MANUAL DE LABORATORIO - Clostridium difficile

MANUAL DE
LABORATORIO
CURSO-TALLER: Diagnóstico de
laboratorio de Infecciones y
enfermedades causadas por
Clostridium difficile
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA – UNAH
FACULTAD DE MICROBIOLOGÍA LIBA – UCR
2014
CURSO-TALLER:
Diagnóstico de laboratorio de infecciones y enfermedades causadas por Clostridium difficile
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA UNAH | LIBA | UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
PERÍODO 1: Lunes 29 de septiembre
Detección de toxinas A/B de C. difficile en heces para diagnóstico clínico
La prueba C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE® (Techlab) es un cartucho rápido que detecta
simultáneamente el antígeno del glutamato deshidrogenasa (GDH) y las toxinas A y B
de C. difficile en muestras de heces. La prueba detecta el antígeno de C. difficile, GDH,
para determinar su presencia y confirma el hallazgo de la variedad toxígena de C.
difficile mediante la detección de las toxinas A y B en muestras de heces de personas con
posible enfermedad por C. difficile. Esta prueba se utiliza como ayuda para diagnosticar la
enfermedad por C. difficile.
El valor predictivo negativo para la parte de la toxina en comparación con el cultivo de
citotoxicidad es del 98,1%.La sensibilidad de la toxina es del 87,8% en comparación con el
cultivo de citotoxicidad, en tanto que la especificidad de la toxina es del 99,4% en
comparación con el cultivo de citotoxicidad.
Trabajo en 4 – 6 grupos
Procedimiento:
1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregar 750 µl de diluente y 1 gota de
conjugado.
2. Adicionar a esta mezcla 25 µl de la muestra de heces.
3. Agitar vigorosamente.
4. Transferir 500 µl lentamente de esta mezcla al orificio pequeño en la esquina
superior derecha del cartucho de detección.
5. Dejar reposar por 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Agregar 300 µl del buffer de lavado en la ventana de detección (grande) del
cartucho.
7. Esperar que todo el buffer se absorba.
8. Adicionar 2 gotas de sustrato a la ventana de detección (grande) del cartucho.
9. Dejar reposar 10 min a temperatura ambiente.
10. Leer el resultado. Deben aparecer los 3 puntos en el centro ya que es el control
interno.
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Dr. Carlos Quesada Gómez (CQ) | Dra. Evelyn Rodríguez Cavallini (ER) | Dipl. Robin Cárdenas Mora (RC)
Laboratorio de Investigación en Bacteriología Anaerobia, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica
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Diagnóstico de laboratorio de infecciones y enfermedades causadas por Clostridium difficile
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Antígeno positivo
Antígeno positivo
Antígeno negativa
Toxinas negativa
Toxinas positiva
Toxinas negativa
Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el
laboratorio clínico. Parte I
Trabajo Individual
Cultivo bacteriológico de C. difficile: Medios selectivos y ricos
1. Sembrar en agar CCFA y en agar BAK la cepa de C. difficile que recibirá en un
vial.
2. Rotular las placas de petri con el nombre, la fecha y el medio.
3. Incubar en jarras de anaerobiosis: incluir el sobre de anaerobiosis y el indicador
redox.
4. Incubar las jarras bien cerradas por 48 horas a 35 °C, hasta el período 3.
PERÍODO 2: Martes 30 de septiembre
Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte I
Trabajo individual
Tratamiento con alcohol, inoculación en CCFA y caldo FAB
1. Dispense 1 ml de la muestra de heces líquida en tubos rotulados cónicos para
centrifuga de 15 ml.
2. Si la muestra es semi-sólida, dispense 1 ml de una solución estéril de 0.05% de
extracto de levadura en el vial de 2 ml en que se recibió la muestra. Luego,
dispense 1 ml de la muestra de heces con extracto de levadura en tubos rotulados
cónicos de 15 ml para centrifuga.
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3. Si la muestra es totalmente sólida, dispense 0.5 ml (500 ul) de una solución estéril
de 0.05% de extracto de levadura a tubos cónicos para centrifuga de 15 ml
rotulados y con una torunda estéril, pasar un volumen igual de la muestra de
heces sólida.
