GENÉTICA BACTERIANA I Genética microbiana: • qué son los genes • cómo se replican • cómo se transmite la información a generaciones posteriores o entre microorganismos • cómo la expresión de sus información determina las características particulares de un organismo. La información genética contenida en una célula procariota: genoma. que incluye el “cromosoma” “cromosoma” y los plásmidos Los genes: son segmentos de DNA que codifican productos funcionales y que están contenidos en los cromosomas •Cromosoma procariótico: •Única hebra de DNA bicatenario •Haploides •Circular y covalentemente cerrado •Superenrollamiento negativo •Transporta toda la información genética necesaria para todas las estructuras y funciones de la célula •E. coli: coli: casi 5000 kpb de DNA •No posee envoltura nuclear •Cromosoma eucariótico: • DNA bicatenario lineal •Múltiples cromosoma (S. (S. cereviseae: cereviseae: 8 p) •Poseen histonas (nucleosoma) •Núcleo con envoltura nuclear •Diploides Tomado de Brock. Microbiología de los microorganismos. 12° 12° edición Gen: unidad de la herencia, segmento de DNA que especifica una proteína, a través del RNAm, ó un tRNA, un rRNA, o cualquier otro RNA no codificante. Es responsable de: - las características estructurales y metabólicas de un organismo - la transmisión de estas características de una generación a otra. Genoma: conjunto de genes contenidos en una célula ó en un virus Genotipo: constitución génica precisa de una célula. Fenotipo: características observables tanto morfológicas como fisiológicas Gen: DNA: acido desoxirribonucleico Secuencias de bases: Purinas: adenina y guanina Pirimidinas: timina y citosina Solo se transcribe una de las dos cadenas RNAm: codifica para uno ó mas proteínas tRNA y rRNA: actúan en la síntesis de proteínas, no codifican información genética para la fabricación de éstas. Cada grupo de tres bases de una molécula de RNAm codifica un solo aminoácido, este triplete: codón El código genético se traduce por el sistema de síntesis de proteínas: ribosomas (proteínas y rRNA), tRNA y factores de transducción Procariotas Eucariotas • Haploide • Haploide - diploide • 1 cromosoma circular • varios cromosomas lineales • 105 - 106 pb • 107 – 109 pb • casi totalmente secuencias codificadoras y de regulación • familias multigénicas y secuencias redundantes • Ausencia de intrones • Presencia de intrones • Algunos genes organizados en operones: ARN policistrónico • Unidades de transcripción simples • transcripción transcripción--traducción acopladas • regulación en etapas de maduración de ARNm Borrelia burgdorferi : 1 lineal, Rhodobacter sphaeroides: 2 circulares Saccharomyces cerevisiae 16, Giardia lamblia 4 En procariotas . transcripcióntranscripción-traducción acopladas . ausencia de intrones Expresión génica se regula principalmente en la transcripción. En procariotas: a partir de una molécula de DNA se transcriben muchas moléculas de RNAm diferentes. Un solo RNAm lleva la información de varios genes, mas de una región codificadora Estructura del ADN Estructura del ADN Tamaño de una molécula de DNA: E. coli: 4.640.000 pb ó 4.640 kpb ó 4,64 Mpb (1000pb ó 1kpb ó kb) Estructura secundaria, repeticiones invertidas y estructuras tallo bucle: Es habitual en el DNA y RNA Las repeticiones invertidas en el ADN son sitios de unión frecuentes para proteínas especificas de unión al ADN que regulan la transcripción. Superenrollamiento del DNA: El DNA de doble cadena es retorcido aún más. Topoisomerasas clase I: cortan una sola hebra de DNA, elimina el superenrollamiento adicional en el DNA, lo relaja Topoisomerasas clase II: cortan ambas hebra de DNA e introduce superenrrollamiento negativo en el DNA. Para evitar que todo el cromosoma bacteriano se relaje cada vez que se realiza una muesca, se organiza en dominios de superenrollamiento, estabilizado por proteínas