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Concepto de gen y
Regulación I
Genética I
2013
Flávio Silva Junqueira de Souza
Concepto de gen: evolución histórica
Gregor Mendel
- 1866: Gregor Mendel muestra que características en la arveja (altura, color y
textura del fruto etc) se transmiten entre generaciones como entidades
discretas (no se mezclan en los "híbridos").
- 1900: "redescubrimiento" del trabajo de Mendel por los botánicos Carl Correns,
Erich von Tschermak-Seysenegg y Hugo De Vries
- 1900-1903: Hugo de Vries introduce el concepto de mutación y la teoria
evolucionista de la mutación
Hugo de Vries
Oenothera lamarckiana
Concepto de gen: evolución histórica
- 1909: el botánico Wilhem Johannsen crea los términos genotipo y fenotipo y la
palabra gen, con el significado de:
"las condiciones, fundamentos y agentes determinantes que están presentes
[en los gametas] de manera separada, única y independiente, [por los cuales]
muchas características de los organismos son especificadas."
W. Johannsen (1909) Elemente der exakten Erblichkeitslehre
- 1909-1915: en Drosophila, Thomas Hunt Morgan, Alfred Sturtevant y otros
muestran que los genes están alineados en cromosomas y estudian
los fenomenos de ligamiento y recombinación
Thomas H. Morgan
Nobel 1933
(Fisiología y Medicina)
Concepto de gen: evolución histórica
- 1941-1945: los microbiólogos George Beadle y Edward Tatum muestran que los
genes actuan a traves de enzimas específicas en vias metabólicas.
Utilizaron mutantes del hongo Neurospora crassa inducidos por rayos X
1941: mutaciones genéticas
afectaban una actividad enzimática
específica en una via metabólica
(síntesis de la vitamina B6)
fig: selección de mutantes auxotróficos
de Neurospora crassa
Concepto de gen: evolución histórica
- 1941-1945: los microbiólogos George Beadle y Edward Tatum muestran que los
genes actuan a traves de enzimas específicas en vias metabólicas.
Utilizaron mutantes del hongo Neurospora crassa inducidos por rayos X
un gen = una enzima
un gen = un polipéptido
Beadle
George Beadle & Edward Tatum
Nobel 1958
(Fisiología y Medicina)
Tatum
un gen = una enzima (o polipéptido)
ejemplo: catabolismo de
fenilalanina y tirosina
enfermedades
asociadas
Concepto de gen: evolución histórica
- 1928: Frederick Griffith descubre un "principio transformante" en cepas de
Streptococcus pneumoniae
experimento de Griffith
- 1944: O. Avery, C. MacLeod y M. McCarty descubren que el "principio
transformante" está compuesto por DNA
Concepto de gen: evolución histórica
- 1952: Alfred Hershey y Martha Chase descubren que DNA, pero no proteina,
es transferido del fago T2 a la célula de E. coli durante la infección
experimento de
Hershey & Chase
el material hereditario (los genes) es el DNA
Concepto de gen: evolución histórica
- 1953: James Watson y Francis Crick descubren la estructura del DNA
doble hélice
Concepto de gen: evolución histórica
- 1958: Francis Crick propone el "dogma central de la biología molecular" y que
la secuencia lineal de DNA se corresponde con la secuencia de una
proteina (colinearidad)
esquema de flujo de información
propuesto por el "dogma"
(Crick, 1958)
- 1962-1965: Marshall Nirenberg, Heinrich Matthaei, Gobind Khorana y otros
descubren el código genético
Concepto de gen: evolución histórica
colinearidad: la secuencia lineal de DNA en el gen se corresponde con la secuencia lineal
de una proteina
Concepto de gen: evolución histórica
- 1977: Richard Roberts y Philip Sharp descubren los exones y intrones (genes
no son siempre colineares con las proteinas)
Concepto de gen: evolución histórica
genes de RNA: muchos genes codifican RNAs que no se traducen a proteinas
noncoding
RNAs
Concepto de gen: evolución histórica
- 1977: Frederick Sanger y colaboradores secuencian el genoma de DNA del
bacteriofago φX174
- 1980s-1990s: secuenciación de miles de genes y primeros genomas (E. coli,
levadura etc); desarrollo de programas de computadora para la
identificación de genes y ORFs en genomas
ORF (open reading frame): secuencia del
ATG inicial hasta el codon Stop
Concepto de gen: evolución histórica
- 2000s: secuenciación de los genomas del ser humano, ratón, Arabidopsis, etc.
