Células Madre

Células Madre
AUTORES:
Camacho Maldonado Manuel
Camacho Maldonado Zabdi Alejandro
Espinosa Mendes Jorge Ramón
ASESOR:
Luis David Zepeda Domínguez
Colegio Anglo Mexicano de Coyoacan
MÉXICO 2015
Resumen
En el mundo hay mucha gente que a causa de su trabajo o de algunas actividades de alto
riesgo pueden provocarse lesiones en los ojos, más específicos en la retina que es parte
fundamental para la visión, dichas lesiones pueden causar que las personas vean borroso o
que pierdan la visión completamente, hasta el momento se sabe el proceso de curación de
este tipo de lesiones en la retina, pero no se ha logrado con éxito aparte de que son
demasiado tardadas; por lo que estamos llevando a cabo un experimento con células madre
para disminuir la inflamación y acelerar la curación de las lesiones en la retina, lo que se
espera en
estos modelos murinos con los que se está trabajando es que logren una
recuperación total tanto de la retina como de la visión y la integridad anatómica del ojo, para
que en un futuro si se tiene éxito, se pueda empezar a trabajar la aplicación de células
madre en seres humanos para la regeneración y recuperación en lesiones retinianas.
Summary
In the world there are many people that because of their work or certain risk-activities can be
induced eye injuries, specifically in the retina which is a fundamental part of vision, these
injuries can cause in people blurred vision, or lose sight completely, until today we know the
healing process of these kind of injuries in the retina, but it has no succedded That besides
are too time-consuming; That besides are too time-consuming; so we are conducting an
experiment with stem cells to reduce inflammation and speed healing of lesions in the retina,
what is expected in these murine models with which we are working is to achieve full
recovery of both the retina and the vision and the anatomical integrity of the eye, so that in
the future if you are successful , you can start working applying human stem cells for
regeneration and recovery in retinal lesions .
INTRODUCCIÓN
Planteamiento del problema.
¿Cuál es el efecto de los implantes de células madre Pluripotenciales de ratón en la
recuperación de una lesión en la retina en los modelos murinos?
Hipótesis.
Los implantes de células madre pluripotentes de ratón son eficaces para la cicatrización en
lesión retiniana traumática de un modelo murino.
Sustento teórico.
Casi en la mitad de los traumatismos oculares graves se afecta la retina, cuyas lesiones se
asocian en mayor proporción con pérdida visual permanente. En trauma orbitario con
secuelas intraoculares significativas la lesión más frecuente es la conmoción o edema de la
retina, la cual se caracteriza por tumefacción pálida y oscurecimiento del relieve coroideo.
El trauma ocular ocasiona uno de cada diez desprendimientos de retina y el pronóstico de
desprendimiento no es bueno, ya que puede atrofiarse.
El trauma ocular es una causa importante de ceguera prevenible en todo el mundo y casi
50% de las lesiones oculares ocurren en menores de 18 años de edad.
En el trauma ocular abierto el paciente deberá ser intervenido quirúrgicamente de inmediato.
El cierre quirúrgico de la penetración ocular deberá restaurar la anatomía y la arquitectura
funcional, evitar complicaciones posibles y preparar el globo ocular para futuras
intervenciones.
La retina es una parte del sistema nervioso central y como el cerebro es en gran parte
incapaz de reemplazar las neuronas perdidas por enfermedad o lesión. Dependiendo del
tipo neuronal, las enfermedades neurodegenerativas de la retina se pueden dividir en los
que afectan a la retina externa y las que afectan a la retina interna.
El termino célula madre fue acuñado a finales del siglo XX, cuando el científico
alemán Darwinist Ernst Haeckel y Cols, fusionaron los conceptos de filogenia 1 y
ontogenia2 para descubrir stammzelle (Stem cell), un concepto nuevo para definir a
las células primordiales que se diferencian en diferentes tipos de células y en organismos
multicelulares.
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Filogenia: La filogenia es la historia del desarrollo evolutivo de un grupo de organismos.
Ontogenia: Describe el desarrollo de un organismo, desde el ovulo fertilizado hasta su senescencia.
