Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRÍA EN CIENCIAS, ÁREA: BIOTECNOLOGÍA
RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNERO Pachyphytum
(CRASSULACEAE), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS, AREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
IGNACIO GARCÍA RUIZ
ASESORES:
M.C. SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ
DRA. JUNE SIMPSON
Tecomán, Col. Marzo de 2003
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No, 175/2003.
C. IGNACIO GARCIA RUIZ
EGRESADO DE LA MESTRÍA EN CIENCIAS
AREA: BIOTECNOLOGÍA
PRESENTE
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área; de
Biotecnología de esta Facultad a mi cargo de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de que
efectuó las correcciones y acato las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo,
se le autoriza la impresión de la tesis “RELACIONES INTERESPECÍFICAS DEL GÉNERO
Pachyphytum (Crassulaceae), EMPLEANDO MARCADORES GENÉTICOS AFLP”,
misma que ha sido dirigida por los C.C., M.C. Salvador Guzmán González, Profesor –
Investigador de la Universidad de Colima y la Dra. June Simpson W., Profesora del
Departamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV, Unidad Irapuato.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para
obtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma
y contenido por los C.C. Dra. Martha I. Vergara Santana, Dr. Alfonso Pescador Rubio, M.C.
Salvador Guzmán González. Profesores –Investigadores de la Universidad de Colima.
Sin otro particular de momento me despido de usted muy cordialmente.
C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO
C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE
C.C.P. ARCHIVO
RVMD nlpv**
Of. No. 175/2003.
“2003, 45º ANIVERSARIO DE LA FACULTAD DE DERECHO”
Km 40 Autopista Colima- Manzanillo Tecomán, Colima, México C.P.28100
Tel.01(313)322 94 05 Ext.. 52251 Fax 52252 fcba@tecoman.ucol.mx
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional por haberme brindado la beca de la COTEPABE y
COFAA para realizar los estudios de Maestría durante dos años y seis meses.
A la Universidad de Colima, por permitirme ingresar al posgrado de la Facultad de
Ciencias Biológica y Agropecuarias.
Al Dr. Silvio Maldonado Bautista, Director del CIIDIR-IPN Michoacán, por su
confianza y apoyo incondicional.
Al Dr. Oscar Comas, por su confianza en apoyarme con la Beca SUPERA-ANUIES
Al Director de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Ing. Rodolfo V.
Morentín Delgado, por sus finas atenciones.
Al Coordinador del posgrado Dr. Sergio Aguilar, por su paciencia y finas atenciones.
A todos los profesores del Programar Drs. Jaime Molina Ochoa, Roberto Lezama,
Javier Farias, Oscar Rebolledo, Alfonso Pescador, Rocío Flores, y a los M.C.
Trinidad Ramírez y Arnoldo Michel quienes aportaron comentarios valiosos durante
mi formación profesional.
A la Dra. June Simpson, del CINVESTAV Irapuato, por el apoyo en la realización de
la fase final del trabajo de laboratorio (técnica AFLP).
Al M. C. Salvador Guzmán González, por su amistad brindada, paciencia, dirección y
orientación, del trabajo desarrollado durante mi formación.
Al comité revisor de la Facultad, Dra. Martha Vergara y Dr. Alfonso Pescador, por su
paciencia y por sus atinadas sugerencias en el orden y redacción del documento final.
A todos los compañeros del laboratorio de Genética (L-6), del Cinvestav Irapuato,
por su amistad y auxilio en el trabajo experimental, en especial al Dr. Raúl
Rodríguez, Sanjuana Hernández, así como a Katia, Mónica, Alfredo, Alex, Lulú, Teté
y Fernando Hernández.
A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología Campus Tecomán, por su apoyo
en el desarrollo preliminar del trabajo experimental, en especial a Miguel A. Flores y
Gilberto Manzo. Asimismo a Mario Orozco, Ramiro Ruiz, Argelia Juárez, Emeterio
Payró, José Luis Rosas, por su amistad y confianza.
A todos los compañeros del posgrado que convivieron conmigo y que me brindaron
su amistad, en especial a Francisco J. Santana, Rocío Nadal, Miguel A. Manzanilla,
Manuel Robles, Ramón Govea.
Al Dr. Alejandro Bravo y Biól. Jaime Nava, del CIIDIR-IPN Michoacán, asimismo al
Dr. Aarón Rodríguez de la Universidad de Guadalajara, por la lectura crítica y
sugerencias en alguna de las versiones de este trabajo.
Al Dr. Jerzy Rzedowski, del Instituto de Ecología A.C., Región Bajío, por su apoyo y
confianza brindada. Del mismo centro, un agradecimiento especial para el M.C.
Emmanuel Pérez-Calix, por su apoyo con material y salidas de campo, literatura,
sugerencias e ideas, pero sobretodo por su amistad. Al M.C. Eleazar Carranza, por
compartir material colectado en campo; al Dr. Sergio Zamudio por su amistad y por
facilitarme la revisión del herbario IEB.
Al Dr. Octavio Martínez de la Vega, del Cinvestav Irapuato, por su asesoría en la
utilización del programa estadístico S-Plus 2000.
Por su disposición y excelente compañía en colectas y exploración de campo: J.
Antonio Machuca, Servando García, Jesús García, Yolanda Hernández, Melissa
García, Karen Angelina García, Germán Hernández, Miguel Cházaro, Raúl Acevedo
y Mario Mendoza.
Al Dr. Jorge Meyrán por facilitarme parte del material original de Pachyphytum
coeruleum.
A Charly Glass (q.e.p.d.), por haberme compartido su amistad, material y literatura.
A todos mis amigos y compañeros del CIIDIR-IPN Michoacán, por su amistad y
apoyo brindado desinteresadamente, en especial a Elizabeth del Río, Guadalupe
Arceo, y Fabián Villalpando.
A TODOS MUCHAS GRACIAS
DEDICATORIA
Con todo respeto a mis padres Angelina Ruiz (q.e.p.d.), y Andrés García, por su
constante apoyo, cariño, y amor fraterno que nunca me han faltado.
A mi esposa Yolanda y a mis hijas Melissa y Karen Angelina, por su paciencia,
amor, calidez y dulce compañía que me han brindado.
A todos mis hermanos y hermanas, por su cariño, comprensión y apoyo.
A todos mis sobrinos y sobrinas, deseando que el presente sea considerado un
pequeño ejemplo de superación que nos permita mejorar en todos los niveles de vida.
A todos los integrantes de mi familia política, por su atención, apoyo y amistad
brindada.
A todos mis profesores del posgrado por sus experiencias compartidas.
A todos mis parientes y amigos.
En remembranza a una idea de un Profesor del, posgrado:
"Existen dos principales problemas en el mundo: la pobreza y la ignorancia; a
nosotros nos corresponde tratar de resolverla ignorancia."
ÍNDICE
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
Página
vii
RESUMEN
ABSTRACT
I INTRODUCCIÓN
x
xi
1
II REVISIÓN DE LITERATURA
5
2.1 Diversidad genética
5
2.1.1 Variación genética
5
2.1.2 Poliploidia en las plantas
6
2.1.3 Evolución
7
2.1.4 Especiación
8
2.1.5 Especiación y método sistemático
11
2.1.6 Conservación de la herencia
12
2.1.7 Fenotipo y genotipo
13
2.1.8 Mutación
14
2.1.9 Aislamiento reproductivo
14
2.2 Sistemática
16
2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica
17
2.4 Filogenia y sistemática molecular
19
2.4.1 Enzimas de restricción
23
2.4.2 Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos
Amplificados (AFLP)
25
2.5 Supuestos biológicos y estadísticos sobre los marcadores
31
2.5.1 Homología de los fragmentos
31
2.5.2 Neutralidades de los alelos
32
2.6 Unidades operacionales taxonómicas (OTUs)
33
2.6.1 Medidas de similaridad genética
34
2.6.2 Métodos estadísticos para el análisis de la diversidad
genética
36
2.7 Representaciones gráficas de análisis numéricos
38
2.7.1 Métodos de obtención de dendrogramas
40
2.7.2 Intervalos de confianza y pruebas de hipótesis
sobre dendrogramas
41
2.8 Análisis estadístico de datos moleculares
43
2.9 Generalidades de la familia Crassulaceae
44
2.9.1 Distribución de las Crassulaceae
45
2.9.2 Estudios filogenéticos en las Crassulaceae
48
2.10 Ubicación taxonómica del género Pachyphytum
51
2.10.1 Descripción botánica
52
2.10.2 Secciones del género Pachyphytum
55
III MATERIALES Y MÉTODOS
63
3.1 Material Biológico
63
3.2 Extracción de ADN
66
3.3 Purificación del ADN
66
3.4 Cuantificación del ADN
67
3.5 Integridad del ADN
68
3.6 Análisis AFLP del ADN
69
3.7 Restricción del ADN
69
3.8 Ligación de los adaptadores
69
3.9 Primera amplificación
70
3.10 Marcaje y selección de los iniciadores
70
3.11 Segunda amplificación
71
3.12 Separación de productos de amplificación
72
3.13 Análisis de datos
73
3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias
73
3.13.2 Análisis del agrupamiento
73
IV RESULTADOS
75
4.1 Reacciones de la técnica AFLP
76
4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP
76
4.3 Relaciones genéticas interespecíficas
80
V DISCUSIÓN
87
5.1 Uso de la técnica AFLP
87
5.2 Polimorfismo del ADN
90
5.3 Evidencia filogenética
92
5.4 Implicaciones taxonómicas
94
5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual
101
5.6 Importancia y status del género Pachyphytum
103
VI CONCLUSIONES
108
VII LITERATURA CITADA
109
ÍNDICE DE CUADROS
Descripción .
Página
Cuadro 1. Localidades reportadas de las especies de Pachyphytum
57
Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado
65
Cuadro 3. Resultados obtenidos con el análisis de marcadores tipo
77
AFLP
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Número
Figura 1.
Descripción
Pachyphytum machucae García, Glass et Cházaro. Tomado de Acta
Página
54
Botánica Mexicana.
Figura 2.
Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum.
64
Figura 3.
Electroforésis en .gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especies
estudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de
Pachyphytum; 18-22 especies testigo. La marca de peso molecular a
los costados derecho e izquierdo.
75
Figura 4.
Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones
de bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo
(18-22), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinación
de iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas del costado izquierdo
señalan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.
78
Figura 5.
Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de
bandeo de especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (1822), obtenido a partir de la técnica AFLP, con la combinación de
iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de las bandas
monomórficas. La escala de la izquierda son las pares de bases (Pb)
del marcador de peso molecular usado (escalera 123 Pb). La escala de
la derecha indica la numeración de las bandas legibles encontradas.
79
Figura 6.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética
“Manhattan” /average. La especie P. glutinicaule, queda fuera del
grupo principal, junto con los grupos testigo.
81
Figura 7.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética
"Manhattan" / compact. La especie testigo B. glabrifolia, separa en dos
a las especies en estudio, lo cual no es factible.
81
Figura 8.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética
"Manhattan" / connected. De nuevo, la especie P. glutinicaule se
comporta junto con los grupos testigo.
81
Figura 9.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética de
Jaccard ó "Binary" / average. Este gráfico, agrupa de manera clara las
especies testigo, no así con el grupo en estudio.
82
Figura 10.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” /
connected. Similar al anterior en el grupo en estudio no se encuentran
claros los agrupamientos formados.
82
Figura 11.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” /
compact. Gráfico con mayor representatividad, la separación entre el
grupo en estudio y el testigo son más claras.
82
Figura 12.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” /
compact. Similar al anterior, se agrupan más claramente las especies
en estudio, mejora la interpretación de sus relaciones.
83
Figura 13.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” /
connected. Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del
grupo en estudio.
83
Figura 14.
Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” /
average. Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las
especies del género Pachyphytum.
83
Figura 15.
Dendrograma obtenido por medio de "Nei" y compact con un bootstrap
de 3000 repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos
de intersección con la línea punteada a un nivel de disimilaridad de
0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B) logrados, los
números en los nodos significan los valores de confianza en cada
agrupación. Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies
problema” de ubicar dentro de alguna sección del género
Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremos superior e
inferior.
85
Figura 16.
Relaciones geográficas y afinidades genéticas de las especies del
género Pachyphytum. Primer grupo especies 1-6, segundo grupo
especies 7-17.
99
ix
RESUMEN
El género Pachyphytum son plantas de ornato con poblaciones naturales reducidas,
tiene cinco especies cuya ubicación taxonómica es incierta a nivel de sección. Se
considera que la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a
nivel sección, se modificará si se agrupan con relación a su polimorfismo genético.
Para probar esto, se planteó el objetivo de determinar las relaciones genéticas
interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su
polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP). El ADN de las 17
especies de Pachyphytum fue extraído y analizado a través de marcadores AFLP,
utilizando cinco combinaciones de iniciadores. La longitud de las bandas obtenidas
varió de 175 a 525 pb y el número total de bandas legibles fue de 406, de las cuales
el 92.4 % fueron polimórficas. Las bandas polimórficas fueron analizadas por
diferentes métodos de agrupamiento, donde el que brindó mejor información fue
“Nei”
/compact.
Un
remuestreo
(bootstrap)
de
3000
repeticiones
apoyó
al
dendrograma obtenido, el cual confirmó la asociación de dos grupos principales,
presentándose cuatro de las especies problema en uno de estos. Se concluye que
las tres agrupaciones formadas con base en características fenotípicas de la
taxonómica clásica, en las secciones del género Pachyphytum, no se correlacionan
con las dos agrupaciones conformadas por medio de la similaridad genética.
Palabras clave: Pachyphytum, Crassulaceae, marcadores genéticos, AFLP.
x
ABSTRACT
The
genus
Pachyphytum
includes
ornamental
plants
with
reduced
natural
populations, contains five species whose taxonomic location is uncertain at the
section level. It is considered that the classic taxonomic classification of the
Pachyphytum species at the section leve¡ will be modified if they are grouped in
relation to genetic polymorphism. In order to shidy this hypothesis, the objective of
this work was to determine the interspecific genetic relations of plants of the
Pachyphytum genus by means of the analysis of Amplified Fragment Length
Polymorphisms (AFLP). The DNA of 17 species of Pachyphytum was extracted and
analyzed through AFLP genetic markers, by employing five combinations of primers.
The length of the bands obtained varied from 175 to 525pb and the total number of
legible bands was of 406, of which 92, 4 % were polymorphic. The polymorphic bands
were analyzed by different grouping methods. The Nei/compact method was the most
adequate in tucos information provide. A resampling (bootstrap) of 3000 repetitions
supported the obtained dendrogram, which confirmed the existence of two main
groups, in one of wich, four problem species were found to group. The three groups
formed on a phenotypic basis using classical taxonomic in the Pachyphytum genus
sections, are not correlated with the two groups formed based on genetic similarity
using molecular markers.
Key words: Pachyphytum, Crassulaceae, genetic markers, AFLP.
xi
I INTRODUCCIÓN
La biodiversidad es el resultado del proceso evolutivo, mutación y selección
determinan las características y cantidad de diversidad biológica que existe en un
lugar y momentos dados, en el contexto conservacionista se refiere a la diversidad
de especies, variación genética, variación intraespecífica e intrapoblacional, (Halffter
y Ezcurra 1992), patrones complejos de variación pueden empañar los límites entre
especies y conducir a la complejidad taxonómica (Matolweni et al., 2000), por lo que
pueden presentarse taxa de posición incierta. Uno de los principales inconvenientes
que presenta la clasificación taxonómica actual, es la falta de ubicación adecuada de
especies problema; ya que existen varios taxa con características intermedias que no
es posible precisar su ubicación en alguno de los diferentes niveles taxonómicos,
inclusive familias botánicas de posición incierta (Bremer et al., 1998). Judd et al
(1999), consideran que a los sistemáticos les corresponde la identificación e
interpretación de grupos de organismos producto de la evolución. De esta forma los
estudios taxonómicos, los aspectos prácticos de exploración en campo, colecta de
especimenes, así como el descubrimiento y descripción de especies son la base
empírica para estudiar sus similitudes e interpretar sus relaciones de parentesco y
posteriormente clasificarlas (Mishler y De Luna 1997).
Los caracteres morfológicos, tradicionalmente, han servido como la única base
para la mayoría de los estudios taxonómicos (Stevens 1984, 1986). La incorporación
de nuevos tipos de datos, particularmente los moleculares, ha sido necesaria en taxa
donde los caracteres morfológicos, por sí solos no han resuelto los problemas
taxonómicos (González 1997). Los sistemas de clasificación resultantes son una
forma de comunicación del conocimiento de la diversidad biológica, de tal forma que
cada
sistema
de
clasificación
implica
una
hipótesis
particular
de
relaciones
filogenéticas entre los taxa clasificados; también implica una serie de hipótesis sobre
los orígenes comunes de las similitudes entre tales taxa (Mishler y De Luna 1997).
1
En este sentido teórico, las clasificaciones son el marco histórico para
interpretar los patrones de similitudes entre taxa, interacciones ecológicas y su
distribución geográfica (Brooks 1981; Cracaft 1983; Eldredge y Cracaft 1980; Farris
1979). El concepto de especie ha tenido un papel muy importante en muchas áreas
de la biología; en el sentido teórico, la especie se ha considerado el fundamento en
la construcción de las clasificaciones (Mishler y De Luna 1997). Un problema
filosófico en la taxonomía consiste en decidir qué conocimiento es aceptable, o qué
debe usarse como base confiable para la clasificación biológica: las similitudes por sí
solas o las inferencias sobre las relaciones filogenéticas (De Luna 1995).
La sistemática vegetal se basa usualmente en caracteres morfológicos,
producto de la expresión genética, en cambio, los polimorfismos del ADN brindan la
observación directa del genotipo de las plantas (Matsumoto et al., 1997). La
existencia de polimorfismos en las poblaciones es de gran importancia para el
estudio de procesos biológicos en la ecología evolutiva y la sistemática (González
1998). Por lo que, la eficacia del carácter utilizado en sistemática será mayor si no
resulta de la influencia del medio sobre el fenotipo; en virtud de lo anterior el uso
directo del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales para
una clasificación (Crawford 1990). Con la ventaja adicional de que el número de
datos que se pueden obtener está limitado solo por el tamaño del genoma (Hillis
1987).
La mayoría de los autores que abordan estos temas, usan las filogenias de
una u otra forma para tomar decisiones taxonómicas y construir una clasificación
(Nelson 1973; Wiley 1980). Forey (1992) menciona que la filogenia ocupa un lugar
central entre la sistemática y la taxonomía al ayudar a resolver problemas de
ubicación y de nomenclatura; por lo que una alternativa que contribuye al
esclarecimiento sobre la ubicación de especies problema, son los estudios genéticos
o moleculares de las especies. Se considera que las especies problema son un
desacierto de los biólogos al acordar como se deben identificar las especies, ya que
se deben tomar en cuenta aspectos evoautivos (O’Hara 1993; Hey 2001). Wolf et al
2
(1991) consideran que los taxa que poseen grandes problemas en sistemática
proporcionan excelentes modelos de .estudio del proceso evolutivo. Por lo que una
alternativa es el estudio genético de las especies con alguna de las diferentes
técnicas actuales derivadas del análisis del ADN.
Una de las técnicas que ha proporcionado la mayoría de los datos para la
reconstrucción filogenética de las angiospermas es a través del mapeo de sitios de
restricción del genoma entero del DNA del cloroplasto (cpDNA) (Palmer et al., 1988;
Jansen et al., 1991; Olmstead y Palmer, 1992). Dichos análisis se han usado para
conocer el grado de relaciones a nivel de género y familia, y brindan gran potencial
de apoyo a la botánica sistemática (Olmstead y Palmer 1994), asimismo, ha sido de
utilidad
en
análisis
filogenético
de
especies
congenéricas
y
entre
géneros
relacionados, así como en niveles taxonómicos superiores (Soltis et al., 1992,
1997a). Se puede considerar el hecho de que los análisis filogenéticos enfocados a
todos los niveles de los grupos superiores de plantas, han planteado algunos de los
cambios más dramáticos en la clasificación y en los conceptos de sus relaciones
(Soltis y Soltis 2000a). Al grado que se ha propuesto un nuevo código que remplace
al actual Código Internacional de Nomenclatura Botánica (ICBN) (Cantino y de
Queiroz 2000; Berry 2002; Stevens 2002; Brummitt 2002).
La clasificación actual del género Pachyphytum Link, Klotch y Otto, semejante
al de muchas especies, obedece a que durante el período pre-evolutivo a finales del
siglo XIX, la mayoría de los datos disponibles para los taxónomos fueron los
morfológicos, anatómicos y geográficos; los cuales hoy en día, aún son considerados
un
componente
Pachyphytum
importante
pertenece
a
de
la
la
taxonomía
familia
(Heywood
Crassulaceae
y
1976).
usualmente
El
género
ha
sido
considerado dentro de la subfamilia Echeverioideae (Berger 1930), sin embargo en
la última década, Hart, (1995), lo ubica en la subfamilia Sedoideae. Este género
comprende las secciones Pachyphytum, Diotostemon e Ixiocaulon, diferenciadas por
rasgos de morfología floral y foliar principalmente (Berger 1930; Walther 1931; von
Poellnitz 1937; Moran 1968a). Sin embargo Pachyphytum machucae por sus
3
características intermedias respecto al tamaño de los pétalos y sépalos, así como por
el grado de superposición de las brácteas florales, es difícil precisar su ubicación
taxonómica a nivel de sección (García et al., 1999), situación similar ocurre con P.
garciae y P. brevifolium (Pérez-Calix et Glass 1999), y con P. rzedowskii (García et
al., 2002).
Algunos elementos de la familia Crassulaceae en general y algunas especies
del género Pachyphytum, en particular tienen gran importancia en la horticultura
como plantas de ornato, sobre todo en Europa y Norteamérica. En contraste sus
poblaciones naturales están reduciéndose por sobrecolecta y alteración de su
hábitat; sin embargo ninguna de sus especies se encuentra citada en los apéndices
de la Norma Oficial Mexicana. Pachyphytum es endémico del centro de México; es
poco conocido, no tiene reportes en sistemática molecular, filogenia, biodiversidad ni
conservación genética.
Del total de especies reportadas de este grupo (16), se presentan cuatro (P.
machucae, P. garciae, P. brevifolium y P. rzedowskii), que por sus características
morfológicas es difícil ubicarlas en alguna de las secciones conocidas. Otra más (P.
contrerassi) cuyo reporte científico está actualmente en prensa, guarda un escenario
similar; por lo que se considera una situación problemática dentro de la clasificación
del grupo, y a la vez podría ser un modelo para realizar un análisis de sus relaciones
genéticas interespecíficas con marcadores moleculares, ya que se tiene como
hipótesis que la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a
nivel sección, se modificará si se agrupan con relación a su polimorfismo genético.
Para probar esto, se plantea el siguiente objetivo:
Determinar las relaciones genéticas interespecíficas de plantas del género
Pachyphytum mediante el análisis de su polimorfismo genético con marcadores
AFLP.
4
II REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Diversidad genética
2.1.1 Variación genética
Ledig (1988), considera que la diversidad genética puede conceptualizarse
jerárquicamente en tres niveles: de alelo, de grupos de alelos que tienden a variar en
su conjunto y del genoma completo de una especie. La variación genética, con base
en la mutación y recombinación genética dentro de especies y poblaciones,
constituye la materia prima de la selección natural y deriva génica, de esta forma
algunas variantes pueden conferir ventajas adaptativas sobre los individuos que las
poseen, donde cada individuo podría ser proveedor en el sentido “darwiniano”, y
podría dejar más descendientes que aquellos que poseen menores variantes (Lewin
999; Judd et al., 1999). Matolweni y colaboradores (2000) consideran que patrones
complejos de variación pueden empañar los límites entre especies y conducir a la
complejidad taxonómica. Hillis y Holder (2000), indican el interés de los biólogos por
escribir la historia de la vida usando las relaciones evolutivas como una fuente de
datos de análisis biológicos de otros campos, y que los árboles evolutivos o
filogenéticos proveen de la estructura básica para interpretar la variación biológica.
Asimismo, Singh (1999), reporta que la variación genética puede resultar de
una mutación, como un cambio en el genotipo de un organismo, el cual no fue
heredado de sus ancestros; y considera que es la última fuente de variación en una
especie que reabastece el suministro de variabilidad genética. El mismo Singh,
agrega que una mutación puede ser (puntual), o presentarse como un cambio mayor
en la estructura del cromosoma (cromosómica); al ser de esta última forma, puede
deberse a deleción, inversión, aneuploidia, o poliploidia, por lo que la recombinación
consistirá en un rearreglo de cromosomas, realizado de manera conjunta por medio
de la meiosis y la fertilización del material genético de distintos parientes,
produciendo un nuevo genotipo (Singh 1999).
5
Por su parte Lewin (1999), agrega que la mayoría de las especies existen
como poblaciones separadas geográficamente, no sólo como una simple población y
que como resultado, poblaciones individuales de la misma especie generalmente
desarrollan diferentes variaciones genéticas, donde cada variante se extiende a otras
poblaciones solo cuando los individuos se mueven entre poblaciones y empiezan a
aparearse. El mismo comenta que si las poblaciones permanecen completamente
aisladas una de otra (separadas por un gran sistema de ríos ó ubicadas entre
montañas), entonces las distinciones sustantivas genéticas pueden acumularse
dentro de las poblaciones, y a veces da como resultado el establecimiento de
subespecies, o a nivel de especies diferentes.
La variabilidad fenotípica de las poblaciones tiene tres componentes: (1) las
modificaciones inducidas por el ambiente; (2) la recombinación génica; y (3) las
mutaciones (Stebbins 1978, 1999; Ayala et al., 2000), y consideran que la mayor
parte de la variabilidad observada en las poblaciones es consecuencia de las dos
primeras; ya que las modificaciones inducidas por el ambiente alcanzan su máxima
expresión en los organismos' sometidos a fluctuaciones drásticas de su entorno, y
afecta mucho más a las características secundarias de los procesos metabólicos que
a las básicas, de tal forma que entre al ADN génico y la expresión final de un
carácter fenotípico se interpone una trama compleja de interacciones moleculares.
