tuvo un porcentaje de 46%. El día 7 se obtuvo una disminución del porcentaje de crecimiento de F. oxysporum (27%) y B. cinerea (81%), mientras S. sclerotiorum tuvo aumento en el porcentaje de crecimiento de 35% (Figura 3) % Porcentaje de inhibición según concentración 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 5 7 Día Conc. 150 Conc. 250 Conc. 500 FIG.4. Porcentaje de Inhibición según concentración. Desv. Std. 47 El porcentaje de inhibición de la concentración de 500g/L fue el que obtuvo un mayor valor (48%) en el día 5 y en el día 7 fue 44%, esta concentración fue la que alcanzo un menor porcentaje de crecimiento y un mayor porcentaje de inhibición de los tres hongos (Figura 4) Por el valor del porcentaje de inhibición de los días 5 y 7 en la concentración 500g/L se presume que la acción antifúngica del extracto permanece durante estos días; ya que su poder de inhibición disminuye en un 2% durante estos dos días, el porcentaje de inhibición del extracto de 250g/L, aunque es menor el comparado con el de la contracción de 500g/L, en el día 5 fue de 41% y aumento en un 3% el día 7. El porcentaje de inhibición de la concentración 150g/L fue la menor, aumento un 4% del día 5 al 7 (Figura 4). % Porcentaje de inhibición según tiem po 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 5 Día 15 min. 30 min. 7 Desv. Std. FIG.5.Porcentaje de inhibición según tiempo. El porcentaje de inhibición con tratamiento térmico de 30 min fue el que produjo un mayor valor 42% el día 5 y 44% el día 7, El tratamiento con 15 min alcanzo en el día 5 un porcentaje de 34% y disminuyo el día 7 hasta 31 %. El tratamiento térmico de 30 min fue el que obtuvo un menor porcentaje de crecimiento y un mayor porcentaje de inhibición de los hongos (Figura 5). 48 % Porcentaje de Inhibición según especie 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 Fusarium oxysporum 5 Día Sclerotinia sclerotiorum 7 Botrytis cinerea Desv. Std. FIG. 6. Porcentaje de Inhibición según especie. F. oxysporum tuvo un porcentaje de inhibición el día 5 de 46% y el día 7 la inhibición aumento en un 28%. Mientras que S. sclerotiorum el día 5 obtuvo una inhibición de 53% y fue disminuyendo hasta llegar a 15 %. B. cinerea el día 5 alcanzo un porcentaje de inhibición del 19 y aumento el día 7 a 22% (Figura 6). Teniendo en cuenta que el porcentaje de inhibición mayor al 20% es positivo para evidenciar la inhibición del crecimiento de los hongos (Márquez et al. 2007), la concentración del extracto acuoso con una concentración de 500g/L y un tratamiento térmico de 30 min, es el que obtiene la propiedad antifúngica capaz de disminuir el crecimiento de los hongos (Figura 6). La inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum se observa en la figura 7 donde el control, es decir el medio de cultivo que no tiene adición de extracto acuoso de tomillo se ve invadido completamente con el hongo patógeno, mientras que con la adición del extracto inhibe su normal desarrollo. 49 15 min 30 min Fusarium oxysporum Día 7 150g/L 150g/L Control 250g/L 250g/L 500g/L 500g/L FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 7 B. cinerea tuvo un comportamiento en el crecimiento similar al de F. oxysporum en el control; con la adición al medio de cultivo del extracto acuoso de tomillo se observa una inhibición del crecimiento con los tratamientos utilizados (Figura 8). 15 min Botrytis cinerea 30 min Día 7 150g/L 150g/L Control 250g/L 500g/L FIG. 8. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 7. 