UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS “LIXIVIACIÓN FÚNGICA DE ORO A PARTIR DE TARJETAS DE CIRCUITO IMPRESO PROVENIENTES DE TELÉFONOS CELULARES” TESIS Que para acreditar la Experiencia educativa: Experiencia Recepcional Programa Educativo: Ingeniería Química P r e s e n t a: “BRENDA JOAN SOTO” Director: Dra. Rosalba Argumedo Delira Xalapa, Ver., Julio 2014 Esta tesis fue financiada por el proyecto: PROMEP/103.5/13/7135 AGRADECIMIENTOS A Dios pues él ha sido mi gran refugio en cada situación de felicidad o tristeza. A mi madre por haberme dado la vida, por siempre confiar en mí, por no ponerme límites para realizar mis sueños al contrario siempre recibí su mejor consejo, su más grande apoyo, a mi familia que aunque están lejos siempre tuvieron fe en mí y me alentaron a continuar También agradezco infinitamente al maestro José Juan Muñoz León mi profesor de la preparatoria quien me dio las herramientas necesarias para ingresar a la universidad y quien a la vez me permitió conocer al Doctor Ragueb Chain que desde ese día se convirtió en mi ángel tomando el papel de un padre para mí al brindarme todo tipo de apoyo que yo requerí en cualquier momento. Sin duda los verdaderos amigos no deben quedar fuera, Irving, Karen, Adriana, Erika, Janeth, Esther, Mónica, Ari, Anni, Jessi, los cuales me brindaron su ayuda, sus consejos, su amistad y me motivaron a continuar siempre, muchas gracias!. Finalmente y no por menos importe quiero agradecer a la doctora Rosalba Argumedo quien nunca me dejo sola en este sueño y que por su paciencia, enseñanzas y gran corazón hoy puedo ver realizado. Lixiviación fúngica de oro a partir de tarjetas de circuito impreso provenientes de teléfonos celulares Brenda Joan Soto Universidad Veracruzana, 2014 RESUMEN Los teléfonos celulares obsoletos se encuentran dentro de los Desechos de Equipos Eléctricos y Electrónicos (DEEE o WEEE por sus siglas en inglés). Como resultado de los rápidos cambios en las características de los equipos y capacidades, la vida útil de los teléfonos celulares es aproximadamente de un año, lo que crea un flujo importante de estos dispositivos móviles obsoletos, millones de estos son desechados cada año, contribuyendo con la generación de la denominada basura electrónica. Los teléfonos celulares están constituidos por materiales valiosos como plástico, Fe, Cu, Al, Au, Ag, Pd principalmente, no obstante también contienen sustancias tóxicas como Pb, Cd, As, Hg y éteres difenil polibromados por mencionar algunos. En vista del deterioro ambiental que pueden provocar las sustancias tóxicas y el reuso de los materiales valiosos de los teléfonos celulares, varios estudios se han enfocado en recuperar los metales preciosos a partir de las tarjetas de circuito impreso (TCI) como un motor económico que impulse el reciclado de estos desperdicios. Los métodos que se han implementado para la recuperación de estos metales a partir de las TCI son hidrometalúrgicos y pirometalúrgicos los cuales presentan desventajas ambientales y energéticas, por lo que la generación de nuevas técnicas de recuperación de metales a partir de las TCI de bajo impacto ambiental y energético es cada vez más necesaria. Considerando lo anterior, la presente investigación tuvo como objetivo general encontrar las condiciones de cultivo adecuadas para incrementar la recuperación de oro por hongos a partir de las TCI de los teléfonos celulares. Para cumplir con este objetivo, se plantearon diferentes fases experimentales: 1) desmantelamiento de teléfonos celulares y reducción del tamaño de las TCI, 2) ensayos preliminares para determinar las condiciones de cultivo adecuadas para cada tipo de hongo, 3) lixiviación de Au por hongos unicelulares y pluricelulares y 4) bioacumulación fúngica de Au. En los resultados de los ensayos preliminares, se encontró que la mayor lixiviación de Au para el hongo A. niger MXPE6 (6.20%) se presentó en cultivos sin agitación, mientras que para la levadura B-20 (8.43%) se obtuvo en cultivos con agitación. Por otra parte, los ensayos de biolixiviación mostraron que la recuperación máxima de Au bajo cultivos sin agitación para el consorcio fúngico formado por A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y A. niger MXPE6 son de 56 y 17% respectivamente, mientras que la levadura B-20 no lixivió Au bajo condiciones de cultivo con agitación. No obstante, la levadura B-20 (47%) presentó la mayor bioacumulación de Au en su biomasa seca en comparación con el consorcio fúngico (10%) y A. niger MXPE6 (7%). Es evidente que la composición de las TCI, las condiciones de cultivo utilizadas afectan la eficiencia de biolixiviación fúngica de Au. Por lo tanto la modificación de algunas de estas condiciones podría incrementar dicha eficiencia. Palabras clave: Biolixiviación, oro, teléfonos celulares, TCI, basura electrónica. i ÍNDICE GENERAL Pág. ÍNDICE DE FIGURAS v ÍNDICE DE CUADROS vii 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 3 2.1. ALTERNATIVAS PARA LA RECUPERACIÓN DE METALES A PARTIR DE LAS TCI PROVENIENTES DE LOS RESIDUOS DE TELÉFONOS CELULARES 3 2.1.1. Hidrometalúrgicas y pirometalúrgicas 3 2.1.2. Biológicas 4 2.1.3. Ventajas y desventajas del empleo de técnicas biológicas para la recuperación de metales a partir de las TCI provenientes de los residuos de teléfonos celulares 5 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 7 4. JUSTIFICACIÓN 8 5. OBJETIVOS 9 5.1. OBJETIVO GENERAL 9 5.2. OBJETIVOS PARTICULARES 9 6. HIPÓTESIS 10 7. MARCO TEÓRICO 11 7.1. DEFINICIÓN DE RESIDUO ELECTRÓNICO, TELÉFONO CELULAR Y TARJETA DE CIRCUITO IMPRESO 11 7.1.1. Residuo electrónico 11 7.1.2. Teléfono celular 11 7.1.3. Tarjeta de circuito impreso (TCI) 12 7.2. COMPOSICIÓN DE LAS TARJETAS IMPRESO DE LOS TELEFONOS CELULARES DE CIRCUITO 7.2.1. Tipos de tarjeta de circuito impreso 7.3 CONSUMO DE MUNDIAL Y NACIONAL TELÉFONOS CELULARES 12 14 A NIVEL 15 7.4. TOXICIDAD E IMPACTO AMBIENTAL DE LOS RESIDUOS DE TELÉFONOS CELULARES 17 7.5. HISTORIA DEL ORO (Au) 19 7.6. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DEL Au Y ALGUNAS 20 ii APLICACIONES 7.7. IMPORTANCIA DE OBTENER ORO A PARTIR DE UNA FUENTE SECUNDARIA COMO LAS TCI DE TELÉFONOS CELULARES 21 7.8. MECANISMOS Y TRANSPORTE DE MASA DE LOS PROCESOS EVALUADOS EN ESTE TRABAJO : LIXIVIACIÓN, BIOSORCIÓN Y BIOACUMULACIÓN 22 7.9. BIOPROCESO 24 7.10. BIOLIXIVIACIÓN DE MATERIALES SÓLIDOS 24 7.11. METALES 7.12. REACCIONES DE ÓXIDO-REDUCCIÓN 25 25 7.13. PROTEÍNAS 25 7.14. ENZIMAS 26 7.15. pH 26 7.16. CURVA DE CALIBRACIÓN 26 7.17. ESPECTROSCOPIA ATÓMICA 26 7.17.1. Espectrometría de Emisión Óptica por Plasma acoplado Inductivamente (ICP-OES) 27 7.18. LEVADURA 28 7.19. HONGO 29 7.20. FASES DE CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS 29 7.21. BIORREACTORES 29 8. MATERIALES Y MÉTODOS 31 8.1. Diagrama general de la metodología 31 8.2. BIORREACTORES DE LIXIVIACIÓN UTILIZADOS 32 8.3. DESMANTELAMIENTO DE TELÉFONOS CELULARES Y REDUCCIÓN DEL TAMAÑO DE LAS TCI 34 8.4. ENSAYOS PRELIMINARES PARA LA SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO ADECUADO PARA CADA TIPO DE HONGO 34 8.4.1. Ensayos preliminares para seleccionar las condiciones de cultivo adecuadas para hongos unicelulares 34 8.4.2. Ensayos preliminares para seleccionar las condiciones de cultivo adecuadas para hongos pluricelulares 35 8.5. LIXIVIACIÓN DE Au POR HONGOS UNICELULARES Y PLURICELULARES 35 8.5.1. Lixiviación de la levadura bajo condiciones de cultivo con 35 iii agitación 8.5.2. Lixiviación de Aspergillus niger MXPE6 bajo condiciones de cultivo sin agitación 36 8.5.3. Lixiviación de un consorcio de Aspergillus niger bajo condiciones de cultivo sin agitación 36 8.6. BIOACUMULACIÓN FÚNGICA DE Au 37 8.