4. Agregar 1 ml de etanol al 96% a la suspensión de heces en los a los tubos cónicos
de 15 ml.
5. Mezclar con el vortex vigorosamente y luego incubar a temperatura ambiente por
35 minutos.
6. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos.
7. Decantar el etanol en tubos de desecho. Este líquido descartado debe ser tratado
como material biopeligroso.
8. Usando una torunda estéril inocular el sedimento en platos de agar CCFA y rayar
con asas estériles para obtener colonias aisladas.
9. Incubar en jarra de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir la jarra en el período
4.y luego examinar los platos en busca de colonias sospechosas,
10. La torunda usada para inocular el agar introducirla en el caldo FAB e incubarlo por
el mismo período de tiempo. Este medio funcionará como un respaldo en caso que
el cultivo primario sea negativo (inocular el caldo FAB, cada 4 personas).
Diagnóstico molecular. Parte I
Trabajo en 4 – 6 grupos
Preparación de inóculo para extracción del ADN
1. A partir de los medios de cultivo con aislamientos de C. difficile de dos en un vial,
inocular 0.2 ml en un caldo BHI pre-reducido.
2. Incubar por 24 horas a 35 °C. Utilizar en el período 3 para la extracción de ADN de
los aislamientos de C. difficile.
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PERÍODO 3: Miércoles 1 de octubre
Prueba de sensibilidad a los antibióticos en aislamientos clínicos. Parte I
Trabajo en 4 - 6 grupos
1. Abrir las jarras con las placas de BAK incubadas en el período 1.
2. En un tubo con caldo BHI hacer uno inóculo similar al estándar 3 de McFarland
con el aislamiento de la placa de BAK.
3. Con ayuda de una torunda, distribuir el inóculo de la bacteria en tres direcciones
en un placa de agar E-test.
4. Colocar una tira de E-test de clindamicina y otra de vancomicina, en sentidos
contrarios, sobre la bacteria sembrada en el agar E-test.
5. Incubar las placas en jarras de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir hasta el
período 5.
Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el
laboratorio clínico. Parte II
Trabajo individual
1. Abrir las jarras con las placas de agar CCFA y BAK incubadas en el período 1.
2. Reconocer, describir e identificar la morfología macroscópica y colonial de C.
difficile en agar selectivo CCFA y en el medio rico BAK.
3. A partir de los crecimientos en BAK, realizar una tinción de Gram y reconocer la
morfología microscópica de C. difficile.
4. Subcultivar los aislamientos de C. difficile en placas de BAK.
5. Incubar en jarras de anaerobiosis por 48 horas a 35 °C. Abrir hasta el período 5.
Diagnóstico molecular. Parte II
Trabajo en grupos
Extracción del ADN de aislamientos clínicos de C. difficile
1. Rotular un tubo de microcentrifuga, estéril y libre de nucleasas de 1.5 ml.
2. Preparar un baño a 100 °C y otro a 56 °C. Puede ser de bloque seco o un baño
maría.
3. Transferir 400 µl del cultivo en caldo de C. difficile con 8 a 12 horas de
crecimiento (inoculados en el período 2) al tubo de microcentrifuga.
4. Centrifugar a 14.000 rpm por 2 minutos.
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5. Aspirar el sobrenadante y descartarlo, con mucho cuidado de no causar
alteraciones en el “pellet” de bacteria del centrifugado.
6. Resuspender el “pellet” de bacterias en 200 µl del reactivo de InstaGene Matrix
(BioRad).
7. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.
8. Incubar el tubo por 15 minutos a 56 °C, en un baño seco o baño maría.
9. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.
10. Calentar la preparación a 100 °C en un baño maría o en agua hirviendo, por 8
minutos.
11. Agitar vigorosamente en un vórtex durante 10 segundos.
12. Centrifugar a 14.000 rpm por 2 minutos para sedimentar la matriz del reactivo.
13. Usar 2 µL del sobrenadante para cualquier reacción de PCR con un volumen final
de 25 µL.
