Marcadores GTMs

Introducción a la Biotecnología 2011
Agrobiotecnología
Temas: definiciones, herramientas, OGM y no-OGM, aplicaciones.
Matías N Recúpero recuperomn@gmail.com
¿Qué entendemos por Agrobiotecnología?
Todo lo referido al agro, siempre y cuando el hombre ejerza un cambio mediante su
intelecto en el rendimiento/eficiencia/mejora general de un bien o servicio mediante el
empleo de conocimientos en biología.
Todo bien o servicio que tenga relación con el agro, y dependa de que el hombre modifique
el normal desarrollo de la naturaleza para aumentar los rendimientos obtenidos mediante
sus conocimientos en ciencias naturales y tecnológicas.
Todo bien o servicio destinado al mejoramiento de la producción agronómica en el cual se
utilice para tal fin organismos, microorganismos o partes de ellos como herramientas o
medios para lograr la mejora.
Productos/servicios Agrobiotecnológicos
Ejemplos modernos:
- Todos los OGM (resistentes a herbicidas, resistentes a plagas, productores de una
proteína recombinante de interés, etc.).
- Inoculantes.
- Controladores biológicos.
- Micropropagación.
- Fitomejoramiento molecular.
Ejemplos clásicos:
- Injertos.
- Propagación por estaca (clonación).
- Fitomejoramiento clásico por fenotipo.
Eventos con evaluación favorable de la CONABIA y con permiso de comercialización.
Especie
Soja
Maíz
Maíz
Algodón
Maíz
Algodón
Maíz
Maíz
Maíz
Maíz
Maíz
Maíz
Algodón
Maíz
Maíz
Maíz
Maíz
Característica introducida Evento de Transformación
Solicitante
Tolerancia a glifosato
"40-3-2"
Nidera S. A.
Resistencia a Lepidópteros
Tolerancia a Glufosinato de
Amonio
Resistencia a Lepidópteros
Resistencia a Lepidópteros
Tolerancia a glifosato
Resistencia a Lepidópteros
Tolerancia a glifosato
Resistencia a Lepidópteros y
tolerancia a Glufosinato de
Amonio
Tolerancia a Glifosato
Resolución
SAPyA N° 167 (25-3-96)
SAGPyA N° 19
(16-1-98)
"176"
Ciba-Geigy S. A.
"T25"
AgrEvo S. A.
SAGPyA N° 372 (23-6-98)
Monsanto Argentina S.A.I.C.
Monsanto Argentina S.A.I.C.
Monsanto Argentina S.A.I.C.
Novartis Agrosem S.A.
Monsanto Argentina S.A.I.C.
Dow AgroSciences S.A.y
Pioneer Argentina S.A
SAGPyA N°428 (16-7-98).
SAGPyA N° 429 (16-7-98).
SAGPyA N° 32 (25-4-01).
SAGPyA N° 392 (27-7-01).
SAGPyA N° 640 (13-7-04).
SAGPyA N° 143 (15-03-05)
Syngenta Seeds S.A.
SAGPyA N° 640 (22-08-05)
"MON 531"
"MON 810"
"MON 1445"
" Bt 11"
" NK 603 "
"TC 1507"
"GA 21"
Tolerancia a glifosato y
SAGPyA Nº 78
"NK603x810"
Monsanto
resistencia a Lepidópteros
(28/08/07)
Resistencia a Lepidópteros y
Dow AgroSciences S.A.y
SAGPyA Nº 434
tolerancia a Glufosinato de
"1507xNK603"
Pioneer Argentina S.R.L.
(28/05/08)
Amonio y Glifosato
Resistencia a Lepidópteros y
SAGPyA Nº 82
"MON531xMON1445" Monsanto Argentina S.A.I.C.
Tolerancia a glifosato
(10/02/09)
Tolerancia a glifosato y
SAGPyA Nº 235
"Bt11xGA21"
Syngenta Agro S.A.
Resistencia a Lepidópteros
(21/12/09)
Tolerancia a glifosato y
"MON88017"
Monsanto S.A.I.C.
SAGPyA Nº 640 (07/10/10)
Resistencia a Coleópteros
Resistencia a Lepidópteros
"MON89034"
Monsanto S.A.I.C.
SAGPyA Nº 641 (07/10/10)
Tolerancia a glifosato y
Resistencia a Lepidópteros y "MON89034 x MON88017" Monsanto S.A.I.C.
SAGPyA Nº 642 (07/10/10)
Coleópteros
Inoculantes
Los inoculantes son productos que contienen Bacterias Fijadoras del Nitrógeno (N2) de la
atmósfera con una gran efectividad a través de una asociación simbiótica con especies
leguminosas principalmente, especies como maíz, trigo, tabaco, arroz, pasturas en forma de
compuestos fácilmente asimilables (NH4).