Genes son identificados por programas de computadora en base a
identidad de secuencia con genes ya conocidos o secuencias de cDNAs
modelos de genes
cDNAs
conocidos
conservación de
secuencia
ensembl.org
(base de datos genómicos)
Concepto de gen: evolución histórica
- 1860s–1900s: gen como unidad discreta de la herencia
- 1910s: gen como un locus distinto (que puede mutar, recombinar etc)
- 1940s: gen como controlador de una enzima o proteina
- 1950s: gen como ente físico (doble hélice de DNA)
- 1960s: gen como código transcripcional
- 1970s–1980s: gen como ORF (con intrones y exones)
- 1990s–2000s: gen como entidad anotada en bases de datos genómicos
Gerstein et at (2007) Genome Res
Qué es un gen?
- algunas definiciones posibles:
- Human Genome Nomenclature Organization : a DNA segment that contributes to phenotype/function.
In the absence of demonstrated function a gene may be characterized by sequence, transcription
or homology.
- Sequence Ontology Project : a region (or regions) that includes all of the sequence elements
necessary to encode a functional transcript. A gene may include regulatory regions, transcribed
regions and/or other functional sequence regions.
- Alberts et al (2008) Molecular Biology of the Cell, 5th ed. : ...[a] gene is any DNA sequence that is
transcribed as a single unit and encodes one set of closely related polypeptide chains" (or RNA)
- Laurence A. Moran (Sandwalk blog) : a gene is a DNA sequence that is transcribed to produce a
functional product.
no hay una definición simple de gen
Regulación de la expresión génica
¿ tienen las distintas células de un organismo
el mismo genoma ?
¿cómo se genera la diversidad de células que componen un
organismo complejo?
Regulación de la expresión génica
- experimentos de generación de plantas completas a partir de células de tejidos adultos
muestran que todos los genes de la planta están presentes en células diferenciadas
adultas
- la capacidad de una célula de generar todos los tipos celulares del adulto se
denomina totipotencialidad
Regulación de la expresión génica
John Gurdon
- 1962: clonación de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de células intestinales
de renacuajos: reprogramación nuclear
John Gurdon Nobel 2012
(Fisiología y Medicina)
Clonación
Dolly
Polly
- 1996: clonación de la oveja Dolly a partir de un nucleo de una célula adulta (fibroblasto)
de la ubre: reprogramación nuclear
Regulación de la expresión génica
¿ tienen las distintas células de un organismo
el mismo genoma ? sí
Regulación de la expresión génica
- número de genes que codifican proteinas
Escherichia coli (bacteria entérica)
4,377
Saccharomyces cerevisiae (levadura)
5,770
Caenorhabditis elegans (nemátodo)
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)
21,733
~17,000
Danio rerio (pez cebra)
26,247
Homo sapiens (humano)
20,769
Mus musculus (ratón)
23,139
Arabidopsis thaliana (brasicácea modelo)
27,407
Picea abies (pino nórdico)
28,354
Regulación de la expresión génica
- las células no expresan todos sus genes al mismo tiempo
patrón de expresión
proteica analisada
por electroforesis 2D
- células humanas expresan 30-60% del total de genes que codifican proteinas
- cada tejido/tipo celular tiene su perfil de expresión de mRNAs y proteinas característico
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Regulación de la expresión génica
- las células no expresan todos sus genes al mismo tiempo
- la expresión génica es regulada
patrón de expresión
de mRNAs analisada
por hibridación
de microarrays
Regulación de la expresión génica
niveles de control:
- alteraciones estructurales (cromatina,
amplificación génica etc)
- regulación de la transcripción (unión de
proteinas activadoras y represoras etc)
- regulación del splicing (splicing alternativo)
y localización del mRNA
- regulación de la estabilidad del mRNA y
traducción (miRNAs)
- modificaciones posttraducionales en la
proteina (fosforilación etc)
Regulación pretranscripcional
regulación a nivel de reestructuración o acceso al DNA
- amplificación génica
- rearreglos cromosómicos
- regulación de la estructura de la cromatina
(eucromatina x heterocromatina)
Amplificación génica
- aumenta la cantidad de producto (mRNA y proteina) por un aumento en el número
de copias del gen. No es muy comun en la naturaleza. Ejemplos:
1) amplificación extracromosómica de genes ribosomales en oogénesis de anfibios y
algunos insectos
2) en la oogénesis de Drosophila, amplificación de los genes que codifican para
proteínas coriónicas
3) cromosomas politénicos de dipteros
en el cancer:
4) la amplificación de oncogenes en la progresión tumoral, por ejemplo el protooncogen Myc. La amplificación de ciertos genes también puede llevar a la
resistencia a drogas
Amplificación génica/genómica
- cromosomas politénicos:
- cromosomas gigantes formados por repetida replicación sin división celular