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 37 9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39 9.1. ENSAYOS PRELIMINARES PARA LA SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DECUADO PARA CADA TIPO DE HONGO 39 9.2. LIXIVIACIÓN DE Au POR HONGOS UNICELULARES Y PLURICELULARES 40 9.3. BIOACUMULACIÓN FÚNGICA DE Au 53 10. CONCLUSIONES 54 11. RECOMENDACIONES 55 LITERATURA CITADA 56 ANEXO I 62 ANEXO II 64 ANEXO III 67 iv ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1.1. Teléfonos celulares obsoletos, los cuales forman parte de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (basura electrónica). 1 Figura 7.1. Principales elementos que constituyen un teléfono celular. a) Carátula, b) Tarjeta de circuito impreso, c) Pantalla, d) Teclado y e) Batería. 12 Figura 7.2. Tarjetas de circuito impreso. a) TCI de computadora y b) TCI de teléfono celular. 15 Figura 7.3. Crecimiento lineal del número de usuarios a nivel mundial de telefonía móvil (ITU, 2014). 16 Figura 7.4. Crecimiento lineal del número de usuarios a nivel nacional de telefonía móvil (ITU, 2014). 17 Figura 7.5. Comparación de la cantidad recuperada de Au. Minería vs TCI. 22 Figura 7.6. Esquema de la lixiviación: Antes de la lixiviación (izquierda) y después de la lixiviación (derecha), a) Medio mineral, b) Fase portadora, sólido con soluto (Au), c) Soluto, d) Fase portadora solida lixiviada, e) Medio mineral con el soluto (partículas de Au). 23 Figura 7.7. Mecanismo de biosorción y bioacumulación de Au por microorganismos 24 Figura 7.8. Descripción general de la técnica de Espectrometría de Emisión Óptica por Plasma Acoplado Inductivamente (ICP). 28 Figura 8.1. Biorreactor sin agitación con capacidad de 5 L. a) dispositivo de inoculación y b) dispositivo de muestreo. 32 Figura 8.2. Biorreactor con oxigenación y capacidad de 2 L. a) dispositivo para inocular y b) dispositivo de oxigenación. 33 Figura 8.3. Biorreactor con agitación y capacidad de 5 L. a) dispositivo para inocular, b) controlador de agitación y c) dispositivo para muestrear. 33 Figura 9.1 Bioensayos de lixiviación bajo condiciones con agitación para la levadura B-20. 41 v Figura 9.2. Bioensayos de lixiviación bajo condiciones estacionarias del consorcio fúngico A. niger MXPE6 + A. niger MX7. 41 Figura 9.3. Consumo de glucosa en los medios de cultivo para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 43 Figura 9.4. Concentración de proteínas en la biomasa fúngica para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 45 Figura 9.5. Concentración de proteínas extracelulares presentes en el medio de cultivo de la levadura B-20 para los tratamientos con y sin residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). 46 Figura 9.6. Comportamiento del pH para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 48 Figura 9.7. Biomasa fúngica seca de los tratamientos con y sin residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). 49 Figura 9.8. Biolixiviación fúngica de Au para los tratamientos con residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). 51 Figura 9.9. Cambios del material cortado de las TCI al ser expuestas a los dos hongos y al consorcio fúngico. 52 Figura 9.10. Bioacumulación fúngica de Au para los tratamientos con residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). 53 vi ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 7.1. Composición representativa de los constituyentes que conforman las tarjetas de circuito impreso en peso (%). Pág. Cuadro 7.2. Toxicidad al ser humano de algunas sustancias presentes en los residuos de teléfonos celulares (Yuan y McPherson, 2003). 18 Cuadro 9.1. Biolixiviación de Au, biomasa fúngica seca y pH de los ensayos preliminares para el hongo A. niger MXPE6 y la levadura B-20 bajo diferentes condiciones de cultivo. 40 13 vii 1. INTRODUCCIÓN En la actualidad la tecnología va avanzando rápidamente por lo que el uso de dispositivos electrónicos como los teléfonos celulares ha aumentado considerablemente en los últimos años. Como resultado de la innovación tecnológica en las características de los equipos, la vida útil de los teléfonos celulares es aproximadamente de un año, lo que crea un flujo importante de estos dispositivos móviles obsoletos (Fig. 1.1). Los residuos de teléfonos celulares en países que no cuentan con una legislación al respecto, son desechados junto con residuos sólidos municipales, lo cual es un peligro latente para el medio ambiente y por ende para el ser humano debido a sus constituyentes. Figura 1.1. Teléfonos celulares obsoletos, los cuales forman parte de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (basura electrónica). Los teléfonos celulares contienen sustancias tóxicas como Pb, Cd, As, Hg y Br (Yuan y McPherson, 2003). Además de materiales valiosos como plástico, vidriocerámicos y otros metales tales como Cu, Fe, Al, Au, Ag y Pd (Wang et al., 2012). Los metales preciosos presentes en los teléfonos celulares obsoletos (fuente secundaria de metales) han propiciado el incremento de investigaciones enfocadas en la recuperación de dichos metales, empleando procesamientos 1 hidrometalúrgicos y pirometalúrgicos, sin embargo presentan desventajas ambientales y energéticas. Por lo cual las alternativas microbiológicas han adquirido gran importancia, debido a que reducen el costo energético y el impacto negativo sobre el medio ambiente que tienen los procesamientos antes mencionados, para la recuperación de metales a partir de esta fuente secundaria. Considerando además que el oro es ampliamente utilizado en diversas industrias (vidrio, eléctrica, electrónica, química, aeroespacial, automotriz y de telecomunicaciones) y que para su obtención de fuentes primarias se necesita remover toneladas de suelo que dañan ecosistemas completos, el presente estudio evaluó diferentes condiciones de cultivo en las cuales se pudiera incrementar la biolixiviación de oro (Au) proveniente de las tarjetas de circuito impreso (TCI o PCB por sus siglas en inglés) de los teléfonos celulares, empleando dos cepas de Aspergillus niger y una levadura, microorganismos previamente estudiados por Madrigal-Arias (2012). Generando información básica que pueda servir para posteriores investigaciones que logren analizar a mayor detalle los mecanismos bioquímicos y genéticos involucrados en la lixiviación fúngica de Au a partir de TCI. Adicionalmente ayudar a la generación de biotecnologías más eficientes para la recuperación de Au a partir de este residuo electrónico. 2 2. ANTECEDENTES 2.1. ALTERNATIVAS PARA LA RECUPERACIÓN DE METALES A PARTIR DE LAS TCI PROVENIENTES DE LOS RESIDUOS DE TELÉFONOS CELULARES 2.1.1. Hidrometalúrgias y pirometalúrgicas Actualmente la recuperación de metales valiosos se lleva a cabo con procesamientos hidrometalúrgicos y pirometalúrgicos. El procesamiento hidrometalúrgico consiste principalmente en la lixiviación ácida o alcalina del material sólido finamente dividido, posteriormente los lixiviados de los metales de interés se aíslan y concentran a través de procesos como: extracción con disolventes, lixiviación-precipitación, cementación, electro-oxidación, intercambio iónico, filtración y destilación (Gramatyka et al., 2007). Dentro de estos procesos se encuentran trabajos como los de Xiu y Zhang, 2009 que reportan una recuperación menor del 30% de As y Zn, 70% de Cd, 38% de Cr, 77% de Mn utlizando HCl y HNO3 a partir de las tarjetas de circuito impreso. Más adelante Ha et al., (2010) recuperó oro (90 y 98%) a partir de las TCI de teléfonos celulares utilizando tiosulfato, cianuro y amonio, indicando que la eficiencia de lixiviación se encuentra en función de la concentración de estas tres sustancias. Otros trabajos muestran que con 24 g L-1 de tiosulfato y con 6% de Fe3+ se logró recuperar oro (90%) y plata (50%) a partir