Dentro de los géneros más conocidos de Bacterias Fijadoras de Nitrógeno, o promotores
biológicos del crecimiento vegetal, se encuentran los Rhizobium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Sinorhizobium, Mycorhizae, Cianobacterias, Pseudomonas, Azospirillium,
etc., que pueden ejercer su acción mediante unmodelo simbiótico ó no simbiótico con la
especie vegetal.
Control biológico de plagas
Picudo del algodonero parasitado por Beauveria bassiana.
Insectos plagas
- Control biológico de insectos Entomófagos (parasitoides, predadores), Técnica
del insecto estéril
- Control microbiano de insectos
Bacterias entomopatógenas
Virus entomopatógenos
Hongos entomopatógenos
- Hongos Antagonistas Trichoderma spp
Herramientas de la Agrobiotecnología.
- Marcadores moleculares.
- Transformación génica.
-
Genómica.
Transcriptómica.
Proteómica.
Metabolómica.
Ing. de tejidos.
Morfogénesis.
Metagenómica.
Bioinformática.
Etc….
Marcadores.
¿Qué son y para qué se usan?
Tipos de marcadores:
Marcadores morfológicos
Marcadores bioquímicos (Isoenzimas, proteínas de reserva)
Marcadores moleculares:
- Basados en la hibridación del ADN.
- Basados en la amplificación arbitraria del ADN.
- Basados en la amplificación sitio-específica del ADN.
Marcadores funcionales o de expresión.
Marcadores moleculares:
Basados en la hibridación del ADN
RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción),
VNTR (repeticiones en tándem de número variable).
Basados en la amplificación arbitraria del ADN
RAPDs (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente)
AFLPs (polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados)
Basados en la amplificación sitio-específica del ADN
Microsatélites Los microsatélites son regiones hipervariables del genoma que
contienen arreglos de secuencias simples en tandem de mono, di, tri, tetra o
pentanucleótidos que se repiten entre 10 y 100 veces.
STS (Sequence-Tagged Sites) o sitios marcados por secuencias, es un término general
dado a un locus en particular definido por las secuencias de sus iniciadores específicos.
Debe satisfacer dos condiciones: se debe conocer su secuencia, que permite diseñar
iniciadores específicos que permitirán su amplificación por PCR, y tener una localización
única en el cromosoma o genoma estudiado.
Marcadores Funcionales o de Expresión
Marcadores COS (Conserved Orthologue Set).
Los marcadores COS representan genes
funcionales conservados en un amplio rango
de plantas dicotiledóneas.
Marcadores GTMs (Gene Targeted Markers)
Los GTMs se basan en polimorfismos dentro
de genes, independientemente de si se
conocen o no sus funciones.
Marcadores Funcionales propiamente dichos (FM: Functional Markers) Estos marcadores
derivan de motivos polimórficos (mutaciones) dentro de los genes, y estos polimorfismos
afectan directamente la expresión fenotípica del carácter asociado al Gen. Los FM reciben
también el nombre de marcadores diagnósticos, marcadores de genes blanco o
marcadores perfectos (perfect markers).
Marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
Estos marcadores se basan en la detección de polimorfismos resultantes de la alteración
de una única base en una secuencia de ADN. Algunos autores consideran SNPs sólo
cuando ocurre una sustitución de base, otros consideran también la inserción/deleción de
una base (InDel).
Los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) o los generados por pequeñas inserciones/
deleciones (Indels) se han convertido en una de las herramientas más utilizadas para la
caracterización genética tanto de plantas como de animales debido a su baja tasa de mutación y
a su gran abundancia y dispersión en los genomas. Su uso se ha extendido a aplicaciones tales
como la construcción de mapas genéticos de alta resolución, mapeo de asociación, estudios de
diversidad genética y conservación, identificación y análisis de la estabilidad de cultivares,
delimitación y asignación de grupos heteróticos, análisis filogenéticos, selección asistida por
marcadores y caracterización de recursos genéticos.
Ejemplos de caracteres para los
cuales se realiza selección
asistida utilizando marcadores
moleculares
agrupados por rasgo.
SSR Simple Sequence Repeats (microsatélites)
SCAR Sequence Characterized Amplified Region,
CAPS (Cleavage Amplified Polymorphic Sequence)
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
INDEL
TRANSFORMACIÓN GÉNICA DE PLANTAS
La transformación de plantas se basa en la totipotencia de ciertas células vegetales:
células simples, somáticas o gametofíticas que pueden ser regeneradas completamente
en plantas fértiles por tratamiento con distintos regímenes de fitohormonas.
Técnicas
• Gene gun o bombardeo de
partículas
• microinyección
• Electroporación
• Agrobacterium tumefaciens
Transgen
Mediados por Agrobacterium
1.Colonización bacteriana.
2.Inducción del sistema de
virulencia.
3.Formación del T-DNA.
