Protocolos de extracción de ADN total de mariposas

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Protocolos de extracción de ADN total de mariposas utilizando
Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol
1. Materiales
-Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul
-Baño de María
-Incubadora
-Campana de extracción
-Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm
-Juego de disección, que incluya: una tijera pequeña, una pinza entomológica y un bisturí
-Congelador (-20°C)
-Cámara de electroforesis horizontal
-Tubos de 1,5ml
-Guantes de látex sin polvo
2. Reactivos
-Tris-HCL
-EDTA
-SDS
-NaCl
-Proteinasa K
-Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (25:24:1)
-Isopropanol
-Etanol
-TE (10:1)
-RNasa
3. Preparación de soluciones
A) Buffer de extracción
Reactivo
Tris-HCl (pH=8.0)
EDTA (pH=8.0)
SDS
NaCl (opcional)
Protocolos de laboratorio UEG 2009
Concentración en solución
100mM
50mM
1%
500mM
Por: Duina Posso Duque
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Nota: Mezcle los ingredientes, complete al volumen deseado y autoclave. Este Buffer se puede
almacenar por meses en la nevera, a 4°C.
B) T10E1
Reactivo
Tris-HCl (pH=8.0)
EDTA (pH=8.0)
Concentración en solución
10mM
1mM
Nota: Completar el volumen con agua destilada, autoclavar y guardar al 4°C.
4. Protocolo
Tejido utilizable: Patas, antenas, tórax.
Los otros tejidos no se utilizan por que contienen metabolitos secundarios que pueden afectar la
PCR.
1) Precalentar el buffer de extracción a 55°C por 10min
2) En un tubo de 1,5mL introducir 20g de los tejidos utilizable
3) Agregar 500uL del buffer de extracción precalentado
4) Picar el tejido con la tijera hasta tener trozos muy pequeños
5) Agregar 10uL de ProteinasaK (20mg/mL)
6) Incubar a 55°C por una noche entera
7) Agregar 500uL de Fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Resuspender por inversión
cuidadosamente hasta que se forme una emulsión (unas 30 inversiones). El
fenol:cloroformo es sumamente tóxico y todo el trabajo con este reactivo debe hacerse en
campana de extracción (ver ficha MSDS adjunta).
8) Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
9) Transferir la fase acuosa (la de arriba) con una pipeta a un tubo nuevo de 1,5mL.
10) Repetir la limpieza con fenol:cloroformo:isoamilalcohol (pasos 7-8-9).
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Por: Duina Posso Duque
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11) Agregar un volumen de NaCl (5M) correspondiente al 10% de la muestra, y mezclar bien.
12) Agregar un volumen de isoppropanol frio correspondiente al volumen de la muestra
resultante del punto 10.
13) Incubar a -20°C de 2 horas en adelante.
Nota: En este paso se puede dejar la muestra en el congelador por una noche completa o
varios días. Entre más tiempo se deje en frio se puede recuperar una mayor cantidad de
ADN. Cuando el ejemplar, esta recientemente colectada (pocos días) no es necesario dejar
por más de dos horas. Si el ejemplar es antiguo y no ha sido almacenado correctamente se
recomienda dejarlo aunque sea una noche en el congelador.
14) Centrifugar a temperatura ambiente, a 12000rpm durante 5min y descartar líquido por
inversión del tubo.
15) Agregar 400uL de etanol frio al 70%
16) Centrifugar a temperatura ambiente a 12000rpm durante 3 min y descartar el líquido por
inversión del tubo.
17) Dejar secar el ADN a temperatura ambiente, con el tubo abierto.
18) Resuspender en 50uL de T10E1 (10mM) y agregar 1uL de RNasa (10mg/mL). En su
defecto resuspender en agua milliQ autoclavada.
19) Incubar A 37°C por 20min
Nota: si la muestra de ADN se ve sucia, con alguna coloración marrón, se puede limpiar
una vez más la muestra repitiendo los pasos 12-13-14-15-16-17 y resuspendiendo solo en
TE o agua.
20) Visualizar 1ul de la muestra en un gel de agarosa al 0.8%
5. Resultados obtenidos con este método de extracción
Tres ejemplares de mariposas fueron utilizados para la extracción de ADN mediante el método de
fenol:cloroformo:isoamilalcohol descrito anteriormente. Uno de ellos consistió en una mariposa
fresca, capturada el mismo día de la extracción. Los otros dos ejemplares fueron mariposas
colectadas en el 2008 y almacenadas en sobres de papel mantequilla hasta el momento de la
extracción. La extracción se hizo partiendo de las patas, antenas y el abdomen de las mariposas y
se utilizó aproximadamente la misma cantidad de tejido para cada uno de los ejemplares.
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Por: Duina Posso Duque
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El resultado de la extracción se vio en un gel de agarosa al 0.8% (ver Figura1). En el gel puede
verse diferencias en la calidad y cantidad del ADN extraído para cada individuo. El ADN obtenido a
partir de la mariposa fresca es un ADN de buena calidad, presenta una banda clara en lo alto del
gel, y una concentración elevada, alrededor de 200ng/uL. Por el contrario el ADN extraído a partir
de las mariposas de un año es un ADN degradado, se ve una mancha a través del canal. Por esto
se recomienda trabajar con individuos frescos.
Figura1: ADN total de mariposas extraído con el método de fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Visualización
en un gel de agarosa al 0.8% teñido con Sybr Safe. A) Mariposa fresca. B) Mariposas con un año de
antigüedad de colecta. Se sirvieron 3uL de cada muestra en el gel.
6. Bibliografía
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. ‘‘Molecular Cloning: A Laboratory Manual,’’ Cold
Spring Harbor Laboratory
Martin J.-F., A. Gilles and H. Descimon. 2000. Molecular Phylogeny and Evolutionary Patterns of
the European Satyrids (Lepidoptera: Satyridae) as Revealed by Mitochondrial Gene Sequences.
Molecular Phylogenetics and Evolution Vol. 15, No. 1, pp. 70–82.
Como citar este protocolo:
Duina Posso Duque. Protocolos de extracción de ADN total de mariposas utilizando
Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol. Protocolos de laboratorio UEG
(http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). 2009. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas,
Altos de Pipe- Venezuela.
Protocolos de laboratorio UEG 2009
Por: Duina Posso Duque
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