2.1.2 Poliploidia en las plantas
Sobre las diferencias entre las especies intervienen muchos genes y hay a
menudo también, cambios cromosómicos, de igual forma, la transformación de una
especie en otra en el transcurso del tiempo, o la disociación de una especie ancestral
en dos o varias derivadas es, por lo tanto, un proceso lento; no obstante, junto a esta
manera gradual de formación de especies, también pueden surgir especies nuevas
en una sola generación mediante la poliploidia (Dobzhansky 1975; Soltis y Soltis
2000b). Esto puede ocurrir, ya sea mediante la duplicación del complemento
cromosómico en los híbridos de dos especies previamente existentes (alopoliploidia),
6
o bien por la multiplicación de los cromosomas de una sola especie (autopoliploidia),
se considera que en uno y otro caso el poliploide posee, al menos inicialmente todos
los genes que estaban presentes en sus antepasados sin tener ninguno nuevo. Sin
embargo, la especie ancestral puede seguir existiendo al lado del poliploide; la
diversidad orgánica aumenta por lo tanto y la formación de especies mediante
poliploidia ha ocurrido en todos los grupos importantes de plantas (Dobzhansky
1975; Soltis y Soltis 2000b; Holsinger 2000). J. Simpson (comunicación personal,
enero del 2.003) señala que la poliploidia permite que las mutaciones actúen sobre un
juego de genes, sin afectar las funciones de las otras copias de genes.
2.1.3 Evolución
El concepto implica el desarrollo de una entidad en el transcurso del tiempo a
través de una secuencia gradual de cambios de un estado simple a uno más
complejo (Savage 1978). Judd y colaboradores (1999), consideran a la evolución
como el cambio genético a través del tiempo y que es la mayor fuente de diversidad
del propio árbol de la vida. Indican también, que un ingrediente esencial de la evolución
es
la
variación
natural
entre
individuos,
por
lo
que
es
importante
el
entendimiento del surgimiento de esta variación así como de su distribución
geográfica. Stebbins (1999), agrega que la evolución es un proceso de dos pasos
que inicialmente requiere de variación genética dentro de poblaciones, así como el
moldeado de esta variación mediante la recombinación genética y la selección
natural; ninguna de las dos, la estructura genética de poblaciones ni el moldeado por
medio
de
la
selección
natural
es
dominante,
las
dos
situaciones
son
interdependientes y de igual importancia.
Teoría Sintética de la Evolución
Esta básicamente reconoce cinco tipos básicos de procesos a saber (Stebbins
1978, 1981, 1999; Soltis y Soltis 2000a):
A) Mutación génica,
B) Cambios en la estructura y número de cromosomas,
7
C) Recombinación génica
D) Selección natural y
E) Aislamiento reproductivo.
Las tres primeras causan la variabilidad genética sin la cual no pueden ocurrir
cambios. La selección natural y el aislamiento reproductivo dirigen las poblaciones de
organismos hacia diferentes canales adaptativos.
Tres procesos accesorios ejercen influencia sobre la operación de las cinco
causas básicas:
a) La migración de individuos de una población a otra.
b) La hibridación interracial de especies emparentadas aumentan la magnitud
de variabilidad genética disponible en una población.
c) Los efectos del azar, sobre poblaciones poco numerosas pueden alterar la
modalidad en que la selección natural dirige el curso de la evolución.
2.1.4 Especiación
La especiación puede definirse como la separación permanente de sistemas
poblacionales que migran de un sistema y que podrían ser una desventaja cuando se
incorporan a otro, dichas desventajas podrían ser prevenidas por la ausencia de
pareja
de
los
migrantes,
cuando
los
dos
sistemas
estuvieran
aislados
reproductivamente; también se puede considerar como el proceso que crea unidades
discretas de variación (taxa) y especialmente la formación de especies (Judd et al.,
1999).
El tipo de origen puede tener efectos sobre el tipo subsiguiente de variación
mostrado por la especie, así mismo en especies heterocigóticas equilibradas el
“crossing-over” también actuará, dando lugar a grandes mutaciones aparentes
(Huxley 1965; Holsinger 2000).
8
En :o que se refiere al modo de acción de la selección natural, las especies
pueden ser divididas en dos categorías contrapuestas: A) aquella donde la selección
natural nada tiene que ver con la evolución de los caracteres específicos básicos, y
actúa simplemente sobre las especies como tal, en competencia con sus afines;
abarca todas las especies en las que la divergencia de carácter es abrupta e inicial; y
B) aquellas formas en las que la modificación del carácter es gradual, en este caso la
selección natural puede, como demuestran los argumentos deductivos e inductivos,
desempeñar un papel en la producción de los caracteres de la especie y no solo
abarca todas las formas en las que la separación de grupos tiene lugar por
aislamiento geográfico, fisiológico o ecológico, sino también aquellas en las que la
separación inicial es genética y no implica diferenciación visible (Huxley 1965;
Stebbins 1978; Schaal y Olsen 2000).
Al parecer es inexistente razón a priori para que una sola especie no se
extienda sobre una amplia zona geográfica, variando de región a región, aunque
todas las variedades reales o potenciales formen parte de un grupo interfecundo, y
tampoco existe razón alguna a priori para que mas de una especie de la misma
familia o género se presente en mismo hábitat ecológico (Huxley 1965). El mismo
agrega, que sin embargo, en ninguno de los dos casos queda confirmada dicha
suposición, ya que numerosas especies se presentan sin que su existencia parezca
tener a primera vista, una razón o significación. Estudiando más a fondo el problema
vemos que esto depende de dos series de hechos, uno concerniente a la relación del
organismo con su medio, y el otro referente a su base genética (Simpson y Cracaft
1995). El medio sufre cambios que crean barreras entre una región y otra, de esta
forma el aislamiento de grupos que pertenecieron originalmente a la misma especie
quedan incomunicadas, de esta forma, el completo aislamiento permite diferencias,
unas por adaptación y otras casuales y sin utilidad, que se acumulan en cada uno de
los grupos, hasta que en muchos casos se transforman en nuevas especies (Huxley
1965; Schaal y Olsen 2000).
9
Posteriormente la base cromosómica de la herencia sufre accidentes, como
las inversiones, el intercambio segmentario, el hibridismo y la poliploidia, que mas
pronto o más tarde reducen o terminan por abolir los cruzamientos fecundos entre el
tipo nuevo y el viejo; de este modo gran número de nuevas especies esencialmente
semejantes a aquellas de las que surgieron llegan a ponerse en contacto, y las
nuevas y viejas especies rivalizan entre si en habitats idénticos o (muchas veces
como resultado de la emigración subsiguiente) en habitats que se superponen
(Huxley 1965, Holsinger 2000).
La formación de muchas especies geográficamente aisladas y la mayor parte
de las genéticamente aisladas carece, pues, de alcance sobre el proceso principal de
la evolución (Stebbins 1999). Este último consiste en el desarrollo de nuevos tipos
dotados de mecanismos de gran eficacia biológica, en radiación adaptativa de esos
tipos para valerse de todas las clases y medios y modos de vivir en la colonización
de nuevas regiones de la superficie del globo, en la obtención de nuevos recursos
para su explotación y en un más rápido desarrollo de los recursos obtenidos
(Stebbins 1999; Soltis y Soltis 2000a).
Los principales procesos de la evolución consisten, esencialmente en una
mayor extensión de las actividades vitales en nuevas áreas de eventos sustanciales,
en una explotación más intensa y en un progresivo aumento del control de la vida
sobre el medio, independizándose de él (Huxley 1965). Superpuestos a estos
procesos y teniendo poca o nula influencia sobre ellos, se hallan los procesos de
formación de las especies, tal como han sido descritos, y que son la consecuencia de
accidentes en el medio o en el mecanismo genético de la vida (Judd et al., 1999).
En gran parte la diversidad sistemática que se observa mínimamente en la
naturaleza carece de importancia para el curso principal de la evolución, y son solo
variedades superpuestas de un modelo más amplio; se puede comentar que aunque
es inevitable que la vida se divida en especies y que el amplio proceso de la
evolución opere con especies como unidades de organización, el número que se
10
necesita para esto es mucho menor que el número que realmente existe (Huxley
1965), comenta además, que la formación de especies constituye un aspecto de la
evolución pero una gran parte de ellas es en cierto sentido, un accidente, un
desenfreno biológico al azar, sin influencias sobre las direcciones esenciales y
continuas del proceso evolutivo.
2.1.5 Especiación y método sistemático
Huxley (1965), considera tres principales fases sobre la especiación en la
historia de la taxonomía moderna: base filosófica, fase darwinista (doctrina de la
descendencia con modificaciones) y el período mendeliano basado en la teoría de
citogenética de la herencia particularizada y mutación. Esta doctrina de fijeza de las
especies era en un aspecto la racionalización o reflexión, por la necesidad práctica
de identificar las plantas para fines medicinales; una vez aceptada se prestaba a la
fácil identificación. Si las especies son inmutables y constituyen entidades diferentes,
el principal objeto de la sistemática sería establecer una distinción entre ellas (Huxley
1965; Simpson y Cracaft 1995).
Al llegar la época .darwinista, todo cambió, la homología, en lugar de ser
esencialmente un término descriptivo que sólo significaba la particularización de un
plan arquetipo común, vino a ser un término explicativo que implicaba la intervención
de un plan general en la descendencia desde un antepasado común (Huxley 1965).
La base de la clasificación vino a ser en teoría al menos, filogenético, ya que el grado
de semejanza era tomado como índice de la intimidad del parentesco, y las
categorías taxonómicas fueron definidas suponiendo que cada una de ellas
representaba una rama de un orden superior o inferior en el árbol filogenético
(Huxley 1965; Stebbins 1978).
A comienzos del presente siglo, puede considerarse como un subperíodo,
caracterizado por el uso de distribución geográfica como un criterio taxonómico,
aparte de los caracteres morfológicos; esto también significó el abandono de los
11
últimos vestigios de un “linneismo” subconsciente, y la adopción de un esquema
completamente filogenético tanto en la sistemática major como en sistemática minor
(Huxley 1965; Weller y Sakai 1999; Crawford 2000).
Huxley (1965) considera que una clasificación basada sobre la idea de la
sucesión filogenética pertenece mas bien al campo de la especulación, salvo en
algunas líneas fósiles, ya que no se puede conocer el curso real de los sucesos en la
evolución de un grupo; comenta además, que en la mayor parte de los grupos el
único dato que poseemos para basar nuestro esquema de clasificación es el
referente a las especies, subespecies y variantes genotípicas que existen en la
actualidad, pues son los únicos grupos con existencia biológica concreta. Agrega
también que, lo que ahora sabemos acerca de los diferentes métodos para la
formación de nuevas especies y de los mecanismos genéticos y fisiológicos que
rigen su producción y mantenimiento nos permite observar el problema con mayor
claridad, y comenzamos a darnos cuenta de que será necesaria una nueva base para
la clasificación por lo que se refiere a la diversidad sistemática minor, aunque el
método filogenético continúe siendo aplicable a los grupos major (Huxiey 1965). Judd
et al (1999), por su parte consideran que la especiación usualmente requiere de
alguna separación geográfica entre sistemas de poblaciones que evite el flujo
genético, ya que la especiación alopátrica incluye la división de una especie en dos o
más poblaciones que divergen en aislamiento físico.
2.1.6 Conservación de la herencia
La herencia es una fuerza conservadora. En efecto, los genes desempeñan la
función de plantillas para la producción de réplicas exactas de sí mismos; al hacer
que la prole se parezca a sus progenitores, la herencia da estabilidad a los sistemas
biológicos. La evolución en cambio, es la antítesis de la inmutabilidad. Una definición
mas amplia de la evolución considera que “el estado actual de un sistema es
resultado de un cambio más o menos continuo del estado que tuvo originalmente”
12
(Lewontin 1968). Por su parte Dobzhansky (1975), agrega que si la herencia fuera
siempre perfecta, la evolución no tendría lugar.
La parte complementaria de la herencia es la variación, la cual tiene dos
aspectos, uno estático y otro dinámico (Dobzhansky 1975), añade además, que la
variación como calidad (variabilidad) es la diversidad observable entre individuos o
grupos dentro de una misma especie, o la diversidad entre especies distintas. La
variabilidad como proceso implica que el desarrollo de los individuos puede verse
modificado por influencias ambientales, y que la dotación hereditaria puede alterarse
mediante la recombinación de los genes o la mutación (Philiptschenko 1927;
Dobzhansky 1975). La selección natural darwiniana y la deriva genética al azar han
manipulado la evolución dé la enorme diversidad vegetal; el papel principal de la
variación heredada es la reproducción diferencial o selección natural (Judd et al.,
1999).
2.1.7 Fenotipo y genotipo
El fenotipo de un individuo es lo que en él puede descubrirse mediante la
observación, a saber: los elementos estructurales y las funciones de su organismo, o
sea lo que un ser viviente es para nuestros órganos de los sentidos sin que
recurramos a otros medios para estudiarlo (Dobzhansky 1975), por otra parte el
genotipo, en cambio, es la suma total de materiales hereditarios que un individuo
recibe de sus progenitores y otros antepasados. Al respecto Judd y colaboradores
(1999), consideran que todos los organismos desempeñan funciones por medio de
los mismos patrones metabólicos, y que hace que el ADN del genotipo registre la
información genética y transmita esta información (generalmente con algunas
variantes) para coordinar el desarrollo del fenotipo, que sería la parte externa de
todos los organismos. Su comentario final al respecto es que los mayores cambios
son generalmente registrados en los fenotipos.
13
2.1.8 Mutación
La fuente primaria de la diversidad orgánica es la mutación.
La teoría de la mutación afirma que las propiedades de los organismos están
integradas por unidades notoriamente distintas. Los grados intermedios, que tan
numerosos son entre las formas externas de plantas y animales, no existen entre
tales unidades como tampoco existen entre las moléculas de la química (Dobzhansky
1975), de tal forma que una mutación es, un cambio en uno o más genes. La
mutación y la recombinación genética proveen la variación requerida para el cambio
evolutivo; dicha mutación incluye cambios en el ADN, desde cambios en una simple
base hasta la adición en el genoma total (Judd et al., 1999).
2.1.9 Aislamiento reproductivo
El aislamiento de especies en el mismo grupo de organismos suele lograrse
por diferentes medios, de esta manera el aislamiento de una pareja dada de
especies fines puede ser el resultado de diversos mecanismos de aislamiento cuyos
efectos se refuerzan los unos a los otros Dobzhansky (1937). El mismo autor
propuso el nombre de “mecanismos fisiológicos de aislamiento” para designar en
general todas las causas, con excepción del aislamiento geográfico, que impide el
intercambio de genes entre las poblaciones. El término fisiológico en este contexto
fue causa de equívocos y tomando esto en cuenta, Mayr (1942) lo cambio por
"mecanismos de aislamiento reproductivo". Según Levin (1971), los mecanismos de
aislamiento reproductivo pueden clasificarse acorde a su tiempo de efecto durante su
reproducción.
Por lo que todo aislamiento reproductivo es resultado de diferencias genéticas
entre las poblaciones, en tanto que el aislamiento geográfico no se debe
necesariamente a esto mismo; el aislamiento de hábitat casi llena la brecha, pero
aún en este caso, el apego de las diferentes especies a habitats diferentes se debe
14
evidentemente a sus constituciones genéticas (Dobzhansky 1975; Mayr 1977; Judd
et al., 1999).
Complementando lo anotado anteriormente, según Singh (1999) y Judd et al.,
1999), agregan que los mecanismos de aislamiento pueden dividirse en dos grandes
categorías:
A. mecanismos precigóticos (anteriores a la formación del cigoto).
I. Mecanismos pre polinización
1. Aislamiento geográfico. Separadas geográficamente
2. Aislamiento ecológico. En mismas regiones geográficas, pero diferente
nicho.
3. Aislamiento estacional. Las flores abren en diferentes épocas.
4. Aislamiento temporal. Las flores abren a diferentes horas.
5. Aislamiento etológico. Tienen diferentes polinizadores.
6. Aislamiento mecánico. Entre especies cercanas, la polinización se previene
por diferentes estructuras de la flor.
II. Mecanismos post polinización
1. Aislamiento gametofítico. La polinización cruzada ocurre, pero el polen falla
en la germinación, o si germina, los gametos masculinos no alcanzan al
huevo dentro del saco embrional.
2. Aislamiento gamético. Dentro del huevo, la fusión gamética o endospérmica
puede no ocurrir.
B. Mecanismos post zigótico (posteriores a la formación del cigoto)
1. Incompatibilidad de la semilla (la semilla no se forma)
2. Inviabilidad híbrida. Los F1 mueren antes de florecer.
3. Esterilidad híbrida. El F1 no produce semillas viables
4. Esterilidad híbrida F2, los híbridos F2 mueren antes de florecer o las
semillas no germinan.
15
Se considera que estos conceptos son las bases para conocer el estado y la
relaciones genéticas de que guardan los organismos dentro una población o en una
comunidad, por lo que, como lo anota Llorente (1995), el hombre, ya sea
individualmente o en las sociedades que forma, ha tenido que reconocer su universo
biológico y describir sus similitudes y discontinuidades, a la vez que descubrir y
establecer las unidades, principios y leyes que subyacen en la variedad y el número
de los seres vivos. El mismo autor agrega que, de esta manera, se han formulado
arreglos clasificatorios que han permitido entender a los seres vivos; los fundamentos
que han servido a los taxónomos o naturalistas. de antaño para proponer
clasificaciones biológicas han variado a lo largo de la historia de la humanidad y de la
ciencia.
2.2 Sistemática
La sistemática es la rama de la biología que trata de detectar, describir y
explicar la diversidad biológica (Moritz y Hillis 1996; Martínez 1997). Los primeros
sistemas de clasificación como el de Linneo en 1735, consistían simplemente en
asignar jerarquías de manera que se pudiera recuperar la información. Los siguientes
sistemas utilizaron numerosos caracteres seleccionados a posteriori para producir
una clasificación llamada “natural”, como los desarrollados por Jussieu hacia finales
de 1700 (Martínez 1997). La teoría de Darwin sobre el origen de las especies ha
servido mas para explicar los patrones de similitud observados que para alterar las
clasificaciones existentes, sobre todo en las más recientes (filéticas) como las de
Engler y Prantl de 1887-1915 (Stuessy 1990; Martínez 1997). Por su parte Judd y
colaboradores (1999), consideran a la sistemática como la ciencia de la diversidad
organísmica; que incluye el descubrimiento, descripción e interpretación de la
diversidad biológica, así como a la síntesis de información sobre la diversidad en
forma de un sistema de clasificación predecible. Anderson et al (2002), agregan que
la taxonomía es la parte medular de la sistemática, que se encarga de la descripción
y clasificación formal de las cosas vivientes; los sistemáticos fueron de los primeros
en reconocer e interpretar patrones evolutivos significativos en la naturaleza.
16
En todos los sistemas de clasificación elaborados hasta mediados del siglo
XX, las decisiones se tomaron de manera intuitiva, arbitraria y sin criterios rigurosos,
por lo que Bremer y Wanntrop (1978), concluyeron que la clasificación filética no se
podía considerar ciencia, sino un arte altamente personal no reproducible. Esta
inconformidad con el análisis subjetivo de la información llevó al desarrollo de
métodos de análisis más rigurosos, la fenética, basada en similitud general (“overall
similarity”) obtenida por el análisis estadístico de un gran número de caracteres
(Stuessy 1990), y la cladística que reconstruye las genealogías de los organismos
para proponer su clasificación (Scotland 1992; Mayr 1974; Martínez 1997).
Las fuentes de información taxonómica hasta principios de los años cincuenta
fueron la toma directa de características morfológicas, anatómicas, embriológicas,
palinológicas y citológicas. A mediados de los cincuenta se inició la etapa
experimental de la sistemática, al incluirse el uso de la química secundaria para la
obtención de datos, sobre todo de flavonoides, en muchos trabajos de taxonomía
clásica (Martínez 1997). El uso de esta metodología se extendió hasta los años
ochenta (Crawford 1989). La popularidad de éstos métodos se basa en que cualquier
carácter utilizado para un análisis sistemático debe reflejar cambios genéticos
(Martínez 1997). Cada día se tiene más arraigo sobre la idea de que la clasificación
fundamental de los seres vivos es aquella que se conoce como evolutiva o
filogenética, lo que significa que las similitudes y diferencias entre los organismos
son un producto o consecuencia de las relaciones de ancestría o descendencia de
las poblaciones y especies a las que pertenecen (Llorente 1995).
2.3 Análisis fenéticos y taxonomía numérica
La taxonomía numérica es una rama desarrollada de la taxonomía, la cual
tiene un gran avance con el desarrollo de las computadoras. Este campo de estudio
es también conocido como taximetría (Rogers 1963), taxometría (Mayr 1966),
taxonomía matemática (Jardine y Sibson 1971), morfometría multivariada (Blackith y
Reyment 1971) y fenética. Los métodos modernos de taxonomía numérica tuvieron
17
sus inicios con las contribuciones de Sneath (1957), Michener y Sokal (1957), Sokal
y Michener (1958), los que culminaron con la publicación de “Principios de
taxonomía numérica” (Sokal y Sneath 1963), con una versión expandida y
actualizada “Taxonomía numérica” (Sneath y Sokal 1973).
De acuerdo con Singh (1999), en las recientes décadas se observó un fuerte
debate sobre la disponibilidad de las “técnicas empíricas” o “técnicas operacionales”
en estudios de sistemática. El mismo autor, considera que, la taxonomía empírica
forma clasificaciones sobre juicios taxonómicos basados en la observación de datos
y no en suposiciones, por otro lado la taxonomía operacional se basa en métodos
operacionales y experimentación para evaluar y observar datos, antes de una
clasificación final. El mismo Singh, agrega que la taxonomía numérica encuentra un
balance entre las dos, ya que es empírica y operacional. De tal manera que la
taxonomía numérica no produce nuevos datos o un nuevo sistema de clasificación,
sino que más bien es un nuevo método de organizar dichos datos que pudieran
ayudar en un mejor entendimiento de sus relaciones; y las clasificaciones especiales
se basan en uno o algunos caracteres, o sobre un juego de datos, por último
comenta que la taxonomía numérica busca la base de la clasificación sobre un gran
número de caracteres de muchos juegos de datos en un esfuerzo por producir una
clasificacicn fenética completa de máxima predicción (Singh 1999).
Además añade que, la metodología de la taxonomía numérica incluye la
selección de unidades operacionales (poblaciones, especies, géneros, etc., de las
cuales se reúne información) y caracteres; la información de estos es registrada y la
similaridad (y/o distancia) entre unidades determinadas usando varias fórmulas
estadísticas, y agrega que, los análisis finales incluyen la comparación de datos de
similaridad y la construcción de diagramas o modelos, los que brindan un resumen
del análisis de los datos. Estos modelos o diagramas son usados para una síntesis
final y un mejor entendimiento de las relaciones.
18
Singh (1999), tambien menciona, que las mayores ventajas de la taxonomía
numérica sobre la taxonomía convencional incluyen: (1) poder para integrar datos de
una
gran
variedad
de
fuentes,
como
la
morfología,
fisiología,
fitoquímica,
embriología, anatomía, palinología, cromosómica, ultraestructuras, micromorfología y
molecular; (2) automatización considerable del procesamiento de datos; (3) datos
codificados
en
forma
numérica
que
pueden
integrarse
con
sistemas
de
procesamiento de datos en varias instituciones, que pueden usarse en la descripción
de claves, catálogos, mapas y otros documentos; (4) los métodos son cuantitativos,
dando discriminación a lo largo del espectro de diferencias taxonómicas, y poder
brindar mejores clasificaciones y claves; (5) la creación de datos explícitos en tablas
necesarias en la taxonomía numérica, mediante el uso de más y mejores caracteres
descritos, lo que necesariamente mejorará una taxonomía convencional; (6) la
aplicación de la taxonomía numérica propone preguntas recientes concernientes a la
clasificación
e
inicia
los
esfuerzos
para
la
reexaminación
de
sistemas
de
clasificación; (7) un número de conceptos biológicos y evolutivos han sido
reinterpretados, por lo se introduce un interés renovado en la investigación biológica.
2.4 Filogenia y sistemática molecular
La filogenia puede ser definida como las relaciones históricas entre linajes de
organismos y sus componentes (por ejemplo los genes) (Hillis et al., 1996). Existen
dos principales componentes de la filogenia: la cladogénesis, que es el patrón de
ramificación de la filogenia, y la anagénesis que es el grado de divergencia y la
cantidad de cambio evolutivo que ocurre entre los puntos de ramificación expresados
como la cantidad total de cambio evolutivo dentro de linajes ( a lo largo de diferentes
ramas del filograma). Así la filogenia es algo más que sólo la secuencia de
ramificaciones. El escenario filogenético, incluye el grado de divergencia y cantidad
de cambios evolutivos seguido de las ramificaciones, por lo tanto requiere de ambos
análisis, cladísticos y anagenéticos (Takhtajan 1997).
19
Un punto de desacuerdo es el uso de las filogenias obtenidas. La mayoría de
los autores usan estas filogenias de una u otra forma para tomar decisiones
taxonómicas y construir una clasificación (Nelson 1973; Wiley 1980), pero otros
autores sostienen que la clasificación y la reconstrucción filogenética son actividades
separadas y complementarias que deben mantenerse así (Felsenstein 1984; Mayr
1981). Dowling y colaboradores (1996), señalan que las filogenias obtenidas son de
las moléculas, que pueden diferir de la de los organismos debido, entre otras cosas,
a introgresiones y conversiones de genes.
Los estudios filogenéticos incluyen dos tipos básicos de datos del ADN:
cambios en el contenido u orden del genoma y la substitución de nucleótidos
(Downie y Palmer 1992), o como lo interpretan Hillis y colaboradores (1994),
fragmentos de restricción y secuencia del ADN. La variación a nivel del ADN puede
observarse directamente por la secuencia del ADN o del ARN, o directamente por la
observación de los polimorfismos detectados con alguna de las endonucleasas de
restricción
que
comercialmente
están
disponibles,
las
cuales
son
empleadas
comúnmente en la técnica de polimorfismos en la longitud de fragmentos de
restricción (RFLP) (Doyle 1993). La eficacia sistemática será mayor si el carácter
utilizado no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, por lo que el
uso directo del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales
para una clasificación (Crawford 1990; Clegg y Durbin 1990), con la ventaja adicional
de que el número de datos que se pueden obtener está limitado solo por el tamaño
del genoma (Hillis 1987).