14. Guardar el ADN a 4 °C.
PERÍODO 4: Jueves 2 de octubre
Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte II
Trabajo individual
Recuperación de aislamientos en CCFA y subcultivo en agar BAK
1. Abrir las jarras con CCFA y caldo FAB cultivadas con las muestras de heces en el
período 2.
2. Reconocer, analizar e identificar las colonias sospechosas de C. difficile en agar
CCFA.
3. Subcultivar una colonia sospechosa de C. difficile a partir del aislamiento primario
de CCFA en agar BAK.
4. Si las placas de CCFA están negativas por C. difficile, entonces sembrar con asa
bacteriológica el caldo FAB en otro CCFA.
5. Incubar el agar BAK y los posibles agar CCFA en jarra de anaerobiosis, a 35 °C
por 48 horas. Abrir hasta el período 5.
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PERÍODO 5: Viernes 3 de octubre
Manipulación, manejo y subcultivo de aislamientos de C. difficile en el
laboratorio clínico. Parte III
Trabajo individual
Identificación presuntiva de cepas de C. difficile
1.
2.
3.
4.
5.
Abrir las jarras incubadas en el período 3 con las placas de agar BAK.
Comprobar la emisión de fluorescencia al exponer los aislamientos en BAK ante la luz UV.
Realizar una tinción de Gram y reconocer la morfología microscópica de C. difficile.
Reconocer la morfología macroscópica de C. difficile en agar BAK.
Realizar la prueba de aglutinación en látex para la identificación de C. difficile.
Prueba de aglutinación en látex (C. difficile Test Kit, Oxoid®)
En esta prueba, las partículas de látex están sensibilizadas con anticuerpos IgG
específicos para antígenos de la pared de C. difficile. Al mezclarse con un caldo de
enriquecimiento o selectivo conteniendo el microorganismo o con una suspensión de
colonias de C. difficile provenientes de un medio sólido, las partículas de látex se
aglutinan y forman grandes aglomeraciones visibles en 2 minutos. Pocas veces, el kit
puede dar falsos positivos. Por ejemplo, con otras especies como C. innocum y C.
bifermentas.
1. Dejar que el C. difficile Test Kit® alcance la temperatura ambiente.
2. En una tarjeta reactiva del kit, añadir 1 gota solución isotónica salina 0.85%.
3. Con un palillo o asa de inoculación estéril emulsificar una colonia típica de C. difficile que
provenga de agar BAK. en la solución salina estéril, hasta producir una suspensión espesa
y uniforme
4. Añadir 1 gota del reactivo de látex sensibilizado (C. difficile latex reagent) al lado de la
suspensión de la bacteria.
5. Mezclar el reactivo y la suspensión bacteriana con un palillo de madera estéril, extendiendo
la mezcla sobre toda la superficie del pocillo de la tarjeta de reacción.
6. Agitar la tarjeta de reacción con lentos movimientos circulares por 2 minutos y examinar la
aparición de aglutinación en ese plazo máximo.
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Prueba de sensibilidad a los antibióticos en aislamientos clínicos. Parte II
Trabajo en grupos
1. Abrir las jarras incubadas en el período 3 con las placas de agar E-test.
2. Determinar la MIC (concentración mínima inhibitoria)para cada antibiótico y
aislamiento utilizado. Esta es la concentración del antimicrobiano de la tira en
donde se ha formado una zona de inhibición en forma elíptica alrededor de la tira
de E-test.
Clindamcina (S ≤ 4 µg/ml / R≥ 8 µg/ml)
________________________________
Vancomicina
________________________________
Diagnóstico molecular. Parte III
Trabajo en grupos
PCR para la detección de genes de toxinas y tpi (identificación definitiva)
Estos PCRs para C. difficile se conforman de dos multiplex (MP) separados: el MPI que
detecta los genestcdA, tcdBy cdtB y el MPII que detecta los genestcdCy tpi.