de unión especificas. Superenrollamiento: para empaquetar el DNA en el interior de la célula Relajación: es necesaria para la replicación y la transcripción. En bacterias: DNA girasa (topoisomerasas clase II) : introduce superenrollamiento negativo en el DNA. Algunos antibióticos inhiben la topoisomerasas clase II Principios Básicos de la replicación del DNA P r i n c i p i o s Cadena parental B a c i Nueva s o cadena complementaria Nueva cadena complementaria Replicación semiconservativa -La adición de un nucleótido requiere de un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’. -El 5’-trifosfato de desoxinucleósido se incorpora al 3´- hidroxilo de nucleótido anterior -Replicación procede siempre del extremo fosfato 5´ al extremo con el hidroxilo 3´. -DNA polimerasas sintetizan DNA en dirección 5´ 3´ y añaden nucleótidos a un grupo 3’ ya existente. -Cebador: molécula de ac. nucleico a la cual la enzima pueda añadir un nucleótido. Fragmento corto de RNA, sintetizado por la primasa. Horquilla de replicación: zona de DNA desenrrollado por la DNA helicasa Proteína de unión a cadena sencilla: estabiliza el DNA monocatenario. En procariotas existe un solo punto donde puede iniciarse, origen de la replicación, secuencia especifica de DNA de 250 bases reconocida por proteínas especificas de iniciación: - Dna A, Dna B (helicasa), DnaC (proteína cargadora de la helicasa). Se cargan dos helicasa, cada una en direcciones opuestas, dos primasas y dos DNA polimerasas. La replicación se inicia en las dos cadenas sencillas. Cadena avanzada Cadena retrasada: no hay 3’OH libre. Múltiples cebadores de RNA. Fragmentos de Okasaki. DNA pol III ó Dna E: añade desoxirribonucleótidos hasta alcanzar el DNA sintetizado previamente. DNA pol I: sintetiza DNA, es exonucleasa 5’----3’, que elimina el cebador. DNA ligasa: sella la muesca entre un 5’ PO4 y 3´OH. Tres métodos generales de replicación: • El método θ (theta): dos puntos de crecimiento • El método σ (sigma): un punto de crecimiento • El método (lineal): varios puntos de crecimiento El método θ (theta): dos puntos de crecimiento Cromosomas y plásmidos de Gram – (cromosomas circulares): replicación es bidireccional, dos horquillas de replicación que se mueven en sentidos opuestos, lo que da origen a estructuras theta. Permite al DNA replicarse lo mas rápido posible por medio de múltiples horquillas de replicación El método σ (sigma) Replicación por círculo rodante un punto de (plásmidos en Gram +, algunos crecimiento: virus y conjugación). La cadena positiva de la forma replicativa es cortada (Proteína A), queda libre el extremo 3’ y puede usarse como cebador para la síntesis de una nueva cadena. La rotación continuada del circulo conduce a al síntesis de una estructura lineal de cadena sencilla. La proteína A corta y liga los extremos de la cadena generando una molécula de DNA de cadena sencilla. Velocidad : 45 Kb/min a 37ºC, desenroscar:4500 vueltas /min El método (lineal): Varios puntos de crecimiento -Microorganismos eucariotas y algunos virus y bacterias -Se utiliza un cebador proteico -DNA polimerasa añade la base a un grupo OH presentes en proteínas especificas cebadoras que se unen al extremo 5’. No se eliminan. -100 nucleótidos/seg - Sitios específicos de replicación - Un solo punto o cientos OH •Parada de replicación: las dos horquillas de replicación chocan cuando los dos círculos de DNA están completos. Secuencias Ter reconocidas por proteínas llamada Tus que bloquean el avance, Topoisomerasa IV; separa las dos moléculas de DNA entrelazadas para que se divida en cada célula hija (Proteína Fts) Modelo actual de la replicación en E. coli (Replisoma) • Las topoisomerasas reduce la tensión producida en el desenrollamiento de la hélice (DNA girasa ó Topoi II) • La helicasa abre y la primasa ceba (primosoma) • Las proteínas de unión a ADN mantienen