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Si estas células se clasifican según su descendencia y potencial de desarrollo, es posible
reconocer
cuatro
tipos
de
SC:
Totipotenciales,
Pluripotenciales,
Multipotenciales,
Unipotenciales. El presente proyecto está enfocado principalmente a las células
pluripotenciales ya que las células madre pluripotenciales surgen de células totipotenciales y
pueden originar la mayor parte de los tipos de células especializadas necesarias para el
desarrollo fetal. Es decir, las SC pluripotentes humanas pueden generar todas las células
del cuerpo, pero ninguna célula del tejido extraembrionario.
La diferencia adicional de SC pluripotentes conduce a la información de células madre
multipotentes y unipotentes. Las multipotentes solo pueden crear un número limitado de
tipos celulares, y las células unipotentes solo las de su mismo tipo.
Dos propiedades de las SC sustentan su utilidad y expectativas: tienen la capacidad de
originar células diferenciadas y se renuevan por sí mismas, ya que cada división de la SC
crea cuando menos otra SC.
El trasplante de SC parece una herramienta prometedora para la regeneración de tejidos
enfermos, dañados o defectuosos. Las células madre hematopoyéticas3 ya se han utilizado
para restaurar células hematopoyéticas. Los rápidos adelantes en la investigación con Sc,
han planteado la posibilidad de usar otro tipo de células para el reemplazo celular y tisular.
Para las terapias con SC, la retina tiene la combinación óptima de la facilidad de acceso
quirúrgico, combinado con una capacidad de observar células trasplantadas directamente a
través de medios oculares claros. La pregunta ahora es: ¿Qué enfermedades retinianas son
blancos más apropiados para los ensayos clínicos con células madre pluripotenciales?
No solamente para enfermedades vasculares retinianas se han reemplazado con ESC como
tratamiento de estas, también se han empleado en enfermedad Stagardt, retinitis
pigmentosa y distrofia de fotorreceptores con diferentes métodos de aplicación de las
mismas.
Objetivo General
Determinar la eficacia en la cicatrización de implantes de células madre pluripotentes de
ratón en un modelo murino con lesión retiniana traumática.
Fundamentación teórica.
Células Madre
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Hematopoyesis: Es el proceso de formación, desarrollo y maduración de los elementos formes de la sangre a
partir de un precursor célula común e indiferenciado conocido como célula madre hematopoyética.
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Una célula madre es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse en distintos tipos de
células especializadas, no solo morfológicamente sino también de forma funcional.
Tienen la capacidad de dividirse simétricamente dando lugar a dos células hijas, una de las
cuales tiene las mismas propiedades que la célula madre original y la otra adquiere la
capacidad de poder diferenciarse si las condiciones ambientales son adecuadas. La mayoría
de los tejidos de un organismo adulto poseen una población residente de célula madre que
permite su renovación periódica y su regeneración cuando se produce un daño tisular.
Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo células
como las células madre mesenquimales4 y las células madre hematopoyéticas, mientras que
otras son precursoras directas de las células del tejido en el que se encuentran.
Las células madre embrionarias son aquellas que forman parte de la masa celular interna de
un embrión de 4 a 5 días de edad. Estas son pluripotentes lo cual significa que pueden dar
origen a tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. Una característica
fundamental de las células madre embrionarias es que pueden
mantenerse de forma
indefinida, formando al dividirse una células idéntica a ellas mismas y mantener una
población estable de células madre.
CLASIFICACION DE LAS CELULAS MADRE.
Totipotenciales. Únicamente el cigoto y las descendientes de las dos primeras divisiones
son células totipontenciales ya que tienen la capacidad de formar tanto el embrión como el
trofoblasto de la placenta.
Pluripontenciales. A los 4 días las células pluripotenciales empiezan a diferenciarse,
formando el blastocisto y la masa celular interna.
Multipontenciales. Son células capaces de producir un rango limitado de linajes de células
diferenciadas de acuerdo a su localización
Unipotenciales. Son células capaces de generar un solo tipo de célula específica.
Anatomía y fisiología del ojo humano
El ojo es un órgano que detecta la luz y es la base del sentido de la vista. Su función
consiste básicamente en transformar la energía lumínica en señales eléctricas que son
enviadas al cerebro a través del nervio óptico.