El uso de marcadores moleculáres para resolver problemas taxonómicos en
plantas se inició en la década de los cincuenta con las isoenzimas (Market y Moller
1959), ya en los setenta fue la electroforésis de enzimas (Gottlieb 1971), y hacia los
ochenta las técnicas de manipulación y análisis habían avanzado lo suficiente como
para poder estudiar la variación del ADN y ARN (Moritz y Hillis 1996). Las tres
grandes áreas de aplicación de la sistemática molecular son en la estructura genética
de poblaciones (como variación geográfica, heterogocidad), delimitación de especies
20
(incluyendo
híbridos)
e
inferencia
filogenética
(Baverstock
y
Moritz
1996).
Actualmente el uso de estos marcadores se ha vuelto tan común, que de 71 trabajos
publicados en la revista Systematic Botany en 1994 y 1995, el 52% incluían técnicas
moleculares (Martínez 1997).
Las técnicas moleculares que se han usado para resolver problemas
taxonómicos en plantas son la secuencia de :aminoácidos, serología, hibridación
ADN-ADN, electroforésis de énzimas, cambios en sitios de restricción y secuencia de
ácidos nucleicos. Las dos primeras han tenido un impacto marginal debido a
problemas de técnica o interpretación (Martínez 1997).
El contenido y orden de genes es muy estable en las plantas, y se ha
demostrado que la tasa de cambio evolutivo en la molécula es apropiada para
estudios filogenéticos prácticamente a cualquier nivel taxonómico (Palmer 1986;
1987; Palmer et al., 1988). El ADN del cloroplasto por su tamaño relativamente
pequeño y naturaleza conservadora lo hace una molécula ideal, ya que es fácil de
manipular, y analizar con diferentes técnicas (endonucleasas restrictivas, secuencia
genética). Además este genoma se presenta en múltiples copias por ende su
aislamiento del tejido fotosintético es relativamente sencillo y requiere pocas
cantidades
de
tejido
(Wallace
1995;
Cota
y
Wallace
1996).
En
la
familia
Crassulaceae se realizó el análisis filogenético del ADN del cloroplasto usando la
variación de sitios de restricción. (Ham 1994, 1995, Ham et al., 1994, Ham y’t Hart,
1998).
Tipos de marcadores y sus usos
Se
puede
definir
como
“marcador”
(biológico)
cualquier
característica
heredable que nos permita estudiar la diversidad biológica; hasta hace unos cuantos
años
la
mayoría
de
los
"marcadores"
que
se
utilizaban,
eran
marcadores
morfológicos (fenotípicos), posteriormente con el advenimiento de las técnicas de
estudio
de
material
genético
(ADN)
que
se
han
desarrollado
a
partir
del
descubrimiento de su estructura en 1953, y en forma explosiva durante la última
21
década con las modernas técnicas de biología molecular, la tendencia actual es el
estudio de la diversidad y variabilidad del material genético mismo y no de su
expresión fenotípica (Avise 1994).
El mismo autor afirma que, los marcadores genotípicos son aquellos que se
refieren a diferencias en la información genética misma, y no en su expresión como
sucede con los marcadores fenotípicos, y que estos se pueden dividir en dos tipos:
1) Secuencias de un gen o una región en particular (secuencias de ADN
mitocondrial, del cloroplasto y en general para cualquier gen o genes para los
cuales conocemos su secuencia.
2) Polimorfismos en tamaños de fragmentos (marcadores de ADN que no se
basan en diferencia de secuencia, por Ej. RFLP, RAPD, AFLP y polimorfismos
en secuencias repetidas como mini o microsatélites).
El mismo Avise (1994) señala, que las secuencias de genes funcionales están
sujetas a una fuerte selección natural, teniendo relativamente pocos “grados de
libertad” (bases que pueden variar sin alterar la función del gen y resultar letales); por
tanto
las
diferencias
en
las
secuencias
de
genes
funcionales
evolucionan
“lentamente”; sirven por tanto para estudiar la filogenia de grupos taxonómicos
bastante separados (casi en todos los casos, mas alejados que género), y que por
otro lado, los polimorfismos en la longitud de secuencias homólogas de ADN son
extremadamente útiles en el estudio de la diversidad genética intraespecífica, ya sea
desde el punto de vista de poblaciones o también muestreando individuos
representativos de diferentes poblaciones.
Los objetivos de los métodos de análisis de la diversidad pueden ser
considerados de dos tipos: a) para inferir el árbol filogenético de los individuos
estudiados; b) para inferir el parecido genético (o relación) entre individuos
estudiados; por lo que considera que, el objetivo será filogenético cuando se está
22
trabajando
con
individuos
representativos
de
especies
muy
diferentes,
reconstruyendo el árbol evolutivo de los individuos (Avise 1994). En cambio si se
está trabajando con poblaciones de la misma especie, de especies relacionadas o
individuos representativos de poblaciones de la misma especie, entonces en la
mayoría de los casos el objetivo será la caracterización de las poblaciones y el
estudio de la variabilidad dentro de ellas (Hillis et al., 2000).
2.4.1 Enzimas de restricción
Dowling y colaboradores (1996), consideran que las enzimas de restricción
son endonucleasas tipo II (secuencias definidas) producidas por bacterias como
mecanismo de defensa contra ADN extraño, y que cada enzima corta la doble
cadena de ADN en un sitio de reconocimiento :específico y simétrico, ya que es el
mismo si se lee a partir de la'porción 5’ o de la 3’ de cada cadena; dependiendo de
donde corte, pueden quedar porciones colgantes en la cadena 5’, en la 3’, o en
ninguna, y esta simetría permite que la cadena se vuelva a unir.
Bult y Zimmer (1993), comentan que las enzimas pueden cortar ADN ya sea
de origen nuclear o de organelos, aunque el ADN mitocondrial no se usa en
sistemática vegetal; agregan que, debido a los frecuentes rearreglos en el ADN
nuclear; la porción más usada es el ADN ribosomal, que se puede usar a muy
diferentes niveles taxonómicos en virtud de que los genes que codifican para los
fragmentos 18S y 25S son poco variables, mientras que los espaciadores
(transcritos) son variables en mayor proporción. Una de las limitantes es que el ADN
ribosomal está metilado, es decir tiene un grupo metilo en su molécula, por lo que
existen pocas enzimas que lo corten (Bogler y Simpson 1995). Otra limitante es la de
analizar solamente una región muy específica del genoma (comunicación personal,
J. Simpson enero, del 2003).
Por su parte Jansen y colaboradores (1998), considera que existen dos
métodos para interpretar datos de enzimas de restricción: por la presencia o
ausencia de cada fragmento o de sitio de restricción, por lo que las diferencias en los
23
fragmentos de restricción pueden presentarse como substitución, supresión o
inserción de nucleótidos. Los mismo autores agregan que, los mapeos de sitios de
restricción distinguen dos tipos de cambios entre uno y otro, ya que si se compara un
taxon muy relacionado con otro, a un nivel bajo de secuencia y divergencia (< 1.0%),
es posible que se interpreten adecuadamente los cambios de sitios de restricción por
cada inspección de patrones, o de fragmentos del patrón. A mayores niveles la
divergencia es esencial para mapear los sitios de restricción y la substitución de
bases
(inserción/supresión),
para
hacer
una
acertada
determinación
de
los
caracteres de homología en comparaciones filogenéticas (Jansen et al., 1998).
Los mismos autores consideran, que en virtud de que el mapeo de sitios de
restricción claramente consume más tiempo que la interpretación de datos de los
fragmentos, éstos deben ser más completos en comparación con genomas a
mayores niveles de diversidad de secuencias (> 1.0%), en la obtención de árboles
genéticos confiables. Una de las ventajas es que mediante el uso de un mayor
número de enzimas, el análisis de datos de sitios de restricción puede mostrar mayor
diversidad de secuencias que la misma secuenciación del ADN (Jansen et al., 1998).
Dos estudios recientes (Cummings et al., 1995, Hillis et al., 1994) sugieren que
con el análisis en sitios específicos a lo largo del genoma, es más factible obtener la
información completa de un genoma entero, ó una correcta filogenia; que con la de
los sitos contiguos.
Jansen et al (1998) consideran que dentro de las limitaciones sobre el uso de
sitios de restricción, están: 1) que dicha técnica generalmente requiere de altas
cantidades de ADN purificado; mientras que el ADN para de secuenciación requiere
pequeñas cantidades de ADN aislado de ejemplares de herbario o material fósil, 2)
para el estudio de secuencia, el ADN de diferentes laboratorios se combina más
fácilmente, mientras que no ocurre esto en el caso de datos de sitios de restricción,
la combinación de secuencias rbcL de varios laboratorios es un excelente ejemplo
(Chase et al., 1993). Limitaciones complementarias serian, 3) se sospecha que existe
más ambigüedad acerca del carácter homólogo en los datos de los sitios de
24
restricción, que en !a secuenciación del ADN, y 4) los datos de sitios de restricción
no son considerados para la comparación sobre evolución molecular, como las
secuencias del ADN; finalmente concluyen que el conocimiento de la actual
secuencia de nucleátidos permite comparaciones más exactas de los patrones y
rangos de la secuencia evolutiva.
Por lo que, hasta ahora se recomienda que los análisis de sitios de restricción
continúen usándose para estudios filogenéticos en plantas, especialmente a bajos
niveles taxonómicos donde el valor de divergencia es bastante baja (usualmente
< 1 %) en los cuales los sitios de mapeo no son necesarios (Jansen et al., 1998).
2.4.2
Polimorfismos
en
la
Longitud
de
los
Fragmentos
Amplificados
Una de las técnicas moleculares más nuevas es la del AFLP o polimorfismos
en la longitud de los fragmentos amplificados. La metodología de dicha técnica fue
desarrollada por Marc Zabeau para la Compañía Dutch Keygene y publicada por
primera vez por Vos y colaboradores (1995). El procedimiento esta basado en la
amplificación selectiva de fragmento restringido, usando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los polimorfismos detectados son de hecho cambios en, o cerca
de los sitios de restricción (Simpson 1997ª, Simpson et al., 1999).
El método AFLP es una combinación de RFLP con PCR ya que en este caso
la amplificación de la reacción es realizada usando iniciadores específicos para sitios
con enzimas de restricción. Como en el caso de los RFLP’s los polimorfismos
observados son debidos a mutaciones o a sitios cercanos con enzimas de
restricción. Los RAPD, DAF (huella digital amplificada del DNA) y AFLP son
marcadores moleculares multi-locus (Simpson 1997b, Simpson et al., 1999). Los
datos AFLP se obtienen de marcadores genéticos producto de una combinación del
ADN digerido con enzimas de restricción, y la ligación de las secuencias de
nucleótidos específicos enlazados en los extremos por los fragmentos de restricción,
25
seguidos por dos rondas de amplificaciones en la PCR usando iniciadores
etiquetados con base .en las secuencias enlazadas (Vos et al., 1995; Wolfe y Liston
1998).
Simpson (1997ª) y Simpson et al (1999), consideran, que en otras palabras, la
técnica consiste en la digestión del ADN genómico completo usando dos enzimas de
restricción, generalmente las más usadas son EcoRI y Msel, al final de los sitios de
restricción se usan adaptadores moleculares adhesivos y entonces se ligan a los
fragmentos digeridos para producir fragmentos de ADN genómico bordeados por
adaptadores
de
secuencias
especificas.
Los
mismos
autores
agregan
que,
subsecuentemente, dos reacciones de amplificación PCR son llevadas a cabo; en
que los oligonucleótidos usados en la primera amplificación corresponden a los
adaptadores moleculares más un nucleótido extra interno al fragmento, finalmente el
resultado de esta amplificación son sólo fragmentos con el nucleótido extra, seguido
directamente por los sitios de restricción que pueden ser amplificados; se asume que
el 25 % de todos los posibles fragmentos están en igual probabilidad que A, C, T, y G
seguido en cada sitio. Una alícuota de esta primera reacción de amplificación es
tomada para experimentar la segunda amplificación (Simpson 1997ª). El mismo autor
comenta que en la segunda reacción se usan tres nucleótidos seleccionados (ANN),
lo que significa que sólo fragmentos con esta combinación en particular de 6
nucleótidos adyacentes a los sitios de restricción deben ser amplificados. Uno de los
oligonucleótidos en la amplificación de la segunda reacción (normalmente el
homólogo al hexa-cortador), es etiquetado radiactivamente, lo subsecuente es la
separación de los fragmentos amplificados sobre geles de secuenciación de
poliacrylamida, las bandas pueden ser detectadas por auto-radiografía o detección
fluorescente (Simpson 1997ª; Simpson et al., 1999).
Normalmente en el caso del ADN genómico de plantas bajo estas condiciones
de amplificación, se observan 50-100 bandas por muestra (Simpson 1997ª). La
selección ocurre en diferentes niveles, produciéndose tres tipos de fragmentos en la
digestión de original: ECORI-ECORI, EcoRl-Msel y Msel-Msel; en general, los
26
fragmentos EcoRl-EcoRl podrían ser. mas largos que EcoRl-Msel o Msel-Msel y
muchos podrían estar disponibles para entrar a la secuencia en el gel o engañar la
capacidad de las reacciones de la amplificación PCR (Simpson 1997ª, Simpson et
al., 1999). Vos y colaboradores (1995), sugieren que los fragmentos Msel-Msel están
pobremente amplificados debido a la formación de estructuras parecidas a un
“ganchillo”.
Los fragmentos podrían también estar sin detectar al final del análisis desde
que el oligonucleótido específico EcoRl está etiquetado, por lo que sólo fragmentos
cortos EcoRl-EcoRl o EcoRl-Msel podrían ser detectados; este tamaño de fragmento
de selección es combinado con el uso de bases específicas seleccionadas como se
menciona anteriormente, para producir un número de bandas las que son fácilmente
separadas y analizadas en una secuencia de geles (Simpson 1997ª). La posibilidad
de usar diferentes combinaciones de oligonucleótidos selectos en cada sitio de
restricción y también el uso de diferentes enzimas de restricción hacen de la técnica
AFLP poderosa en la detección de polimorfismos a lo largo del genoma (Vos et al.,
1995). Pequeñas variantes al protocolo de Vos y colaboradores se han propuesto,
entre éstas, la de Reineke y Karlovsky (2000), en que remplazan el iniciador
etiquetado por la incorporación de nucleótidos α -etiquetados durante el PCR; o la
detección por medio de quimioluminiscencia (Lin et al., 1997).
Las bandas observadas sobre los geles de AFLP son clasificadas como
presentes o ausentes en cada individuo y el método es más comúnmente usado
como un sistema dominante/recesivo (Simpson 1997ª). Sin embargo van Eck et al.,
(1995) han hecho habitual el uso de este método como un sistema codominante por
comparación de intensidades de bandas en orden para determinar heterocigotos.
Aunque los AFLP’s teniendo rasgos en común con los marcadores polimórficos
amplificados al azar (RAPD’s) son mucho más reproducibles debido al uso de largos
oligonucleótidos iniciadores que son 100% homólogos con el sitio objeto, permitiendo
así las condiciones para el uso de amplificaciones estringentes (Simpson 1997ª). El
mismo autor y colaboradores (1999), consideran que, la principal ventaja de los
27
AFLP's es la capacidad de analizar muchos loci de manera simultánea del genoma
total y rápidamente calificar gran número de marcadores; sin embargo agregan, que
aunque actualmente es necesario equipo sofisticado y/o radiactivo para llevar a cabo
los análisis AFLP, el método puede ser fácilmente automatizado por el alto
rendimiento
de
muestras
producidas.
Las
marcas
fluorescentes
o
quimioluminiscentes están reemplazando a las radiactivas, y él número de puntos de
datos producidos en un corto tiempo exceden los costos (Vaillancourt et al., 1992;
Huang y Sun 1999).
Aplicaciones
El análisis de la variación genética con marcadores de polimorfismo en la
longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), consiste en el uso combinado con
PCR (reacción en cadena de la polimerasa), donde la amplificación permite la
detección de polimorfismos genómicos en los fragmentos de restricción. Los
marcadores tipo AFLP han demostrado ser útiles para evaluar diferencias genéticas
entre individuos, poblaciones, incluyendo linajes independientes, dentro de especies
(Mueller y Wolfenbarger, 1999), así como para el análisis de las relaciones entre especies,
estudio de la diversidad genética y pedigrí, relaciones genéticas y estudios
de variación, caracterización de genotipos, entre otros (Caicedo et al., 1999; Bai et
al., 1999; Barret et al., 1998; Lombard et al., 2000; Saunders et al., 2001; Massa et
al., 2001; Shaun et al., 2000; Miyashita et al., 1999; Cervera et al., 2001; Schaal y
Olsen 2000; Koopman et al., 2001).
La técnica AFLP tiene muchas aplicaciones actualmente, y además de mapeo
y huella digital se usa en diferentes formas para estudios de expresión de RNA, así
como para la detección de la metilación en cambios del estado de desarrollo de
organismos (Reyna-López et al., 1997, en Simpson 1997a). También han sido
usados en un amplio rango de taxa, incluyendo plantas, hongos, animales y
bacterias,
para
cercanamente
resolver
relacionadas
problemas
en
que
de
variación
ha
sido
28
genética,
imposible
o
resolver
de
especies
con
datos
morfológicos, o con otro tipo de caracteres moleculares sistemáticos (Heun et al.,
1997; Russell et al., 1997).
Los marcadores multi-locus brindan información rápida del genoma sobre
distintos
individuos,
debido
a
esto
dichos
marcadores
son
escogidos
para
discriminación en materia legal en cuanto a estudios filogenéticos (Lin y Kuo 1996).
Los AFLP han sido usados para inferir relaciones filogenéticas basadas en medidas
de disimilaridad genéticas en especies cercanamente relacionadas (Sharma et al.,
1996; Huys et al., 1996; Hill et al., 1996; Tohme et al., 1996; Heun et al,1997; Keim
et al., 1997; Yee et al., 1999; Angiolillo et al., 1999; Hansen et al., 1999; Mace et al.,
1999a, Ibid. 1999b; Roldán-Ruiz et al., 2000; Loh et al., 2000a); en relaciones
intergenéricas e interespecíficas (Loh et al.,
2000b;
Xu
et
al.,
2000;
Van
Huylenbroeck et al., 2000; Saunders et al., 2001); relaciones filogenéticas entre
especies (Aggarwal et al., 1999); estudios filogenéticos en varios organismos
incluyendo plantas, bacterias (Lin et al., 1997; Aggarwal et al., 1999), y hongos
(Majer et al., 1996).
Los AFLP también son usados en el agrupamiento de linajes cercanos
relacionados en el examen de la biodiversidad (Karp et al., 1996; Sharma et al.,
1996; Lerceteau y Szmidt 1999), evaluando la diversidad genética (Yee et al., 1999;
Xu et al., 2000; Barret et al., 1998; Lombard et al., 2000); para el mapeo del genoma
y/o desarrollo de plantas, genes marcados (se revisaron más de 20 trabajos al
respecto).
La técnica AFLP presenta potencial para el estudio de poblaciones donde es
importante el monitoreo a escala fina del genotipo de individuos (Travis et al., 1996;
Teulat et al., 2000). Se ha demostrado la eficiencia de la técnica AFLP en la
caracterización de germoplasma (coto-Yamamoto 2000), de ecotipos (Miyashita et al
1999; Shaun et al., 2000). Esta técnica también ha sido usada en estudios genéticos
de poblaciones para caracterizar poblaciones ,naturales de antracnosis del frijol,
29
patógeno en México donde tiene una fuerte correlación entre la estructura clonal de
la población y la distribución geográfica observada (González et al., 1998).
Se ha propuesto que los AFLP's podrían ser usados para saturar la región en
un gene de interés y así producir enlaces marcados muy cercanos (Tanksley et al.,
1995), así como en la construcción primaria de mapeo genético y distancias entre
marcadores, las cuales son de mejor resolución en comparación con los RAPDs,
RFLP y SSR (Van Deer Lee et al., 1997; Miyashita et al., 1999). Cuando se añade la
efectividad en el mapeo genético, los marcadores AFLP tienen gran capacidad de
extensión al cubrir totalmente el genoma y disminuir la distancia media entre distintos
marcadores (Cervera et al., 1996b). Por lo que, se considera que los AFLPs están
surgiendo como marcadores adicionales en la elección de mapeo genético para
incrementar los ya existentes RFLP y RAPD (Mueller y Wolfenbarger, 1999). De igual
forma Innan y colaboradores (1999) presentan un método de estimación de la
diversidad del nucleótido en base a los AFLP. Hedren y colaboradores (2001), los
consideran útiles en el estudio detallado de poliploidía y evolución en la familia
Orchidaceae.
Ventajas y limitantes de los AFLP
Las ventajas de la técnica incluye: (1) No se requiere información a priori de
secuencias para el análisis de AFLP; (2) Se detectan un gran número de bandas
polimórficas;
estandarizados
(3)
La
técnica
disponibles;
(4)
es
altamente
Las
reproducible
amplificaciones
AFLP
existiendo
son
paquetes
dirigidas
bajo
condiciones de alta selectividad (alta estringencia), “mostrando casi una perfecta
replicabilidad” (Wolfe y Liston 1998; Mueller y Wolfenbarger 1999). Por ejemplo
la mayoría de las aplicaciones basadas en PCR incluyen sólo una ronda de
amplificaciones, esta técnica requiere dos. (5) Los análisis AFLP requieren pequeñas
cantidades de ADN, pudiendo las muestras estar parcialmente degradadas; (6) Este
tipo de marcadores pueden ser generados a gran velocidad; (7) Estos pueden
segregarse en una moda mendeliana y pueden ser usados para poblaciones
genéticas y análisis tipo QTL; (8) El nivel de resolución puede ser llevado a cabo
30
desde la electroforésis del gel de agarosa, en el gel de acrilamida o con el auxilio de
mecanismos automatizados (Mueller y Wolfenbarger 1999).
Las limitantes incluyen el número de pasos requeridos para la producción de
resultados, asimismo la mayoría de otros métodos basados en PCR pueden usar
geles de agarosa para llevar a cabo la electroforésis y teñidos con Bromuro de Etidio.
Costos adicionales y/o como las enzimas de restricción para el ADN total y ligación
de enlaces requieren la compra de enzimas y licencia del paquete. Adicionalmente la
separación de fragmentos radioetiquetados necesita del uso de electroforésis en
geles de poliacrilamida en un aparato secuenciador del gel o tener acceso a un
secuenciador automatizado para fragmentos etiquetados radiactivamente (Wolfe y
Liston 1998). Una limitante adicional, para el uso de las técnicas moleculares es que
en nuestro país su costo es mayor, comparada con las técnicas tradicionales
(Martínez 1997).
2.5
Supuestos
biológicos
y
estadísticos
sobre
los
marcadores
moleculares
2.5.1 Homología de los fragmentos
En el caso de los RFLP, RAPD, AFLP y otros sistemas parecidos, se asume
que los fragmentos comigrantes son homólogos; es decir que si se tienen bandas
que se observan en la misma posición de un gel en dos muestras (individuos)
diferentes, entonces estos fragmentos pertenecen al mismo locus, en el sentido de
estar exactamente en la misma posición en los cromosomas de los individuos
estudiados (Arnold y Emms 1998), por lo que se supone que la secuencia de dichos
fragmentos es idéntica. Se considera importante la utilización de este tipo de
marcadores sólo en especies fuertemente relacionadas, con tiempos muy cortos de
divergencia (microevolución) o bien en especies muy relacionadas (Hillis et al.,
1996).
31
2.5.2 Neutralidad de los alelos
Otro
supuesto
es
que
los
diferentes
fragmentos
muestreados
son
selectivamente neutros; es decir que no confieren al portador ni ventaja ni desventaja
para su sobrevivencia (Hillis et al., 1996). Estos mismos autores consideran que, una
gran cantidad del ADN de los organismos no codifica directamente; es decir que no
porta información, por lo que este tipo de ADN es selectivamente neutro y es el tipo
de cadena que presentará mayor polimorfismo, puesto que esta libre de variar y
cualquier mutación que ocurra se puede perpetuar sin estar sujeta a selección.
Independencia de los Fragmentos
La
independencia
probabilística
de
dos
eventos
se
refiere
a
que
la
probabilidad de que dos eventos sucedan al unísono es un producto de la
probabilidades individuales; es decir si los dos eventos son “A” y “B”, serán
independientes si P [AB]= P [A] P [BI, o dicho de otra forma, si el hecho de que un
evento haya ocurrido no afecta la probabilidad de que ocurra en el otro (Everit 1993).
Desde el punto de vista de los marcadores éstos serán independientes si y sólo si: 1)
están situados en diferentes cromosomas (de otra manera, los marcadores “ligados”
en el mismo cromosoma tenderán a heredarse juntos); 2) La (s) población (es) se
encuentra(n) en equilibrio Hardy-Weinberg; es decir, no hay mutación, migración,
selección ni deriva génica (Everit 1993; Hillis et al., 1996).
El proceso de especiación (generación de nuevas especies) fue concebido
como algo gradual acorde con la teoría darwinista, en consecuencia existió un
continuo de especies incipientes que era más fácil diferenciar por métodos
matemáticos, según los seguidores de Adanson (Llorente 1995). El mismo autor
anota que, la práctica era interpretar ciertas diferencias morfológicas en términos de
discontinuidad
reproductiva,
entonces
las
medidas
cuantitativas
y
métricas
propuestas constituían una alternativa, y en vez de especies hablaban de unidades
taxonómicas operacionales, con su acrónimo: OTU’s; y concluye que, con las
32
especies biológicas no podían operar y consideraban que las prácticas subjetivas y
arbitrarias en su reconocimiento prohibían su uso en la taxonomía numérica.