la estabilidad del ADN simple hebra • Holoenzima Holoenzima:: dos DNA Pol III conectadas por un dímero • La polimerasa en la hebra conductora sintetiza una hebra continua • La polimerasa en la hebra retrasada se mueve en la dirección opuesta opuesta:: sintetiza el ADN en fragmentos de Okazaki • Al completar cada fragmento se disocia del ADN pero se mantiene el complejo enzimático para hacer la síntesis de un nuevo fragmento. fragmento. Corrección de errores en la replicación del DNA: Pol I y Pol III: poseen actividad exonucleasa 3’----------5’ que elimina un nucleósido equivocado. Pol I : poseen actividad exonucleasa 5’---------- 3’ que elimina e cebador. RNA: contiene ribosa y uracilo. Monocatenario •Otras clases de RNA: implicados en regulación RNA polimerasa no necesita de cebadores. Holoenzima RNA pol: cinco subunidades Nucleo: sintetiza RNA Factor sigma : reconoce el sitio en el DNA para el comienzo de la síntesis de RNA. Dentro de la secuencia del promotor existen secuencias mas cortas y altamente conservadas que son reconocidas por el mismo factor Sigma : Secuencias consenso. Estas se sitúan antes del inicio de la transcripción: Región -10: caja Pribnow Región -35. La cadena que se transcribe es la de abajo (verde claro) Alternativos Las repeticiones invertidas en el DNA transcripto forman una estructura tallo bucle que termina la transcripción cuando va seguida de una serie de uracilos Unidad de transcripción: unidades que comienzan en el sitiode inicio y de terminación enlazadas en el cromosoma. Algunas poseen un solo gen, pero otras dos ó mas genes que se cotranscriben. La mayoría de los genes codifican para proteínas, pero otros codifican RNA que no se transcibe: rRNA y tRNA. Los procariotas tienen rRNA 16S, rRNA 23S y rRNA 5S. Existen agrupaciones que contienen un gen para cada rRNA y se cotrancriben. En procariotas, los mRNA son degradados rápidamente por ribonucleasas, mientras que los rRNA y tRNA no por su estructura altamente plegada, REGULACION. El ensamblaje en un operón de genes relacionados permite su regulación de forma coordinada por una región especifica anterior al operón. Operador o centro de unión del activador Un grupo de genes relacionados entre si y que se cotranscriben a la vez a partir de un solo promotor para generar un sólo mRNA policistrónico: OPERON Código genético: correspondencia de cada triplete de tres bases del mRNA, codón, codifica un aminoácido especifico. 43: 64 Código degenerado: muchos aminoácidos están codificados por mas de un codón. Un codón del mRNA es reconocido por el apareamiento específico de sus bases con una secuencia complementaria de tres bases llamada anticodón en los tRNA. Transducción: Transducción: Codones de parada o codones sin sentido: no codifican ningún aa, indican el final de la traducción: UAA,UAG yUGA Codon de inicio: AUG. Fundamental comenzar en el nucleótido correcto o pauta 0. La fidelidad del la pauta de lectura correcta depende de las interacciones entre mRNA y rRNA, y del ribosoma que reconoce un AUG específico en el mRNA como codón de inicio con la ayuda de una secuencia situada antes en el mRNA: Secuencia de ShineDalgarno Transducción: tRNA: es especifico tanto para el codón como para su aa correspondiente y son puestos en contacto por enzimas especificas: aminoacil-tRNA-sintetasas •Cadena sencilla y estructura secundaria. 