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Células Madre Mesenquimales: Son un ejemplo de tejido o de células madre “Adultas” pluripotentes, pueden
producir varios tipos de células de los tejidos esqueléticos tales como el cartílago, hueso y grasa.
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El ojo humano funciona de forma muy similar al de la mayoría de los vertebrados y algunos
moluscos; posee una lente llamada cristalino que es ajustable según la distancia, un
diafragma que se llama pupila cuyo diámetro está regulado por el iris y un tejido sensible a
la luz que es la retina. La luz penetra a través de la pupila, atraviesa el cristalino y se
proyecta sobre la retina, donde se transforma gracias a unas células llamadas
fotorreceptoras en impulsos nerviosos que son trasladados a través del nervio óptico al
cerebro.
Su forma es aproximadamente esférica, mide 2,5 cm de diámetro y está lleno de un gel
transparente llamado humor vítreo que rellena el espacio comprendido entre la retina y el
cristalino.
En la porción anterior del ojo se encuentran dos pequeños espacios: la cámara anterior que
está situada entre la córnea y el iris, y la cámara posterior que se ubica entre el iris y el
cristalino. Estas cámaras están llenas de un líquido que se llama humor acuoso, cuyo nivel
de presión, llamado presión intraocular, es muy importante para el correcto funcionamiento
del ojo.
Para que los rayos de luz que penetran en el ojo se puedan enfocar en la retina, se deben
refractar. La cantidad de refracción requerida depende de la distancia del objeto al
observador. Un objeto distante requerirá menos refracción que uno más cercano. La mayor
parte de la refracción ocurre en la córnea, que tiene una curvatura fija. Otra parte de la
refracción requerida se da en el cristalino. El cristalino puede cambiar de forma, aumentando
o disminuyendo así su capacidad de refracción. Al envejecer, el ser humano va perdiendo
esta capacidad de ajustar el enfoque, deficiencia conocida como presbicia o vista cansada.
Conjuntiva
La conjuntiva es una membrana mucosa y transparente que tapiza el globo ocular desde el
limbo hasta los fondos de saco conjuntivales. Ayuda a lubricar el globo ocular, produciendo
mucosidad y lágrimas, aunque éstas en una cantidad menor que las glándulas lagrimales.
Córnea
Es la estructura hemisférica (cónica) transparente localizada al frente del órgano ocular, y
que permite el paso de la luz a las porciones interiores y que protege al iris y cristalino no
posee vasos sanguíneos pero si esta inervado. Se nutre de la lágrima y del humor acuoso.
Humor acuoso
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Es un líquido claro que fluye por la cámara anterior (entre la córnea y el iris) y la cámara
posterior (entre iris y cristalino).También tiene la función de mantener su presión constante,
lo que ayuda a conservar la convexidad original de la córnea.
Iris
Es la membrana coloreada y circular del ojo que separa la cámara anterior de la cámara
posterior. Posee una apertura central de tamaño variable que comunica las dos cámaras: la
pupila.
Cristalino
El cristalino es una lente biconvexa que está situada tras el iris y delante del humor vítreo.
Su propósito principal consiste en permitir enfocar objetos situados a diferentes distancias.
Ligamento suspensor del cristalino
El ligamento suspensor del cristalino se encarga, junto con el cristalino, de dividir el ojo en
dos secciones: la cámara anterior y la posterior. Sin embargo, su principal función es la de
aumentar o reducir la tensión del cristalino para que este adopte una forma más o menos
esférica y se logre el enfoque de los objetos.
Cuerpo ciliar
El cuerpo ciliar es una parte del ojo situada entre el iris y la región de la ora serrata en la
retina. Es el responsable de la producción del humor acuoso y del cambio de forma del
cristalino necesario para lograr la correcta acomodación (enfoque). Está formado por dos
estructuras, el músculo ciliar y los procesos ciliares.
Ora serrata
Es el límite de la retina. Existe una ora serrata nasal o medial y una ora serrata lateral o
temporal. Por delante de la ora serrata la retina que compone la porción ciliar y la porción
irídea de la retina no es fotosensible.