1. Las mezclas separadas de los multiplex PCR deberán estar conformados así:
MP I
Componente
Master Mix 2X
cdtB F1/R1 (10 µM)
tcdA F/R-A3B (10 µM)
tcdB F3/R4 (10 µM)
Agua PCR
ADN
MP II
Volumen (µl)
12.5
0.75
0.75
0.75
8.5
2.0
Componente
Master Mix 2X
tpi F/R(10 µM)
Pal F15/R16 (10 µM)
Volumen (µl)
12.5
0.5
0.5
Agua PCR
ADN
9.5
2.00
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Características de primers utilizados
Nombre del Primer
cdtB F1/R1
tcdA F/R-A3B
tcdB F3/R4
tpi F/R
Pal F15/R16
Gen
cdtB
tcdA
tcdB
tpi
tcdC
Tamaño del
producto
582 bp
420 o 150 bp
329 bp
230 bp
673 bp
(posible deleción)
Descripción
Subunidad B de la toxina binaria
Toxina A
Toxina B
Triosa-fosfato isomerasa específica de
C. difficile
Regulador negativo del PaLoc
2. Se recibirán tubos de PCR con la mezcla de los primers para MPI y MPII ya
diluidos en agua para PCR.
3. Agitar vigorosamente el ADN extraído en el período 3 y centrifugar a 14.00 rpm por
2 minutos.
4. Agregar 2 µl de ADN a los tubos de MPI y MPII de cada uno de los ADN extraídos,
y por separado de los ADN control (cepa NAP1, NAP7 y una cepa A-B+).
5. Agregar 12.5 µl del master mix a cada tubo y así obtener un volumen final de
reacción de 25 µl.
6. Dejar reposar por 2 minutos los tubos de reacción de PCR y transferirlos a un
termociclador con las siguientes condiciones:
A. 1 ciclo a 95 °C por 15 minutos
B. 30 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 57 °C por 90 segundos y 72 °C por 60
segundos
C. 1 ciclo de extensión final a 72 °C por 7 minutos
D. Dejar a 4 °C.
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PERÍODO 6: Sábado 4 de octubre
Cultivo y aislamiento de C. difficile a partir de muestras clínicas. Parte III
Trabajo en grupos
Identificación definitiva por métodos bioquímicos (Rap ID 32A)
1. Abrir las jarras con los aislamientos subcultivos en agar BAK del período 4.
2. Abrir una ampolla de API Suspension Medium de 2 ml.
3. Con la ayuda de una torunda preparar una suspensión igual al 3 de McFarland a
4.
5.
6.
7.
8.
9.
partir del cultivo de BAK.
Homogenizar la ampolla e inocular en cada pocillo de la galería 55 µl por cúpula
de la prueba de RapID 32A.
Recubrir el test URE con 2 gotas de aceite mineral.
Poner la tapa sobre la galería.
Incubar a 35 °C por 4 h, en aerobiosis.
Revelar las reacciones de la fila 0 añadiendo 1 gota de NIT1 y NIT2 para la cúpula
NIT, 1 gota de James para la cúpula IND y 1 gota de FB para las pruebas de PAL
a SerA.
Refiérase a la base de datos del RapID 32 A para interpretación e identificación
final.
Diagnóstico molecular. Parte IV
Trabajo en grupos
Electroforesis e interpretación del PCR
1. Preparar dos geles de 1.5% de agarosa en buffer TBE al 0.5X con el reactivo de
tinción del ADN (GelRed, sustituto de bromuro de etidio).
2. Chorrear el gel en la cámara de electroforesis para ADN con el peine
correspondiente y esperar que se gelifique. Un gel será para el MPI y otro para el
MPII.
3. Cargar en los pocillos extremos de las muestras un GeneRuler (GR) de 50 bp,
seguido de los amplicones del ADN control:
GR – NAP1 – Toxina A- Toxina B+ - NAP7 – Muestras -NAP1 -Toxina A- Toxina B+ - NAP7 – GR
4. Correr una electroforesis a 100V por 90 min
5. Visualizar en un capturador de imágenes de geles al exponerlo a luz UV.
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