250g/L 500g/L 50 En la figura 9 se observa que S. sclerotiorum tuvo un menor crecimiento en el medio con el extracto en todas las concentraciones y con los tratamientos térmicos comparados con el control. 15 min Sclerotinia sclerotiorum 30 min Día 7 150g/L 150g/L Control 250g/L 500g/L 250g/L 500g/L FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 7. En las figuras anteriores (Figura 7, 8 y 9) se observa que el extracto de tomillo logra inhibir el crecimiento normal de los hongos patógenos, los controles que no están adicionados con el extracto confirma el comportamiento normal en el crecimiento de los hongos patógenos. 6.2 PRUEBA DE INVERNADERO Al evidenciarse la enfermedad, se aplicó el extracto que tuvo mayor valor en el porcentaje de inhibición contra los fitopatógenos en la prueba in vitro, este extracto fue el de concentración de 500g/L con un tiempo de ebullición de 30 min; se calculó el porcentaje de incidencia y severidad de la enfermedad con cada planta inoculada con los diferentes hongos fitopatógenos, tomando como referencia la siguiente escala. 51 ESCALA DE SEVERIDAD NIVEL PORCENTAJE SÍNTOMAS 0 0 Planta sana 1 0 - 10 Leves 2 10 - 50 Severos 3 50 -75 Muy severos 4 ≥ 75 Planta muerta TABLA Nº 2. Escala de Severidad (Agrios, 1998) FIG. 10. Escala de Severidad (Agrios, 1998) 6.2.1 FUNCIÓN CURATIVA La dosis del extracto se le aplicó a las plantas cuando se observó el crecimiento micelial por encima de la turba. En las figuras 11 y 12 se puede observar que S. slcrerotiorum presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad con un valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, este es uno de los hongos fitopatógenos con alto grado de agresividad en el cultivo de albahaca, se demuestra que tiene la capacidad de causar graves daños a los cultivos y tiene una incidencia alta por encima de los otros hongos fitopatógenos utilizados para este estudio. % INCIDENCIA Nivel Curativo 80 % 70 60 50 40 30 32 39 F. oxysporum Sclerotinia sclerotiorum 44 23 14 20 10 0 B. Cinerea C+ C- HONGOS FITOPATOGENOS FIG. 11. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Curativo. % 52 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 % SEVERIDAD Nivel Curativo 71,5 F. oxysporum Sclerotinia sclerotiorum B. Cinerea 26,9 10 1 6 C+ C- HONGOS FITOPATOGENOS FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Curativo. 6.2.2 FUNCIÓN PREVENTIVA El extracto acuoso de tomillo con tratamiento térmico se aplicó antes de la inoculación durante 10 días. Al observar las figuras 13 y 14 se puede establecer que S. sclerotiorum, presenta un porcentaje de incidencia y de severidad más alto que los otros hongos (25% de incidencia y 18 % de severidad). Aunque estos porcentajes comparados con los valores del función curativa de extracto sean más bajos S. sclerotiorum sigue siendo la mayor amenaza en el cultivo de albahaca. B. cinerea es el segundo hongo con valores más altos de porcentajes de incidencia y severidad, en la función preventiva se disminuyó el valor del porcentaje de incidencia más de la mitad con respecto a la función curativa del extracto, 44% a nivel curativo y 21% a nivel preventivo, por otro lado, los resultados en el porcentaje de severidad de la enfermedad no son buenos, 26.9% de severidad en la función curativa y 17% en la función preventiva. Al observar estos resultados se demuestra que la prevención es la mejor opción de atacar enfermedades causadas por microorganismos (Figuras 13 y 14). 