de TCI de teléfonos celulares (Jing-ying et al., 2012). Por otro lado en el proceso pirometalúrgico se emplea la incineración, fundición, sinterización y reacciones en fase gaseosa a elevadas temperaturas, lo cual genera altos gastos energéticos (Sum et al., 1991; Cui y Zhang 2008). Un ejemplo importante es la recuperación de metales (99.5%) y residuos de fibra de vidrio (74.7%) a partir de TCI cortadas en fragmentos de 5 cm x 5 cm empleando pirólisis a vacío en un reactor (Long et al., 2010). En otros estudios sobre el tratamiento de las TCI por pirólisis, se informa de la recuperación del 75.5% en 3 peso de diversos metales y fibra de vidrio, 20% en peso de aceite y 4.3% de gas (Zhou y Qiu, 2010). Cabe mencionar que en los procesos hidrometalúrgicos se generan grandes cantidades de efluentes ácidos y lodos que deben ser eliminados correctamente, mientras que en los procesamientos pirometalúrgicos se generan gases altamente tóxicos (Zhou et al., 2011). Las tecnologías que existen actualmente para la obtención de metales a partir de las TCI son eficientes pero no satisfacen las necesidades futuras de la industria metalúrgica, debido a la alta contaminación ambiental y alto costo (Tuncuk et al., 2012). Por lo que el desarrollo de nuevas tecnologías sustentables es de gran importancia. 2.1.2. Biológicas En los últimos años se han buscado métodos alternativos para la recuperación de metales provenientes de las TCI de los teléfonos celulares, debido a esto algunas investigaciones han empleado microorganismos para dicho fin, encontrando que el mecanismo microbiano predominante es la biolixiviación de materiales sólidos, en el cual el metal es liberado a la solución (Krebs et al., 1997). Dentro de los trabajos donde se emplean microorganismos para recuperar metales a partir de las TCI se encuentra el estudio de Wang et al. (2009), donde se reporta la biolixiviación de Cu (99.9%), Pb (100%) y Zn (98%) a partir de TCI con ayuda de las bacterias Acidithiobacillus ferroxidans y Acidithiobacillus Thiooxidans aisladas del drenaje de una mina. Además mencionan que la lixiviación de estos metales aumenta al disminuir el tamaño de partícula de la TCI. Otra bacteria empleada en la biolixiviación de metales a partir de TCI es Chromobacterium violaceum, la cual es capaz de generar cianuro que forma complejos con el oro, un ejemplo de ello es la investigación de Chi et al. (2011), quienes informan que la biolixiviación de Cu (24.6%) y Au (11.31%) incrementa al 4 aumentar el pH, pero a la vez el contenido de cobre inhibe la biolixiviación de oro, finalmente se concluyó que los metales provenientes de los residuos de TCI pueden ser recuperados de una manera amigable para el medio ambiente, sin embargo los rendimientos son menores que en los procesamientos conocidos (hidrometalurgia y pirometalurgia) esto se debe a que las técnicas biológicas aún se encuentran en investigación por lo que aún hacen falta muchos estudios para poder incrementar los rendimientos de recuperación de metales a partir de estos residuos haciendo el proceso más eficiente. 2.1.3. Ventajas y desventajas del empleo de técnicas biológicas para la recuperación de metales a partir de las TCI provenientes de los residuos de teléfonos celulares Es de esperarse que en éste como en todo proceso existen ventajas y desventajas, sin embargo la balanza se inclina más hacia los aspectos positivos, ya que con las técnicas biológicas se pretende recuperar metales valiosos de objetos que ya son considerados basura y no arrasando con ecosistemas como es el caso de la minería. Además son más económicos los procesos biológicos, comparados con los gastos energéticos necesarios para que funcionen los hornos de la pirometalurgia y las grandes cantidades de reactivos corrosivos usados en la hidrometalurgia. A continuación se mencionan algunas ventajas y desventajas del uso de las alternativas microbiológicas. Ventajas: Las tecnologías microbiológicas son de menores costos al compararlas con otros procesos convencionales como la hidrometalurgia o pirometalurgia. Son amigables con el medio ambiente. 5 Flexibilidad en las instalaciones, que permite hacerlas rentables en espacios reducidos. La adquisición de microorganismos no requiere de una inversión económica ya que pueden ser aislados de diversos ambientes (Rodríguez et al., 2001; Llyas et al., 2007). Desventajas: El desarrollo de los microorganismos es impredecible. Se requieren más medidas de control para que el proceso sea óptimo. Se necesitan grandes cuidados para evitar contaminaciones. Actualmente la recuperación de metales no es del 100%. Los procesos son más lentos por lo que se necesitan periodos de tiempo más largos (Pant et al., 2012). 6 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El gran impacto de la tecnología y la moda está generando que las personas cambien de teléfono celular mucho antes de que este se encuentre inservible, debido al poco conocimiento acerca de sus componentes y de la aplicación adecuada de las normatividades para el tratamiento de estos residuos, éstos son desechados como cualquier otro residuo común sin imaginar las consecuencias ambientales que se pueden generar. Las sustancias tóxicas presentes en un teléfono celular son persistentes en el ambiente y pueden ser lixiviadas por las lluvias hacia el suelo y cuerpos de agua generando contaminación, lo cual es muy probable que afecte la salud de los seres humanos expuestos a estos sitios (Lim y Schoenung, 2010). Por otro lado, la obtención de oro es un proceso sumamente complicado que acaba con ecosistemas ya que para obtener un par de gramos de oro es necesario remover toneladas de suelo y subsuelo debido a que este metal se encuentra en concentraciones muy bajas. Además las rocas son tratadas con cianuros los cuales ocasionan contaminación del subsuelo y de las aguas subterráneas con consecuencias para la salud humana y para el medio ambiente. Por lo que una alternativa para la obtención de oro menos destructiva y menos contaminante, es recuperarlo a partir de las TCI provenientes de los teléfonos celulares empleando métodos microbiológicos. Otra problemática que se presenta específicamente en nuestro país, es que al no contar con la aplicación adecuada de la legislación para este tipo de residuos y tecnologías limpias para la recuperación de los materiales tóxicos y valiosos de los teléfonos celulares, estos residuos son recolectados en algunos estados de nuestro país y son llevados a otros países (China y Suiza) para la recuperación de los materiales valiosos, lo cual representa una gran pérdida económica para México. 7 4. JUSTIFICACIÓN Generalmente los teléfonos celulares dejan de usarse aunque se encuentran en buenas condiciones, como consecuencia la vida útil del teléfono móvil es de uno a dos años y posteriormente tienden a ser desechados. Los teléfonos celulares tienen en su interior una TCI constituida de una gran variedad de metales valiosos comercialmente como oro, plata, paladio y cobre, los cuales se podrían recuperar de estos residuos de manera sustentable (alternativa a las fuentes tradicionales), con bajos costos y con menor impacto ambiental. Son cada vez más necesarias investigaciones que puedan contribuir en ello, se sabe que existen microorganismos con la capacidad de recuperar ciertos metales entre ellos el oro el cual tiene un gran valor comercial en estos tiempos, por lo cual el presente estudio se justifica al tratar de generar información útil para la recuperación de oro proveniente de las TCI de los dispositivos móviles de una manera sustentable, contribuyendo al reciclaje de dichas tarjetas que actualmente forman parte de los residuos sólidos encontrados en rellenos sanitarios y que generan gran contaminación, para ello se emplearon hongos aislados del relleno sanitario del Tronconal, municipio de Emiliano Zapata, Veracruz, comenzando a escalar dichos procesos, cabe mencionar que la información que se genere será innovadora debido a las pocas investigaciones actuales sobre dicho tema, con la cual se pretende contribuir un poco con el desarrollo de nuestro país. 8 5. OBJETIVOS 5.1. OBJETIVO GENERAL Evaluar las condiciones de cultivo adecuadas para incrementar la lixiviación de oro por hongos a partir de las TCI de los teléfonos celulares. 