73 y 93 nucleótidos de extensión •Regiones doble cadena y bases inusuales •Parte variable: anticodon •Otras partes interaccionan con: rRNA, componentes proteicos del ribosoma, proteínas de transducción no ribosómicas y con la aminoacil-tRNA-sintetasas •En el extremo 3’ o brazo aceptor tienen tres nucleótidos desapareados: CCA añadidos por la nucleotidil- transferasa terminal. El aa se une covalentemente a la adenosina e incorporado a la cadena polipeptídica. Transducción: Reconocimiento de los t RNA: Contactos entre sec. nucleotídicas específicas en el brazo aceptor y bucle D del tRNA y aa específicos de la sintetasa. Además el anticodon con su sec. especifica Activación y carga: AA + ATP------------- aminoacil-AMP+P-P Permanece unido a la sintetasa hasta que choca con el tRNA aminoacil-AMP + tRNA ---------aminoacil-tRNA + AMP P-P es escindido por una pirofosfatasa Como se utiliza un ATP y se forma un AMP se necesitan un total de dos enlaces fosfatos para cargar un tRNA con un aa. El aminoacil-tRNA abandona la sintetasa y viaja a ribosoma donde se sintetiza el polipéptido. Formados por rRNA, proteínas ribosomales y proteínas no ribosómicas. 70S Iniciación: Se forma el complejo de iniciación: 30S, mRNA, tRNA de formilmetionina y prot. de iniciación: IF1,2 y 3. GTP. Luego 50S. 70 S funcional Sec. De Shine –Dalgarno: sec de 3 a 9 nucleóti. antes del codón de inicio del mRNA que ayuda a unirlo al ribosoma. Se encuentra en el 5´mRNA y es complementario con el 3’ del rRNA 16S, lo que permite la transducción de mRNA policistrónico, por reconocimiento de cada codón de iniciación. Unión de un formilmetionil-tRNA iniciador al codón de inicio AUG. Elongación, traslocación y terminación: mRNA se desliza unido al 30S. La 50S interacciona con el Trna. Sitio A (SA): aceptor, se une el nuevo tRNA cargado por factores de elongación proteicos (EF-Tu) Sitio P (SP): péptido, el tRNA sujeta al péptido en crecimiento. Prot. no ribosómicas ó factores de elongación: EF-Tu y EFTs.GTP. Formación del enlace péptidico. El tRNA que sujeta al péptido se trasloca del SA al SP, dejando el SA (EF-G y GTP). El ribosoma avanza tres nucleótidos y expone un nuevo codón, empujando el tRNA ahora vacío al Sitio E. Finalización: cuando se alcanza el codón de parada por medio de factores de liberación. Transducción: La traducción de varios ribosomas y un solo mRNA: Polisoma. Aumenta la velocidad y eficiencia de la transducción Estabilidad vs evolución mecanismos de reparación = estabilidad génica mecanismos de variabilidad = base de la evolución • mutación: modificación heredable en la secuencias de bases de un genoma (pequeños cambios en la célula) • recombinación: intercambio físico de DNA entre elementos genéticos (grandes cambios en la célula) célula) Mutante: portadores de un cambio en su genoma, su fenotipo puede estar alterado. Cepa salvaje: aislada de la naturaleza. gen: hisC; prot:HisC; fenotipo: His+: capaz de sintetizar su propia histidina. Técnica de réplica en placa: para detectar mutantes nutricionales defectivos. . Mutaciones seleccionable: resistencia a los fármacos de los mutantes con respecto a la progenie. Ventaja selectiva al mutante. Mutación no seleccionable: perdida de color de un organismos pigmentado, no tiene ventajas ni desventajas sobre la progenie. (rastreo). La colonia de la placa madre que esta ausente en la placa de réplica (mutante) se puede purificar y caracterizar Una mutante con una necesidad nutricional para el crecimiento: auxótrofo y el progenitor del cual deriva protótrofo. Ejm: Los mutantes de E.coli con fenotipo His – son auxótrofos de Histidina Causas de mutaciones: •Errores en la replicación del DNA •Mutágenos: químicos, luz UV o rayos X. Posibles efectos: •Sin ningún efecto: mutación silenciosa •Producción de una proteína defectuosa o incompleta: mutación de cambio de sentido ó sin sentido •Producción de una proteína con función disminuida Mutaciones: Espontáneas: sin intervención humana, radiación natural o radicales de oxígeno . Errores de apareamiento durante la replicación del DNA. Inducidas: con intervención humana. Usadas en ingeniería genética Puntuales: sólo cambian un único par de bases. reversibles - Sustitución: modificación química del ADN: radicales de O2, (guanina en 8 –hidroxiguanina) - inserción de una base anómala durante la replicación - perdida o