2.6 Unidades operacionales taxonómicas (OTUs)
El primer paso en el análisis numérico incluye la selección de Unidades
Taxonómicas Operacionales (OTUs), que son muestras de las cuales se registrarán
los datos. Aunque sería ideal seleccionar individuos de una población como OTUs,
consideraciones prácticas hacen necesario seleccionar los miembros dei rango
inferior como OTUs. Así los OTUs para el análisis de especies podrían ser varias
poblaciones, para el estudio de un género podrían ser las diferentes especies, y para
una familia podrían ser los diferentes géneros. Esto no sería aconsejable, sin
embargo, para el uso de géneros y rangos superiores como OTUs la mayoría de
caracteres podrían mostrar variación de una especie a otra y de esta manera no
sería apropiado para comparación. La solución práctica podría ser el uso de un
representante de cada taxon. Por ejemplo si una familia va a ser analizada y sus
géneros comparados, los datos de una especie representativa de cada género
pueden ser usados para el análisis (Singh 1999).
El mismo autor agrega que la enorme cantidad de datos que generalmente se
maneja en estudios numéricos hacen esencial el uso de la computadora, por lo que
los caracteres mas adecuados para su manejo son de dos-estados (binario ó
presencia-ausencia). Los dos estados ó caracteres binarios son mejor codificados
como 0 y 1 para dos estados alternos; como una codificación es manejada muy
eficientemente por computadoras, los datos codificados pueden ser inscritos en
forma de una matriz con t números de hileras (OTUs) y n número de columnas
(caracteres) con la dimensión de la matriz (y el número de atributos) siendo t x n
(Singh 1999); por lo que, una vez que se han codificado los datos y asentados en
forma de una matriz, el próximo paso es calcular el grado de parecido entre cada par
de OTUs. Dicho autor finalmente anota, que un gran número de fórmulas han sido
33
propuestas para calcular la disimilaridad o similaridad (distancia taxonómica) entre
las OTUs
2.6.1 Medidas de similaridad genética
Una disimilaridad entre dos OTUs es una estimación cuantitativa sobre que
tan divergente son las OTUs (Singh 1999). Las unidades de disimilaridad dependen
de la naturaleza del resumen de la información molecular (Avise 1994). La medida de
disimilaridad genética varía entre cero (para OTUs cercanamente relacionadas) a
uno (Nei 1987). Para cada OTU corresponde una línea en el gel de electroforésis, se
pueden tener n números, cero es la banda ausente y uno la banda presente. Para
medir la disimilaridad genética entre dos OTUs es necesario comparar los patrones
de sus bandas. Patrones similares indican que los individuos están genéticamente
cercanos, por otro lado patrones disimilares indican divergencia genética. Se puede
medir la disimilaridad genética entre OTUs como el número de discrepancias (0,1 ó
1,0) dividido entre el número de comparaciones (bandas) (Weir 1996; Simpson et al.,
1999).
Los mismos autores, así como Weir (1996), consideran que la disimilaridad
genética es perceptible, ya que en los datos de los AFLP amplificados para un
número de bandas dado en dos OTUs, así como la ausencia de amplificación indican
homología a nivel del ADN, al menos en los sitios reconocidos por las enzimas, y
agregan que, de esta manera la disimilaridad entre OTUs, A y B pueden estimarse
por medio de la siguiente formula: D(A, B)= ( ∑ | Ai - Bi | ) / n; donde Ai y Bi,
i=1,2,...n; son los códigos numéricos para la lectura en la banda i, y el símbolo “| |“
denotan los valores absolutos.
Everit (1993) y Singh (1999), anotan que, la estimación de la disimilaridad
entre dos OTUs es determinada, como la suma de los valores absolutos de las
diferencias dividida entre el número de bandas comparadas, y que esta medida de
diversidad genética, es llamada en estadística “parejas simples” (“simple matching”)
34
o disimilaridad “Manhattan”. Si se tienen k OTUs, las medidas de diversidad genética
entre éstas pueden ser escritas en una tabla k por k o una matriz (Singh 1999). Esta
matriz deba ser simétrica, con ceros en la diagonal principal (Simpson et al, 1999), y
agregan que, al comparar un par de patrones de bandeo AFLP de dos individuos, el
cuestionamiento es ¿que tan similares. son? o equivalentemente ¿que tan diferentes
(disimilares) son?; por lo que es necesario dar una respuesta numérica, existen
varias
formas
de
hacerlo,
resumiéndose
en
un
coeficiente
de
similaridad
o disimilaridad.
Los coeficientes de similaridad según, Everit (1993) y Sneath y Sokal (1973) son de
tres tipos:
a) El Coeficiente de Nei y Li (Nei y Li 1979). Este índice se calcula como el
doble del número de bandas compartidas sobre el total de bandas (en ambos
individuos); SNL= 2D/ (B+C+2D); valor 0.5556
b) Coeficiente de Apareamiento Simple (Sneath y Sokal, 1973; Skroch et al.,
1992; “manhattan”. Sitios iguales (0,0 ó 1,1) entre total de sitios. SAS = (A+D)/N;
valor 0.4667
c) Coeficiente de Jaccard (Sneath y Sokal, 1973); “binary”; SJ= D/ (B+C+D);
valor 0.3846
Una de las diferencias importantes entre los coeficientes consiste en si se
toman en cuenta los casos en donde ambas muestras tienen una banda ausente (0 y
0) ó no. Los coeficientes de Nei y Li y el de Jaccard, dependen solamente de las
bandas presente en los individuos que se están analizando; mientras que el
coeficiente de “Apareamiento simple” (Simple matching coefficient) sí los toma
(Sneath y Sokal 1973; Skroch et al., 1992).
Se considera que mientras no exista una base teórica sólida, no es posible
decidir sobre cual de los coeficientes es más adecuado. Desde el punto de vista
práctico, cuando la proporción de (0 y 0) en un grupo de individuos es menor al 20%,
35
las conclusiones sobre la estructura genética de éstos son aproximadamente las
mismas, independientemente del coeficiente que se utilice (Swofford et al., 1996).
2.6.2 Métodos estadísticos para el análisis de la diversidad genética
Existen diferentes métodos estadísticos para realizar el análisis de la
diversidad genética, entre estos destacan, máxima parsimonia, máxima verosimilitud,
distancia genética y métodos de agrupamiento (Hillis et al 1996).
Máxima parsimonia
Debido en parte al gran número de caracteres involucrados, estos datos se
analizan por métodos de distancia, parsimonia o máxima verosimilitud con los que es
posible obtener una filogenia (Hillis et al., 1996).
Se utiliza aquí la palabra “parsimonia” en el sentido de “simplicidad” y los
métodos de máxima parsimonia operan seleccionando los árboles filogenéticos que
minimizan el número de eventos evolutivos necesarios para explicar los datos. Esto
está basado en el principio filosófico de la “navaja de Occam”, principio científico que
dice: que si dos hipótesis explican igualmente los datos, la hipótesis más simple debe
de preferirse. Los métodos de máxima parsimonia están implementados en una
enorme variedad de algoritmos de búsqueda que trata de encontrar el “árbol” más
parsimonioso” bajo algún criterio específico (Hillis et al., 1996).
Máxima verosimilitud
El concepto de máxima verosimilitud es central a la inferencia estadística y
básicamente se trata de elegir el valor del (o los) parámetros de un modelo que son
más creíbles o "verosímiles" dada la información que dan los datos. En general, la
implementación del modelo, los supuestos que es necesario hacer y lo complejo de
la búsqueda numérica que hay que efectuar, hacen que los métodos de máxima
verosimilitud no puedan ser, aplicados a datos demasiado complejos (muchos
caracteres y/o muchos individuos) (Swofford y Olsen, 1990).
36
Distancia genética
Este método ha sido (y continúa siendo) confundido muy a menudo en la
literatura con la disimilaridad genética. El concepto de distancia genética se basa en
las diferentes frecuencias de alelos en las poblaciones; es una función de las
frecuencias génicas en cada población. Existen diferentes fórmulas para medir la
distancia genética (Weir 1996) y, en todos los casos, aquí el sujeto de estudio es la
población y no el individuo en sí, de manera que podemos estudiar la variación
dentro y entre poblaciones y, en algunos casos tratar de obtener dendrogramas o
árboles filogenéticos que relacionen a las poblaciones. Para hacer esto utilizando
datos de distancia genéticas se requiere de algún método en particular: máxima
parsimonia, máxima verosimilitud o agrupamiento. En realidad la “distancia genética”
no es un método de análisis sino un tipo particular de datos, la mayoría de los
estudios con isoenzimas caen dentro de este tipo, y este tipo de estudios se
caracterizan por estudiar muchos individuos (de cada población) en pocos loci (Weir
1996).
Agrupamiento
Son técnicas jerárquicas las cuales producen un dendrograma, este método
se inicia con el cálculo de las distancias de cada individuo hacia la totalidad de
individuos, los grupos se forman por el proceso de aglomeración o división (Manly
1986), la fase complementaria incluye la sepáración de individuos removidos dentro y
fuera en los diferentes estados del análisis. El proceso se completa cuando los dos
últimos agrupamientos se combinan dentro de uno solo, el cual contiene todos los
taxa originales (Swofford y OIsen 1990). Los métodos de agrupamiento son
algorítmicos; ya que no se busca un dendrograma “óptimo”, como ocurre en el caso
de los métodos de máxima parsimonia o verosimilitud; en contraste se tiene una
“receta” con la cual se obtiene un único dendrograma. Los métodos de agrupamiento
constan de dos pasos: 1) una fórmula para medir la disimilaridad genética, que
permite obtener una matriz de similaridad (o disimilaridad) con todas las medidas de
37
disimilaridad entre todos los posibles pares de individuos y 2) un algoritmo para
construir un dendrograma (Avise 1994; Everit 1993).
2.7 Representaciones gráficas de análisis numéricos
La taxonomía numérica auxilia en la determinación de las relaciones fenéticas
entre organismos o taxa. Cain y Harrison, (1960) definen las relaciones fenéticas
como un arreglo por similitud global, basada en todos los caracteres sin alguna
importancia en particular. Sneath y Sokal, (1973) definen las relaciones fenéticas
como similaridad (parecido) basado en un juego de características fenotípicas del
objeto u organismo bajo estudio. Es una manera distinta de relaciones cladísticas, las
cuales son una expresión reciente de un ancestro común y está representado por
una red ramificada de relaciones ancestro-descendiente. Mientras que las relaciones
fenéticas están representadas a través de un fenograma, las relaciones ciadísticas
son mostradas en un cladograma (Singh 1999).
Dendrograma
Un dendrograma es una forma gráfica de visualizar las medidas de
disimilaridad que se tienen en una matriz. Un árbol filogenético es, en contraste, una
aseveración sobre la historia evolutiva de un grupo de individuos. La escala de un
dendrograma está dada en disimilaridad (o similaridad), en contraste, la escala del
árbol filogenético (la longitud de sus ramas) representa tiempo de divergencia (Singh
1999). Por lo que un dendrograma refleja hasta cierto punto, la historia microevolutiva de los individuos, esta presunción está justificada pero es necesario más
trabajo teórico para llegar a sustentarla (Hillis et al., 1996).
Fenograma
Un Fenograma es un diagrama que se construye con base en análisis
numéricos. Cada diagrama resulta de la utilización de un gran número de caracteres,
usualmente de todos los campos disponibles e incluye cálculos de similaridad entre
taxa y la construcción de un diagrama a través del análisis de agrupamiento (Cluster
38
analysis) (Everit 1993; Singh 1999). El diagrama es útil, ya que está basado en un
gran número de caracteres y la clasificación jerárquica resultante puede ser usada
para decidir sobre los niveles de umbral de similaridad entre taxa. Consta de dos
pasos: una fórmula para medir la disimilaridad genética y un algoritmo para construir
un dendrograma (Avise 1994; Everit 1993).
Se considera el hecho de que un fenograma esta relacionado con un
dendrograma, por el sustento teórico con que ambos son construidos. Por otro lado,
un “árbol filogenético” y un “dendrograma” son gráficas que se parecen y a menudo
se confunden. Sin embargo, existen diferencias muy importantes. En un árbol
filogenético cada nodo representa un “ancestro común”, en cambio en los nodos de
un dendrograma son simplemente, los puntos donde dos individuos o grupos se unen
(Singh 1999). Estos representan el nivel de disimilaridad (o similaridad) que existe
entre los individuos (o grupos) (Singh 1999).
El término fenético (como opuesto a filogenético o filético) expresa relaciones
en términos de similaridades entre ¡al propiedades actuales de los organismos sin
referencia de cómo éstas son dominantes (Caín y Harrison 1960; Sneath y Sokal
1973). Algunas fuentes de información, más que los filéticos, pueden usarse en la
construcción
de
clasificaciones
fenéticas,
como
las
químicas,
citológicas,
embriológicas y de rasgos genéticos (DNA) pueden ser incluidos, así como fuentes
tradicionales como la morfología y anatomía; esto no implica el significado evolutivo
de como se producen los grupos (Heywood 1976).
Cladograma
Por su parte Wiley (1981), considera como cladograma a un diagrama
ramificado de entidades en las cuales las ramificaciones se basan o infieren por
conexiones históricas entre entidades evidenciadas por sinapomorfias, de esta
manera se considera una filogenia o dendrograma histórico. Las relaciones
cladísticas describen patrones de ancestría, sobre como son los caracteres de los
organismos en torno a la evolución sin estar de acuerdo con el estado actual. Los
39
parecidos en grupos fenéticos, lo cual es debido a ancestría común es denominado
patristico,
la
similaridad
debida
a
paralelismo
y
convergencia
es
llamada
homoplástica (Wiley 1981). Estos dos componentes juntos hacen la similaridad
fenética. La similaridad patrística puede a su vez dividirse en primitiva y derivada
acorde a si es o no conservadora de algunos de los mismos linajes evolutivos como
su inmediato o mas remoto ancestro común (Heywood 1976).
2.7.1
Métodos de obtención de dendrogramas
Una vez que se define la forma en que se mide la disimilaridad genética, es
posible obtener una matriz conteniendo toda la información relevante. Es decir, una
matriz que contenga todos los n(n-1)/2 coeficientes de disimilaridad entre los
posibles pares de individuos (n es el número de individuos) (Everit 1993). Existen
dos razones para construir dendrogramas: 1) proporcionan una manera de resumir
información presente en la matriz de disimilaridad y 2) se espera que el dendrograma
sea similar (al menos en forma) al árbol filogenético de los individuos estudiados
(Everit 1993). Los métodos o algoritmos para la obtención de dendrogramas difieren
entre si en la forma en que se mide la distancia entre grupos (Everit 1993; Efron y
Tibshirani 1993; Simpson et al., 1999).
Se conocen tres métodos para la elaboración de dendrogramas, acorde a las
distancias que presentan entre sí los individuos estudiados:
a) Método del promedio
El promedio aritmético no ponderado por pares (UPGMA): “unweighted pair
group with arithmetic average”, representa el promedio aritmético de las distancias
entre todos los posibles pares de individuos en los dos grupos (Swofford y Olsen
1990; Singh 1999).
40
b) Método del vecino cercano
La distancia mínima, ligamiento simple o de conexión significa la distancia
menor entre miembros de los dos grupos (Swofford y Olsen 1990; Singh 1999).
c) Método del vecino lejano
La distancia máxima, ligamiento completo o compacto significa la distancia
mayor entre miembros de los dos grupos. Este método generalmente podría conducir
a un estrecho agrupamiento discreto que se une a otros solo con dificultad y a
relativamente
bajos
valores
de
similaridad
totales
(Swofford
pruebas
de
y
Olsen
1990;
Singh 1999).
2.7.2
Intervalos
de
confianza
y
hipótesis
sobre
dendrogramas
El valor estimado de un parámetro de interés es inútil si no va acompañado de
un enunciado que permita evaluar que tan preciso es dicho valor, o sea conocer que
tanta confianza podemos tener que el valor obtenido esté cerca del verdadero valor
del parámetro (Everit 1993). En estadística este problema se soluciona por medio de
los intervalos de confianza; en vez de dar como valor estimado un solo punto, se da
un intervalo o región de la cual se tiene confianza que incluya el verdadero valor del
parámetro.
Existen dos aspectos separables que determinan un dendrograma: 1) su
forma o topología; es decir, quien se une con quien y en que orden y 2) la escala, o
disimilaridades en las cuales ocurre las uniones (Efron y Tibshirani 1993).
Cada método de agrupamiento define un tipo de función que determina la
topología del dendrograma. Todas estas funciones tienen como característica común
que dan un resultado “discreto” (un determinado grupo existe o no existe) como
respuesta a valores continuos (las disimilaridades). Es razonable pensar que para
41
cada algoritmo y para cada matriz de disimilaridad existirán límites dentro de los
cuales los valores de la matriz de disimilaridad se pueden mover sin alterar la
topología del dendrograma. Sin embargo, encontrar estos límites es una tarea difícil,
dada la complicada estructura de correlación que existe entre los elementos de la
matriz de disimilaridad (el cambio de posición de una banda en un individuo particular
puede alterar a todo el renglón correspondiente (y columna) de la matriz de
disimilaridad) (Efron y Tibshirani 1993; Weir 1996; Efron et al., 1996).
Es de poco interés la topología del árbol cerca de las unidades, y más bien se
centra en la parte “alta”; es decir es posible tener varios individuos representando
una población que acertadamente deberán formar un grupo compacto, pero no hay
interés en la topología de esa rama, sino en lo que está ocurriendo más arriba del
árbol, es d9cir dónde diferentes poblaciones (ó especies) se unen (Everit 1993). Para
buscar el estadístico de interés, se deben hacer algunos supuestos sobre las
distribuciones de los datos originales (presencia o ausencia de cada banda en cada
individuo). En virtud de que no se ha desarrollado un modelo teórico que tome en
cuenta de manera equilibrada las bases biológicas de los métodos, no es posible
hacer supuestos razonables sobre la distribución de éstos (Everit 1993). Por ello una
de las soluciones asequibles es utilizar métodos de remuestreo, en particular,
“bootstrap” (Felsenstein 1985), para aproximar las distribuciones de los estadísticos
de interés (Brown 1994; Efron et al., 1996).
En el caso que nos ocupa, los datos son presencia/ausencia de n bandas
(renglones de la matriz de datos) colectadas para k individuos (columnas de la matriz
de datos). El estadístico de interés es el dendrograma (obtenido por dos pasos: Iobtener la matriz de distancia y ll- aplicar el algoritmo de agrupamiento), y una
muestra boostrap (o réplica) que se compone de una matriz de n renglones, tomados
al azar con reemplazo de la matriz original y k columnas, por ejemplo: 1, 2...n; para
obtener una réplica hacemos n “sorteos” donde cada número es escogido del
conjunto {1,2,...n} y en el sorteo cada número tiene la misma oportunidad de ser
elegido: 1 /n ( Efron et al., 1996; Simpson et al., 1999).
42
Una vez que se tiene un gran número de réplicas del dendrograma, es posible
hacer ciertas comparaciones entre el dendrograma original (DO) y los dendrogramas
obtenidos a partir de cada una de las B réplicas digamos, {D1, D2 ....DB}. En
particular, es posible observar, para cada uno de los n-2 nodos del dendrograma
original, si ese nodo (“X” agrupación) existe en cada una de las réplicas (Everit
1993). Contando el número de veces que cada uno de los nodos del dendrograma
original se repite en las réplicas obtenemos un estimado del nivel de confianza para
dicho nodo. Si un determinado nodo se repite en el 100% de los casos se podrá estar
muy seguro de que dicho nodo realmente existe en el verdadero dendrograma (Everit
1993). Por el contrario, si un nodo se repite en raras ocasiones, digamos solamente
en el 5% de las réplicas, se pensará que dicho agrupamiento es producto del azar.
En el sentido de no tener suficiente evidencia de que en realidad dicho nodo exista
en el verdadero dendrograma. (Felsenstein 1985; Efron et al., 1996; Simpson et al.,
1999).
2.8 Análisis estadístico de datos moleculares
El
S-plus
es
un
sistema
de
análisis
estadístico,
no
está
diseñado
especialmente para el análisis de datos moleculares o para la aplicación de
algoritmos jerárquicos, sin embargo da la posibilidad de programar rápida y
eficientemente nuevos métodos (Everit 1993); así como de intervalos de confianza,
utilizando el método de Felsenstein (1985), el cual es un método de remuestreo
(varias
replicas
del
dendrograma)
para
aproximar
las
distribuciones
de
los
estadísticos de interés por medio de un sorteo al azar en donde cada número tiene la
oportunidad de ser elegido: Una vez que se tiene un gran número de réplicas del
dendrograma es posible compararlo con el dendrograma original, en particular es
posible para cada uno de los nodos n-2 del dendrograma original, ver si ese nodo
(grupo) existe en cada una de las réplicas. Contando el número de veces que cada
uno de los nodos del dendrograma original se repite en las réplicas se obtiene un
nivel estimado de confianza para dicho nodo (Felsenstein 1985; Efron et al., 1996).
43
2.9 Generalidades de la familia Crassulaceae
La familia Crassulaceae comprende 1200-1500 especies, agrupadas en seis
subfamilias, y cinco grandes géneros: Sedum, Crassula, Kalanchoe, Echeveria y
Sempervivum (Berger, 1930). De acuerdo con van Ham (1994,1995) Ham y 't Hart
(1994), en las crasuláceas existen dos líneas evolutivas y consecuentemente el
número de subfamilias disminuye. Estas son la Crassuloideae (sensu Berger 1930),
la cual se distingue de las demás Crassulaceae por la combinación de flores
haplostemonas (aquellas cuyo androceo consta de un solo verticilio estaminal), y de
hojas opuestas; está representada por dos géneros, y cerca de 200 especies; y la
Sedoideae la cual se caracteriza por flores obdiplostemonas (aquellas que presentan
los estambres del verticilio externo epipétalo), y hojas en espiral; representada por
cerca de 30 géneros y entre 1000 a 1200 especies (‘t Hart 1997).
En la subfamilia Echeverioideae, casi la totalidad de estos géneros presentes
en
Norteamérica
actualmente
son
aceptados,
por
ejemplo:
Echeveria,
Graptopetalum, Pachyphytum, Tacitus, Thompsonella, incluyendo Sedum Sección
Pachysedum, pero excluyendo Dudleya y probablemente también Villadia (Eggli et
al., 1995), estos mismos autores reportan para México 12 especies de Pachyphytum,
género cercano a Echeveria con el que se pueden originar híbridos, pero también es
posible hibridizar con muchas otras especies de géneros norteamericanos. Al
respecto se reportan híbridos entre Pachyphytum con Echeveria (Walther 1934;
Moran 1965; Uhl 1994ª, 1995ª, 1995b, 1996, 1997, 1999); entre Pachyphytum y
Lenophyllum (Uhl 1993a); entre Pachyphytum y Thompsonella (Uhl 1994b); entre
Pachyphytum y Tacitus (Uhl 1993b, 1995c) entre Pachyphytum y Villadia (Uhl
1994c).
Walter (1972), incluye aproximadamente 150 taxa de Echeveria mexicanas.
Jacobsen (1978) enlista 29 taxa mexicanos de Dudleya, más de 30 de Villadia y 89
de Sedum. Adicionalmente a las anteriores, con recientes descripciones Fitz y
Anderson (1997), reportan 13 especies de Pachyphytum, 14 de Graptopetalum,
44
cuatro de Lenophyllum, tres de Thompsonella, una de Tacitus y tres de Kalanchoe.
Por lo que hasta ahora se consideran aproximadamente 350 taxa mexicanos de
Crassulaceae.
Con
respecto
a
la
clasificación
de
la
familia
Crassulaceae,
ésta
ha
permanecido sin cambios desde el tratado de Berger (1930), el cual tiene parte de
sus orígenes en una temprana clasificación infrafamiliar publicada por De Candolle
(1828). Asimismo, de manera parcial Britton y Rose (1903) abordan los taxa
americanos de Crassulaceae. Estudios recientes, sobre todo los de van Ham et al
(1992), Ham (1994, 1995) Ham y ‘t Hart (1998) permiten incremento y claridad en el
conocimiento de la actual clasificación a nivel infrafamilia, posteriores a los que
planteó Berger en 1930. Otros estudios en varios niveles y con diferentes objetivos
dentro de las Crassulaceae, acuerdan en que la mayor división entre la familia es
entre los taxa haplostemonos y los obdiplostemonos, o como lo planteó Berger en
1930 (Berger 1930), entre las Crassuloideae y el resto de la familia.
Aunque la familia no incluye ningún cultivo masivo en grandes áreas, un
número considerable de especies son importantes para la horticultura; por ejemplo
Kalanchoe blossfeldiana, así como el desarrollo de varios híbridos producto de
cruzas intergenéricas (UN 1992; Thiede 1995).
Un gran número de especies de esta familia son usados intensamente en
estudios de fisiología, ya que la característica suculencia de sus hojas, cutícula
serosa, estomas hundidos y hábito en roseta constituyen la más importante
adaptación a ambientes áridos (Denton 1982), acorde con esta adaptación son
nombrados
los
miembros
de
la
familia
Crassulaceae,
como
plantas
“CAM”,
refiriéndose al metabolismo ácido de las Crassulaceae (Pilon-Smits 1992).
2.9.1 Distribución de las Crassulaceae
La distribución de las crasuláceas es casi cosmopolita e incluye todo el
hemisferio norte así como el sur de África, con evidentes centros de diversidad en
45
México, Sudáfrica, Europa y en las montañas templadas de Asia (van Ham 1994), y
sus especies contribuyen de una manera importante a las comunidades vegetales de
habitats en montañas y lugares semiáridos de regiones templadas y subtropicales.
Thiede (1995), considera que con cerca de 407 especies, América es el
continente con mayor diversidad de crasuláceas, y México tiene el mayor número de
ellas; con 305 especies (75% de todas las especies americanas), Sudáfrica es el
segundo con cerca de 225 especies. El mismo autor agrega que, en América,
Estados Unidos de Norteamérica es el segundo en diversidad de especies con 77,
Centro América y Sudamérica comprenden 18 y 38 especies, respectivamente; por lo
que en México el porcentaje de especies de crasuláceas endémicas es 89.8% y para
Echeveria es de 97.1 %, lo que probablemente representa el más alto grado de
endemismo dentro de las familias y géneros en este país.
México ocupa el tercer lugar entre los países con mayor diversidad biológica
(Rzedowski 1991, 1992). Existen tres tipos de manifestaciones de la diversidad en el
ámbito específico o supraespecífico: α (diversidad de especies), β (heterogeneidad
ecológica) y (heterogeneidad biogeográfica) (Williams-Linera et al., 1992).