5.2. OBJETIVOS PARTICULARES Efectuar ensayos en los cuales se evalúen condiciones de cultivo sin agitación que incrementen la lixiviación de oro a partir de TCI por una levadura y dos Aspergillus niger. Realizar ensayos en los cuales se evalúen condiciones de cultivo con agitación que incrementen la lixiviación de oro a partir de TCI por una levadura y dos Aspergillus niger. 9 6. HIPÓTESIS La lixiviación de oro por Aspergillus niger será incrementada en condiciones de cultivo sin agitación. La lixiviación de oro por la levadura se incrementará en condiciones de cultivo con agitación. 10 7. MARCO TEÓRICO Los teléfonos celulares obsoletos se encuentran dentro de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (REEE o WEEE por sus siglas en inglés), a continuación se dan algunas definiciones importantes para la comprensión del presente trabajo. 7.1. DEFINICIÓN DE RESIDUO ELECTRÓNICO, TELÉFONO CELULAR Y TARJETA DE CIRCUITO IMPRESO 7.1.1. Residuo electrónico Cualquier dispositivo que utilice un suministro de energía eléctrica, que haya alcanzado el fin de su vida útil (Mohan y Bhamawat, 2008). Cualquier aparato eléctrico o electrónico que ha llegado al final de su vida útil y que se encuentra obsoleto o ya ha sido desechado (OECD, 2001). Estos residuos comúnmente se componen de productos duraderos que son utilizados en telecomunicaciones, procesamiento de datos, entretenimiento o el hogar. Algunos ejemplos son: acondicionadores de aire, teléfonos celulares, refrigeradores y computadoras, los cuales ya no tienen un uso por los consumidores (Nhorom et al., 2008). 7.1.2. Teléfono celular Son los dispositivos electrónicos complejos para realizar llamadas que, en general constan de las siguientes partes (Fig. 7.1): batería, caja, micrófono, antena, y la tarjeta de circuito impreso que actúa como el cerebro del teléfono (Yuan y McPherson, 2003). 11 Figura 7.1. Principales elementos que constituyen un teléfono celular. a) Carátula, b) Tarjeta de circuito impreso, c) Pantalla, d) Teclado y e) Batería. 7.1.3. Tarjeta de circuito impreso (TCI) Es una base sobre la cual se montan componentes microelectrónicos tales como capacitores y chips semiconductores, ésta proporciona las interconexiones eléctricas entre los componentes y se puede encontrar comúnmente en todos los productos electrónicos (LaDou et al., 2006). 7.2. COMPOSICIÓN DE LAS TARJETAS DE CIRCUITO IMPRESO DE LOS TELÉFONOS CELULARES La fabricación de las placas de circuito impreso es compleja ya que su proceso consta de más de 50 pasos y son utilizadas grandes cantidades de productos químicos altamente peligrosos, tales como bifenilos policlorados, formaldehido, dimetilformamida y plomo (Vélez, 2010). Asia produce tres cuartas partes de las tarjetas de circuito impreso del mundo (Li et al., 2007). 12 Las tarjetas de circuito impreso de los teléfonos móviles se encuentran elaboradas de diversos materiales, constituidas en un 63% por metales, 24% de cerámicos y 13% de polímeros (Yamane et al., 2011). Entre los metales que contienen se encuentra el Fe, Pb, Cu, Sn, Ni, Ti y Al, además de algunos metales preciosos como Pd, Au y Ag (Cuadro 7.1). Varios de estos metales pueden ser recuperados cuando el teléfono celular se vuelve un residuo electrónico (Cui y Forssberg, 2003; Cui y Forssberg, 2007). Cuadro 7.1. Composición representativa de los constituyentes que conforman las tarjetas de circuito impreso en peso (%). Materiales Metales (40%, Máx)a Cu Al Pb Zn Ni Fe Sn Sb Au/ppm Pt/ppm Pd/ppm Cerámicas (30%, Máx)a SiO2 AL2O3 Óxidos alcalinos Titanatos, mica, etc. Plásticos (30%, Máx) a %a %b %c %d %e %f %g 20 26.8 10 15.6 22 17.85 23.47 2 2 1 2 8 4 0.4 1000 2000 50 4.7 1.5 0.47 5.3 1.0 0.06 80 3300 - 7 1.2 1.6 0.85 280 110 - 1.35 0.16 0.28 1.4 3.24 420 1240 10 1.55 0.32 3.6 2.6 350 - 4.78 4.19 2.17 1.63 2.0 5.28 350 4.6 1300 250 1.33 0.99 1.51 2.35 1.22 1.54 570 30 3301 294 15 6 6 15 - 30 - - 3 - - 41.86 6.97 CaO9.95 MgO0.48 - - - - - - 16 - - Polietileno 9.9 Polipropileno 4.8 Poliésteres 4.8 Epóxidos 4.8 Cloruro de polivinilo 2.4 Politetrafluoretileno 2.4 Hule 0.9 a b Shuey et al. (2006); Sum (1991). Zhao et al. (2004). c Zhang y Forssberg (1997). d Kim et al. (2004). e Iji y Yokoyama (1997). f Kogan (2006). g Ogunniyi et al. (2009). 13 Como podemos ver en esta tabla se muestran los componentes de las TCI, sin embargo no todos los investigadores reportan oro en las tarjetas debido a que utilizaron diferentes técnicas de extracción para el análisis de metales. En particular Kogan, (2006) y Ogunniyi et al. (2009) utilizaron agua regia para la determinación de oro y otros metales ya que se sabe que el oro puede ser disuelto en esa mezcla de ácidos, los demás determinaron otros metales. . 7.2.1. Tipos de tarjeta de circuito impreso Las tarjetas de circuito impreso son diversas y complejas en término del tipo, cantidad, tamaño y forma de los materiales y componentes, que significa un reto para su clasificación y reciclaje (Wang y Gaustad, 2012). En la actualidad existen tres tipos de tarjetas de circuito impreso: Tarjeta con una sola capa: circuitos de cobre y agujeros sin metalización. Tarjeta de doble capa: los circuitos están unidos por dos capas de cobre con agujeros metalizados. Tarjeta con múltiples capas: se caracterizan por tener circuitos en todas las capas (Yamane et al., 2011). Otra clasificación para las TCI es la siguiente (Murugan et al, 2008): TCI-FR-4: Compuestas por una capa múltiple de resina epóxica, fibra de vidrio y recubiertas por una capa de cobre, son usadas en teléfonos móviles. TCI-FR-2: Son hechas con una sola capa de fibra de vidrio, papel de celulosa o cubierta fenólica y con una capa de cobre, comúnmente utilizadas en televisores, aparatos domésticos y computadoras. Por otro lado, una de las características principales para diferenciar una TCI de una computadora de una TCI de un teléfono celular es que la TCI de la 14 computadora (Fig. 7.2) posee una sola capa mientras que la del teléfono celular es multicapa (Yamane et al., 2011). Ambas tarjetas se encuentran dentro de las TCI de alto grado de metales preciosos, en comparación con las TCI de bajo grado como las TCI de televisores (Wang y Gaustad, 2012) Figura 7.2. Tarjetas de circuito impreso. a) TCI de computadora y b) TCI de teléfono celular. 