- encontrados en glándulas salivares de larvas de Diptera (moscas y parientes)
- presumiblemente aumentan la producción de enzimas salivares y permiten
crecimiento más rápido de la larva
- ejemplo de amplificación genómica
Drosophila larva
polytene chromosomes
Amplificación génica
- amplificación de genes del corión en Drosophila:
- células foliculares del ovario de Drosophila amplifican las regiones genómicas
que codifican genes estructurales coriónicos (forman la cáscara del huevo)
- regiones amplificadas se localizan en los cromosomas 3rd y X
Rearreglos cromosómicos
- recombinación V(D)J en linfocitos de vertebrados: selección clonal
cada linfocito expresa un
anticuerpo distinto
Rearreglos cromosómicos
- recombinación V(D)J en linfocitos de vertebrados:
- ejemplo: recombinación exones V y J más exon constante (C) para formar una
cadena liviana
- cada linfocito expresa polipeptidos distintos devido a
recombinación
Rearreglos cromosómicos
- mating type switch en Saccharomyces cerevisiae
- células haploides de levadura pueden conyugar y formar células diploides
- conyugación ocurre entre células de distinto mating type: a y
a
Rearreglos cromosómicos
- mating type switch en S. cerevisiae
- cambio de mating type puede ocurrir por
conversión génica (sustituición de un gen
por otro) en el locus (cassette) activo MAT
- conversión depende de la recombinasa
HO, expresada en la fase final de G1
del ciclo celular
Regulación de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota está intimamente asociado a histonas (cromatina)
- heterocromatina: cromatina densamente enpaquetada, condensada,
transcripcionalmente inactiva
- eucromatina: cromatina descondensada, formando loops,
transcripcionalmente activa
Regulación de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota está intimamente asociado a histonas (cromatina)
- heterocromatina: resistente a la expresión génica
- barriers (barreras) son elementos de DNA que impiden que la heterocromatina
invada una región de eucromatina
- translocaciones que eliminan barriers causan efectos de posición en la expresión
génica por la expansión anormal de dominios de heterocromatina
Regulación de acceso al DNA
- el genoma nuclear eucariota está intimamente asociado a histonas (cromatina)
- heterocromatina: resistente a la expresión génica
- barriers (barreras) son elementos de DNA que impiden que la heterocromatina
invada una región de eucromatina
- translocaciones que eliminan barriers causan efectos de posición en la expresión
génica por la expansión anormal de dominios de heterocromatina
Regulación de acceso al DNA
- estructura de la cromatina: histonas y nucleosomas
solenoide (30 nm) que depende de la histona H1
formado por un octámero de histonas
H2A, H2B, H3 y H4 (x2)
Broad Institute
Regulación de acceso al DNA
- estructura de la cromatina:
- histonas del octámero poseen colas
N-terminales que pueden sufrir
modificaciones posttraduccionales
fig: ensamblado del octámero de histonas
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- la relajación espontánea de la estructura del nucleosoma permite la unión de proteinas que
reconocen el DNA (por ejemplo, factores de transcripción)
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP (con actividad
helicasa) pueden hacer deslizar nucleosomas y exponer regiones del DNA
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP pueden
reemplazar las histonas del nucleosoma por histonas especiales
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- complejos de proteinas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP pueden
reemplazar las histonas del nucleosoma por histonas especiales
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- histonas del octámero poseen colas N-terminales que pueden sufrir modificaciones
posttraduccionales
histona H3
metilación (M) en residuos de arginina y lisina
fosforilación (P) en residuos de serina y threonina
acetilación (A) en residuos de lisina
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- código de histonas (histone code): ciertas modificaciones de histonas están asociadas y
influencian la estructura de la cromatina y la expresión génica
Regulación de acceso al DNA
- la estructura de la cromatina es dinámica:
- código de histonas (histone code): ciertas modificaciones de histonas están asociadas y
influencian la estructura de la cromatina y la expresión génica
HATs: histone acetylases
HDACs: histone deacetylases
- ejemplo: las colas de histonas interaccionan fuertemente con el DNA (carga -) por residuos
de lisina (carga +); la acetilación de las lisinas neutraliza las colas de histonas y reducen la
compactación de la cromatina, favoreciendo la transcripción
técnica
- inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
con anticuerpos anti histonas modificadas
permite determinar la localización de esas
modificaciones en un locus específico o en
todo el genoma.