El grado de endemismo de las crasuláceas en México, es mayor que el de las
Cactáceas (78%) (Hernández 1994). En las Crassulaceae, tres géneros son
endémicos de México, que representan el 23% del total de esta familia; ó el 30% de
todos los géneros mexicanos de plantas con flores (Thiede, 1995). En general el
endemismo genérico en México es estimado de ser cercano al 10% (Rzedowski,
1993). Los endemismos corresponden a taxa que se encuentran únicamente, en un
lugar, región o país, según la unidad territorial en que se base el análisis, su pérdida
equivale a la extinción. (Williams-Linera et al., 1992).
Según van Ham (1994,1995), México es uno de los centros de diversidad de
crasuláceas, con cerca de 300 especies endémicas distribuidas en 5 géneros:
Echeveria, Graptopetalum, Pachyphytum, Sedum y Villadia. Todas las Crassulaceae
46
del México Central pertenecen a la misma línea evolutiva (van Ham 1994, 1995, van
Ham y Hart 1998).
Van Ham (1994, 1995) y ‘t Hart (1995), indican que la mayor parte de la
riqueza de especies de las crasuláceas de Norte América, se ubica a lo largo de un
gradiente
altitudinal
casi
constante,
relativamente
menor
a
bajas
altitudes,
se incrementa por arriba de los 800 m. y alcanza picos pronunciados entre los 1,800 a
2,400 m., que a mayor altitud la riqueza baja y sólo pocas especies se encuentran
por arriba de los 3,400m. La riqueza de especies a lo largo del gradiente latitudinal
muestra un incremento pronunciado hacia latitudes tropicales y alcanza un máximo
en el sur de México, En la región tropical mexicana, las crasuláceas generalmente se
restringen a las montañas y tierras altas, que conjuntamente forman la “Provincia de
las tierras altas Mexicanas” dentro del holártico “Región Madre” (Thiede 1995).
Este último autor añade que, en base en los patrones de distribución de todas
las especies, se pueden distinguir 11 centros regionales de endemismos en México y
uno en Guatemala, considerando que el mayor centro geográfico evolutivo de las
crasuláceas mexicanas tropicales tiene rangos cercanos continuos desde el estado
de Hidalgo y Querétaro hasta Oaxaca. Incluye los centros regionales de HidalgoQuerétaro,
México-Morelos,
Orizaba,
Tehuacán
y
Oaxaca,
los
cuales
se
interconectan de varias formas expresando similitudes florísticas, y que comprende
un alto número de taxa infragenéricos, y elevado número y porcentajes de especies
endémicas (también a nivel infragenérico), y la mayoría de centros de riqueza de
especies dentro de grupos infragenéricos de Echeveria y Sedum tropicales (Thiede
1995).
El impacto de diferentes amenazas (sobrecolecta, saqueo, cambio de uso del
suelo, etc.), sobre las cactáceas y otras suculentas mexicanas depende sobre todo
de la característica individual de la población de especies. La mayoría de los cactus
mexicanos amenazados ocurre en pequeñas poblaciones disyuntas de regiones
áridas y semiáridas del país, y una proporción signíficante de ellas son representadas
47
sólo por una o pocas poblaciones. La mayoría de estas especies tiene una
combinación
de
atributos
biológicos
y
ecológicos
haciendo
que
éstas
sean
extremadamente vulnerables a alguna forma de disturbio (Fitz y Anderson 1997).
Estos mismos autores agregan que, estas plantas usualmente tienen pequeñas tasas
de desarrollo, largos ciclos de vida y la repoblación por individuos (vegetativa), es
extremadamente baja.
Estas características de ser vulnerables por pequeñas tasas de desarrollo,
largos ciclos de vida, etc., determinan una lenta respuesta demográfica de las
poblaciones después del disturbio. Sin embargo, la información general sobre
poblaciones vegetales no está disponible, por lo que resulta muy difícil evaluar con
precisión el grado de amenaza sobre dichas especies en particular (Fitz y Anderson
1997).
La Subtribu Sedinae incluye la mayoría de crasuláceas americanas (cerca del
96% de las especies) y todos los géneros de la antigua Subfamilia Echeveriodeae (‘t
Hart 1995). Dicha subtribu está representada por 2 grandes géneros (Sedum y
Echeveria) dos de tamaño medio (Villadia y Dudleya) y 6 géneros pequeños (en el
que queda incluido Pachyphytum). Excepto por Sedum, los géneros de Sedinae son
endémicos de América. Los patrones de distribución, centros de riqueza de
endemismos de especies, así como la evolución de Crassulaceae americanas son
todavía enormemente desconocidas, considerándose que en apariencia los géneros
monotípicos son representantes antiguos, paleoendémicos o de linajes aislados (‘t
Hart 1995).
2.9.2 Estudios filogenéticos en las Crassulaceae
La familia Crassulaceae comprende según Berger (1930), seis subfamilias
(Sedoideae, Echeverioideae, Cotyledonodeae, Kalanchoideae, Sempervivoideae y
Crassuloideae), sin embargo posteriormente a los estudios realizados por van Ham
48
(1994, 1995), van Ham, et al (1994), van Ham y ‘t Hart (1998), consideran que dicha
familia comprende sólo dos líneas evolutivas: Sedoideae y Crassuloideae.
Particularmente,
la
familia
Crassulaceae
es
considerada
dentro
de
las
angiospermas como monofilética (Berger 1930; Cronquist 1981; Thorne 1983;
Haskings y Hayden 1987), y es clasificada en el complejo orden Rosales,
relacionándose con las familias Penthoraceae y Saxifragaceae (Takhtajan 1980,
1997), afiliaciones que fueron confirmadas mediante caracteres serológicos (Grund y
Jensen 1981) y la comparación de secuenciación del ADN del cloroplasto rbcl a nivel
de género (Albert et al., 1992). Posteriormente, amplios análisis filogenéticos
basados en secuencias del gen rbcl (Chase et al, 1993; Morgan y Soltis 1993), así
como de secuencias del gen 18S del ADN ribosomal (Soltis y Soltis 1997; Soltis et
al., 1997b) indican que las Crassulaceae forman parte del ciado de las Saxifragales.
El análisis de la secuencia del gen matK sobre 112 especies de ésta familia
indican fuertemente a las Crassulaceae como un grupo monofilético (Mort et al.,
2001),
que
se
caracteriza
primordialmente
por
tener
una
estructura
floral
relativamente primitiva que consiste de flores regulares, usualmente pentámeras con
múltiplos, carpelos libres y una o dos series de estambres (Takhtajan 1980). De
manera secundaria la familia exhibe un gran número de rasgos xerofíticos como son:
hojas gruesas y suculentas, cutícula serosa y generalmente hábitos o formas
arrosetadas formando setos, y desarrollan formas parecidas a tapetes (Denton
1982), de tal forma que reflejan adaptación a habitats áridos.
La subfamilia Echeverioideae agrupa a los géneros Pachyphytum, Echeveria
y Villadia y es señalada como un grupo polifilético. Este clado Acre (uno de los
siete), es de los más sorprendentes, porque como grupo se muestra ascendente en
la parte superior del cladograma, éstas se unen a las especies americanas,
altamente diferenciadas y afines a Echeveria, las cuales se han hipotetizado como
las más primitivas, o al menos derivadas del Sedum acre de las Crassulaceae, (‘t
Hart y Koek-Noorman, 1989; ‘t Hart, 1992).
49
El Clado Acre es el más diverso en México y comprende en adición a Sedum,
los
géneros
Echeveria,
Graptopetalum,
Lenophyllum,
Pachyphytum,
Tacitus,
Thompsonella y Villadia (Thiede 1995). Mort et al., (2001) señala que, con base en
información cromosómica, este clado ubica a la mayoría de los taxa mas variables y
confusos, que incluyen a Pachyphytum, Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y
las especies mexicanas de Sedum. Van Ham y ‘t Hart (1998), apoyan la monofilia de
Pachyphytum, y consideran que este clado Acre comprende un tercio de la
diversidad genética de la familia Crassulaceae.
Los árboles filogenéticos de las crasuláceas basados en enzimas de
restricción del ADN del cloroplasto presentados por van Ham (1994, 1995)
comprende 44 especies, de 19 géneros; que representan seis de las subfamilias
planteadas por Berger, pero un estudio más extenso de las relaciones intergenéricas
dentro de la familia requieren de mayor número de muestreos taxonómicos. Sin
embargo, se considera que estos resultados pueden ser usados como referencia
para la clasificación a nivel infrafamilia y genérica de las crasuláceas. Asimismo, los
estudios de van Ham et al., (1994), van Ham (1995) concluyen que el análisis de
secuencia de un espacio entre los genes trnL y trnF pueden también ser usados
para inferir relaciones filogenéticas dentro de las crasuláceas.
Estudios en plantas cultivadas combinando estudios de citología y morfología
de plantas bajo condiciones semejantes de cultivo, han mejorado el entendimiento
del significado de variación intraespecífica y especiación en la familia Crassulaceae y
se considera perfeccionada la delimitación entre especies (‘t Hart 1991). Los trabajos
de van Ham y Hart, (1998) revelaron las interrelaciones moleculares de los
principales grupos de la familia Crassulaceae. Asimismo, otros estudios sobre el
ADN reafirman el conocimiento sobre las relaciones evolutivas dentro de la familia, y
han auxiliado en verificar la prueba de una temprana propuesta de tendencias
evolutivas (van Ham 1994, 1995).
50
2.10 Ubicación taxonómica del género Pachyphytum
De acuerdo con ‘t Hart, (1995), la familia Crassulaceae tiene la siguiente
ubicación taxonómica:
FAMILIA Crassulaceae
SUBFAMILIA Sedoideae Berger in Engler y Prantl.Sinónimos: Subfamilia Cotyledonoidae, Subfamilia Echeverioideae, Subfamilia
Kalanchoideae, Subfamilia Sempervivoideáe, Subfamilia Dudleyoideae
TRIBU Sedeae ‘t Hart, Trib. nov.
β SUBTRIBU Sedinae ‘t Hart Subtrib. Nov.β CLADO-ACRE
GENERO Pachyphytum Link, Klotzsch & Otto in Allg. Gartenzeit 1841
El género Pachyphytum fue descrito por Link, Klotzsch y Otto en 1841 (Stearn,
1937), la planta tipo fue colectada por Ehrenberg en México, sin localidad definida, tal
especie fue nombrada como Pachyphytum bracteosum . Salm-Dick 20 años más
tarde encontró y describió Diotostemon hookeri (Salm-Reifferscheid-Dyck, 1854), el
cual posteriormente se reconoció como Pachyphytum hookeri (Berger, 1930). Entre
1905 y 1911 Rose, describe P. longifolium, P. brevifolium y P. compactum, asimismo
reubica otras especies que se presentaron como sinónimos del mismo o de otros
géneros. La primera revisión de este grupo se debe a Von Poellnitz (1937),
destacando la información del material colectado hasta esas fechas. En la misma
década, el género fue abordado por Walther (1931, 1937), y más recientemente por
Moran (1960, 1963, 1965, 1967ª, 1967b, 1968ª, 1968b, 1968c, 1971, 1989, 1990,
1991ª, 1991b, 1992); Meyrán (1963); UN y Moran (1973); Kimnach y Moran (1993),
mismos que han descrito algunas especies y publicado aspectos relacionados a
Pachyphytum. Los más reciente descubrimientos, aportan la descripción de tres
especies: dos del estado de Michoacán (García et al., 1999, 2002), y otra en el
estado de Querétaro (Pérez-Calix et Glass, 1999), asimismo, existe una más del
estado de Jalisco, cuyo reporte técnico se encuentra “en prensa”.
51
2.10.1 Descripción botánica
Pachyphytum Link, Klotzsch y Otto (Link, Klotzsch y Otto, 1841). Plantas
herbáceas o sufruticosas, carnosas, perennes, glabras, frágiles, solitarias, o bien en
colonias densas; tallo simple o ramificado; hojas fácilmente caedizas, alternas,
dispuestas en espiral o agrupadas en rosetas alargadas o compactas en los ápices
de los tallos, semicilíndricas, rollizas o aplanadas, carnosas, ápice generalmente
mucronado, verdes, rojizas o violáceas, comúnmente glaucas; pedúnculo verde,
anaranjado o rojizo, provisto de brácteas alternas, sésiles, la base prolongada más
debajo de su inserción con el tallo; inflorescencias en forma de cincinos laterales y
axilares, ocasionalmente las flores solitarias; las flores subtendidas por brácteas
grandes o pequeñas; cáliz de 5 sépalos unidos en la base, iguales o desiguales en
longitud y ancho, adpresos, en algunas especies más largos que los pétalos; corola
algo campanulada a urceolada, de color blanco, verde, anaranjado, rojo o
combinando estos colores, pétalos 5, unidos cerca de la base, erectos y extendidos
en el ápice, cada pétalo con un par de escamas en su interior (similar a un pliegue
del mismo segmento); estambres 10, 5 libres, alternando con los pétalos, los otros 5
epipétalos alternos a los sépalos, adnados a los lóbulos de la corola; nectarios 5;
gineceo de 5 pistilos libres; fruto de folículos divergentes en la madurez; semillas
pequeñas numerosas (Link et al., 1841).
El género Pachyphytum posee 12 especies (Eggli et al., 1995). Actualmente
con las descripciones de P. caesium, P. machucae, P. Garciae y P. Rzedowskii suman 16
las especies descritas, si se incluye en este listado P. contrerassi, cuyo reporte
técnico actualmente está “en prensa”, sumarian 17. La totalidad son de distribución
restringida al centro de México, de la región meridional de Tamaulipas a Guanajuato
e Hidalgo, Jalisco y Michoacán. Se desarrollan en laderas rocosas entre los 600 y
2500 m s.n.m. (Uhl y Moran 1973).
Las plantas del género Pachyphytum, por la belleza de sus flores, de sus
estructuras vegetativas, así como por su aparente facilidad de reproducción, son
recomendadas por varios autores para su cultivo, incluyendo los híbridos obtenidos
52
al cruzar este con otros géneros relacionados. Al respecto (Uhl y Moran 1973),
mencionan que el número de cromosomas estándar de Pachyphytum es de 31-33 ó
sus múltiplos, ya que algunas especies presentan poliploidías.
El género Pachyphytum es considerado cercano a Echeveria (Eggli et al.,
1995), del cual se diferencia principalmente por presentar un par de apéndices en
forma de escamas en la superficie interna de cada segmento de la corola uno a cada
lado del filamento epipétalo (fig. 1).
53
Figura 1. Pachyphytum machucae I. García, Glass et Cházaro. A. Habito. B. Hoja en
vista ventral, a-b sección transversal de la hoja. C. Bráctea a-d sección transversal de la
bráctea. D. Flor en vista lateral. E. Vista interior de los pétalos. F. Carpelos y nectarios. G.
Vista dorsal del cincino joven. (Dibujo basado en material tipo I. García Ruiz 4497, CIMI, IEB,
ENCB, MEXU y realizado por Rogelio Cárdenas), (tomado de: Acta Botánica 47: 1 1).
54
2.10.2 Secciones del género Pachyphytum
Berger (1930), dividió al género Pachyphytum en dos grupos, llamados
sección Diotostemon (Salm-Dyck) Walter, y sección Pachyphytum, las cuales han
sido aceptadas desde entonces. Walther (1931), añade la sección Echeveriopsis , a la
cual Moran (1961a), reintegra al género Echeveria. La sección Pachyphytum es
tipificada por la especie P. bracteosum
Klotzsch. La sección Diotostemon es
tipificada por P. hookeri (Salm-Dyck) Berger. Moran (1968a), propone la sección
Ixiocaulon, tipificada por la especie P. glutinicaule.
De tal forma que las secciones propuestas con sus respectivas especies
quedan de la siguiente manera:
Sección Pachyphytum
Caracterizada por tener grandes brácteas del cincino joven imbricadas,
pétalos más cortos que el cáliz y pedicelos florales cortos, con una gran mancha roja
en el interior de los pétalos, las hojas basales varían de elípticas a obovadas y de
menos de 2 a más de 5 veces más anchas que gruesas. Las especies son las
siguientes:
P. bracteosum Klotzsch
P. caesium Kimnach y Moran
P. kimnachi Moran
P. longifolium Rose
P. ovíferum C.A. Purpus
P. viride E. Walther
P. werdermannüv. Poellnitz
55
Sección Diotostemon
En esta sección, las brácteas del cincino floral joven son reducidas, no están
imbricadas, los sépalos son menores que los pétalos, los sépalos están adpresos a
los pétalos, los pedicelos son largos. Esta constituida por las especies:
P. coeruleum Meyrán
P. compactum Rose
P. hookeri (Salm-Dyck) Berger
Sección Ixiocaulon
En este subgénero las brácteas del cincino joven son imbricadas, los sépalos
son más cortos que la corola, el tallo es inicialmente víscido, las hojas son ovobadaespatuladas, dos veces más ancho que grueso. Conformada por las especies:
P. glutinicaule Moran
P. fiftkaui Moran
La
distribución
geográfica
conocida
de
la
totalidad
de
las
especies,
corresponde a las colectas registradas de material botánico para cada especie
(cuadro 1).
56
Cuadro 1. Localidades donde se han reportado especies del género Pachyphytum
P. bracteosum
Hidalgo: Barranca de Meztitlan; entre Jihuico y poco antes de
Meztitlan; barrancas entre Atzcatzintlan y Meztitlan 1200 m H. E.
Moore 2115 (BH); canon de venados, Lindsay ex Moran 6413
(SD); cerca de San Juan, 1300 m, Moran y Uhl 13415 (BH,
ICF,SD); La Paila, 1300m, Moran y Kimnach7793 (BH, SD); Tajo
de Caballero 1850 m arriba de San Juan Mezquititlan, Moran
10071 (BH, SD); San Juan al SE de Meztitlan, enero 9 del 2000, I.
Garcia y S. Garcia 5684 (CIMI, IEB).
P. brevifolium
Guanajuato: Tipo: Cerca de Guanajuato, enero, 1898, A. Dugés
153 (GH, US); cascada cerca de Picones, municipio de
Guanajuato, 2150m.s.n.m., E. Pérez y E. Carranza 2875 (IEB);
alrededores de Picones, cerca del río, municipio de Guanajuato,
2150m.s.n.m, E. Perez y C. Glass 3793 (IEB); Canada del
Capulín, cerca de la Sauceda, municipio de Guanajuato,
2000m.s.n.m., E. Perez y C. Glass 3796 (IEB).
P. caesium
Tipo: Aguascalientes: Cerca de 2 km al N del pueblo Presa de
la Serna, cerca de los 2000m, suroeste de Aguascalientes. Abril
1990, W. Minnich 12101 (HNT, holotipo; MEXU, isotipo); Arroyo
agua zarca, 7.3 millas camino al noroeste de Milpillas de arriba,
cerca de los 2000 m. Julio 24, 1989, W. Baker 7073 (CAS, HNT,
MEXU, SD, US paratipos).
P. coeruleum
Queretaro: Entre Cadereyta y Zimapan, Hgo. (Adquirida por el
Sr. Jorge Meyran) del Sr. Yoshida, sin localidad exacta. Tipo
MEXU (52609); UC (1175244)
P. compactum
Hidalgo: Tipo lxmiquilpan, marzo 1905, C.A. Purpus (No. 05/801
J. N. Rose, Cultivada), Holotipo floracion en Washington, marzo
1910, (US 574499)
Queretaro: Cerro El Mexicano, 2100m, Moran 14758 (ARIZ, BH,
CAS, ENCB, HNT, K, MEXU, MICH, NY, SD, TEX, UC, US);
ladera norte cerro de la Cruz, 1950 m W de la canada, Moran
14794 (BH, CAS, GH, MEXU, MO, SD, US); cerca de acueducto,
Queretaro H. Fittkau ex Moran 14720 (CAS, SD, US); San Jose el
Alto, 4 km N-NE de la Ciudad de Qro., Moran 14792 (SD); Cerro
de La Cruz,. La Canada, municipio de El Marques, R. Moran
14794 (MEXU); Cerro el Mexicano, municipio de Colon, R. Moran
14758 (ENCB, MEXU); 5-6 km al NW de la Carbonera, municipio
de Colon, E. Carranza y S. Zamudio 4025 (IEB); 8 km del poblado
El Zamorano, camino al Cerro Zamorano, municipio de Colon, E.
Perez y E. Carranza 2756 (IEB); km al NE de Presa de Rayas,
municipio de Colon, S. Zamudio 7382 (IEB); Cerro de las Tres
Madres, El Terreno, municipio de Toliman, S. Zamudio 2009
(IEB); 3 km al SE de San Juan de la Rosa, municipio de
Cadereyta, S. Zamudio 2933 (IEB).
57
P. contrerassi
Jalisco: Salto Cascada “Cola de Caballo” o Mirador Dr. Ati, aprox.
Km 14 carr. Guadalajara-Zacatecas, Cantiles rocosos, ladera
Norte, alt. 1240m, en bosque tropical caducifolio, marzo 7 de
1999, I. Garcia Ruiz y J.A. Machuca 5569 (CIMI).
P. fittkaui
Guanajuato: Tipo: 13 millas al este de San Luis de La Paz,
enero 25 de 1968, R. Moran 14770 (SD 67775); 14 km de
canada de Moreno, carretera San Luis de La Paz-Xichu,
municipio Victoria, 2100m, E. Perez y E. Carranza 2901 (IEB).
San Luis Potosi: Balneario de Lourdes, Glass y Foster 969 (SD).
P. garciae
Queretaro: Tipo: El Zapote, ± 4 km al NW de Rio Blanco,
municipio de Penamiller, alt... 1600m, canada con matorral
submontano,,E. Perez y S. Zamudio 3574 (IEB); El Zapote, ± 4
km al NW de Rio Blanbo, municipio de Penamiller, alt. 1600m, E.
Perez y E. Carranza 3798 (IEB)
P. glutinicaule
Hidalgo: Tipo: Ladera norte, Rio Tula a 1550 m, (puente
Tasquillo) 13 millas al norte de lxmiquilpan, diciembre 1° de 1959,
Moran y Kimnach. 7805. Area circundante del geiser de
Tecozautla; barranca de Toliman, cerca de Zimapan, fondo de la
barranca 1200 m y en la mina Lomo de toro a 1400 m; Cerro
Tathi, cerca de Zimapan, Walther (1936).
Queretaro: 6 km al N del río Extorax, municipio de Penamiller, J.
Meyran 2692, segun Moran (1963); Ibíd., E. Pérez y S. Zamudio
S/n. (IEB); Tziquia, frente a la Sabina, municipio de Cadereyta, S.
Zamudio 9013 (IEB).
58
P. hookeri
San Luis Potosi: Puente Tecolote, Sierra Fria, Ahualulco San
Jose de la Purisima, Escalerilla, ranchito de Juarez, acantilados
en montanas de Aguascalientes y oeste de San Luis Potosi entre
2000 y 2500 m. Rocosidades de San Luis Potosí, C.A. Purpus
7685 (UC); disperso sobre acantilados cerca del norte al este de
la carretera, cañón de Rio Cracalbaquero, 10 mi. Al norte de
Ahualulco, 2000 m. C.H. Uhl 1534 (BH, CAS, SD, US).
Localmente comun acantilados cerca del norte Puente Tecolote
km 52 sobre Ia carretera San Luis Potosi a Zacatecas, J. Meyran
2301 (BH, CU, MEXU?, SD). Moran y Uhl 13349 (BH, SD, UC);
comun sobre rocosidades de Escalerilla 2200 m. Moran y
Kimnach 7639 (BH, CAS, CU, SD, US); rocosidades 2400 m
arriba de San Jose de la Purisima, Moran y Kimnach 7645 (CU,
SD); sobre rocosidades 2100 m arriba de Ranchito Juarez, 7 mi.
SE de Zaragoza, Moran y Kimnach 7660(CU, MEXU, SD, US),
R.T. Clausen, 50-37 (BH, CU) comprada en la calle de San Luis
Potosi, dicen que es de un canon y montanas en un mirador de la
ciudad, E. Palmer in 1902, Rose 499 (holotipo de P. uniflorum
Rose, US 399948; isotipos NY, US)
Guanajuato:
Cascada
cerca
de
Picones,
municipio
de
Guanajuato, E. Perez y E. Carranza 2875 (IEB); Guanajuato,
municipio de Guanajuato, A. Duges 153 (GH, US), segun Britton y
Rose (1903).Se ha observado en bosque de encino. Alt. 2150 m.
florece en febrero.
Aguascalientes: Rocosidades volcanicas sombreadas arriba de
2400, ca. 20 km al este de Rincón de Romos, R. McVaugh 23749
(MICH); acantilados igneos cara norte de Sierra Fria, 3.4 mi. Al
este de Tepezala 8400 ft. C.H. Uhl 2109 (BH, SD)
P. kimnachi
Tipo: San Luis Potosi: Ladera este del Pico Agujon, Sierra de la
Equiteria, 22 julio, 1962 Myron Kimnach 290, fl. Abril (SD 64541).
Ladera sur Cerro Agujon, marzo 19 del 2000, I. Garcia y G.
Hernandez 5693 (CIMI, IEB).
P. longifolium
Hidalgo: Paredes de la barranca y aparentemente epifita sobre
arboles de pino, Mpio. Meztitlan. Comun sobre rocas Iadera NE
cerca de la laguna Meztitlan J. Henrickson y B. Christman 2066/
(BH, SD). 2mi. NW de San Cristobal, 1200 m, R. Moran y C. H.
Uhl 13417(BH, MEXU, MICH, SD, UC, US); 3 mi. NW de Meztitlan
1200m R. Moran y C. H. Uhl 13416 (BH, HNT, ICF, SD, MICH,
NY, UC, US); sobre acantilados y arboles del rio Tolantongo, F.
Otero 01 (SD?). Toxhico, al SW de Meztitlán, enero 9 del 2000, I.
Garcia y S. Garcia 5682 (CIMI, IEB).