53 Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos cultivos, fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo con la función curativa y preventiva del extracto (Figuras 13 y 14). % INCIDENCIA Prevención 80 70 F. oxysporum % 60 50 Sclerotinia sclerotiorum 40 30 20 10 B. Cinerea 25 16 C+ 21 5 9 C- 0 HONGOS FITOPATOGENOS FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Preventivo. % SEVERIDAD Prevención 80 % 70 60 50 F. oxysporum 40 B. Cinerea Sclerotinia sclerotiorum 30 20 10 18 6 C+ 17 C1 2 0 HONGOS FITOPATOGENOS FIG.14. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto de tomillo a nivel Preventivo. El carvacrol y el timol son los monoterpenos que caracterizan a algunas de las especies de la familia Lamiaceae, principalmente en los oréganos (Origanum spp.) y los tomillos (Thymus spp.). Estos compuestos son a los que se le atribuyen propiedades antifúngicas. Las concentraciones en que estos 54 componentes son encontrados presentan una importante variabilidad debido a numerosos parámetros significativos que afectan la composición química de esta planta, principalmente la localización geográfica y las condiciones climáticas y ambientales (Vokou et al., 1993). La evaluación de extractos vegetales sobre organismos patógenos se realiza usualmente in vitro, esto hace que no sean reconocidas las ventajas que estos tienen sobre los productos químicos y a su vez sea complicado su utilización en campo. El insuficiente rendimiento mostrado por formulaciones químicas comerciales demuestra la necesidad de crear métodos para la producción de compuestos biológicos con una mayor eficacia y una vida útil prolongada. Este aspecto es crucial para prácticas de control biológico para ganar credibilidad y competitividad (Rhodes, 1993).El uso de fungicidas químicos para su uso en el cultivo de albahaca convierte a agentes de biocontrol en una alternativa confiable contra las enfermedades causadas por hongos en el cultivo. 55 7. CONCLUSIONES De los resultados de la presente investigación se puede concluir: • El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) acuoso con tratamiento térmico de 30 min inhibió 42% el día 5 y 44% en el día 7 el crecimiento de los hongos fitopatógenos. • Se observó un mayor porcentaje de inhibición de crecimiento en el extracto de 500g/L con tratamiento térmico en los hongos patógenos utilizados. • El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) inhibe el crecimiento en mayor proporción a Fusarium oxysporum in vitro con un porcentaje de inhibición en el día 7 de 74%. • Se puede observó en la prueba de invernadero que S. slcrerotiorum presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad en la función curativa con un valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, y en la función preventiva presenta un porcentaje de incidencia y de severidad más alto que los otros hongos, 25% de incidencia y 18 % de severidad. • Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos cultivos, fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo en la función curativa y preventiva del extracto. • En la prueba de invernadero se observó que el extracto de tomillo tiene un mejor resultado en prevención de enfermedades causadas por hongos patógenos que en la curación de estas. 56 8. RECOMENDACIONES • Es necesario llevar el extracto de tomillo (Thymus vulgaris) a un análisis cromatográfico y de espectrometría de masas para conocer la totalidad de sus componentes y su concentración individual con el fin de conocer cual es el componente con mayor proporción que posee la característica antifúngica. • Determinar el mecanismo de inhibición de las sustancias en los hongos. • Para próximos estudios se recomienda utilizar concentraciones más altas de extracto, para así observar un mayor porcentaje de inhibición, frente a los hongos en estudio. 