Tendón y músculo ocular
Los músculos oculares extrínsecos son músculos que se insertan en el exterior del globo
ocular y en los huesos de la órbita. Tienen la función principal de mover el globo ocular en la
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dirección deseada y de manera voluntaria. Son los músculos rectos superior, interno u
externo y los músculos oblicuos mayor y menor.
Esclerótica
Es la "parte blanca del ojo". Es una membrana de color blanco, gruesa, resistente y rica en
fibras de colágeno. Constituye la capa más externa del globo ocular. Su función es la de
darle forma y proteger a los elementos más internos.
Coroides
Es una membrana profusamente irrigada con vasos sanguíneos y tejido conectivo, de
coloración oscura que se encuentra entre la retina y la esclerótica del ojo. La función de la
coroides es mantener la temperatura constante y nutrir a algunas estructuras del globo
ocular.
Retina
Es la capa de tejido sensible a la luz que se encuentra en la parte posterior interna del ojo y
actúa como la película en una cámara: las imágenes pasan a través del cristalino del ojo y
son enfocadas en la retina. La retina convierte luego estas imágenes en señales eléctricas y
las envía a través del nervio óptico al cerebro. La retina normalmente es de color rojo debido
a su abundante suministro de sangre. Un oftalmoscopio le permite al médico ver a través de
la pupila y el cristalino hasta la retina. Si el médico observa cualquier cambio en el color o
apariencia de la retina, esto puede ser indicio de una enfermedad.
Cualquier persona que experimente cambios en la percepción de la nitidez o del color,
destellos de luces, moscas volantes o distorsión en la visión debe hacerse examinar la
retina.
Fóvea
La fóvea es una pequeña depresión en la retina, en el centro de la llamada mácula lútea.
Nervio Óptico
El nervio óptico está compuesto por axones de las células fotorreceptoras situadas en la
retina, capaces de convertir la luz en impulsos nerviosos. Transmite la información visual
desde la retina hasta el cerebro para realizar funciones de reconocimiento de imágenes o
patrones.
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Es un nervio sensorial que emerge del globo ocular; es el nervio que nos permite la visión.
Mide aproximadamente 4 centímetros de longitud.
Humor vítreo
El humor vítreo es un líquido gelatinoso y transparente que rellena el espacio comprendido
entre la retina y el cristalino (cumple la función de amortiguar ante posibles traumas). El
humor vítreo igual que el humor acuoso proveen los elementos necesarios para el
metabolismo de los tejidos vasculares como la córnea y el cristalino. Ambos junto a la
córnea y el humor acuoso constituyen los 4 medios transparentes del ojo.
Patología de la retina
Retinopatía Diabética
La diabetes afecta a la capacidad del organismo de usar y almacenar el azúcar y puede
causar trastornos graves en los ojos: cataratas, glaucoma, visión borrosa y alteraciones en
los vasos oculares.
El 60% de pacientes con diabetes de 15 o más años de duración, presenta vasos
sanguíneos dañados en los ojos. Sólo un porcentaje reducido de los que desarrollan
retinopatías tienen problemas serios de visión y un porcentaje aún más pequeño se vuelve
ciego.
Hay dos tipos de retinopatía diabética. En el primero, la retinopatía no proliferativa, los vasos
sanguíneos de la retina presentan cambios, estos vasos gotean y sufren hemorragias, en
algunos casos, el líquido exudativo se deposita en la mácula, con lo que los objetos situados
en la zona central de la visión se vuelven borrosos, dificultando la lectura y el trabajo
detallado. Si el proceso sigue avanzando, puede convertirse en ceguera. La retinopatía es
una señal de peligro: puede avanzar a etapas más graves y dañar la vista.
El segundo tipo es la retinopatía proliferativa, donde hay neoformaciones de vasos, de gran
fragilidad, que pueden desgarrarse y sangrar dentro del humor vítreo, pudiendo ocasionar
también desprendimiento de retina y glaucoma.