59
P. machucae
Tipo: Michoacán: Municipio Pajacuarán, 2 km al este de
Pajacuarán, Barranca del Agua, cerca de El Cometa, alt.1850 m,
enero 7 de 1997, I. Garcia Ruiz 4497 (IEB, CIMI, ENCB, MEXU);
El Cometa, alt. 1850 m. bosque tropical caducifolio, J.A. Machuca
N., I. Garcia Ruiz y M. Chazaro B. 7862 (IBUG, WIS, XAL).
P. oviferum
San Luis Potosí: Barranca Bagre, cerca de minas San Rafael
1911 C.A. Purpus
Michoacán: Tipo: municipio de Tuxpan, Cerro Piedra Redonda,
al W de Las Caleras, unos 12 km al W de Tuxpan, alt. 2140 m.
19.X1.1989, R. Torres y P. Ramirez 13705 (holotipo: IEB);
aproximadamente 1 km al SW de Tuxpan, Cerro de la Vibora, en
bosque tropical caducifolio, enero 27 del 2000, I. Garcia 5686
(CIMI); Ibid., marzo 5 del 2000, I. Garcia y J. Garcia 5690 (CIMI).
P. rzedowskii
P. viride
Guanajuato: El Álamo, SW de Xichú, municipio de Xichú, E.
Pérez y E. Carranza 2899 (IEB). Querétaro: Aproximadamente
2.5 km al S de Arroyo Seco, municipio de Arroyo Seco, E.
Carranza 2413 (IEB); ladera NE del Cerro La Tembladera, 10.5
km al NE de Pena Blanca, municipio Penamiller, S. Zamudio 9038
(IEB); Ibid., E. Perez y S. Zamudio 2748 (IEB); Cerro La
Tembladera ladera N al Sur de Camargo, municipio de
Penamiller, E. Carranza 4712 (IEB); Santa María del Mexicano,
ca. 20 km, adelante de Colón municipio de Colon, R. Moran
10179 (ENCB); cliffs 7.7mi NE de Cadereyta, S of San Javier,
municipio de Cadereyta, C.H. Uhl 1853 (MEXU). Crece sobre
riscos casi verticales, en matorral xerófilo. Alt. 1600-2200 m.
florecen durante la mayor parte del ano, principalmente de
noviembre-mayo.
P.
werdermannii
Tamaulipas: Tipo: Valle de Jaumave, al lado de una montaña
entre cactus y arbustos bajos, cerca de 600-700 m, 1933. Prof. E.
Werdermann
Fuente: Purpus (1919); Von Poellnitz, (1937); Werdermann (1937) Walther (1936,1937) Moran
1963,
1965, 1967a, 1967b, 1968b, 1968c, 1971, 1989, 1990, 1991 a, 1991 b, 1992); Meyrán (1963); Kimnach
y Moran (1993); García et al (1999, 2002); Pérez-Calix et Glass (1999). Tambien se revisaron
ejemplares del género Pachyphytum en los Herbarios CIMI del CIIDIR-IPN Michoacan y del IEB del
Instituto de Ecología, A.C., en Pátzcuaro, Michoacán.
60
Se reconoce que teóricamente, las clasificaciones son el marco histórico para
interpretar los patrones de similitudes, interacciones ecológicas y su distribución
geográfica entre taxa como lo mencionan Brooks (1981); Cracaft (1983); Eldredge y
Cracaft (1980); Farris (1979), y que la eficaz sistemática será mayor si el carácter
utilizado no es el resultado de la influencia del medio sobre el fenotipo, el uso directo
del material genético debe aportar los caracteres más fundamentales para una
clasificación (Crawford 1990; Clegg y Durbin 1990). Es considerado “marcador”
(biológico) cualquier característica heredable que nos permita estudiar la diversidad
biológica (Avise 1994). Hasta hace unos cuantos años la mayoría de los
“marcadores” que se utilizaban, eran marcadores morfológicos (fenotípicos), en la
actualidad con el advenimiento de las técnicas de estudio de material genético
(ADN), la tendencia actual es el estudio de la diversidad y variabilidad del material
genético (marcadores moleculares), mismo y no de su expresión fenotípica (Avise
1994).
Los marcadores moleculares pueden ser: las secuencias de ADN y el análisis
de su polimorfismo; con respecto a ésta última, una de las técnicas más recientes es
la del polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP), la cual es
una combinación de RFLP con PCR (Vos et al., 1997), usada entre otros, para
resolver problemas de variación de especies cercanamente relacionadas, que ha
sido difícil de resolver con datos morfológicos (Heun et al., 1997; Rusell et al; 1997).
Actualmente la clasificación taxonómica presenta el problema de ubicar varios
taxa con características intermedias dentro de alguno de los diferentes niveles
taxonómicos (Bremer et al., 1998), considerando a las “especies problema”, como un
desacierto de los biólogos al no acordar con exactitud sobre la identificación de las
especies, actualmente se estima conveniente tomar en cuenta aspectos filogenéticos
dentro de la clasificación (O’Hara 1993; Hey 2001).
Se toma como modelo de estudio al género Pachyphytum, ya que dentro del
conocimiento actual del grupo, los taxa: P. machucae I. García, Glass et Cházaro; P.
61
brevifolium Rose, P. garciae Pérez-Calix et Glass, (Pérez-Calix y Glass 1999.) y P.
rzedowskii I. García, Pérez-Calix et Meyrán (García et al., 2002) es difícil asignarles
un lugar apropiado en el esquema tradicional clasificatorio dentro de alguna de las
tres secciones del género Pachyphytum (García et al, 1999, 2002; Pérez-Calix et
Glass, 1999). Adicionalmente una especie cuyo reporte actualmente se encuentra en
“prensa” (P. contrerassi), por sus características morfológicas se ubica en una
situación taxonómica similar que P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P
rzedowskii; por lo que se considera necesario determinar las relaciones genéticas
interespecíficas de plantas del género Pachyphytum mediante el análisis de su
polimorfismo genético con marcadores AFLP.
62
III MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material biológico
Para
determinar
las
relaciones
genéticas
y
sistemáticas
del
género
Pachyphytum fueron colectadas las 17 especies que conforman este grupo, de las
cuales existen ejemplares de respaldo en un herbario que corroboran su existencia.
Algunos de estos materiales fueron obtenidos de localidades tipo (lugar donde
se desarrollan las especies de plantas descritas originalmente) en diversos estados
de la republica, como Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Guanajuato, Hidalgo,
Aguascalientes, Michoacán y Jalisco (fig. 2).
Con respecto a las especies testigo se consideraron miembros de distintos
grupos relacionados con el género en estudio (Qiu-Yun et al., 1996); y relacionados
con la familia Crassulaceae, (Mort et al., 2001); de tal manera que representen a
grupos específicos de linajes adoptivos asociados a la sección (Starr et al., 1999;
Hansen et al., 1999; Virk et al., 1998; Schmidt y Jensen 2000; van Ham et al., 1994;
van Ham y ‘t Hart 1998).
Las especies testigo de la misma familia botánica que fueron seleccionadas
por
encontrarse
muy
relacionadas
fueron:
Graptopetalum
pachyphyllum,
G.
amethystinum, Sedum corynephyllum y Echeveria fulgens, y como grupo externo se
utilizó Bursera glabrifolia de la familia Burseraceae (cuadro 2).
El material usado se colectó directamente de campo y se acondicionó en
invernadero mediante el transplante en macetas rígidas con un sustrato de arena, jal
y tierra negra en igual proporción, manteniéndose a 30°C de temperatura, con una
humedad relativa de 80%, y riego con agua corriente cada 5-7 días. Aunque por
seguridad, también se mantuvo hasta su utilización, tejido fresco de las especies en
ultracongelador (REVCO) a -70°C.
63
Figura 2. Distribución conocida de las especies del género Pachyphytum, en México.
a) P. bracteosum Klotzsch. Estado de Hidalgo
b) P. brevifolium Rose Estado de Guanajuato
c) P. longifolium Rose Estado de Hidalgo
d) P. compactum Rose Estado de Querétaro
e) P. oviferum C. A. Purpus Estado de San Luis Potosí
f) P. hookeri (Salm-Dyck) Berger Estado de San Luis Potosí
g) P. viride E. Walter Estado de Querétaro
h) P. werdermanniV. Poellnitz Estado de Tamaulipas
i) P. coeruteum Meyrán Estado de Quérétaro
j) P. glutínicaule Moran Estados de Hidalgo y Querétaro
k) P. kimnachi Moran Estado de San Luis Potosí
1) P. fittkaui Moran Estado de Guanajuato
m) P. caesium Kimnach y Moran Estado de Aguascalientes
n) P. machucae 1. García, Glass et Cházaro Estado de Michoacán
o) P. garciae Pérez-Calix et Glass Estado de Querétaro
p) P. rzedowskii 1. García, Pérez-Calix et Meyrán Estado de Michoacán
q) P. contrerassi Pérez-Calix, 1. García et Cházaro (en prensa) Estado de Jalisco
64
Cuadro 2. Lista de taxa y origen del material usado
TAXA
Pachyphytum bracteosum Klotzsch
ORIGEN, LOCALIDAD, COLECTOR, NÚMERO, COLECCIÓN
Cultivado de San Juan Meztitlán, Hidalgo; I. García y S.
García 5684 (CIMI, IEB)
P. brevifollum Rose
P. caeslum Kimnach y Moran
P. coeruleum Meyrán
P. compactum Rose
P. contrerassl Pérez-Calix, 1. García et Cházaro
P. fittkaui Moran
P. garclae Pérez-Calix et Glass
Cultivado del municipio de Guanajuato, Gto. E. Pérez y C. Glass
Cultivado de localidad Tipo, Aguascalientes; I. García
5570 (CIMA; cultivado S/N de C. Glass
Material Tipo, sin localidad conocida. Cultivado del Sr. Yoshida; J.
Meyrán 523, (MEXU52609)
Cultivado del Cerro Zamorano, Querétaro; E. Pérez y E. Carranza
Cultivado de localidad Tipo; Barranca al N. de Guadalajara, Jalisco;
Cultivado del municipio de Victoria, Guanajuato ; E. Pérez y E.
Carranza 2901 (IEB)
Cultivado de localidad Tipo. Querétaro; E. Pérez y S. Zamudio
3574 (IEB); 1. García 5571 (CIMI)
P . glutinicaule Moran
P. hookeri (Salm-Dyck) Berger
P. kimnachl Moran
P. longifolium Rose
Cultivado Del Río Extórax, Querétaro; E. Pérez y S. Zamudio S/N,
Cultivado de localidad Tipo. Guanajuato; C. Glass S/N; Municipio
Cultivado de localidad Tipo, Cerro agujón, San Luis Potosí; L
García y G. Hernández 5693 (CIMI, IEB)
Cultivado del Oeste de Meztitlán, Hidalgo; 1. García y S.
García 5686 (CIMI, IEB)
P. machucae I. García, Glass et Cházaro
P. oviferum C.A. Purpus
Cultivado de localidad Tipo, Pajacuarán, Michoacán; García 4497
Cultivado de C. Glass, localidad Tipo San Luis Potosí; l. García
5573, 5686-C (CIMI)
P. rzedowskll 1. García, Pérez-Calix et Meyrán
Cultivado del municipio Tuxpan, Michoacán, I García et al
5574,5686, 5690 (CIMI, IEB)
P. viride E. Walther
Cultivado del Cerro de la Tembladera Querétaro; Col. E. Pérez y S.
Zamudio 2748 (lEB); L García 5125-bis (CIMI)
P. werdermannü v . Poellnitz
Cultivado del Valle de Jaumave, Tamaulipas; De J. Gpe. Martínez
SIN.; 1. García 5686-D (CIMI)
Graptopetalum pachyphyllum Rose
Graptopetalum amethystinum (Rose) E. Walth.
Sedum corynephyllum (Rose) Fróderstróm
Echeverla fulgens Lemaire
Cultivado de Querétaro; De J. Meyrán S / N
Cultivado de La Sierra de Bolaños, Jalisco; C. Glass S / N
Cultivado de Aprox. 8 km al E del Cerro Agujón, San Luis Potosí; I.
García y G. Hernández SIN
Cultivado del Cerro Prieto, Nuevo Parangaricutíro, Michoacán; I
García et al 4532 (CIMI, IEB, MICH)
Bursera glabrifolla (H. B. K.) Engl.
Cultivado del NE de Jungapeo, Mich.; 1. García S / N
65
3.2 Extracción de ADN .
Para la extracción del ADN se usó el método denominado del “bromuro de
cetil metilamonio” (CTAB) (Doyle y Doyle, 1987, 1990), el cual consiste en: triturar el
tejido vegetal con nitrógeno líquido para minimizar la degradación del ADN. El hielo
formado sirve de abrasivo, el polvo se extrae con el detergente catiónico CTAB, que
solubiliza membranas y desplaza cationes unidos al ADN. El material se tomó
directamente de tejido foliar fresco de plantas cultivadas en invernadero, aunque
también se mantuvo por seguridad material en refrigeración a -70°C, hasta su
utilización. Se molieron dos gramos de tejido fresco en nitrógeno líquido sobre un
mortero y con ayuda de un pistilo hasta obtener un polvo fino; posteriormente el
polvo se mezcló en un tubo de vidrio con 7.5 ml de solución amortiguadora de
extracción [(CTAB 3% (p/v) sigma, NaCI 1.4 M, 2-Mercaptoetanol al 0.1 % (v/v),
EDTA 50 mM, Tris-HCI 100mM, 1 % (p/v) de poi ivinilpirrolidona P.M. 40000, pH 8.0)],
precalentada a 60 °C luego se incubó durante 30-40 min., a 60 °C, agitando por
inversión suave cada 10 min., y enseguida se dejó enfriar (Doyle y Doyle, 1987,
1990).
Posteriormente, se realizó una extracción de los ácidos nucleicos con un
volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1, v/v); se agitó vigorosamente y luego
el homogenizado se centrifugó a 4 °C a 12000 rpm durante 10 minutos; el
sobrenadante fue transferido a otro tubo limpio y el ADN fue precipitado con la
adición de 1 ml de isopropanol y 0.5 vol. de acetato de amonio 7.0 M (0.1 vol. De
acetato de sodio 3.0 M. pH 5.2), seguido por la incubación en hielo hasta la
formación de hebras (Doyle y Doyle, 1987, 1990).
3.3 Purificación del ADN
Las hebras del ADN observadas en las extracciones con el CTAB fueron
colectadas con un gancho de vidrio y se transfirieron a un tubo eppendorf de 1.5 ml.
Estas fueron lavadas con 500p.1 de una solución de etanol al 70% y 10mM de acetato
66
de amonio y luego fueron disueltas en 300µl de solución TE (50mM HCI, 10 mM
EDTA). El ARN fue eliminado con adición de 3µ l de RNAsa a (10mg/ml) e incubados
a 37°C por 60 minutos. Después se le adicionó un volumen igual de la solución fenolcloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1 v/v); se agitó vigorosamente con la mano y
luego fue centrifugado a 12,000 r.p.m. durante 10 minutos, a 4°C. El sobrenadante
fue transferido a un tubo eppendorf nuevo y el ADN fue precipitado con la adición de
0.1 volumen de acetato de sodio 3.0M pH 5.2 y 0.6. volumen de isopropanol. Las
hebras del ADN fueron compactadas por centrifugación y el sobrenadante eliminado
por decantación. La pastilla del ADN fue lavada en dos ocasiones con etanol al 70%.
Una vez seco se resuspendió en 300µl de. TE [Tris-HCI 10mM, EDTA 1mM, pH 8.0],
(Doyle y Doyle 1990; Dellaporta et al., 1983; Lefort y Douglas 1999). El ADN se
guardó en TE a 4°C durante varias semanas.
3.4 Cuantificación del ADN
La concentración de ADN obtenido se calculó por ta medición de la
absorbancia a 260 nm con un espectrofotómetro (Spectronic 21 VM Spectrofotometer
Bauch & Lamb); la pureza respecto a proteínas y polifenoles se determinó por la
relación
de
absorbancia
entre260/280
nm
(A260/A280)
y
260/
230
(A260/A230)
respectivamente (Labarca y Paigen 1980; Dabo et al., 1993). Para ello 3µl de
extracto de ADN fueron disueltos en 600µl de solución TE (10mM Tris HCI pH 8.0, 1
mM EDTA pH 8.0) y transferidos a una celda de cuarzo de 700µl, para obtener la
absorbancia de la solución. Enseguida con este valor se determinó la concentración
© del extracto de ADN, utilizando la fórmula:
C (µg/ml) = (Ab 260/0.020) F
Ab 260= es la lectura de absorbancia a 269 nm.
C= concentración de ADN en microgramos por mililitro.
67
Donde:
F es el factor de dilución
F= Volumen total / Volumen de la muestra
La calidad del ADN fue analizada en muestras por duplicado, sobre la base de
la integridad y a la respuesta a enzimas de restricción y ala amplificación al azar por
la PCR.
3.5 Integridad del ADN
La integridad del ADN purificado, fue analizada por electroforésis sobre un gel
de agarosa de 0.5 cm de grosor al 0.8% (p/v) en el amortiguador de corrida TAE 1X
(40 mM Tris HCI, 10 mM EDTA pH 8.o, 20mM ácido acético glacial). Un volumen de
1µl de la solución de ADN se mezcló con 2.5µl de solución amortiguadora TAE 1X y
con 2.5µl de amortiguador de carga “blue juice” 10X (65% p/v sucrosa, 10 mM Tris
HCI pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.3% p/v de azul de bromofenol). Posteriormente, la
dilución fue colocada en los pozos del gel de agarosa con ayuda de micropipetas.
También se colocaron en los pozos de los extremos laterales 3µl del marcador de
peso molecular 1 Kb plus (de la empresa Gibco). El gel se corrió durante 10 minutos
a 100mA, posteriormente alrededor de 90 minutos a 85 mA, en una cámara de
electroforésis horizontal conteniendo el TAE 1X. Una vez terminada la corrida
electroforética, el gel se tiñó en una solución de 0.5µl/ml de bromuro de etidio en
agua de acuerdo a Lucey et al., (1997). Se agitó suavemente por aproximadamente 5
minutos y luego se enjuagó con agua destilada por 15 minutos. Enseguida el gel fue
examinado en el transiluminador de luz ultravioleta para visualizar las bandas de
ADN y captar la imagen, con el sistema de análisis de imágenes Eagle EyeTM II,
(Stratagene), para su posterior edición e impresión.
68
3.6 Análisis AFLP del ADN
La técnica AFLP, constó de tres pasos principales: a) el ADN genómico fue
cortado con endonucleasas de restricción (Eco RI y Msel) (adquiridas por el
Cinvestav-Irapuato) y ligado a adaptadores específicos (Eco RI y Msel), b)
amplificación por PCR de los fragmentos cortados y c) el análisis de los fragmentos
amplificados en geles de poliacrilamida por medio de radioisótopos (Vos et al., 1995).
(Esta técnica se desarrolló en el laboratorio de genética (L-6) del Cinvestav-Irapuato).
3.7 Restricción del ADN
0.5 ng de ADN fueron mezclados con 5p.l de solución amortiguadora RL 10X
[Tris-HCI 10mM, acetato de magnesio 10mM, acetato de potasio 50mM DTT pH 7.5]
1µl de endonucleasa EcoR1 de 10U/µl (Boehringer) y 1µl de la enzima Msel (se usó
el isosquisómero Tru91) a 4U/µl (Biolabs). La mezcla se aforó a 50µl con agua
desionizada estéril, se agitó por inversión y se incubó 4 horas a 37°C. Posteriormente
las enzimas se desactivaron sometiendo la mezcla a 70°C por 15 minutos, después
de lo cual los tubos se colocaron en hielo (Vos et al., 1995, Simpson et al., 1999).
3.8 Ligación de los adaptadores
Los iniciadores y adaptadores utilizados fueron sintetizados en el laboratorio
de Química de ADN del CINVESTAV, Unidad Irapuato, la secuencia de los
adaptadores fue la siguiente:
Adaptador EcoRl: 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
3’- CTGACGCATGGTTAA-5’
Adaptador Msel: 5’-GACGATGAGTCCTGAG –3’
3’- TACTCAGGACTCAT-5’
A los tubos conteniendo ADN digerido se les agregó la mezcla de ligación
compuesta por 1µl del adaptador EcoR1 de 10U/µl, 1µl del adaptador Mse1 de
69
1 OU/µl, 1.2 µl de ATP 1 0mM pH 7, 1µl de amortiguador RL 1 0X, 1 µl de ligasa T4 de
ADN 1U/µl y 4.8µl de agua desionizada estéril. La mezcla se incubó toda la noche a
15°C, y después los productos se guardaron a -20°C hasta su utilización en la
primera amplificación (Vos et al., 1995; Simpson et al., 1999).
3.9 Primera amplificación
Después de varias pruebas, y en función de la cantidad de ADN presente en
cada muestra, el producto ligado se diluyó 1:15 ( muestras 1-13), y 1:5 ( muestras
14-22), y se tomaron 5µl, los cuales se colocaron en tubos eppendorf de 0.5 ml,
mismos que se les adicionó 2.5µl de la mezcla 1 de iniciadores, compuesta por 1.5µl
de EcoR1+1, y 1.5µl de Mse1+1, 2µl dNTPs (10mM) en 20µl de agua desionizada;
asimismo se adicionaron 2µl de la mezcla 2 compuesta por 0.2µl Taq polymerasa,
5µl del amortiguador PCR .10X, (contenido) en 14.8µl de agua desionizada.
Posteriormente la mezcla contenida en el tubo fue agitada por inversión, luego se
sometió a la reacción de amplificación en un termociclador Pelkin Elmer 9600, por 30
segundos a 94°C de desnaturalización, 60 segundos a 56°C de empalme o
acoplamiento y 60 segundos a 72°C de polimerización, por 20 ciclos. Los productos
obtenidos se almacenaron a 4°C hasta la utilización en la segunda amplificación (Vos
et al., 1995, Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).
3.10 Marcaje y selección de los iniciadores
El iniciador que se marcó radioactivamente fue el EcoR1 +3. El marcaje se
realizó con la siguiente mezcla: 1µl de
32
P (gama-ATP, 750 Ci/mmol), 2.5µl del oligo
EcoR1 +AGG, 0.5µl de Kinasa T4 (10U/µl), 2p.l de amortiguador-T4 Kinasa 5X, y se
agregaron 4 µl de agua desionizada estéril, después esta reacción se incubó una
hora a 37°C, transcurrido este tiempo la enzima T4 Kinasa se inactivó al haberla
sometido a 65°C durante 10 minutos (Simpson et al., 1999). Se probaron dos
70
combinaciones de iniciadores para la primera amplificación, de las cuales se
seleccionaron: EcoRI+A y Msel+A
3.11 Segunda amplificación
Los iniciadores utilizados para la segunda amplificación fueron:
EcoRl+3
5-GACTGCGTACCAATTC/AGG-3’
Msel+3
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ATC-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAAIACC-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ACA-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/ACG-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAA/AAA-3’
En un tubo de PCR se colocaron 5µl directamente de cada muestra de la
primera amplificación, al cual se adicionaron 5.0µl de la mezcla 1 [0.5µl
32
P EcoR1+3
(10ng/µl), 0.6µl del oligo Mse1+3 (50ng/µl), 0.4µl de dNTPs (10mM), 3.5µl de agua
desionizada estéril], también se adicionaron 10µl de la mezcla 2 (2.0µl de
amortiguador de PCR 10X, 0.2µl de taq polimerasa (Boehringer) y 7.8µl de agua
desionizada estéril). Posteriormente el tubo se agitó por inversión y se colocó en el
termociclador, y se corrió 1 ciclo a 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 30
segundos de empalme a 65°C y 60 segundos de polimerización a 72°C, seguido de
otros 24 ciclos a las mismas condiciones, excepto la temperatura de empalme, que
fue descendiendo 0.7°C durante los primeros 11 ciclos, hasta llegar a 56°C (Vos et
al., 1995, Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).
Para la segunda amplificación se seleccionaron cinco combinaciones de
oligonucleótidos
para
la
evaluación
final
-(AGG/ATC,
AGG/ACC,
AGG/ACA,
AGG/ACG, y AGG/AAA). Dicha selección se realizó con base al número de bandas
polimórficas producidas.
71
3.12 Separación de productos de amplificación
La solución para preparar los geles de acrilamida al 6% se realizó a partir de
150 ml de una solución base de acrilamida al 40% [ la cual se preparó utilizando 380
gr de acrilamida Gibco, 20 gr de bisacrilamida (Gibco), seguida de una desionización
con 2% de resina AG501-X8 de bio-radpor durante una hora a temperatura ambiente,
después se filtró la solución con membrana de 1.2 mM millipore y se aforó a un litro
con agua desionizada estéril], 100 mi de solución TBE 10X (Tris base 1 M, ácido
bórico 1 M, EDTA 20mM), finalmente se adicionaron 700 ml de solución de urea 8 M
ajustándose a un volumen de un litro con agua desionizada estéril. La separación de
los fragmentos amplificados se realizó en geles de 35X45 cm, para la preparación del
gel se tomó de la solución de acrilamida al 6%, a la cual se le adicionó 360µl de
persulfato de amonio al 10% y 36 µl de TEMED. Las cámaras de electroforesis que
se utilizaron fueron las de secuencia de Bio-Rad 3000, el gel se precorrió con
amortiguador TBE 0.5X durante 30 minutos a 2000 volts (Dowiing et al., 1996;
Simpson et al., 1999, Caicedo et al., 1999).
Se tomó una alícuota de 3µl del ADN amplificado y se colocó en un tubo
Eppendorf, al cual se le adicionaron 3µl de amortiguador de carga (formamida 955,
azul de bromofenol 0.05%, Xilen-cianol 0.05%, EDTA 10 mM). Después se colocó en
un agitador durante 3 minutos a 95°C para desnaturalizar el ADN; se enfrió
rápidamente, colocando los tubos en hielo. Posteriormente, se tomó una alícuota de
4 µl de dicha mezcla y se cargaron en el gel, incluyendo el marcador de peso
molecular en escalera de 123 pares de bases (Dowling et al., 1996). El gel se corrió
a 2000 volts durante 3 horas. Después de terminada la electroforésis, se retiró el gel
de la cámara, poniéndose los cristales sobre la mesa y con ayuda de una espátula,
éstos se separan. Posteriormente, sobre el gel se colocó una hoja de papel whatman
de 3 mm cortado a la medida, se levantó el papel con el gel adherido, en seguida el
papel se clocó sobre la mesa y se cubrió con papel celofán, luego se puso a secar
en un secador de geles. Posteriormente el gel se fijó con cinta adhesiva al cassete
de exposición y esta se cubrió con la película BioMax de 35X43 cm de Kodak (Lin y
72
Kuo 1996, Simpson et al., 1999), finalmente el cassete se colocó en un refrigerador
Revco a -80°C durante un promedio de 24 horas. Finalmente, se realizó el revelado
dentro del cuarto obscuro, retirando la película (autorradiograma) del cassete que la
contenía, el revelado es inmediato de similar forma que las películas instantáneas de
Kodak.