57 9. REFERENCIAS ADAMS, P.B.; and W.A. AYERS.1999. Ecology of Sclerotinia Species. Phytopathology 69 (8) :896-899. AGRIOS G. 1998. Fitopatología: Eenfermedades de las plantas ocasionadas por hongos, Editorial Limusa. pp 356-360. APABLAZA, G. 1999. Patología de cultivos. Epidemiología y control holístico. Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago de Chile. 347 pp. ASOCOLFLORES, Simposio Internacional, “El manejo integrado de plagas y enfermedades en floricultura”. Bogotá D.C. Febrero de 1995. pp 5 – 18. AVILA, L. Control Con Microorganismos Antológicos de Botrytis cinerea pers: Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, 1993. pp 109 . Tesis (Postgrado Microbiología). BAYONA, M. Control Con Microorganismos Antagónicos de Botrytis cinerea en Rosa – rosa (L) en la Calera Cundinamarca. Bogotá D.C Pontificia Universidad Javeriana, Universidad Industrial de Santander, (Maestría en Microbiología Industrial). 1996. BIANCHI A, ZANBONELLI A, ZENECHI A Y BELLESIA (1997) Ultrastructural studies of the effect of Allium sativum on phytopathogenic fungi in vitro. Plant Dis. 81: 1241-1246. BRUNNER, G, Gas Extraction An Introduction to Fundamentals of Supercritical Fluids and the Application to the Separation Processes, Springer, New York, USA (1994). DAHLSTROM, D. A. 1999. “Liquid-Solid Operations and Equipment” In Perry’s Chemical Engineers’ Handbook, by Perry, R. H., D. W. Green. y J. O. Maloney, 7th edition, McGraw-Hill, section 18, pp 58-59 (1999). 58 DOSS, R; POTTER S; SHELDNER A; CHRISTIA Y FUKUNAGUA L; 1995. Adhesion of germlins of Botrytis cinerea. Applied and environmental microbiology, Vol 61 (1). pp 260 – 265. ELAD Y VOLPIN H. Heat treatment for the control of rose and carnation grey mould (Botrytis cinerea). Plant Pathology, Vol 40, 1991. pp 286 – 288 ESPITIA. C. 2004. Aceites de Hierbas Aromáticas culinarias, extracción y composición. Proyecto de Hierbas Aromáticas. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. FARAG, K. M. 1989. Enhancing ethephon effectiveness by modifying cuticular transport or stimulating ethylene production in cranberry fi-uit. Ph. D. Thesis. University of Wisconsin - Madison. PP. 216. FERNÁNDEZ, O Y VEGA, L. 2001. Microorganismos antagonistas para el control fitosanitario. Manejo integrado de plagas (Costa Rica). N° 62:96-100 BRUNA, A. 1991. Producción de frutas y hortalizas para uso agroindustrial. Fundación Chile, Santiago. 977 p FONNEGRA. R Y JIMENEZ. S. 2006. Plantas medicinales a probadas en Colombia. Editorial Universidad de Antioquia. FOFANA, B; BENHAMOU, N; MCNALLY, D; LABBÉ, C; SÉGUIN, A AND BÉLANGER R. 2005. Supperssion of induces resistance in cucumber through disruption of the flavonoid pathway. Rev. Biochemistry and Cell Biology. Vol. 95, No. 1. 114-123 p. GAMBOA, Z; Ledo. Producción del Clavel. Cámara de Comercio de Industria y Agroindustria. 1998. GIL, P. 2002. Productos naturas. Universidad Pública de Navarra. España. GÓMEZ, J. 2004. La sanidad de los cultivos hortícolas sobre sustratos en el sur de España. En: Urrestarazu, M. ed. Tratado de cultivo sin suelo. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid. 523-537. 