Moscas volantes
Las "moscas volantes" son pequeños puntitos móviles que muchas personas ven en su
campo de visión. Realmente son pequeños grumos gelatinosos que flotan en el líquido
vítreo del interior del ojo. La retina los percibe como sombras en forma de puntos, círculos,
líneas o telas de araña. Generalmente no tienen gran importancia y se deben al
envejecimiento del vítreo o a la miopía. No obstante, a veces pueden ser las primeras
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manifestaciones de una rotura o desgarro de la retina, con grave riesgo de desprendimiento
de la misma.
Desgarros y desprendimientos de retina
El desprendimiento de retina afecta a una de cada 10.000 personas por año. Se trata de un
problema visual grave que puede ocurrir a cualquier edad, aunque normalmente suele darse
en individuos de edad media o en personas de la tercera edad. Suele ser más frecuente en
personas que son miopes o en aquellos que han tenido anteriormente algún trastorno en la
retina. Un golpe fuerte puede causar el desprendimiento de retina. Con menor frecuencia, se
relaciona con enfermedades de tipo hereditario, así puede presentarse incluso en niños. El
tratamiento no debe demorarse ya que puede acabar en deterioro o pérdida irreversible de
la visión.
La mayoría de los desprendimientos de retina son causados por la presencia de
hemorragias o desgarros en la estructura tisular de la retina. En el interior del ojo se
encuentra el humor vítreo que está firmemente adherido a la retina en algunos puntos
concretos.
Metodología de Investigación.
Expansión de células madre embrionarias de ratón (mESC).
Las mESC se sembraron a una densidad de 50,000 células por centímetro cuadrado, sobre
una monocapa de fibroblastos embrionarios de ratón previamente arrestados en su ciclo
celular, utilizándose medio basal de mESC suplementado con 15% de suero fetal bovino, 2mercaptoetanol al 0.1 m factor inhibidor de leucemia a razón de 1000 U/Ml; se incubaron a
37 grados centígrados y 5% CO2. Una vez que las placas de cultivo se encontraban
confluentes, se procedió a despegar las mESC con tripsina y mediante conteo celular se
obtuvieron dosis de 20,000 y 50,000 células re suspendidas en 0.025 mL de solución salina
balanceada al 0.09%.
Modelo murino con retinotomia.
El manejo de los animales se realizó de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM062.ZOO-1999 y los residuos se dispusieron de acuerdo con la NOM-087-ECOL-1995. Los
animales fueron machos de la cepa Rattus norvegicu de 12 semanas de edad y se
aclimataron durante una semana antes de iniciar el proyecto en jaulas metabólicas con
ciclos de 12 hrs de luz/oscuridad, con humedad controlada (50-60%) y condiciones de
temperatura constante.
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Bajo sedación con 5 mg de ketamina más 8 gm de xilacina intraperitoneal, se realizó una
retinotomia en área temporal, por fuera de las arcadas con un trocar de 27G bajo
observación directa con oftalmoscopio indirecto, la cual que fue realizada por un mismo
retinologo.
Implante de células madre pluripotentes.
Los grupos de estudio se dividieron en grupo control y tres grupos experimentales, cada uno
con diez ratas de laboratorio raza Rattus norvegicus, los cuales fueron conformados en
forma aleatoria (ojo izquierdo de la rata, siendo un total de 40 ojos).
El implante de mESC fue intravitreo con aguja de 27G, el cual fue realizado por un mismo
médico oftalmólogo; al grupo control no se le aplicó ningún tratamiento; el primer grupo
experimental recibió 0.025 intravitreo de solución salina balanceada; al grupo 2 se le
implantaron 20,000 mESC intravitreas re suspendidas en 0.025 ml de solución salina
balanceada; el grupo 3 recibió 50,000 mESC intravitreas re suspendidas en 0.025. ml de
solución salina balanceada; todos los grupos experimentales recibieron las inyecciones a la
primera, segunda y cuarta semanas posterior a la retinotomia.
Estudio histopatológico.