7.3. CONSUMO DE TELÉFONOS CELULARES A NIVEL MUNDIAL Y NACIONAL Sin duda alguna el teléfono celular ha sido una evolución del teléfono patentado en 1876 por Alejandro Graham Bell y mejorado por Alva Edison en 1878, dicho proceso se llevó a cabo en la mayor parte del siglo XX (Goggin, 2009). En la década de 1980 el teléfono móvil se estabilizó, permitiendo que el primer sistema de telefonía móvil se comercializara en 1983 en Estados Unidos, poco después en 1996 ya había más de seis millones de usuarios en Gran Bretaña (AlmanzaBeltrán y Rodríguez-Ramírez, 2011). La telefonía móvil se ha convertido en un servicio indispensable, esencial en la vida cotidiana, experimentando un enorme y constante aumento (Cruz-Sotelo y Ojeda-Benítez, 2013). El uso del teléfono celular en el mundo ha crecido de manera lineal, pasando de 2.2 billones de usuarios en 2005 (la mayoría de los cuales se encuentran en países en desarrollo) a 5.9 billones de suscriptores en 15 2011 (Fig. 7.3) y 6.8 billones en 2013 (ITU, 2014). Lo cual también se ve reflejado con la producción mundial de teléfonos celulares, se estima que en el 2006 se vendieron mil millones de teléfonos móviles en todo el mundo los cuales corresponden a un volumen de 5, 848,000 toneladas (Silva, 2009). Figura 7.3. Crecimiento lineal del número de usuarios a nivel mundial de telefonía móvil (ITU, 2014). En México, la penetración comercial de la telefonía móvil inició operaciones en 1987 con la empresa IUSACELL y ha experimentado un constante crecimiento en la última década (Cruz-Sotelo y Ojeda-Benítez, 2013). El número de usuarios de telefonía móvil a pasado de 22 millones de usuarios en 2001 (Fig. 7.4) a 100 millones de suscriptores en 2012 (ITU, 2014). En cuanto a los datos por entidad federativa, es significativo cómo el Distrito Federal presenta siempre las cifras más altas de número de usuarios de telefonía móvil (Almanza-Beltrán y RodríguezRamírez, 2011). Con respecto a la venta de celulares en México, en el año 2009 se vendieron 12 millones de celulares (Mejía, 2010). Por otra parte, un estudio sobre el uso de teléfonos celulares en México arrojó las siguientes conclusiones (Ruelas, 2009): 16 57% de los hogares en México usan teléfonos celulares. 94% de quienes usan teléfonos celulares es para comunicarse a otros celulares (enviar y recibir mensajes de texto). 61% lo utiliza como parte de su trabajo, 43% para escuchar música, 28% para jugar y 11% para navegar por internet. 91% de las personas consultadas considera a la telefonía celular como un servicio de primera necesidad. Figura 7.4. Crecimiento lineal del número de usuarios a nivel nacional de telefonía móvil (ITU, 2014). 7.4. TOXICIDAD E IMPACTO AMBIENTAL DE LOS RESIDUOS DE TELÉFONOS CELULARES Las sustancias tóxicas presentes en los teléfonos celulares, provocan que estos dispositivos tengan un impacto negativo a la salud y al medio ambiente (Lim y Schoenung, 2010). El mal manejo de los desperdicios de teléfonos celulares (vertidos a cielo abierto, utilizados en rellenos sanitarios e incinerados) en países que no cuentan con una legislación al respecto, contribuyen en gran medida a la 17 contaminación de suelos y cuerpos de agua debido a la lixiviación de los metales presentes en los dispositivos móviles, mientras que la incineración sin control de estos desechos genera la contaminación del aire al liberarse dioxinas, furanos, hidrocarburos policíclicos aromáticos y compuestos orgánicos polibromados principalmente (Lincoln et al., 2007; Osibanjo y Nnorom, 2007). De igual forma se afecta seriamente a la salud humana, ya que la mayoría de las sustancias tóxicas presentes en los teléfonos celulares son persistentes, bioacumulables y pueden provocar cáncer, problemas reproductivos, cardiovasculares, renales, inmunológicos y neurológicos (Wu et al., 2008; Nnorom y Osibanjo, 2009). En el cuadro 7.2 se mencionan los daños que causan a la salud humana algunos de los constituyentes presentes en los residuos de teléfonos celulares. Cuadro 7.2. Toxicidad al ser humano de algunas sustancias presentes en los residuos de teléfonos celulares (Yuan y Mcpherson, 2003). Sustancia Afectación en el humano Antimonio (Sb) Se ha clasificado como un carcinógeno, puede causar dolores de estómago, vómitos, diarrea, ulceras en el estómago si es inhalado por un tiempo considerable. Berilio (Be) Es carcinógeno, puede causar cáncer en el pulmón, enfermedades en la piel y beriliosis. Mercurio (Hg) Causa diversos daños en el sistema nervioso central, los riñones, el cerebro y en los fetos. Níquel (Ni) Puede provocar reacciones alérgicas, bronquitis y mal funcionamiento de los pulmones. Cadmio (Cd) Causa impactos irreversibles en la salud humana en especial en los riñones. Plomo (Pb) Puede dañar el cerebro, el sistema nervioso, los riñones, el sistema reproductivo y enfermedades de la sangre. Retardantes a la flama Estos materiales producen vapores tóxicos que causan trastornos hormonales. Bifenilos policlorados Producen enfermedades hepáticas en los humanos. 18 7.5. HISTORIA DEL ORO (Au) El oro es uno de los primeros elementos conocidos por el hombre y desde el primer momento ha despertado un inusitado interés, tanto por su utilización en monedas, como por sus usos decorativos o por su uso en otros campos, debido a sus propiedades físicas, tales como color, brillo, peso y densidad del orden de ocho veces mayor que la de cualquier otro material no metálico situado a su alrededor (Alguacil, 1995). El oro fue mencionado por primera vez en la literatura hindú en el Vedanta advaita (1000 a. C.), en los escritos de Herodoto (484-425 a.C.) y en el Antiguo Testamento (1000 a.C.) (Renner et al., 2000). Aunque Egipto era el país del oro hasta aproximadamente 1 a.C., el oro también fue encontrado y utilizado en otras regiones como la India, Irlanda, Bohemia, los Cárpatos, la Galia, en la península Ibérica y en el Cáucaso (Green, 1997). En la antigüedad el conocimiento sobre el oro pasó de un gobernante a otro a través de las conquistas y la recaudación de tributos. Los romanos tenían poco del metal en sus propias regiones, pero explotaban las riquezas minerales de los países que habían conquistado, especialmente España (Morrell, 1968). El advenimiento del cristianismo en la Edad Media reduce el esfuerzo general para la obtención de oro, en Europa, sólo los depósitos en las montañas de los Cárpatos y los Alpes fueron de alguna importancia. Fuera de Europa, el oro se produjo en la India, Japón y Siberia. Tras el descubrimiento de América y la rápida conquista del Nuevo Mundo a finales del siglo XV, los españoles transfirieron cantidades considerables de oro del Nuevo Mundo a Europa (Renner et al., 2000). Aunque los conquistadores encontraron una industria minera desarrollada en Centroamérica, sus esfuerzos por aumentar la producción de oro no tuvieron éxito. No fue sino hasta el descubrimiento de yacimientos en Brasil, que se produjo un aumento notable en la producción mundial de oro. Estos depósitos fueron explotados desde 1725 a 1800 (Morrell, 1968). En 1840, el oro aluvial fue descubierto en Siberia y los yacimientos rusos fueron explotados por los zares, Rusia produjo alrededor de un quinto de la producción mundial de oro, una proporción que se mantiene hasta el día de hoy (Green, 1997). El descubrimiento de oro en California en 1848 aumentó la 19 producción de oro en gran medida. Sin embargo, estos depósitos pronto perdieron gran parte de su importancia. El impulso más fuerte se le dio a la producción de oro a través del descubrimiento de los yacimientos de Witwatersrand en Sudáfrica en 1885, el oro de Sudáfrica pronto ocupó una posición dominante en el mercado mundial (Barahona, 1991). 7.6. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DEL ORO Y ALGUNAS APLICACIONES El oro es un metal de transición, brillante, en su estado puro tiene color amarillo pero si se encuentra aleado a otro compuesto su color puede ser negro o morado, es muy denso, blando, maleable y dúctil; debido a esto forma compuestos con otros elementos para fortalecerse. Es el mejor conductor de electricidad y calor. Presenta una alta resistencia a ser alterado químicamente por calor, humedad, y a la mayoría de las sustancias corrosivas (De la Venta, 2009). Consta de una estructura cúbica centrada en las caras (FCC) con un parámetro de red de 407.82 pm, el radio medio de cada átomo tiene un valor de 135 pm, la distancia Au-Au es 0.288 nm, la configuración electrónica de cada átomo de oro es (Xe) 4f 14 5d10 6s1 (Askeland, 2011). El oro se encuentra principalmente en estado nativo, mezclado con arena o diseminado en venas de cuarzo; el primero se llama placer o arenal aurífero, y el último oro en filones. Pequeñas cantidades de oro hay también en los sulfuros naturales de plomo y cobre. Se han hallado pepitas de oro nativo que varían en tamaño desde el de un grano de arena hasta el de masas de más de 50 kilogramos (Rayner-Canham y Overton, 2010). Existe combinado en la silvanita, telurio de oro y plata, (AuAg)Te2, valioso mineral que se encuentra en Colorado. Ninguno de los ácidos corrientes ataca al oro. Se disuelve en una mezcla de ácido nítrico y clorhídrico (agua regia), y en ácido selénico. El oxígeno y el sulfuro de hidrógeno no ejercen acción sobre el oro, pero el cloro y el bromo lo atacan fácilmente formando haluros solubles. El empleo más importante del oro es en la acuñación de moneda (Babor y Ibarz.Aznárez, 1977). Mientras que el oro que se 20 emplea en la joyería suele ser de 10 a 22 quilates, generalmente de 18 quilates. El oro blanco contiene 50% de oro y 50% de plata. Los panes de oro sirven para dorar y rotular en encuadernación. Los vidrios de color rubí más apreciados se obtienen por la adición de una pequeña cantidad de oro metálico; el color es debido al oro en suspensión coloidal (Zabaleta-Alonso, 1999) Al disolver oro en agua regia se forma ácido cloroáurico, HAuCl 4, en el que el oro forma parte del ión complejo negativo AuCl4-. Calentando este complejo se desprende cloruro de hidrógeno, y queda cloruro áurico, AuCl3, rojo y cristalino. Si el cloruro áurico se calienta a 180 °C, se forma cloruro auroso, AuCl y cloro. El óxido auroso, AuO2, es un polvo violeta; el hidróxido correspondiente AuOH, es una base débil (Cotton y Wilkinson, 1993). El óxido áurico Au2O3, es pardo, y su hidróxido, Au(OH)3, es un ácido débil capaz de reaccionar con las bases fuertes formando sales llamadas auratos. El cianuro potásico reacciona con las sales aurosas y áuricas formando el aurocianuro, KAu(CN)2, y el auricianuro, KAu(CN)4, sales complejas incoloras cuyas disoluciones se utilizan para el dorado electrolítico (Babor y Ibarz.Aznárez, 1977). 7.7. IMPORTANCIA DE OBTENER ORO A PARTIR DE UNA FUENTE SECUNDARIA COMO LAS TCI DE TELÉFONOS CELULARES Tomando en consideración todas las aplicaciones mencionadas con anterioridad para el Au y sus futuras aplicaciones en forma de nanopartículas, varios autores señalan que la demanda de este metal aumentará constantemente, pues cada día se están encontrando nuevas aplicaciones para este metal en diversas industrias, lo cual provocará que aumente su demanda y su costo, por tal razón se debe buscar su sustentabilidad (Corti y Holliday, 2004; Deplanche et al., 2011). El problema que radica alrededor del Au es que se encuentra bastante diluido en la corteza terrestre, y los métodos extractivos y de refinación actual a partir de los minerales son complicados, caros, no amigables con el medio ambiente (Fleming, 1992; Dobson y Burgess, 2007; Dill, 2010). Por lo que el desarrollo de nuevas 21 biotecnologías extractivas y de recuperación a partir de los materiales de desecho es cada vez más necesario. Es importante hacer referencia sobre este último punto en especial, pues en materiales de desecho (TCI de teléfonos celulares) se pueden encontrar mayores cantidades de Au (20%) que en su extracción a partir de minerales (0.5-1%) (Fig. 7.5) que podría ser una ventaja para su recuperación desde el punto de vista económico y ambiental (Tuncuk et al., 2012). Figura 7.5. Comparación de la cantidad recuperada de Au, Minería vs Residuos de TCI. 7.8. MECANISMOS Y TRANSPORTE DE MASA EN LOS PROCESOS EVALUADOS PARA ESTE TRABAJO: BIOLIXIVIACIÓN, BIOSORCIÓN, BIOACUMULACIÓN. La biolixiviación es un proceso basado en la capacidad de los microorganismos para transformar compuestos sólidos en elementos solubles y extraíbles para su recuperación (Bosecker, 1997). En este proceso se obliga a los microorganismos a desarrollarse en un medio de cultivo pobre en metales, por lo que éstos buscarán la manera de liberar dichos elementos que se encuentran en las TCI pasándolos a la solución para utilizarlos en su propio desarrollo ya que los metales son de gran importancia en su metabolismo. Ten y ting (2003) reportan que la lixiviación de metales es atribuida a la secreción de ácidos orgánicos de los microorganismos, otras investigaciones confirman que Aspergillus niger produce 22 ácidos orgánicos como cítrico, oxálico, glutámico, etc (Grewal y Kalra, 1995; Legisa y Gradisnik, 1995). También podría estar produciendo algún metabolito secundario o enzima que le permite oxidar a los metales (que inicialmente se encuentran con una valencia 0 y al ser oxidados cambian de valencia) y solubilizarlos (Fig. 7.6). Figura 7.6. Esquema de la lixiviación: I) Antes de la lixiviación y II) Después de la lixiviación. a) medio mineral, b) TCI con soluto (Au), c) soluto, d) TCI lixiviada, e) medio mineral con el soluto (partículas de Au). Otro punto a evaluar ha sido la bioacumulación (Fig. 7.7), mecanismo celular que involucra el transporte del metal al citoplasma consumiendo un gasto de energía, el metal es atrapado por metaloproteinas generadas por el hongo (Vullo, 2003). También existe otro mecanismo involucrado llamado biosorción (Fig. 7.7) el cual se caracteriza por retener a los metales (cargas positivas) en la superficie de las paredes celulares (las paredes celulares generalmente poseen cargas negativas y positivas, generadas por los grupos funcionales presentes en ellas) mediante interacciones fisicoquímicas (Vullo, 2003). 23 Figura 7.7. Mecanismo de biosorción y bioacumulación de Au por microorganismos. 7.9. BIOPROCESO Todo proceso en el cual se hace uso de células microbianas, vegetales, o animales y de algunos componentes de dichas células como pueden ser enzimas o ácidos orgánicos (Doran, 1995). 7.10. BIOLIXIVIACIÓN DE MATERIALES SÓLIDOS Es un proceso basado en la capacidad de los microorganismos para transformar compuestos sólidos en elementos solubles y extraíbles para su recuperación, el cual comprende tres principales etapas 1) reacción redox, 2) formación de ácidos orgánicos e inorgánicos y 3) la excreción de agentes complejantes (Bosecker, 1997). 24 7.11. METALES Los metales son elementos que contienen átomos electropositivos con la capacidad de donar sus electrones de valencia y formar un “mar” de electrones que rodean los átomos. Los electrones de valencia se mueven con libertad dentro de una infinidad de electrones y se asocian con varias partes centrales de átomos. Los metales tienen buena ductilidad debido a que los enlaces metálicos no son direccionales (Askeland, 2011). 7.12. REACCIONES DE ÓXIDO REDUCCIÓN En estas reacciones se transfieren electrones de una sustancia a otra. Reacción de oxidación Este término hace referencia a una semirreacción en la cual existe pérdida de electrones, el estado de oxidación es el número de cargas que tendrá un átomo en una molécula o en un compuesto iónico si todos sus electrones son transferidos. Reacción de reducción De igual manera es una semirreación solo que en esta existe una ganancia de electrones, actuando un agente reductor el cual dona electrones y genera que el elemento se reduzca (Chang, 2010). 7.13. PROTEÍNAS Son macromoléculas formadas por cadenas lineales de monómeros de aminoácidos, mediante un enlace peptídico, se encuentran en toda la célula y tienen funciones tanto estructurales como catalíticas, las proteínas estructurales suelen ser ladrillos que le dan forma la célula como membranas, paredes celulares y componentes citoplasmáticos (Madigan et al., 2010: Armstrong y Bennett, 1982). 25 7.14. ENZIMAS Las enzimas funcionan como catalizadores biológicos, no afectan el equilibrio de reacción pero si aumentan la velocidad de esta. Todas las enzimas son proteínas con excepción a las del grupo de moléculas RNA catalítico. Una enzima contiene uno o varios sitios activos y la molécula fijada en el sitio activo se denomina sustrato (Nelson y Cox, 2009). 