4.Ensamblado de la maquinaria de
transporte y transferencia del
complejo T-DNA.
5.Importación al núcleo e
integración del T-DNA.
6.Expresión de los genes transferidos
 desregulación de la proliferación.
7.Captación y procesamiento de
opinas.
TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Ampliamente usada para plantas dicotiledóneas tabaco, tomate,
soja, alfalfa, papa, colza, zanahoria, algodón.
También algunas monocotiledóneas: arroz y maíz.
Caso…
Semillas de tomate de una variedad comercial. Limpias y listas para el proceso de
transformación
Esterilización superficial de las semillas
50 % solución de lavandina comercial
0,1 % Tween (o detergente comercial)
Germinación
Las semillas estériles son colocadas sobre medio nutritico estéril en
cajas de Petri.
Para este caso se utilizó medio de Murashigue y Skoog (1962).
Explanto
El exlpanto inicial son los plántulas de 7 dias de edad.
Obtención del explanto.
Los cotiledones son cortados y transferidos a medio MS
líquido.
Infección con Agrobacterium.
Luego de una noche en co-cultivo los explantos son
susceptibles a ser infectados por el Agrobacterium
El exceso de Agrobacterium es removido con papel de filtro
para evitar una infección masiva.
Transferencia del ADN
el explanto es co-cultivado con el Agrobacterium por 48 hs.
Tiempo durante el cual el ADN modificado por ingeniería
genética será transferido al ADN genómico de la planta.
Subcultivo a medio con antibióticos.
Los explantos son subcultivados a medio MS con antibióticos para
seleccionar y controlar el Agrobacterium . El medio también contiene
zeatina como regulador de crecimiento.
Los explantos son subcultivados a este medio con Kan
para regenerar la planta (1 dia)
Regeneración de un planta de tomate.
Las zonas de corte comienza a proliferar
estimuladas por la zeatina.
Al cabo de 1 mes se obtendrá un callo.
Comienzo de la regenración.
Luego de 6 semanas los vástagos son separados del callo inicial y
subcultivados en medio MS con zeatina nuevamente.
Medio de enraizamiento.
Al llegar a los 2 cm de altura los vástagos son
subcultivados a un medio de enraizamiento
(MS solo con Kan como agente de selección)
(9 semanas)
Plantas trasngénicas
Plantas enteras, transgénicas, a las 11 semanas
Rusticación (15 semanas)
Aclimatación
Parte V: Ejemplos de aplicaciones de la biotecnología vegetal
Capítulo 1: Aportes de la citogenética al estudio de genomas vegetales.
Capítulo 2: Mejoramiento de plantas forrajeras en la era genómica.
Capítulo 3: Caracterización molecular de la apomixis y su aplicación en la agricultura.
Capítulo 4: Avances de la biotecnología en cultivos ornamentales.
Capítulo 5: Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales.
Capítulo 6: Técnicas de ingeniería genética para conferir resistencia a virus en plantas.
Capítulo 7: Obtención de plantas resistentes a enfermedades bacterianas.
Capítulo 8: Aproximaciones biotecnológicas para un manejo sustentable del estrés fúngico en la agricultura.
Capítulo 9: Utilización de cultivos de tejidos para la obtención y conservación de plantas libres de
enfermedades.
Capítulo 10: Obtención de plantas resistentes a insectos.
Capítulo 11: Aplicaciones biotecnológicas al manejo de malezas.
Capítulo 12: Obtención de plantas tolerantes a distintos tipos de estreses abióticos.
Capítulo 13: Manipulación genética del metabolismo secundario en plantas.
Capítulo 14: Mejoras de calidad en alimentos.
Capítulo 15: Fitorremediación.
Capítulo 16: Plantas como biorreactores.
Obtención de plantas tolerantes a
distintos tipos de estreses abióticos.
Algodón Bt
Maiz Bt
Estrategia ecológica
OGM COMERCIALES
CÓMO SE OBTIENE UN PERMISO
El circuito para la autorización de la
comercialización de Organismo Vegetal
Genéticamente Modificado (OVGM)
consta de un procedimiento
administrativo en tres etapas:
1. Evaluación de los riesgos para los
agroecosistemas, derivados del cultivo
en escala comercial del OVGM en
consideración. Esta evaluación está a
cargo de la Dirección de Biotecnología y
de la CONABIA, conforme a lo
establecido en la normativa vigente,
Resolución SAGYP N° 39/03.
Ministerio
de
Agricultura
2. Evaluación del material para uso
alimentario, humano y animal, la cual es
competencia del Servicio Nacional de
Sanidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASA) y del Comité Técnico Asesor
para el Uso de OGM, de acuerdo a lo
normado por Resolución SENASA N°
412/02.
3. Dictamen sobre la conveniencia de la
comercialización del material
genéticamente modificado en los
mercados argentinos a cargo del
Ministerio de Agricultura, Ganadería y
Pesca.