ganancia de un par de bases A G Transiciones Transversiones T - Inserción -Deleción C Mutaciones por sustituciones de pares de bases: su efecto en el fenotipo - Silenciosa (3° (3° base) - sin sentido C A - modificadora de función - supresora de función - neutrales De cambio de sentido 1° ó 2° base Sin sentido 3°base Mutaciones de varios pares de bases Las inserciones o deleciones afectan el marco de lectura: Inserciones: un trozo de DNA se inserta en un gen. Deleciones : eliminación de un fragmento de un gen VPC Traslocaciones: gran sección de DNA cromosómico se desplaza a una nueva ubicación (reordenaciones por errores en la recombinación) Inversiones: en las que la orientación de un segmento del DNA cambia con respecto al DNA circundante. Las mutaciones por desplazamiento en la pauta de lectura provocan cambios mas drásticos en el DNA, a menudo tienen como resultado la pérdida completa de la funcionalidad del gen. VLV VL Mutagénesis dirigida: proceso para llevar a cabo mutaciones especificas en el genoma (tecnología de DNA recombinante y DNA sintético) Frecuencia de mutaciones espontáneas en un gen típico de 1000 pb: 10-6 y 10-7 por generación ó 10-6 y 10-7 Kpb durante un sólo ciclo de replicación. Mutagénesis por transposones: proceso que utiliza elemento transponible que se inserta en cualquier lugar en un gen pudiendo producir la perdida de la funcionalidad de dicho gen. La mutaciones puntuales son, normalmente reversibles, mediante un proceso de reversión. Revertiente: cepa en la que se reestablece el fenotipo original que había cambiado en el mutante • Revertientes de un mismo sentido: la mutación que restura la actividad se produce en el mismo sitio que la mutación original. Si la retromutacion no sólo es en el mismo sitio, sino que además restablece la secuencia original: revertiente verdadero. • Revertientes de segundo sitio: la mutación se produce en un sitio diferente en el DNA. Pueden causar restauración de un fenotipo salvaje si funcionan como mutaciones supresoras (mutaciones que compensan el efecto de la mutación original y restablecen el fenotipo original) – 1- una mutación en algún lugar del mismo gen que restaura la función enzimática. (Ej. desplazamiento en la pauta de lectura) – 2- una mutación en otro gen que restablezca la función original del gen mutado – 3- una mutación en otro gen cuyo resultado es la producción de una enzima que sustituya la enzima mutada. Las delecciones e inserciones provocan cambios mas drásticos en el DNA, a menudo tienen como resultado la pérdida completa de la funcionalidad del gen. Son irreversibles, salvo por recombinación A diferencia de las mutaciones puntuales, las delecciones a gran escala no revierten, pero las inserciones a gran escala pueden revertir como resultado de una deleción posterior que elimine la inserción. Las mutaciones pueden ser revertidas o suprimidas por una segunda mutación Reversión: restaura secuencia original Supresión intercistrónica: mutación en otro locus restablece el fenotipo Supresión intracistrónica: mutación en el mismo locus restablece el fenotipo Las mutaciones pueden ser inducidas por agentes químicos, físicos o biológicos. Mutagénesis: Mutágenos Mutagénesis: químicos: • análogos de base nucleotídica • productos alquilantes (nitrosoguanidina nitrosoguanidina)) • productos que reaccionan con el ADN Sustitución de pares de bases • agentes intercalantes (acridina, Br de etidio etidio)) desplazamiento del marco de lectura inserción o deleción HNO2 desamina A, C y G Adenina Citocina Guanina hypoxantina uracilo xantina Análogos de bases Citocina Adenina 5-Br uracilo (ceto) Guanina 5-Br uracilo (enol) Adenina Citocina Tautomería de las bases: mutaciones espontáneas Citosina y timina presentan tautómeros (poco frecuentes) El patrón de donores y aceptores de puente de hidrógeno de los tautómeros genera