7.15. pH Una disolución puede ser ácida o básica esto dependerá de la concentración de iones H+ hidronio que contenga, por lo tanto pH se define como el logaritmo negativo de la concentración de H+ (Harris, 2007). El pH aumenta en una unidad cuando la concentración de H+ disminuye por lo tanto cuanto mayor es el pH menos ácida es la disolución (Masterton y Hurley, 2003). 7.16. CURVA DE CALIBRACIÓN En muchos análisis químicos se mide la respuesta del procedimiento analítico a cantidades conocidas de analito (llamadas patrones o estándares) para interpretar luego la respuesta a cantidades desconocidas. Con este fin se prepara una curva de calibración, que es un gráfico, que representa la respuesta de un método analítico en función de cantidades conocidas del analito (Harris, 2007). 7.17. ESPECTROSCOPIA ATÓMICA Este método puede detectar cuantitativa y cualitativamente alrededor de 70 elementos, puede estar basada en la medición de absorción, emisión o fluorescencia. Es necesario llevar una muestra al estado de vapor atómico, en el cual la muestra se atomiza en una llama, empleando un horno calentado 26 eléctricamente o en un plasma de radiofrecuencia. La sensibilidad analítica y el grado de interferencia depende de cómo se hace la atomización (Skoog et al., 2001). 7.17.1. Espectrometría de Emisión Óptica por Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-OES) ICP-OES es uno de los más poderosos y populares herramientas analíticas para la determinación de elementos traza en una gran variedad de tipos de muestras, la técnica se basa en la emisión espontánea de fotones desde átomos e iones que han sido excitados en una descarga de radiofrecuencia. Muestras líquidas y gaseosas pueden ser inyectadas directamente en el instrumento, mientras que las muestras sólidas requieren extracción o digestión ácida de manera que los analitos estarán presentes en una solución. La solución de las muestras a analizar se convierten en un aerosol y son dirigidas al canal central del plasma, en el núcleo el plasma de acoplamiento inductivo (ICP) la temperatura es de aproximadamente 10 000 °K, por lo que el aerosol se vaporiza rápidamente (Hou y Jones, 2000). Los elementos presentes en los analitos han liberado átomos libres en el estado gaseoso. Además las colisiones de excitación dentro del plasma imparten energía adicional a los átomos, provocando su promoción a estados excitados y la energía disponible es suficiente para convertir los átomos en iones, posteriormente se promueven los iones a estados excitados; ambas especies en estado excitado atómicos e iónicos pueden luego relajarse al estado fundamental a través de la emisión de un fotón. Estos fotones tienen energías características que se determinan por la estructura de los niveles cuantizados de energía de los átomos o iones. Por lo tanto la longitud de onda de los fotones se puede utilizar para identificar los elementos de los que son originarios. El número total de fotones es directamente proporcional a la concentración del elemento originario de la muestra (Manning y Grow, 1997). 27 La instrumentación asociada con un ICP-OES es relativamente simple (Fig. 7.8). Una porción de los fotones emitida por el ICP se recoge con una lente o un espejo cóncavo. Este lente se centra en la abertura de entrada de un dispositivo que selecciona la longitud de onda tal como un monocromador. La longitud de onda particular que sale del monocromador se convierte en una señal eléctrica mediante un fotodetector. Luego la señal se amplifica y es procesada por un detector electrónico, finalmente se muestra y se almacena en un ordenador (Rouessac y Rouessac, 2007). Figura 7.8. Descripción general de la técnica de Espectrometría de Emisión Óptica por Plasma Acoplado Inductivamente (ICP). 7.18. LEVADURA Estos microorganismos son hongos unicelulares que se encuentran constituidos por una sola célula redonda u ovalada independiente y microscópica la cual se reproduce por gemación o fisión (Burdon et al., 1968; Alexander, 1994). 28 7.19. HONGO Son organismos desprovistos de clorofila y en consecuencia, desde el punto de vista de la nutrición son heterótrofos pues obtienen su alimento de la materia orgánica. Se han identificado más de 100,000 especies de hongos (Pelczar, 1966). 7.20. FASES DE CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Fase de latencia: cuando se inocula una población microbiana en un medio fresco por lo general el crecimiento no comienza inmediatamente si no tras un periodo de tiempo que constituye la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo y de las condiciones de crecimiento. Fase exponencial: cada célula se divide para formar dos, cada una de las cuales va a formar otras dos y así sucesivamente Fase estacionaria: lo que sucede es que el nutriente esencial del medio de cultivo va a llegar a ser un factor limitante del crecimiento o se generan algunos productos de desecho que inhiben el crecimiento exponencial. Fase de muerte: las células mueren (Madigan et al., 2010). 7.21. BIORREACTORES Un reactor es el corazón de cualquier proceso de fermentación o conversión enzimática, diseñar biorreactores no ha sido una tarea fácil ya que aparte de basarse en principios científicos también incluye los principios de ingeniería y toma de decisiones (Doran, 1995). En esta investigación se hizo uso de biorreactores sencillos. 29 Un biorreactor es un dispositivo útil para hacer crecer células tratando de mantener ciertas condiciones propicias para que el organismo que se está cultivando se desarrolle. Puede ser 1) Discontinuo o batch: el crecimiento de los microorganismos en cultivos de tipo batch hace referencia a que las células se cultivan en un recipiente con una concentración inicial, la cual no será alterada por nutrientes adicionales, por lo que el volumen permanece constante y solo las condiciones del medio como pH, temperatura, la agitación (si cuenta con ella), serán controladas. 2) Semicontinuo: en dicho cultivo los nutrientes son alimentados al biorreactor en forma continua o semicontinua. 3) Continuo: esta condición de cultivo consiste en alimentar los nutrientes y retirar productos de manera continua en el biorreactor. Bajo ciertas condiciones el cultivo puede llegar a alcanzar el estado estacionario donde no existirá variación con el tiempo y volumen del biorreactor. 30 8. MATERIALES Y MÉTODOS 8.1. Diagrama general de la metodología Lixiviación fúngica de Au a partir de las tarjetas de circuito impreso de los teléfonos celulares Sin agitación Con oxigenación Con agitación Desmantelamiento de teléfonos celulares y reducción del tamaño de las TCI Selección de condiciones de cultivo adecuadas para cada hongo Lixiviación de Au por hongos Lixiviación por levadura B20. Cultivo con agitación Lixiviación por Aspergillus niger. Cultivo sin agitación Lixiviación por Aspergillus niger MXPE6 + A. niger MX7. Cultivo sin agitación Se analizó Glucosa Proteínas pH Biomasa seca Lixiviación de Au Bioacumulación de Au 31 8.2. BIORREACTORES DE LIXIVIACIÓN UTILIZADOS Para evaluar las condiciones de cultivo sin agitación que incrementen la lixiviación de Au por los hongos, se utilizó un biorreactor sin agitación de plástico (biorreactor1), el cual tiene un dispositivo para inocular en la tapa y una llave con la finalidad de tomar muestras representativas del cultivo y evaluar la evolución del crecimiento de los hongos y la biolixiviación de Au (Fig. 8.1). Figura 8.1. Biorreactor sin agitación con capacidad de 5 L. a) dispositivo de inoculación y b) dispositivo de muestreo. Asimismo se evaluaron las condiciones de cultivo sin agitación, en un biorreactor sin agitación con un dispositivo de oxigenación (biorreactor 2), el cual se conectó a una bomba de oxígeno (Fig. 8.2). 