59 GOTO, M. 1990. Fundamentals of bacterial plant pathology. Academic Press, New York, USA. 342 pp. GUTIÉRREZ, A. 1996. Control biológico de hongos fitopatógenos. En: Implantación de huertos de manzanos, bases para el manejo orgánico. Manual Carillanca N° 78. INIA, CRI Carillanca. HENAO, T. E, CHAVEZ, J. F. Estudio del poder patogénico de Botrytis cinerea Pers, sobre cinco especies de flores de exportación. Tesis Universidad Nacional. Bogotá. 1982. p 104. HERNANDEZ. A, BAUTISTA. S, Velásquez. M. 2007.Prospectiva de extractos vegetales para controlar enfermedades postcosecha hortofrutícola. Revista Fitotecnica Mexicana, Abril – junio, Año vol. 30, numero 002. Sociedad Mexicana de fitogenetica, Chapingo México. HURTADO, B. A. M, 2002. Estudio del proceso de extracción de componentes minoritarios de aceite de oliva con CO2 supercrítico en contracorriente, Tesis Doctoral. Universidad Autónoma de Madrid, Dpto. de Ing. Química, Madrid, España. JARVIS, W. Botryotinia and Botrytis especies 1981. Taxonomy physiology and pathogenecity. Canadá. Departament of agriculture, monograph Nº 15, 1992. p 194 MANAGIM Diseases in green house crops Aps press. KAGALE, S.; MARIMUTHU, T.; THAYUMANAVAN, B.; NANDAKUMAN, R. and SAMIYAPPAN, R. 2004. Physiological and Molecular Plan Pathology. 65. 91-100 p. LATORRE, B.1999. Enfermedades de las plantas cultivadas. Alfaomega grupo editor. México 37, 731–738. (2004). LI, H., L. PORDESIMO, L., Y J. WEISS, 2004. High intensity ultrasoundassisted extraction of oil from soybeans, Food Research International, LUQUE DE CASTRO, M. D. Y GARCIA-AYUSO L. E., 1998. Soxhlet extraction of solid materials: An outdated technique with a promising innovative future, Anal. Chim. Acta, 369, 1–10. 60 LUQUE-GARCIA, J. L. Y LUQUE DE CASTRO M. D.,2004. Ultrasoundassisted Soxhlet extraction: An expeditive approach for solid sample treatment— Application to the extraction of total fat from oleaginous seeds, J. Chromatogr. A, 1034, 237–242. NYCHAS GJE. 1995. Natural antimicrobials from plants. En New Methods of Food Preservation. Gould G W. (Ed.), Champman & Hall. London, UK. Chap. 4: 59-89. MARÍN, B; VILLADIEGO, M; BARRERA, J. 2006. E valuación de extractos vegetales para el control de Mycosphaerella fijiensis en Plátano Harton (Musa ABB) en Cordoba- Colombia. XVII Reuniao Internacional de Associacao para a Cooperacao nas Pesquisas sobre anano no Caribe na America Tropical. ACORBAT. Joinville, Santa Catalina, Brasil. MARÍN, D. Y ROMERO, R. 1998. El combate de la Sigatoka negra In: Divulgación científica al servicio del productor bananero nacional. Revista CORBANA. San José. Costa Rica. 104-129 p. MARTINEZ. M, 1999. Manual de laboratorio introducción a la biotecnología industrial.CEJA. Bogotá. MARQUEZ, R. DE LA ROSA, C. MERCADO, A. 2007. Actividad antifúngica del extracto total en etanol de las hojas frescas de Pedilanthus tithymaloides. Scientia et Técnica. Mayo. Nº 33. MAZZANTI de CASTAÑON, M.A.; M.A. CUNDOM; y M.G. CABRERA de ALVAREZ. 1994. Enfermedades en cultivos protegidos de tomate, pimiento y berenjena, en el nordeste argentino. Hort. Arg. 13 (34-35). OBLEDO E. N; A.S. HERNÁNDEZ-ROSALES; M.L. LÓPEZ-ORUÉ. 2004. Extractos vegetales, una opción en el control de la Sigatoka negra. XVl Reunión Internacional. ACORBAT. Oaxaca, México. 