- para determinar las modificaciones en
todo el genoma se acopla el ChIP a
microarray hybridisation (ChIP-on-Chip) o
sequenciación (ChIP-seq)
ChIP genómico
- el mapeo genómico de modificaciones de histonas por ChIP-on-Chip o ChIP-seq
permiten determinar las marcas de histonas asociadas a la actividad transcripcional
- distribución de RNA pol II y histonas modificadas en una región del cromosoma IV de C. elegans
wormbook.org
Regulación transcripcional
regulación a nivel de cuando y cuanto el gen se transcribe
- depende de la unión de factores de transcripción (elementos en trans) a
elementos de DNA regulatorios (elementos en cis)
- elementos regulatorios están organizados en promotores y enhancers
unidad
transcripcional
ribosomas
ensamblándose
RNA pol
transcripción en bacterias
Transcripción: procariotas
- el factor sigma (s) es necesario para el reconocimiento del promotor por la RNA
polimerasa
s reconoce el promotor
terminador
ensamblado
holoenzima
separación de cadenas
elongación,
enzima procesiva
Elongación
liberación de s
transcripción abortiva
Transcripción: eucariotas
- varios factores de transcripción
general son necesarios para la
iniciación de transcripción en los
eucariotas
Transcripción: eucariotas
- en eucariotas hay tres RNA polimerasas
Transcripción: eucariotas
- iniciación de transcripción de RNA pol II
TFIIH tiene actividad
helicasa y quinasa
iniciaciones
abortivas
unión de TATA-binding
protein; el DNA se curva
iniciación,
elongación
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Factores de transcripción
- proteinas que controlan la tasa de transcripción de genes
- descubiertos en las décadas de 1950-1960 (lambda repressor, lac repressor)
- pueden activar o reprimir la transcripción
- actuan uniendose al DNA por el DNA-binding domain
- interaccionan y forman complejos con factores de transcripción basales (p. ej. TATA-binding
protein, complejo mediator etc) y con cofactores de transcripción (p. ej. acetilasas de histonas)
Factores de transcripción
- factores de transcripción tienen una organización modular:
dominio de unión al DNA: helix-turn-helix; zinc-fingers, homeodominio,
helix-loop-helix, leucine zipper etc. Pueden mediar homo- o heterodimerización
dominio de transactivación: contacta otras proteinas y promueve la actividad
activadora o represora del factor
dominio de unión a ligando: modula la actividad del factor por unión a otra
molécula (p. ej. dominios de unión a lactosa del represor lac y unión a
estrógeno del receptor de estrógeno)
Factores de transcripción: tipos
- dominio helix-turn-helix:
- poseen dos a-hélices conectadas por una vuelta
- ocurre en bacterias y eucariotas
- una hélice reconoce la secuencia en el surco mayor del DNA
- se unen al DNA como dímeros
hélice de
reconocimiento
(roja)
Factores de transcripción: tipos
- homeodominio:
- tipo especial de helix-turn-helix; poseen tres a-hélices conectadas por vueltas
- ocurre en eucariotas; particularmente importantes en el desarrollo embrionario
- una hélice reconoce la secuencia en el surco mayor del DNA (hélice 3)
Factores de transcripción: tipos
- zinc-fingers:
- incluyen átomos de zinc en su estructura que unen residuos de histidina y cisteina
- un factor puede tener varios zinc-fingers
- hay varios tipos estructurales
a-hélice y b-sheet
unidas por el zinc
Factores de transcripción: tipos
- leucine zippers:
- forman homo- o heterodímeros por interacciones entre a-hélices (una de cada monómero)
- hélices interaccionan por residuos hidrofóbicos (Leu y otros)
- la posibilidad de formar heterodímeros aumenta el
espectro de secuencias-blanco
homodímeros
heterodímero
Factores de transcripción: tipos
- helix-loop-helix:
- dos a-hélices conectadas por un loop flexible
- forman homo- o heterodímeros por interacciones entre a-hélices (una de cada monómero)
- la posibilidad de formar heterodímeros aumenta el espectro de secuencias-blanco; factores con