Posterior a tres meses de la lesión, se sacrificaron los animales para proceder a enucleación
del ojo izquierdo afectado, colocando la pieza patológica en formol amortiguado al 10%, se
realizó incluso del tejido parafina y se obtuvieron cortes histológicos de 3 m de grosor,
tiñéndolos posteriormente con hematoxilina y eosina para ser analizadas posteriormente por
un médico patólogo mediante microscopia directa, en el cual desconocía a qué grupo
pertenecía cada corte histológico.
Implante de Células Madre Pluripotentes y Estudio Histopatológico.
Las aplicaciones íntravitreas se llevaron a cabo en el tiempo establecido y sin
complicaciones. Durante un lapso de 11 semanas posteriores a la primera aplicación
intravitrea de mESC, no se observaron datos de rechazo, endoftalmitis ni alguna otra
complicación secundaria a la misma.
Resultados Obtenidos.
De acuerdo con la histopatología retiniana normal de rata un médico patólogo designó
grados según el nivel de respuesta inflamatoria en nula, leve, moderada y severa, utilizando
como criterio la cantidad de infiltrado inflamatorio crónico constituido por linfocitos y
macrófagos; por otra parte, de signó grados de integridad anatómica en conservada, con
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alteración leve, moderada y severa, en base a la integridad de las capas de la retina y al
desplazamiento anterior de las mismas por la presencia de infiltrado inflamatorio.
Referente al criterio de respuesta inflamatoria, en el grupo control se observó una respuesta
leve en 30% de las muestras y 70% presento una respuesta inflamatoria moderada,
mientras que en el grupo 1 se observó una respuesta inflamatoria leve en 50% de las
muestras y 50% con respuesta moderada. En el Grupo 2 no se observo respuesta
inflamatoria en 20% de las muestras sin embargo, 60% presento respuesta inflamatoria
escasa, 10% con respuesta inflamatoria leve y 10% con respuesta inflamatoria moderada.
En el Grupo 3 no se observo respuesta inflamatoria en 50% de las muestras, 40% presento
respuesta inflamatoria escasa y 10% presento una respuesta leve.
Con respecto a la integridad anatómica, el 30% del grupo control sufrió una alteración leve y
70% presento una alteración moderada, mientras que el grupo 1, 50% presento una
alteración leve y el otro 50% de las muestras una alteración moderada. En el grupo 2, 80%
de las muestras mantuvo conservada su integridad anatómica, 10% presento alteración leve
y 10% restante una alteración moderada. En el grupo 3 90% de las muestras mantuvo
conservada su integridad anatómica y el 10% sufrió una alteración leve.
Al analizar en conjunto los resultados obtenidos en la respuesta inflamatoria de los cuatro
grupos, se observó una tendencia a disminuir esta condición en los grupos que recibieron el
implante intravitreo con mESC en comparación con los grupos no tarareados, así como una
respuesta notoriamente favorable en el grupo 3, mismo que recibió 50,000 células por dosis.
De igual forma, se puede apreciar que el grupo 3 mantuvo conservada su integridad
anatómica en casi todos los casos, a diferencia del grupo control y el grupo 1 que se vieron
afectados en su mayoría presentando una alteración de la anatomía de moderada a leve.
En virtud de que en el grupo control y en el grupo 1 hubo una pérdida de la anatomía y no se
encontró una mejora en la cicatrización, podemos afirmar que la solución salina balanceada
que se utilizó como vehículo para re suspender las mESC, de ninguna manera influyó para
que en los grupos 2 y 3 se presentará una menor respuesta inflamatoria y se conservará la
integridad anatómica, conllevando a una significativa cicatrización.
Conclusiones
El implante mESC es eficaz para una mejor cicatrizacion de lesiones retinianas traumaticas
al reducir la respuesta inflamatoria y restaurar la integridad anatomica, pero es necesario
continuar con protocolos de investigacion para determinar otros parametros como
localizacion y biodistribucion de las mESC, dosis terapeúticas y seguimientos a largo plazo.
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Propuesta
Nuestra propuesta consiste en que se sigan haciendo estudios e investigaciones con
respecto al conocimiento y manejo de este tipo de celulas llamadas celulas madre para que
en un futuro no muy lejano se pueda experimentar con seres humanos y generar una mayor
facilidad en la cura de este tipo de enfermedades como lo son las lesiones retinianas.
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