TEMA "EXTRACCIÓN DE ADN" Laboratorio de bilogía molecular COORDINACIÓN DE BIOSEGURIDAD, UNIDAD IZTAPALAPA Elaboró: Q. A. José Miguel Angel Castillo Minjarez Técnico en control de calidad y trazabilidad de muestras de OGMs EXTRACCIÓN DE ADN EL ADN El ácido desoxirribonucleico o ADN, es el ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de la información. Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos (polinucleótido). Cada nucleótido está formado por la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser adenina (A), timina(T), citosina (C) o guanina (G) y un grupo fosfato. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información genética. El ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas. La union de los nucleotidos ocurre entre el grupo fosfato y el azucar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molecula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrogeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Bases nitrogenadas (purinas y pirimidinas) Watson y Crick postulan que el ADN nativo consiste en dos cadenas antiparalelas en una disposición de doble hélice. Hay apareamiento complementario de pares de bases (AT y GC), se forman por enlaces de hidrógeno dentro de la hélice. La historia del ADN puede pensarse que comenzó en 1865, cuando Gregor Mendel descubre a través de experimentos de reproducción con chicharos, que los rasgos se heredan. En 1866, Ernst Haeckel propone que el núcleo contiene los factores responsables de la transmisión de los caracteres hereditarios. Entre 1884 y 1885, Oscar Hertwig , Albrecht von Kflliker, Eduard Strasburger y August Weismann proporcionan evidencia de que el núcleo de la célula contiene la base de la herencia. En 1889, Richard Altmann introduce por primera vez el nombre de ácido nucleico para una sustancia que hasta ese momento era conocida como nucleina. En 1929, Phoebus Levene identifica los componentes básicos del ADN, incluyendo las cuatro bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). En 1953, James Watson y Francis Crick descubren que la estructura molecular del ADN es una doble hélice en la que A siempre se aparea con T y C siempre con G. James Watson Francis Crick Pero es en el año de 1869 cuando Friedrich Miescher aísla ADN por primera vez. Los experimentos que realizó con vendas quirúrgicas lo llevaron a obtener un precipitado floculento que llamó “nucleína” y que finalmente se llamaría ácido desoxirribonucleico. Friedrich Miescher Métodos de extracción La extracción de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En el caso del ADN, la extracción consiste en su aislamiento y purificación basándose en las características fisicoquímicas de la molécula. Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere una carga neta negativa al ADN, haciéndolo altamente polar y permite disolverlo en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Cuando se pone en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante, quedando expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente. A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos de extracción con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Para elegir el método más adecuado, se pueden emplear los criterios siguientes: ácido nucleico diana; organismo fuente; material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación); uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc.). Métodos tradicionales Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50’s, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN. Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es necesario lisar la celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos celulares. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); tratamiento químico (uso de detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.); digestión enzimática (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación. Separación de proteínas y lípidos En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación. Precipitación del ADN Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación. Redisolución del ADN Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrolisis ácida. Cuando se utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una opción que evita la fragmentación consiste en incubar a 55°C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave. Método de extracción con CTAB El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores. El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar OGM. Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar. Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucléicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol. En esta sección se describirán los principios de las tres etapas principales: la lisis de la membrana celular, la extracción del ADN genómico y su precipitación. Lisis de la membrana celular: La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biológicas presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes. Representación simplificada de las membranas celulares Las moléculas lipídicas están ordenadas en una doble capa continua, en la que las moléculas proteínicas están «disueltas». Las moléculas lipídicas están formadas por extremos hidrófilos, denominados “cabezas”, y extremos hidrófobos, denominados “colas”. En este método, el detergente (CTAB) contenido en el tampón de extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la composición de los lípidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampón de extracción captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear. A continuación se muestra el mecanismo de solubilización de los lípidos con un detergente. Solubilización de los lípidos. En la imagen siguiente se muestra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente captura los lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH. Los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la homogeneización de la muestra y la adición de la solución tampón con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la célula y de los orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN. Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico. Extracción - En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solución acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior. Además, si el pH de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 – 8,0), los ácidos nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos nucléicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa del procedimiento. Precipitación - En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual. Métodos comerciales A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina. La membrana esta insertada dentro de un microtubo de polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora. Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a esta durante la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz. Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN. Los kits comerciales reducen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, pueden permitir una extracción de alta pureza. Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la mezcla de lisis se le añade la solución de unión que tiene un pH específico. Antes de pasar la solución de lisis a través de la columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando con ello la adsorción de la molécula a la membrana cargada positivamente. Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras que el material genético permanece unido a la matriz. El kit con perlas magnéticas además de utilizar soluciones a pH específicos, utiliza un imán o magneto que atrae a las perlas para separarlas de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. En este caso, se añade a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite que las perlas se carguen positivamente, favoreciendo la unión de ADN. Las proteínas y lípidos tienen baja afinidad por las perlas y son eliminados con soluciones de lavado a pH fisiológico. Las perlas son retenidas en la pared del microtubo con el magneto, mientras que la solución con los contaminantes se eliminan por pipeteo. Recuperación del ADN de la matriz En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz. La membrana y el ADN se deshidratan con soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después se recomienda centrifugar nuevamente la columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones. Posteriormente, se adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la membrana, se espera a que el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y resuspenderlo. En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de TrisHCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa de las perlas y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continúan siendo retenidas por el magneto. Es necesario saber que la mayoría de los kits tienden a ser generales a la hora de su aplicación, pero se diseñan con un propósito específico. Por ejemplo, un kit para extraer ADN de sangre total, considera la presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el proceso. Este método será más agresivo en comparación con un kit diseñado para extraer ADN de células o tejidos animales. En los manuales proporcionados por el fabricante se detallan, además de los pasos a seguir en cada caso, la cantidad de muestra recomendada y el rendimiento esperado de acuerdo al tipo de tejido. Esta información debe tomarse en cuenta al momento de elegir un kit. Bibliografía Dahm, R. (2005). Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental Biology, 278(2), 274-288. Nelson, D. L. and Cox, M. M. (2005). Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth Edition. Publisher: W.H. Freeman ISBN: 0716743396. Somma, M. Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos. Extracción y Purificación de ADN. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD, OFICINA REGIONAL PARA EUROPA. JRC. COMISIÓN EUROPEA. Watson, J. D., & Crick, F. H. (1953). Molecular structure of nucleic acids. Nature, 171 (4356), 737-738.