184 p. PATIÑO, LF; SALAZAR, LM; COLLAZOS, JC; PIEDRAHITA, RA; BUSTAMANTE, E. 2006. Bacterias liticas y sustratos en la filosfera de banano y plátano para el control de Sigatoka negra. En: Memorias XVII Reunión Internacional Acorbat. Joinville, SC, Brasil. Bananicultura: un 61 negocio sostenible. Soprano, E; Tcacenco, FA; Lichtemberg, LA; Silva, MC. (eds.) Editorial, Epagri, Estación experimental de Itajaí, SC, Brasil. p. 133-140 PIÑOL, M. 2001. Relaciones entre el metabolismo primarios y secundario de las plantas, citado por Ascon-bieto, J. y Talon, M. Fundamentos de biología vegetal. Introducción al metabolismo secundario. S.I.: McGraw Hill Interamericana. NY, USA. 261-262 p. POLANCO, D. 2004. Validación del potencial antifúngico de extractos de plantas sobre Mycosphaerella fijiensis, agente causal de la Sigatoka negra, en el cultivo de banano. M.Sc. Ciencias Biológicas. Biblioteca Rafael Parra Cortés. Universidad del Tolima, Ibagué, Colombia. 138 p. PURDY, L.H. 1999. Sclerotinia sclerotiorum: History, Diseases and Symptomatology, Host Range, Geographic Distribution, and Impact. Phytopathology 69 (8):875-880. RODRÍGUEZ, K.; MALDONADO, Y.; MURCIA, L.; HUERTAS, W.;VÁSQUEZ, M.; ZAMBRANO, A.; RIVERO, R.; GARCÍA, C.2004.. Evaluación de protocolos para la detección de patógenos en el suelo en papa. REDEPAPA. CORPOICA. Bogotá. ROMERO, RA. 2006. Caracterización y manejo de la resistencia a fungicidas de Mycosphaerella fijiensis en bananos. En: Memorias XVII Reunión Internacional Acorbat. Joinville, SC, Brasil. Bananicultura: un negocio sostenible. Soprano, E; Tcacenco, FA; Lichtemberg, LA; Silva, MC. (eds.) Editorial, Epagri, Estación experimental de Itajaí, SC, Brasil. p.92-99 SEPÚLVEDA, G; PORTA, H.: ROCHA, M. 2003. La Participación de los Metabolitos secundarios en la defensa de las plantas. Revista Mexicana de Fitopatología. Vol. 21. No. 1. 355-363 p. SINGH, I. AND SINGH V. P. 2000. Antifungical properties of aqueous and organic solution extracts of seed plants against Aspergillus flavus and A. niger. Phytomorphology. 50 (2). 151-157 p. 62 SMITH. I. 2002. Manual de enfermedades de las plantas. Ediciones Mundiprensa. Madrid. España. SOKMEN A, SOKMEN M, TEPE B, DAFERERA D, The in-vitro antioxidant activity of the essential oil and crude plant extracts and callus cultures of Origanum acutidens (Hand.-Mazz.)Ietswaart. 3rd International Symposium on Natural Drugs, Napoli-İtalya, 2-4 Ekim 2003, 52. SOLEDADE, M; PIEDRAS, C; Y SORENSEN J. 1998. Phytoalexin accumulation and antifungical compounds from the crucifer wasabi. Vol. 49. No. 7. 1959-1965p. SZENTMIHALYI, K., P. VINKLER., B. LAKATOS., V. ILLES. Y M. 2002. Then, Rose hip (Rosa canina L) oil obtained from waste hip seeds by different extraction methods. Bioresource Technology, 82, 195-201. RHODES, D. J. (199.7) Formulation of biological control agents. In Exploitation of Microovganisnn, cd. D. J. Jones, pp. 411-43’).Chapman & Hall, London ROSA, P. T. V. Y. Meireles M. A. A, 2005. Rapad estimation of the manufacturing cost of extracts obtained by supercritical fluid extraction, J. Food Eng, 67, 235-240. ROZZI, N. L. Y Singh R. K., 2002. Supercritical Fluids and the Food Industr, omprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1, 33-44. ROSALES, FE; BELALCAZAR, S., RIVEROS, AS. 2002. Plantain production in Latin America: A new profitable and sustaintable technology. In: Global confrerence on bana and plantain. 28 de septiembre 21 de octubre. Banglore India. 37 p. TONTHUBTHIMTHONG, P., CHUAPRASERT S., , DOUGLAS. P Y LUEWISUTTHICHA W,2001. Supercritical CO2 extraction of nimbin from neem seeds an experimental study. J. Food Eng, 47, 289-293 . VAGI, E.,. SIMANDI. B, SUHAJDA. A. Y HETHELY E.2005. Essential oil composition and antimicrobial activity of Origanum majorana L. Extracts 63 obtained with ethyl alcohol and supercritical carbon dioxide, Food Research International, 38. 