una hélice truncada pueden actuar como inhibidores
heterodímero
heterodímero
loop flexible
Factores de transcripción: técnicas
- electrophoretic mobility shift assay (EMSA): permite testear si hay proteinas que unen
una determinada secuencia de DNA
- DNA footprinting: permite determinar precisamente el sitio de DNA en donde se une una
proteina
- cromatografia de afinidad por DNA: permite purificar proteinas de extractos celulares con
capacidad de unirse a un elemento de DNA
- phylogenetic footprinting: permite encontrar elementos de DNA funcionales en
secuencias largas de DNA
- precipitación de cromatina (ChIP): permite determinar los sitios de DNA en que un factor
de transcripción se une in vivo
Factores de transcripción: gel shift (EMSA)
Factores de transcripción: cromatografia de afinidad
Factores de transcripción: DNA footprinting
extracto
-
+
Factores de transcripción: phylogenetic footprinting
Factores de transcripción: ChIP
Elementos regulatorios de DNA
- conjuntos de sitios de unión de factores de transcripción con funciones en la regulación
de la tasa de transcripción de uno o más genes
procariotas: promotor; genes frecuentemente organizados en operones (un
promotor para muchos genes en fila); no hay enhancers
levaduras: promotor proximal + UAS (upstream activating sequence) localizada
cerca del promotor; no hay enhancers
animales, plantas: promotor proximal + enhancers (sequencias regulatorias
distales; pueden estar hasta 1 Mb del gen que controlan)
Elementos regulatorios de DNA: técnicas de estudio
- transgenes (genes artificiales) pueden ser usados para evaluar la actividad
regulatoria de elementos de DNA
3' UTR
promotor
enhancer
a testear
gen reportero
promotor
basal
intron
(opcional p/
eucariotas)
pA
GFP (green fluorescent protein)
b-galactosidasa (lacZ)
luciferasa
chloranfenicol acetiltransferasa (CAT)
b-glucoronidasa
- expresión de transgenes (reporteros) puede ser testeada en células en cultivo o
organismos transgénicos (E. coli, levadura, Drosophila, ratón, Arabidopsis etc)
Elementos regulatorios de DNA: técnicas de estudio
- expresión de luciferasa en células en cultivo bajo control de regiones regulatorias
Elementos regulatorios de DNA: técnicas de estudio
- expresión de GFP en el cerebro de ratones transgénicos bajo control de regiones
regulatorias del gen de proopiomelanocortina (Pomc)
Pomc
GFP
10 kb
neuronal
enhancers
promoter
arcuate nucleus
pituitary
Elementos regulatorios de DNA: técnicas de estudio
expresión de lacZ (b-galactosidasa)
en músculos esqueléticos
- embrión de E13.5 con expresión
de lacZ bajo el control del promotor
de myf5 (factor de transcripción que
controla desarrollo de los músculos)
- animales y plantas transgénicas
permiten evaluar la actividad de una
región regulatoria en el organismo
entero (en contraste con células en
cultivo)
Patapoutian et al. 1993
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- bacterias tienen muchos genes de función relacionada organizados en operones
(p. ej. operon de biosíntesis de triptofano, operon de catabolismo de lactosa)
- operones son frecuentemente controlados de manera negativa por represores
(triptofano, lactosa) que se unen a operadores, pero también puede haber regulación
positiva
Estrategias de control transcripcional: procariotas
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- operon lac es controlado tanto por un represor (que deja de reprimir al unirse a lactosa)
como por un activador (proteina CAP, activada por cAMP/glucosa)
Estrategias de control transcripcional: procariotas
- en bacterias el factor sigma usado por la mayoría de los genes es el s70, pero
hay varios factores sigma que controlan grupos de genes especializados
- p. ej. en caso de shock térmico, se transcribe el factor s32 que se une al promotor de
genes de proteinas de heat shock, desencadenando una respuesta protectiva para la
célula