3.13 Análisis de datos
3.13.1 Construcción de la tabla de contingencias
Los patrones de las bandas obtenidos con los diferentes iniciadores, se
examinaron visualmente en los autorradiogramas obtenidos de los geles de
acrilamida. Para generar una tabla de contingencia, tales datos fueron registrados
como variables discretas utilizando 1 para indicar la presencia y 0 para la ausencia
de las bandas en cada una de las especies, a partir de esta tabla de contingencia se
obtuvo el estimador de distancias genéticas utilizando el método de Skroch et al.,
(1992). Posteriormente de la interpretación ocular de presencia o ausencia (1 ó 0) de
bandas polimórficas de ADN en las autorradiografías producto del gel de acrilamida,
se elaboran las tablas de contingencia construyéndose con estos datos una matriz
de las medidas de similaridad genética de las unidades taxonómicas operacionales
(OTUs) por medio de un algoritmo.
3.13.2 Análisis del agrupamiento
A partir de los estimadores de las distancias genéticas (tabla de contingencia,
0/1), se elaboró una matriz con la cual se construyó el dendrograma. El análisis por
agrupamiento, se realizó con diferentes medidas de similaridad genética, esto con la
finalidad de comparar los diversos métodos, y detectar el que se ajustara mejor a las
condiciones “reales” de agrupamiento: A) Coeficiente de apareamiento simple
(Sneath y Sokal 1973; Sckroch et al., 1992) “Manhattan”, con base en sitios iguales
(0, 0 ó 1, 1) entre total de sitios. B) Nei y Li, “Nei” (Nei y Li 1979), que dice: “el doble
del número de bandas compartidas sobre el total de bandas” (en ambos individuos).
73
C) Jaccard, “binary” (Sneath y Sokal, 1973). Posteriormente se utilizaron diferentes
métodos de obtención de dendrograma: UPGMA (average ó promedio), Vecino
cercano (connected), y Vecino lejano (compact).
Con respecto al análisis de agrupamiento de las relaciones genéticas entre las
especies del género Pachyphytum, la disimilaridad genética se midió con los
diferentes métodos mencionados, seleccionándose por la claridad del gráfico, el del
coeficiente Nei y Li (“Nei”), el cual no toma en cuenta las lecturas (0,0); esto es,
cuando las bandas están ausentes en los individuos muestreados, y les da mayor
peso a las coincidencias (1,1). La obtención del dendrograma fue por medio del
método del vecino lejano “compact”, el cual mostró una distribución de las
agrupaciones mas clara que con los otros métodos. Se utilizaron los intervalos de
confianza de Felsenstein “bootstrap” (Felsenstein 1985), con 3000 repeticiones.
Todas las operaciones se realizaron utilizando el programa estadístico S-Plus 2000
(Everit 1994; Schumaker 2001).
74
IV RESULTADOS
La técnica empleada para la extracción del ADN (CTAB), permitió obtener
material suficiente y de considerable grado de pureza de las 17 especies en estudio,
y las cinco del grupo testigo. Dos de las especies (Pachyphytum compactum, y P.
caesium) presentaron dificultad para la extracción de dicho material genético, por lo
cual fue necesario realizar adecuaciones a la técnica (fig. 3).
Figura 3. Electroforésis en gel de agarosa del ADN aislado de las 22 especies
estudiadas, por medio de la técnica del CTAB carril 1-17 especies de Pachyphytum;
18-22 especies testigo. La marca de peso molecular 1 Kb plus (Gibco) a los costados
derecho e izquierdo.
75
4.1 Reacciones de la técnica AFLP
En el gel de electroforésis de acrilamida se presentó un patrón de bandeo muy
variable, siendo necesario realizar una revisión de la técnica en las reacciones
llevadas a cabo en la primera y segunda amplificación del ADN. En principio se
sospechó que se debió al uso de la Taq polimerasa de la marca Gibco. Por lo que se
procedió a realizar distintas pruebas, iniciando con la variación del amortiguador T4
(Exchange y Forward), y el uso de Taq polimerasa marca Roche y Gibco, así como
con una marca radioactiva (32P
℘ -ATP) más reciente; además de modificar el
producto de la primera amplificación en una proporción 1:30. Los resultados tuvieron
diferencias que favorecieron el patrón de bandeo con el uso de la Taq polimerasa
marca Roche y el amortiguador T4 forward. Esto pudiera ser efecto de mejores
condiciones con la mezcla dei material.en estudio.
Apreciando lo anterior, el número de bandas observadas en los geles de las
distintas combinaciones (AGG/ATC, AGG/ACC, AGG/ACA, AGG/ACG, y AGG/AAA),
presentaron un número considerable de bandas polimórficas, lo que se traduce en
mayor cantidad de información de cada especie, consecuentemente en mayor
probabilidad de obtener resultados confiables.
4.2 Polimorfismos de Pachyphytum con AFLP
Es importante notar sobre el patrón de bandeo que manifestó la especie
Pachyphytum glutinicaule, fue legible desde los 50, hasta por arriba de los 525 pares
de bases en todas las combinaciones de iniciadores usadas, situación que no se
presentó en ninguna de las demás especies muestreadas. Podría esto deberse a que
los iniciadores usados permitieron mejor expresión en dicha muestra, o que el ADN
de dicha especie resultase de mejor calidad.
76
Se obtuvieron un total de 497 bandas distintas con las cinco combinaciones
usadas. De éstas resultaron legibles 406 bandas, siendo polimórficas 375, el 92.4 %
(cuadro 3).
Cuadro 3. Número de bandas obtenidas con el análisis de marcadores tipo AFLP, con cinco
combinaciones de iniciadores de 17 especies de Pachyphytum.
COMBINACIÓN
AGG/ATC
AGG/ACC
AGG/ACA
AGG/ACG
AGG/AAA
BANDAS TOTALES
OBTENIDAS
96
103
92
103
103
BANDAS LEGIBLES
79
91
75
81
80
El número de bandas polimórficas por combinación de oligonucleótidos varió de 75 a
91, con un promedio de 81.2, mientras que la longitud de las bandas se manifestaron
entre los 75 y 525 pares de bases (pb) con respecto al peso molecular (Figura 4 y 5).
77
Figura 4. Autorradiografía del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo de
especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo(18-22), obtenido a partir de la
técnica AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACA/M-AGG. Las flechas del
costado izquierdo señálan algunas de las bandas monomórficas más evidentes.
78
Figura 5. Autorradiograma del gel de poliacrilamida presentando patrones de bandeo de
especies de Pachyphytum (1-17) y especies testigo (18-22), obtenido a partir de la técnica
AFLP, con la combinación de iniciadores E-ACG/M-AGG. Las flechas señalan algunas de las
bandas monomórficas. La escala de la izquierda corresponde a las pares de bases (Pb) del
marcador de peso molecular usado (escalera 123 pb). La escala de la derecha indica la
numeración de las bandas legibles encontradas.
79
4.3 Relaciones genéticas interespecíficas
Una
vez
que
se
obtienen
las
autorradiografías
con
las
diferentes
combinaciones, se interpretan las bandas polimórficas y se elaboró la tabla de
contingencias con los valores de presencia/ausencia (1, 0). Con esta tabla en el
programa Excel de Word, se exportó al programa S-plus 2000, en el cuál por medio
de un algoritmo, se obtuvo una matriz; a partir de la ésta se les asignó cierta función
del coeficiente de similaridad genética por medio de la cual se construyeron los
diferentes dendrogramas de las relaciones interespecíficas.
Se presentan los dendrogramas logrados por agrupamiento con las diferentes
coeficientes de similaridad genética (Nei y Li “Nei”; apareamiento simple “manhattan” y
Jaccard “ Binary”), así como por medio de tres métodos de obtención de los mismos
(UPGMA, método del promedio de grupo ó “average”; distancia mínima, ligamiento
simple o de conexión corrnected, ó tambien llamada del “vecino cercano” y distancia
máxima, ligamento completo, ó denominada compacto, compact ó “vecino lejano”),
(figs. 6-14).
80
Figura 6. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética "Manhattan" / average.
La especie P. glutinicaule, queda fuera del grupo principal, junto con los grupos testigo.
Figura 7. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / compact.
La especie testigo B . glabrifolia, separa en dos a las especies en estudio, lo cual no es factible.
Figura 8. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Manhattan” / connected.
De nuevo, la especie P. glutinicaule se comporta junto con los grupos testigo.
81
Figura 9. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / average.
Este grafico, agrupa de manera clara las especies testigo, no así con el grupo en estudio.
Figura 10. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / connected.
Similar al anterior, en el grupo en estudio no se encuentran claros los agrupamientos formados.
Figura 11. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Binary” / compact. Gráfico
con mayor representatividad, la separación entre el grupo en estudio y el testigo son más claras.
82
Figura 12. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / compact. Similar al
anterior, se agrupan más claramente las especies en estudio, mejora la interpretación de sus
relaciones.
Figura 13. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / connected.
Gráfico que no representa claridad entre las relaciones del grupo en estudio.
Figura 14. Dendrograma utilizando el coeficiente de similaridad genética “Nei” / average.
Similar al anterior, son poco claras las relaciones entre las especies del género Pachyphytum.
83
De acuerdo con la topología y el desarrollo de los diversos dendrogramas, se
considera que el agrupamiento obtenido con el coeficiente de Nei y Li “Nei” con el
método “compact” (fig. 12), brinda la información más adecuada sobre las dos
principales asociaciones entre las especies del género Pachyphytum, lo que permite
corroborar la hipótesis planteada inicialmente respecto a la modificación de la
clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel sección, si
se agrupan con relación a su polimorfismo genético.
Los resultados obtenidos con el remuestreo bootstrap (3000 repeticiones)
respecto, a las relaciones genéticas en el dendrograma, realizado mediante el
método de agrupamiento con el coeficiente “Nei” y por medio del análisis del vecino
lejano (compact), indican que la topología del árbol obtenida no varió con respecto a
la mostrada originalmente, lo cual confirma que entre las especies del género
Pachyphytum, se forman dos agrupaciones principales; los valores en los nodos
indican sus respectivos niveles de confianza (fig. 15).
El análisis del dendrograma obtenido (fig. 15), muestra que a un nivel de 46%
de disimilaridad (ó 54% de similaridad) aproximadamente, se forman dos principales
agrupaciones:
(A),
formado
con
Pachyphytum
glutinicaule,
agrupado
con
P.
longifolium, P. bracteosum P. brevifolium, P. oviferum, y P. hookeri. El segundo B),
más numeroso incluye al resto de las especies del género, con P. machucae, P.
garciae, P. viride, P. werdermannü, P. coeruleum, P. caesium , y P. rzedowskii, P.
contrerassi, P. compactum, P. kimnachi, P. fittkaui.
84
Figura 15. Dendrograma obtenido por medio de “Nei” y compact con un bootstrap de 3000
repeticiones. Las flechas del lado derecho señalan los puntos de intersección con la línea
punteada a un nivel de disimilaridad de 0.46, mismas que originan los agrupamientos (A y B)
logrados, los números en los nodos significan los valores de confianza en cada agrupación.
Del lado izquierdo se señalan con asterisco las “especies problema” de ubicar dentro de
alguna sección del género Pachyphytum. Los grupos testigo se ubican en los extremos
superior e inferior.
85
En la primera agrupación (A), se ubican seis especies; formando tres
subagrupaciones principales, una sólo incluye a Pachyphytum glutinicaule, que se
une a otro subgrupo a un 60% de similaridad, y un coeficiente del 17% de confianza;
este subgrupo está conformado a su vez por Pachyphytum longifolium unido a un
71 % de similaridad y un 99% de confianza con un par de especies conformadas por P.
bracteosum y P. brevifollum las cuales se agrupan a un 82% de similaridad y con
un intervalo de confianza de 86%; estas últimas tres especies unen a un 65% de
similaridad con otras dos y con un 42% de confianza, estas son P. oviferum y P.
hookeri unidas entre si a 68% de similaridad con un 19% de confianza.
La segunda agrupación (B), incluye al resto de las especies (11); y lo
conforman cuatro principales subgrupos; el primero constituido por Pachyphytum
machucae unido a P. garciae a un 77% de similaridad con un 81 % de confianza, las
que a su vez se agrupan a un 58% de similaridad y un 45°lo de confianza con la
segunda subagrupación: P. viride y P. werdermannii unidas a un 74% de similaridad
y con un 81 % de confianza; estas se unen una agrupación a un 63% de similaridad
con una confianza de un 8%, dicha agrupación se subdivide para formar el tercer
grupo conformado por P. coeruleum unida a un 67% de similaridad y un 46% de
confianza Con P. caesium y P. rzedowskii las cuales están agrupadas a un 68% de
similaridad y una confianza de 98%; éstas se unen al cuarto subgrupo a un 64% de
similaridad y con un 8% de confianza. Las especies de este cuarto subgrupo lo
conforman P. contrerassi unido con P. compactum a un 68% de similaridad y una
confianza de 31 %, así como a P. kimnachi y P. fittkaui las cuales están unidas entre
si a un 82% de similaridad y con un 100% de confianza.
86
V DISCUSIÓN
5.1 Uso de la técnica AFLP
Se considera necesario incorporar nuevos tipos de datos, en particular los
moleculares, donde los caracteres morfológicos no han resuelto los problemas
taxonómicos (González 1997). Como se ha mencionado desde la aparición de la
técnica AFLP en 1995 (Vos et al), reportes de datos publicados en varios artículos
han demostrado su eficiencia para la caracterización de germoplasma, estudios
filogenéticos en diferentes organismos incluyendo plantas, bacterias, hongos; así
como en estudios de caracterización de poblaciones genéticas y para el mapeo de
diferentes especies de interés económico (Lin y Kuo 1996; Majer et al., 1996; Becker
et al., 1995; Cervera et al., 1996a). Además de que ha sido rápidamente adoptada
por grupos que trabajan campos del mapeo molecular y filogenias (Simpson 1997b).
Acorde con lo anotado por Soltis y Soltis (2000a), los árboles filogenéticos
brindan las bases críticas, no solo para estudios sistemáticos, sino también para
investigaciones en evolución molecular y genética comparativa. Las hipótesis sobre
sus relaciones ya sea basada en datos moleculares (incluyendo DNA, datos de
secuencias, cambios estructurales y pérdidas de gen/intron), morfología y otros
caracteres relacionados con el DNA, o una combinación de caracteres, proveen de
una red muy útil de comparación evolutiva.
La gran utilidad de marcadores moleculares surge de seis propiedades inherentes
que las distinguen de los marcadores morfólógicós (Powell et al., 1996).
• El fenotipo de la mayoría de los marcadores morfológicos pueden ser
determinados en todos los niveles de plantas, por lo que pueden ser hallados
en loci moleculares de tejidos y niveles celulares.
• La frecuencia de alelos tiende a ser mayor en loci moleculares comparados
marcadores morfológicos.
87
• Adicionalmente los mutantes morfológicos tienden a asociarse con efectos
fenotípicos no deseables.
• Los alelos en loci morfológicos interactúan de manera dominante- recesivo que
limita la identificación de genotipos heterogocigotos.
• Los loci moleculares exhiben una forma de herencia codominante que permite
la identificación genotípica de individuos en una población segregada.
•
Pocos efectos epistáticos o pleiotrópicos se observan con marcadores
moleculares como con marcadores morfológicos, por esto un gran número de
marcadores polimórficos pueden generarse y monitorearse de un cruzamiento.
Por lo que se demuestra que los AFLP brindan una técnica diferente, la cual
muestra gran potencial para el uso e investigación del genoma (Poweil et al., 1996).
Con respecto a la comparación de la información obtenida con los AFLP y otras
técnicas referentes al estudio del análisis de diversidad y filogenia (Sharma et al.,
1996), concluyen que los AFLP detectaron mayor nivel de polimorfismo que con los
RAPDs. Ya que el nivel de variación detectado con los análisis AFLP indican que
esta es una mayor y mejor tecnología en la construcción de mapas de linajes
genéticos. Al respecto Simpson (19972) menciona que los AFLP son marcadores
multilocus, los cuales brindan una amplia información del genoma de diferentes
individuos. Asimismo menciona que la principal ventaja radica en el análisis de
muchos loci de manera simultánea de la totalidad del genoma, registrando
rápidamente un gran número de marcadores (Simpson 1997b).
El uso de marcadores moleculares presenta ventajas y desventajas, de manera
general se puede mencionar que todas las técnicas basadas en el análisis del ADN
son caras comparativamente con las isoenzimas o marcadores morfológicos, sin
embargo la cantidad de información obtenida compensa este factor (Simpson
1997b). El uso de los RAPDs y DAFs no ocupan del uso de radiactividad y son
relativamente más baratos, sin embargo estos sistemas de marcadores han sido
criticados por la ausencia de reproducibilidad. La técnica AFLP incluye el uso de
88
radiactividad, pero actualmente se ha empezado a hacer uso de la etiquetación por
medio de fluorescencia (Simpson 1997b). Por lo que puede considerarse que la
integración de métodos de marcadores moleculares es esencial para el análisis y
caracterización de genoma en distintos grupos de interés.
Comparativamente con el método normal de RFLP, pruebas específicas son
usadas en una reacción de hibridación en orden para detectar secuencias homólogas
a la prueba entre cientos de fragmentos producidos cuando el ADN es objetó de
digestión con una enzima de restricción (Simpson 1997b). Los polimorfismos ocurren
cuando las mutaciones afectan la posición de un sitio en una enzima de restricción
de un individuo al ser comparado con otro. Los fragmentos de restricción resultantes
podrían ser de diferentes tamaños y bandas migrantes diferenciadas durante la
electroforésis podría observarse siguiendo al análisis de hibridación. En el caso de
los AFLP una selección o grupo de fragmentos de restricción del genoma digerido,
mismo que puede ser fácilmente obtenido y analizado (Simpson 1997ª).
La existencia de variación en los patrones de bandeo resultantes del gel de
acrilamida con las diferentes combinaciones usadas en el presente estudio,
permitieron la revisión de cada paso en la primera y segunda amplificación de la
técnica AFLP (Vos et al., 1995; Simpson 19971), considerándose importante la
proporción de ADN de la primera amplificación (1:30), así como una marca
radioactiva más reciente. Con el uso de estas estrategias se obtuvo una mejor
resolución en el patrón de bandeo obtenido. Una alternativa al uso de la marca
radioactiva, es la detección mediante la quimioluminiscencia o la fluorescencia (Lin et
al., 1997; Vaillancourt et al., 1992; Huang y Sun 1999).
Durante la segunda amplificación realizada (de la técnica AFLP) se seleccionaron
cinco
combinaciones
AGG/ACC,
AGG/ACA,
de
oligonucleótidos
AGG/ACG,
y
para
la
AGG/AAA),
evaluación
mismas
final
que
(AGG/ATC,
permitieron
la
obtención de un numero adecuado de bandas legibles así como una proporción de
bandas polimórficas para su análisis. Es .probable que con un mayor número de
89
combinaciones, el número de bandas proporcionalmente se incremente, mejorando o
haciendo más confiables los resultados, como ha sido estimado en otros trabajos por
Yee y colaboradores (1999). El hecho de realizar el análisis con un número reducido
de iniciadores podría ser considerado como una limitante; sin embargo es también
probable que los resultados finales obtenidos (matriz y dendrograma) no se vean
alterados. Esto sólo podrá probarse en la práctica con la realización de una mayor
cantidad de combinaciones de iniciadores, además del uso de diferentes métodos de
agrupamiento y por medio de diversos programas estadísticos de cómputo para su
interpretación como el PHYLIP, PAUP o el MaCClade entre otros (Backeljau et al.,
1996).
5.2 Polimorfismo del ADN
Como se observó el análisis AFLP de las distintas especies del género
Pachyphytum nos arrojó un total de 497 bandas, de las cuales resultaron legibles 406
de estas. Para esto se llevaron a cabo cinco combinaciones de iniciadores selectivos
E+3/M+3:
EcoRI+ATC,
EcoRI+ACC,
EcoRI+ACA,
EcoRI+ACG
y
EcoRI+AAA
(Cuadro 3). El promedio de bandas polimórficas fue de 92.4%. Comparativamente
mayor que otros análisis AFLP de estudios similares (Mace et al., 1999a; Lecerteau y
Szmidt 1999; Yee et al., 1999; Teulat et al., 2000), por lo que resulta alto el valor
obtenido, e indica la proporción de loci polimórficos, así, el significado de
heterogeneidad por locus, brinda una manera de medir la diversidad genética dentro
de especies; como es anotado por Sharma y colaboradores (1996).
El dendrograma obtenido por el método del vecino lejano “compact” fue el que
se mostró mejor desarrollado, sin embargo como lo anota Koopman y colaboradores
(2001), al menos parte de las bandas representan marcadores codominantes que
tienen tres estados de carácter 0/0, 1/0, 1/1, lo cual puede incluir homoplasias en el
juego de datos y posiblemente divida a un árbol con topologías erróneas en el
análisis cladístico. Asimismo, dichos autores consideran que los análisis fenéticos y
cladísticos realizados en Lactuca, en casos de topologías idénticas, las homoplasias
90
son menores, lo que no afecta a las conclusiones de las relaciones entre las
especies; inclusive cuando las homoplasias son mayores por diferencias entre los
análisis, las interrelaciones no se afectan a pesar de las objeciones teóricas. Este
tipo de análisis de agrupamiento también fue usado por Xu, et al (2000), con éxito
para caracterizar cultivos de Vigna angularis entre poblaciones y entre individuos.
Se considera que el método ó coeficiente (Nei y Li), sobrestima (no toma en
cuenta los casos 0,1), la disimilaridad entre individuos sobre todo en situaciones de
especies de la misma población o individuos de la misma especie (Everit, 1993);
acorde con el primer punto; sin embargo se piensa que con respecto al segundo, no
fue el caso del presente' trabajo, ya que se emplearon distintas especies de
diferentes poblaciones.
La toponimia, o forma general en que se presentaron las agrupaciones en el
árbol por medio del coeficiente de Nei y Li “Nei” y el de Jaccard “Binary”, a través
del método “compact”, están muy relacionados, coincidiendo con lo anotado al
respecto por Milbourne, et al., (1997), y Koopman, et al., (2001), excepto por los
valores de similaridad que presentan, considerándose que el coeficiente de “Nei” le
da mayor peso a las coincidencias que al coeficiente de “Jaccard” (Everit, 1993).
Las
asociaciones
de
marcadores
genéticos
por
medio
del
análisis
de
agrupamiento se consideran muy útiles ya que incluyen un gran número de
caracteres y porque es una clasificación jerárquica que puede ser usada para decidir
los niveles umbrales de similaridad entre especies (Singh 1999). Asimismo, indican la
formación
de
agrupaciones
muy
distintas
a
las
consideradas
a
partir
del
planteamiento clásico basado en análisis morfológico y anatómico.
A pesar de la frecuente utilización de datos moleculares, existen controversias
sobre su uso en sistemática. El principal hace referencia, que si los datos
morfológicos son mejores que los moleculares para inferir filogenias o viceversa, a
pesar de que hay pocos estudios comparativos y los existentes han demostrado que
91
la divergencia morfológica y la molecular son muy independientes (Wilson et al.,
1974, 1977). Hillis (1987) concluye que la combinación de datos moleculares con los
morfológicos maximizará, tanto la utilización como el contenido de la información, y
este tipo de análisis son los que se están realizando (por ejemplo Chase et al., 1995;
Uhi et al, 1995; Kress 1995).
Los sistemáticos evolutivos intentan utilizar toda la información contenida en
las diferentes dimensiones de la filogenia (Takhtajan 1997). Esto debe dejar claro
que la elaboración de clasificaciones (incluso a nivel de especies) consiste en
realizar los análisis cladísticos y desarrollar la clasificación a partir de la serie de
grupos monofiléticos descubiertos en un cladograma (Mishler y De Luna 1997).
De esta manera se considera que sí existe variación entre las agrupaciones de
las especies del género Pachyphytum a partir de marcadores moleculares tipo
AFLP, y las agrupaciones de las secciones conocidas por aspectos morfológicos;
ubicando a la mayoría de la especies problema (P. machucae, P. garciae P.
rzedowskii
y P. contrerassi) en el grupo (B), y a P. brevffolium en el grupo (A)
conformado por seis especies.
5.3 Evidencia Filogenética
Como es mencionado por Cantino y Wagstaff (1998), la filosofía general
aplicada en este tipo de estudios son que la clasificación debe reflejar una filogenia
cuando existe evidencia filogenética; cuando no se ha realizado ningún análisis
cladístico, o cuando los resultados de cada análisis son indecisos, uno podía
delimitar los taxa lo mejor que se pueda sobre las bases de una combinación de
probables sinapomorfias y discernir sobre vacíos de información fenética.
De igual forma es considerado que las clasificaciones formales se elaboran
para varios propósitos, lo cuales incluyen: comunicación almacenamiento de datos,
predictividad y su función en teorías. El último criterio mencionado es posiblemente el
92
menos conocido como una propiedad deseable de una clasificación. No obstante, el
papel que las clasificaciones tienen en teorías es el propósito más importante
(Mishier y De Luna 1997).
Los taxa filogenéticos son naturales en el sentido de que son entidades
resultantes de (y participantes en) procesos evolutivos. Indudablemente, es posible
que estos procesos y la selección natural puedan moldear organismos que son
similares a pesar de que no estén filogenéticamente relacionados. Aún en estas
situaciones, las similitudes no se presentan en todos los casos, sino sólo algunos
caracteres particulares influidos por la selección funcional. En relación a todos los
caracteres, es mucho más probable que la mayoría de las similitudes se deban a
ancestría común (homología táxica) que a la selección por un ambiente común
(analogía). Esta posición es robusta ya sea para el análisis de datos morfológicos o
moleculares (Mishler y De Luna 1997).