apareamientos C-A y T-G introduciendo errores en la replicación. ¿Qué ocurre cuando estas formas tautoméricas son incorporadas al ADN en la etapa de replicación? G G C T* G C G T G C G C A T G C G C mutante Agentes físicos: radiaciones Radiaciones no ionizantes ó ultravioleta: Las bases del DNA absorben fuertemente a 260 nm. Formación de dímeros de pirimidina: se unen covalentemente entre si, (CT) en la misma cadena de DNA, lo que impide el paso o aumenta la probabilidad de lectura errónea por la DNA polimerasa. Muy útil para aislamiento de células mutantes a dosis adecuadas. Radiaciones ionizantes: rayos X y γ Producen ionización del agua: radicales libres OH. que reaccionan con macromoléculas; DNA, produciendo lesiones Radiaciones no ionizantes:UV Produce dímeros de timina o pirimidinas Deformación de la hélice del ADN que induce errores durante la replicación Reconocimiento por sistema reparador La reparación es susceptible de cometer errores Sistemas de reparación del DNA Si el DNA se puede corregir antes de que la célula se divida, no se producirá mutación. Procesos de reparación del DNA: libres de errores •Reversión directa •Reparación de daño en una sola cadena •Reparación de daño en ambas cadenas •Reversión directa Se aplica a las bases que han sido alteradas químicamente: eliminación química directa del grupo alquilo en bases alquiladas. No hace falta una cadena molde. Foto reactivación: corta los dímeros de pirimidina por la fotoliasa •Reparación de daño en una sola cadena: se elimina el DNA dañado de una sola cadena y la cadena opuesta intacta se usa de molde para reemplazar las bases que faltan (reparación de escisión de bases y apareamientos defectuosos) •Reparación de daño en ambas cadenas: se da en el entrecruzamiento y cortes en ambas cadenas que son reparadas por mecanismos de recombinación y puede ser necesaria la reparación propensa a errores. Mutaciones surgidas de la reparación del DNA: el sistema SOS Cuando se produce un daño a gran escala en el DNA se utiliza un sistema de reparación propenso a errores, que permite que la célula se replique y se divida pero lo hace a costa de introducir mutaciones él mismo: sistema regulador SOS que realiza la reparación sin necesidad de una cadena molde lo que provoca muchas mutaciones. El Sistema SOS es un regulón: genes regulados de manera coordinada y que se transcriben por separado. Lex A: proteína represora, impide la expresión del regulón Rex A: se activa por a presencia de daño en el DNA. La forma activada de RexA estimula la autoinactivación de LexA por corte, lo que desreprime a SOS, permitiendo la expresión coordinada de proteínas de reparación de DNA. DNA polimerasa V El ADN está expuesto a numerosos factores que promueven cambios en la información. La célula cuenta con diferentes mecanismos de reparación o de corrección que en en general utilizan la hebra sana para reparar la dañada. Los sistemas de corrección pueden ser más o menos proclives a error: Subunidad proteica de DNA pol III codificada por el gen dnaQ puede sufrir mutaciones que conducen a cepas mutadoras o hipermutadas Sistema regulador SOS. Rec A y LexA. LexA. DNA pol IV y V V: implicados en la sintesis translesión. Cuando los cambios no son corregidos resultan en mutaciones que pueden afectar una función dada. Menos de 1 en 1000 de los cambios introducidos en el ADN son mantenidos mantenidos,, el resto reparados. reparados. Test de Ames: para detectar químicos mutágenos y carcinógenos: buscar un aumento en la tasa de retromutación en cepas auxótrotofas en presencia de un mutágeno Oxigenasas de función mixta: enzimas hepáticas que activan mutágenos o carcinógenos En la presencia del carcinógeno, la Salmonella His- (cepa auxótrofa), no crece en el medio mínimo, pero inducirá una retromutación ó reversión a his+ revertiendo el crecimiento por el compuesto químico