51–57. VOKOU D. 1993. Pollination ecology of Labiatae in a phryganic (Fast Mediterranean) ecosystem. American Journal of Botany 80: 892-899. VOLPIN, H.; ELAD Y. Influence of calcium nutrition on susceptibility of flowers to Botrytis blight. Phytopathology, Vol 81, 1991. pp 1390 – 1394. ZKAL, S. G. O., SALGIN. U. Y YENER M. E., 2005. Supercritical carbon dioxide extraction of hazelnut oil, J. Food Eng, 69, 217–225. ZAPATA. R, SABABRIA. M, RODRIGUEZ. D. 2003. Reducción del desarrollo de Hongos Fitopatógenos con extracto de cardon lefaria. Interciencia, mayo, año/vol. 28, numero 005. Caracas Venezuela. Pp. 302-306. ZARNOWSKI, R. Y. SUZUKI Y,2004. Expedient Soxhlet extraction of resorcinolic lipids from wheatgrains, J Food Composit. Anal, 17, 649–664. 10. ANEXOS 64 ANEXO Nº 1. Crecimiento de F. Oxysporum con los tratamientos Fusarium oxysporum CONCENTRACION DIA 2 DIA 5 DIA 7 TIEMPO (min) (g/L) (mm) (mm) (mm) 15 150 1 15 19 150 1 13 18 150 1 19 23 150 1 13 31 250 1 13 26 250 1 14 19 250 1 7 10 250 1 9 16 500 2 9 17 500 2 13 26 500 1 19 28 500 1 16 25 150 1 19 19 150 1 20 30 150 2 21 38 150 1 19 12 250 1 9 10 250 1 9 11 250 1 9 10 250 5 10 12 500 1 11 13 500 1 12 19 500 1 13 16 500 1 13 17 3 27 82 3 29 86 1 27 79 2 31 83 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 1 1 15 15 30 30 30 CONTROL + CONTROL - ANEXO Nº 2. Crecimiento de B. cinerea con los tratamientos Botrytis cinerea 65 TIEMPO (min) 15 15 15 30 30 30 CONTROL+ CONTROL - CONCENTRACIÓN DIA 2 DIA 5 DIA 7 (mm) (mm) (mm) 150 7 26 36 150 6 59 69 150 11 30 42 150 9 33 38 250 7 23 39 250 8 33 37 250 9 39 60 250 11 36 59 500 1 38 51 500 2 19 45 500 3 36 41 500 3 38 52 150 6 57 87 150 2 43 56 150 5 33 61 150 1 26 36 250 1 26 32 250 6 19 30 250 2 22 41 250 5 16 26 500 NC 1 31 500 1 13 25 500 1 2 6 500 2 12 21 9 70 87 7 82 86 9 75 87 8 72 87 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 (g/L) ANEXO Nº 3. Crecimiento de S. Sclerotiorum con los tratamientos Sclerotinia sclerotiorum 66 TIEMPO (min) CONCENTRACION DIA 2 DIA 5 DIA 7 (mm) (mm) (mm) 150 1 7 21 150 1 10 16 150 1 11 21 150 1 12 21 250 5 11 21 250 6 12 24 250 5 12 22 250 6 13 21 500 6 16 31 500 6 11 29 500 NC 12 22 500 NC 16 25 150 6 17 23 150 5 13 19 150 3 19 21 150 5 15 22 250 3 10 21 250 5 11 20 250 4 10 26 250 7 12 23 500 NC NC NC 500 NC 3 7 500 1 12 20 500 1 6 11 11 74 87 10 72 87 9 69 85 9 70 86 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 (g/L) 15 15 15 30 30 30 CONTROL + CONTROL - ANEXO Nº 4. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 2. 67 15 min Botrytis cinerea 30 min Día 2 150g/L 150g/L Control 250g/L 250g/L 500g/L 500g/L ANEXO Nº 5. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 5. 15 min Botrytis cinerea 30 min Día 5 150g/L 150g/L Control 250g/L 250g/L 500g/L 500g/L ANEXO Nº 6. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 2. 68 30 min 15 min Fusarium oxysporum Día 2 150g/L 150g/L Control 250g/L 250g/L 500g/L 500g/L ANEXO Nº 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 5 30 min 15 min Fusarium oxysporum Día 5 150g/L 150g/L Control 250g/L 500g/L 250g/L 500g/L 69 ANEXO Nº 8. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 2. 30 min 15 min Sclerotinia sclerotiorum Día 2 150g/L 150g/L Control 250g/L 250g/L 500g/L 500g/L ANEXO Nº 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 5. 15 min Sclerotinia sclerotiorum 30 min Día 5 150g/L 150g/L Control 250g/L 500g/L ANEXO Nº 10. Prueba de Invernadero 250g/L 500g/L 70 Prueba a Nivel Curativo Control + S. sclerotiorum B. cinerea F. oxysporum Prueba a Nivel Preventivo Control - 71