De manera expresa, hasta la fecha no existe algún trabajo reportado sobre la
filogenia del género Pachyphytum. Sin embargo, análisis cladísticos recientes del
ADN del cloroplasto (cpDNA) en la familia Crassulaceae (Ham 1994; Ham y t’Hart
1998), y del gen matK (Mort et al., 2001), incluyen la representación de Pachyphytum
dentro de la subfamilia Sedoidea y Crassuloideae; la primera con siete clados, dentro
del cual el clado Acre incluye los más variables y confusos taxa, esto en base a datos
cromosómicos, incluidos Pachyphytum, Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y las
especies mexicanas del género Sedum (Mort et al., 2001).
Por lo que las especies recientemente publicadas y otro reporte en prensa
resultan ser las “problemáticas”, difíciles, o necesarias de reexaminar su situación
jerárquica para ubicar dentro de alguna de las secciones conocidas de Pachyphytum,
éstas especies, mencionadas en un principio son; (P. machucae, P. brevifolium y P.
garciae; García et al., 1999; Pérez-Calix et Glass 1999), así como P. rzedowskii
(García et aG, 2002), y P. contrerassi. Por lo que se incluyó en el análisis el estudio
de las 17 especies hasta ahora conocidas del género. Se considera que las
93
decisiones de rango son necesarias en vista de que los taxónomos se han
restringido legislativamente al uso de la jerarquía Linneana. Este es entonces un
elemento de arbitrariedad inherente en el sistema formal de nomenclatura de Linneo,
ya que por un lado los organismos (unidades fisiológicas) son reales tal como son los
linajes (unidades filogenéticos) y los demes (unidades reproductivas). Por el otro,
nuestros sistemas de clasificación son obviamente una construcción humana, con
categorías arbitrarias propuestas para servir a ciertos propósitos de nuestro interés
(Mishler y De Luna 1997).
De manera similar se considera que la asignación de una categoría
taxonómica “apropiada” es arbitraria porque depende de decisiones sobre el grado
de conocimiento de los caracteres, de la ecología y distribución de los organismos,
de la tradición en el grupo taxonómico, la facilidad de identificación de las especies y
la estabilidad de la clasificación (Mishler y De Luna 1997). De hecho esto es lo que
de manera formal se expresa en la clasificación de los grupos de plantas desde el
punto de vista Linneano. Por lo que los elementos de análisis moleculares del ADN
nos permiten hasta ahora diferentes puntos de vista sobre una clasificación,
facilitando la identificación y la separación entre especies relacionadas o entre
individuos de la misma especie.
5.4 Implicaciones taxonómicas
Si se toma en cuenta lo planteado por Stevens (1984, 1986), referente a que
los caracteres morfológicos de manera tradicional han servido como la única base
para la mayoría de los estudios taxonómicos. Esto es lo que inicialmente planteó el
problema de cuatro especies del género Pachyphytum que no coincidían con la
clasificación tradicional a nivel sección o subgénero (P. machucae, P. garciae, P.
brevifolium; y P. rzedoswkii (García, et al., 1999; Pérez-Calix et Glass, 1999; García
et al., 2002). Posteriormente se incluyó en situación similar una especie cuyo reporte
técnico se encuentra en prensa (P. contrerassi). Por lo que se asumió como lo
menciona (González 1997) la búsqueda de nuevos tipos de datos que auxiliaran a
94
resolver este tipo de problemas taxonómicos. De esta forma, los resultados de los
análisis de agrupamiento genético, a partir de marcadores moleculares tipo AFLP
conforman dos agrupaciones muy diferentes a las tres agrupaciones conocidas con
el diseño habitual de clasificación.
Respecto con lo anteriormente señalado, se coincide con lo planteado por
Soltis y Soltis (2000a), en que los resultados de los análisis filogenéticos dirigidos en
todos los niveles taxonómicos de los principales grupos de plantas, han propuesto
los cambios más dramáticos en la clasificación y sus relaciones durante los últimos
100-200 años. La relevancia en examinar estos cambios, con recientes análisis
filogenéticos se ejemplifica bien en las angiospermas, donde se considera más
apropiado no usar esquemas tradicionales de clasificación para inferir altos niveles
de relaciones (Soltis y Soltis 2000a). Sin embargo, Moore (1998), considera que el
método filogenético podría incrementar temporalmente el registro global de nombres,
pero podría hacer más costoso el acceso a la taxonomía así como a la estabilidad y
delimitación de un taxon dado.
Los
agrupamientos
conformados
en
el
dendrograma
final
obtenido
(Nei/compact), permiten considerar el hecho de que es necesario un rearreglo
sistemático a nivel dé sección, en virtud de que la clasificación taxonómica clásica,
basada en características morfológicas y anatómicas externas, considera en la
actualidad
tres
secciones
o
subgéneros
(Pachyphytum,
Diotostemon
e
Ixiocaulon), dentro de las cuales las especies se encuentran ubicadas (sensu lato)
(Moran 1968a).
Los análisis del ADN por medio de la técnica AFLP permiten separar a la
totalidad de las especies agrupándolas por parecidos genéticos que no coinciden con
las de la clasificación clásica ó linneana, permitiendo plantear la respectiva hipótesis
sobre su relación y posible origen entre éstas.
95
En virtud de lo anterior, se acepta el planteamiento de la hipótesis inicial; ya
que “la clasificación taxonómica clásica de las especies de Pachyphytum a nivel de
sección, se modifica si se agrupan en relación a su polimorfismo genético”.
Es válido el hecho de plantear un arreglo sistemático a nivel de sección o de
subgéneros, apoyados en el uso de marcadores moleculares, con la posibilidad de
complementar la sistemática basada en la morfología, como lo han considerado
algunos autores (Chase et aG, 1995; Uhl et al., 1995; Kress 1995). Las hipótesis de
las relaciones ya sea basadas en datos moleculares (incluyendo secuencia de datos
del DNA, cambios estructurales y pérdida de genes/intron), morfológicos y otros
caracteres que no incluyen el DNA o una combinación de caracteres, brindan la
estructura más significativa de comparaciones evolutivas (Soltis y Soltis 2000b).
Se considera que el análisis por agrupamiento con el coeficiente de Nei y Li, y
el método de la distancia máxima (vecino lejano ó compact), resultaron herramientas
apropiadas para el esclarecimiento de especies difíciles de ubicar en alguna sección,
a nivel interespecífico, tal como se observó en este estudio, cuyos niveles de
similitud
mostrados
en
el
dendrograma
permiten
considerar
dos
principales
agrupaciones del género Pachyphytum por arriba del 50% de similaridad. Los
dendrogramas que no fueron tomados en cuenta, fue en virtud de que no reflejaron
aspectos reales de agrupación, se eligió al que brindó aspectos más claros de
relación entre las especies.
Los niveles de confianza el reemuestreo “bootstrap” (3000 repeticiones) variaron
con porcentajes del 8 al 100%. Los valores menores implican agrupamientos
débiles, en virtud de la falta de consistencia en dicha unión, pudiendo este
agrupamiento ser producto del azar. En contraste valores altos por arriba del 80,
hasta el 100%, representan mayor afinidad entre especies, con la seguridad de que
dicho nodo realmente existe en el verdadero dendrograma. Sin embargo en ninguno
de estos casos afectó la formación de las dos principales agrupaciones.
96
En virtud del nivel de similaridad y de confianza (100%) observada en el
agrupamiento entre las especies Pachyphytum kimnachi y P. fittkaui, indica que
ambos están estrechamente .relacionados, siendo factible de que se trate de un solo
taxon, considerándose que los fragmentos comigrantes sean homólogos. Esto con
base en el mayor valor de confianza de su unión y un alto nivel de similaridad.
Asimismo, se puede considerar el hecho de que existen variaciones morfológicas
entre éstos taxa, con pocas diferencias significativas a nivel de genoma; además, sus
poblaciones naturales se encuentran bajo condiciones ecológicas similares y de
cercanía geográfica. En ningún otro caso se presenta un valor tan alto de nivel de
confianza, inclusive la recién. descrita P. rzedowskü, así como P. contrerassi, las
cuales pudieran ser consideradas afines o variante de algún taxon previo.
Con base en el análisis de agrupamiento “Nei” con el método “compact” y
haciendo referencia a las localidades citada para cada especie, se elabora un
esquema de asociaciones genético-geográfico entre las especies del género
Pachyphytum. Los grupos logrados se entrelazan a manera de “herradura” por su
interior. Dicha distribución coincide con uno de los centros regionales de
endemismos de México (Hidalgo-Querétaro), como lo menciona Thiede (1995) (fig.
16).
En los gráficos obtenidos de las agrupaciones conformadas mediante el
análisis de disimilaridad genética entre las especies, destaca la forma aislada en que
se comporta Pachyphytum glutinicaule, unida por la parte superior al resto de las
especies del primer grupo (grupo A), por lo que podría considerarse el taxon mas
primitivo ó basal de este, ó de ambos grupos, o la especie principal que participó en
el proceso de variación genética de los demás taxa; ya que como lo considera Lewin
(1999), esta (la variación genética), constituye la materia prima de la evolución
confiriendo ventajas adaptativas en los individuos que las poseen.
Esto coincide con las relaciones geográficas conocidas de las especies, ya
que se reporta a P. glutinicaule de la zona limítrofe entre los estados de Querétaro e
97
Hidalgo; el resto de las especies son de los alrededores y entorno de estados
circunvecinos. Por otro lado, aquellas “especies problema” mismas que no fue
posible su ubicación taxonómica por medio de características morfológicas a nivel de
sección (P. machucae, P. garciae, P. brevifolium y P. rzedowskii), así como P.
contrerassi actualmente “en prensa”; todas, excepto P. brevifolium, se encuentran en
el grupo B. Pachyphytum brevifolium forma parte del grupo A, conformado por seis
especies.
98
Figura 16. Relaciones geográficas y afinidades genéticasde las especies
del género Pachyphytum. Primer. grupo especies 1-6, segundo grupo
especies 7-17.
1. Pachyphytum glutinicaule
2. P. longifolium
3. P. bracteosum
4. P. brevifolium
5. P. oviferum
6. P: hookeri
7. P. machucae.
8. P. garciae
9. P: viride
10. P. werdermannii
11. P: coeruleum
12 P caesium
13. P. rzedowskil
14. P contrerassi
15. P compactum
16. P kimnachi
17. P. fittkaui
99
Similarmente, en estas agrupaciones se separa Pachyphytum glutinicaule del resto
de especies del grupo A; coincidiendo en parte con lo planteado por Moran (1968ª),
en la sistemática clásica del grupo, que por sus características morfológicas forma
parte de la sección Ixiocaulon junto a P. fittkaui. Asimismo, la agrupación de P.
oviferum, P. longifolium y P. bracteosum ; coincide parcialmente con el agrupamiento
que tradicionalmente conforma la sección Pachyphytum, sin embargo dicha sección
no incluye a P. brevifolium, ni a P. hookeri, (esta última de la sección Diotostemon);
como lo establece la agrupación a partir de los AFLP.
El grupo B se considera de novedad, ya que dicha agrupación incluye
también especies de las tres secciones clásicas; (Pachyphytum, Diotostemon e
Ixicocaulon). Asimismo contiene especies que se consideraron problemáticas de
ubicar taxonómicamente (P. machucae, P. garciae, P. rzedowskii, P. contrerassi).
Además se considera que las especies P. kimnachi y P. fittkaui, de esta agrupación,
comparten la mayor de las similaridades observadas con el mayor valor de confianza
(100%), del género, lo que supone un posible origen común, o admitir el hecho de
que se trate de un solo taxon, coincidiendo en que sus poblaciones se encuentran
muy estrechas geográficamente.
Actualmente es difícil realizar una comparación de los resultados observados
con la técnica (AFLP), con el método de agrupamiento (Nei), ni con el género
Pachyphytum; ya que a la fecha no. se conocen reportes de trabajos previos al
respecto con este modelo, por lo que se puede considerar útil esta primera prueba
realizada. Sin embargo existen trabajos como el de Koopman et al., (2001), quienes
concluyen que dicha técnica molecular es adecuada para el estudio de las relaciones
entre especies cercanas.
Con el avance en el conocimiento de nuevas técnicas que permitan
acercarnos al genotipo de las especies, es muy probable que existan arreglos en
taxa considerados problemáticos de ubicación taxonómica, se estima este ensayo
una primera aproximación al grupo a nivel entre especies. Por lo que se considera
necesario realizar otras pruebas con marcadores genéticos diferentes, como el ADN
100
del
cloroplasto
(cpADN),
secuenciación,
RAPD’s,
RFLP,
etc.,
que
permitan
comparaciones o complementar los resultados presentados. Así como el manejo de
la información por medio del uso de programas estadísticos ex profeso como el
PAUP, PHYLYP, Parsimony Analysis Software, HICLAS, entre otros (Backeljau et al.,
1996).
5.5 Las clasificaciones y la sistemática actual
Las dos principales actividades de la sistemática vegetal son la clasificación e
identificación (Judd et al., 1999). Ellos mismos añaden que, la primera consiste en la
ubicación de una entidad dentro de un esquema de relaciones lógico y organizado.
Dentro de los organismos este esquema es usualmente jerárquico, que consiste de
grandes grupos incluyentes: el reino vegetal (la totalidad de las plantas verdes), y
grupos menos incluyentes gradualmente en conjuntos de redes como familias,
géneros y especies (Judd et al., 1999). Por lo que fundamentalmente la sistemática
vegetal se basa en caracteres morfológicos como rasgo distintivo entre los
organismos usando las jerarquías linneanas (Stevens 2002). De este modo la
clasificación siempre se ha enfocado en la agrupación y descripción de organismos,
y hasta recientemente se ha interesado con las relaciones filogenéticas (Judd et al.,
1999).
Con el trabajo de Darwin sobre el. origen de las especies en 1859, se ha
estimulado la incorporación de las relaciones generales evolutivas dentro de la
clasificación, un proceso actual que todavía no ha sido totalmente realizado (De
Queiroz y Gauthier 1992). Los sistematas filogenéticos enfocan su atención sobre el
resultado del proceso de descendencia con modificación y separación de linajes, y su
principal propósito es descubrir los productos de este proceso y la crónica de eventos
evolutivos que han resultado con la diversidad presente (De Queiroz y Gauthier
1992).
101
La sistemática tradicional o evolutiva organiza a las especies por su grado de
parentesco
dentro
del
árbol
filogenético,
agrupa
a
especies
que
comparten
caracteres derivados de un antecesor común pero que no necesariamente incluye a
todos los descendientes, así resulta que los árboles filogenéticos tradicionales
incluyen una serie de ramas que se suceden en el tiempo y que tienen la misma
categoría taxonómica (Pough et al., 1996).
Acorde con Mishler (2000), se prevén futuras trayectorias en aspectos de
clasificación, particularmente la necesidad sobre las jerarquías libres en taxonomía.
Aquí cabe mencionar las iniciativas al respecto con trabajos como los de Cantino y
de Queiroz (2000), Stevens (2002), Brummitt (2002) y de Berry (2002); entre otros;
los primeros proponen el nuevo Código Filogenético (Phylocode), el cual vendría a
sustituir al tradicional Código Internacional de Nomenclatura Botánica. Hasta ahora
esta propuesta se fundamenta en la necesidad de que las nuevas clasificaciones se
basen en caracteres puramente evolutivos sugiriéndolo como práctico y de mejor
manejo de la información. Se considera que requiere de tiempo para su total
aceptación, por parte de la comunidad científica.
En base a lo anteriormente expuesto se considera que con el conocimiento de
la filogenia de las especies se tendrá una clasificación más precisa que brinde una
ubicación más clara de los organismos dentro del grupo al que corresponde. Si nos
referimos al caso del estudio del género Pachyphytum, como se ha manifestado en
este trabajo, sin duda repercutirá en que las secciones conocidas por la clasificación
clásica basada en caracteres morfológicos serán solo parte de la historia del grupo.
Sin duda, al realizar algun otro análisis similar basado en el estudio del ADN
de las especies de Pachyphytum, se proporcionarán los elementos que permitan
corroborar y /o aseverar la separación o la conformación de tan solo dos grupos,
como se ha demostrado con los presentes hechos, grupo A y grupo B;
desconociendo por la falta de elementos de coincidencias las tres secciones
reconocidas por Moran (1968a). Para esto sin duda tendrán que realizarse mayor
102
número de análisis al respecto a nivel de diversidad genética entre las poblaciones
que componen el grupo, con un mayor número representativo de muestras.
Ya que como lo aborda Crawford (2000), la sistemática macromolecular
durante los pasados 50 años, ha estado representado por diferentes fases desde los
compuestos secundarios hasta las proteínas. La secuenciación de aminoácidos de
proteínas de los 60’s y 70’s presentaron un impacto en la filogenia, la electroforésis
de enzimas brindó datos a nivel de población y niveles taxonómicos bajos, con lo
cual
se
estimuló
la
discusión
sobre
la
especiación.
El
empleo
del
ADN
intensivamente en la generación de filogenias se incrementó al brindar datos
moleculares en rangos de grupos de especies y géneros (Crawford 2000).
Por lo que la incorporación de datos moleculares ha tenido un efecto
estimulante positivo en la sistemática vegetal durante las pasadas cinco décadas,
además los resultados de los estudios moleculares son de gran valor cuando estos
son parte de investigaciones que en un sentido amplio incluya técnicas tradicionales
como estudios en campo y de cromosomas (Crawford 2000).
5.6 Importancia y status del género Pachyphytum
La familia Crassulaceae comprende un gran número de especies de gran valor
en la horticultura como plantas de ornato, la mayoría de las cuales pueden ser
fácilmente propagadas y producidas comercialmente (Heywood 1978; ’t Hart 1997),
sobre todo en Europa y Norteamérica, ya que se presentan como hierbas o arbustos
sobretodo perennes, de variadas formas de desarrollo, con hojas crasas de diversas
formas y tamaños, dispuesta en roseta, o en espiral con atractivas flores de varios
tamaños y colores, además de tolerar largos períodos de sequía. En nuestro país es
explotada a baja escala como planta de ornato. Cházaro y Huerta (1995), reportan
que especies exóticas de los géneros Crassula, Aeonium, Graptopetalum, Echeveria,
103
Sedum y Kalanchoe, son cultivadas en Jalisco como plantas de ornato, y consideran
a Echeveria colorata como la más cultivada por este carácter.
Sin embargo si se considera lo anotado por Jacobsen (1978), Walther (1972),
Fitz y Anderson, (1997), con respecto a la riqueza florística que esta familia
representa en México (350 taxa), se tendrían enormes posibilidades de explotar este
recurso mediante el cultivo formal en invernaderos, tanto de especies o de los
numerosos híbridos que se pueden obtener a partir de los géneros conocidos como
lo reporta Uhl (1992) y Thiede (1995). El mismo Uhl (1992), considera que es factible
que puedan hibridarse intergenéricamente - en virtud de que los taxa son
relativamente jóvenes y muestran poca divergencia evolutiva; a este respecto, Ham
(1994), reconoce que todas las crasuláceas mexicanas pertenecen a una misma
línea evolutiva.
En
particular,
respecto
al
género
Pachyphytum,
las
posibilidades
de
considerarla como planta de ornato son bajas, ya que del total de especies
reportadas (14) por y Fitz y Anderson (1997), al parecer la principal especie que es
objeto de cultivo masivo es, P. oviferum, siendo esto justificable en virtud de que
presenta hojas gruesas y carnosas con una inflorescencia atractiva, además por ser
de fácil propagación vegetativa.
Considerando las 17 especies de Pachyphytum que se reportan en este
trabajo, las posibilidades de explotarlas en la horticultura mediante los diferentes
híbridos obtenidos serian mayores; ya que se pueden hibridar con Echeveria,
Villadia, Lenophyllum, Thompsonella y Tacitus como lo reportan (Walther 1934;
Moran 1965; Uhl 1992,1993 a, 1993b,1994a, 1994b,1994c, 1995a, 1995b, 1995c,
1996, 1997, 1999). Por otro lado, Jacobsen (1978), se manifiesta contrario a los
híbridos, ya que el atribuye que esto contribuirá a mayores errores o equivocaciones
haciendo más confusa su identificación.
104
El hábitat en que se desarrollan las crasuláceas principalmente son lugares
rocosos, la alteración o destrucción es debido a la reforestación en lugares
montañosos que localmente pueden reducir su área, esto podría ser de poca
consecuencias; sin embargo es más serio el desarrollo de turismo en masa en
ambientes alpinos afectando poblaciones endémicas estrechas (‘t Hart 1997). Se
considera que la sobrecolecta es otro factor que no se reporta en documentación
escrita, sin embargo es común observar en los mercados, tianguis y viveros
numerosas especies de plantas de las Crassulaceae, que conjuntamente con varios
taxa
de
las
Cactaceae,
son
extraídas
ilegalmente
de
su
hábitat
natural
y
comercializadas como si fueran producto de explotación en vivero o de invernadero,
algunas de éstas son enviadas al extranjero desde donde se promueve la venta de
plántulas y semillas a través del internet.
Sánchez-Mejorada (1982), anota este problema en el caso de las Cactáceas,
y según él las dos principales causas que amenazan a este grupo de plantas y que
menguan continuamente sus poblaciones son: la destrucción del medio ecológico en
que habitan y la recolección excesiva de ejemplares con fines comerciales. A pesar
de lo anterior no existe alguna restricción para ello, ya que la Norma Oficial
Mexicana, ni en el anexo 11 de suculentas mexicanas amenazadas de la IUCN
(Olfield
1997)
reportan
alguna
especie
de
Pachyphytum
en
los
apéndices
correspondientes; por lo que se considera proponer en los foros respectivos que
ciertas especies de este género presentan poblaciones muy reducidas y que su
hábitat se esta perdiendo mediante diversas causas como las anteriormente
presentadas, y que en virtud de esto sería conveniente ubicarlas en alguno de los
apéndices de esta Norma.
El género Pachyphytum es endémico de México (Jacobsen 1978), desde
Tamaulipas hasta el oriente de Michoacán y del norte de Hidalgo hasta Jalisco y
Aguascalientes, desarrollándose un mayor número de especies en la región centro
de Querétaro, Guanajuato y San Luis Potosí; sin embargo se considera poco
conocido, en virtud de que se desarrolla de manera natural en rocosidades poco
105
accesibles y hasta recientemente con una mayor exploración botánica se ha
incrementado el número de especies conocidas, creyéndose factible el hallazgo de
algunas otras en los espacios intermedios de la distribución geográfica hasta ahora
conocida.
Hasta ahora no se conocen reportes en sistemática molecular, filogenia,
biodiversidad y conservación genética referente, o exclusiva de Pachyphytum. Van
Ham (1994, 1995), reporta haber incluido P. compactum de el Cerro el Mexicano de
Querétaro en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las Crassulaceae a
partir del ADN del cloroplasto (cpDNA), al respecto comenta que este género
pertenece al clado 7 (Acre), junto con Echeveria y Villadia; así como con especies de
Sedum de diversas partes del planeta. Además concluye que con esta información
generada puede considerarse que es muy poco conocido sobre de la evolución de la
familia Crassulaceae; y que Pachyphytum junto a otros, representa recientes
radiaciones evolutivas de antiguos progenitores parecidos a Sedum. Posteriormente
Ham y Hart (1998); Mort et al (2001), incluyen a Pachyphytum compactum y P.
kimnachi en el análisis sobre las relaciones filogenéticas de las crasuláceas a partir
del cpDNA y del gen del cloroplasto matK respectivamente, con similares resultados
a los reportados por Ham en 1994.
Perspectivas
Acorde a lo reportado por Ham (1994); Ham y Hart (1998), así como Mort y
colaboradores (2001), el clado a que pertenece el género Pachyphtum comprende un
tercio de la diversidad taxonómica dentro de las Crassulaceae, y que acorde con la
hipótesis de Ham y Hart (1998) es necesario mucho más trabajo filogenético para
resolver los límites entre géneros y sus relaciones dentro de este enorme clado. Se
considera .fue dentro de este clado se encuentran los taxa mas variables y confusos
en
base
a
datos
cromosómicos
e
incluyen
a
los
géneros
Pachyphytum,
Graptopetalum, Echeveria, Lenophyllum y a las especies mexicanas del género
Sedum (Mort et al., 2001). Así mismo como lo anota Stebbins (1999) debería
conocerse el desarrollo del principal objetivo de una . investigación referente a la
106
evolución vegetal, y que ésta incluya la combinación de aspectos morfológicos,
fisiológicos e histológicos, con una cuidadosa observación de las poblaciones
naturales, así como de las poblaciones artificiales que se establecen en jardines,
invernaderos y viveros; el costo económico que representa se verá justificado en
virtud de que constituye un gasto que será recompensado en el futuro por lo efectos
de daños evitados al ambiente.
Por otro lado Hillis y Holder (2000), consideran que aunque la biología
comparativa tiene inmensos beneficios del desarrollo de la tecnología computarizada,
hay muchas técnicas y algoritmos en la ciencia de la computación que no han sido
ampliamente aplicadas a la filogenética. Esto implica que una vez que se han
realizado los aspectos prácticos de la investigación y logrado las tablas de
contingencias respectivas; será necesario usar al límite los algoritmos y programas
conocidos para obtener el máximo provecho de los resultados de la investigación
realizada.
107
VI CONCLUSIONES
Las dos agrupaciones observadas en las relaciones interespecíficas de las
especies del género Pachyphytum por medio del análisis de ADN con marcadores
genéticos tipo AFLP, no se correlacionan con las agrupaciones conformadas a través
de la sistemática clásica basada en características morfológicas y anatómicas
externas, por lo que la situación de la clasificación taxonómica de las secciones
Pachyphytum, Diotostemon e Ixiocaulon varía.
La técnica AFLP permitió detectar un alto nivel promedio (81.2%) de
polimorfismos en las especies de Pachyphytum analizadas, por lo que se considera
dicha técnica como una importante herramienta para precisar “especies problema” de
ubicación taxonómica en especies relacionadas.
108
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