32 Figura 8.2. Biorreactor con oxigenación y capacidad de 2 L. a) Dispositivo para inocular y b) Dispositivo de oxigenación. Finalmente para evaluar las condiciones de cultivo con agitación, se utilizó un biorreactor con agitación (biorreactor 3), el cual a diferencia de los antes descritos contiene un dispositivo agitación y de igual manera dispositivos para inocular y muestrear (Fig. 8.3). Figura 8.3. Biorreactor con agitación y capacidad de 5 L. a) dispositivo para inocular, b) controlador de agitación y c) dispositivo para muestrear. 33 8.3. DESMANTELAMIENTO DE TELÉFONOS CELULARES Y REDUCCIÓN DEL TAMAÑO DE LAS TCI Se desmantelaron los teléfonos celulares hasta obtener las TCI y se cortaron hasta conseguir un polvo. Este material se esterilizó con etanol por 4 h y se puso a secar durante 24 h a 70 °C. Posteriormente 4 muestras representativas de 1g del material se sometieron a una digestión con agua regia (HCl/HNO3, 3:1) durante 48 h a 220 °C, la solución obtenida se filtró y se aforó a 50 mL. Las muestras disueltas se analizaron en un espectrofotómetro de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES) para saber el contenido de Au presente en el material. 8.4. ENSAYOS PRELIMINARES PARA LA SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO ADECUADAS PARA CADA TIPO DE HONGO 8.4.1. Ensayos preliminares para seleccionar la mejor condición de cultivo para hongos unicelulares La levadura L-20 se creció en cajas de Petri con agar nutritivo (Bioxon®) a 28 °C por 7 días. Transcurrido este tiempo, se preparó una suspensión de la levadura a una concentración de 108 UFC mL-1. Luego se preparó el medio mineral (g L-1): 1.5 (NH4)2SO4; 0.5 NaH2PO4; 0.1 CaCl2; 0.1 MgCl2 y 20 glucosa; pH=4.45, del cual se les adicionaron 0.750 L al biorreactor 1 y al biorreactor 2 con capacidad de 2.5 L, mientras que al biorreactor 3 con capacidad de 5 L, se le adicionaron 1.6 L. Posteriormente al biorreactor 1 y al biorreactor 2 se les agregaron 7.3 g de polvo de las TCI previamente esterilizado, y 9.1 g al biorreactor 3. Después se agregaron 10 mL de la suspensión de la levadura al biorreactor 1 y al biorreactor 2, y 20 mL al biorreactor 3. Finalmente los biorreactores se dejaron a temperatura ambiente por 8 días. Al término de la incubación se determinó la biomasa seca, el pH y la cantidad de Au lixiviado utilizando espectrometría de emisión óptica ICPOES (Varian ® Mod. 725-ES). 34 8.4.2. Ensayos preliminares para seleccionar la mejor condición de cultivo para hongos pluricelulares Aspergillus niger MXPE6 se creció en cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA, Bioxon®) a 28 °C por 10 días. Transcurrido este tiempo, se cortaron discos individuales de PDA con micelio del hongo (7 mm de diámetro). Posteriormente al biorreactor 1 y al biorreactor 2 con capacidad de 2.5 L, se les adicionó 0.750 L del medio mineral (g L-1): 1.5 (NH4)2SO4; 0.5 NaH2PO4; 0.1 CaCl2; 0.1 MgCl2 y 20 glucosa; pH 4.45, mientras que al biorreactor 3 con capacidad de 5 L, se le adicionó 1.6 L del medio mineral. Luego al biorreactor 1 y al biorreactor 2 se les agregó 4 g de polvo de las TCI previamente esterilizado, y 9.1 g al biorreactor 3. Después se agregaron 20 discos individuales de PDA con micelio del hongo al biorreactor 1 y al biorreactor 2, y 38 discos al reactor 3. Finalmente los bioreactores 1 y 2 se dejaron a temperatura ambiente por 12 días, y 7 días para el biorreactor 3. Al término de la incubación se determinó, la biomasa seca, el pH y la cantidad de Au lixiviado utilizando espectrometría de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES). 8.5. LIXIVIACIÓN DE Au POR HONGOS UNICELULARES Y PLURICELULARES 8.5.1. Lixiviación de la levadura bajo condiciones de cultivo con agitación La levadura L-20 se creció en cajas de Petri con agar nutritivo (Bioxon®) a 28 °C por 7 días. Transcurrido este tiempo, se preparó una suspensión de la levadura a una concentración de 108 UFC mL-1. Posteriormente al biorreactor 3 con capacidad de 5 L, se les adicionaron 1.6 L del medio mineral (g L-1): 1.5 (NH4)2SO4; 0.5 NaH2PO4; 0.1 CaCl2; 0.1 MgCl2 y 20 glucosa; pH 7.2. Luego se le agregaron 11 g de polvo de las TCI previamente esterilizado. Después se añadieron 20 mL de la suspensión de la levadura al biorreactor. Finalmente se dejó incubar a temperatura ambiente por 16 días. Para los controles se emplearon biorreactores inoculados sin el polvo de TCI y se emplearon tres réplicas para 35 cada tratamiento. Durante el periodo de incubación se realizaron muestreos cada 48 h y se determinó el pH, azúcares totales (Anexo I), proteínas (Anexo II), biomasa seca total y la cantidad de Au lixiviado utilizando espectrometría de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES). 8.5.2. Lixiviación de Aspergillus niger MXPE6 bajo condiciones de cultivo sin agitación Aspergillus niger MXPE6 se creció en cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA, Bioxon®) a 28 °C por 10 días. Transcurrido este tiempo, se cortaron discos individuales de PDA con micelio del hongo (7 mm de diámetro). Posteriormente al biorreactor 1 con capacidad de 5 L, se les adicionó 1.6 L del medio mineral (g L -1): 1.5 (NH4)2SO4; 0.5 NaH2PO4; 0.1 CaCl2; 0.1 MgCl2 y 20 glucosa; pH 4.45. Luego se agregaron 11 g de polvo de las TCI previamente esterilizado. Después se agregaron 38 discos individuales de PDA con micelio del hongo. Finalmente se dejó incubar a temperatura ambiente por 32 días. Para los controles se emplearon biorreactores inoculados sin el polvo de TCI y se emplearon tres réplicas para cada tratamiento. Durante el periodo de incubación se realizaron muestreos cada 96 h y se determinó el pH, azúcares totales (Anexo I), proteínas (Anexo II), biomasa seca total y la cantidad de Au lixiviado utilizando espectrometría de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES). 8.5.3. Lixiviación de un consorcio de Aspergillus niger bajo condiciones de cultivo sin agitación Los hongos filamentosos Aspergillus niger MXPE6 y A. niger MX7 se crecerán en cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA, Bioxon®) a 28 ºC por 10 días. Transcurrido este tiempo, se cortarán discos individuales de PDA con micelio de cada A. niger (7 mm de diámetro). Posteriormente al biorreactor 1 con capacidad de 5 L, se les adicionó 1.6 L del medio mineral (g L -1): 1.5 (NH4)2SO4; 0.5 36 NaH2PO4; 0.1 CaCl2; 0.1 MgCl2 y 20 glucosa; pH 4.45. Luego se agregaron 11 g de polvo de las TCI previamente esterilizado. Después se agregaron 19 discos individuales de PDA con micelio de cada respectivo hongo. Finalmente se dejó incubar a temperatura ambiente por 32 días. Para los controles se emplearon biorreactores inoculados sin el polvo de TCI y se emplearon tres replicas para cada tratamiento. Durante el periodo de incubación se realizaron muestreos cada 96 h y se determinó el pH, azúcares totales (Anexo I), proteínas (Anexo II), biomasa seca total y la cantidad de Au lixiviado utilizando espectrometría de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES). La biomasa y los parámetros cinéticos del crecimiento de los hongos se calculó como se muestra en el Anexo III, ya que es importante observar cómo afecta la presencia del residuo de TCI al desarrollo del hongo. 8.6. BIOACUMULACIÓN FÚNGICA DE Au De la biomasa seca total de cada tratamiento, se tomaron 0.5 g de biomasa seca de la levadura, Aspergillus niger MXPE6 y de la combinación de Aspergillus niger, cada una se colocó en un tubo de digestión al cual se le adicionaron 10 mL de agua regia, posteriormente se calentaron a 220 °C durante 48 h, la solución obtenida se filtró y se aforó a 50 mL. Las muestras disueltas se analizaron por espectrometría de emisión óptica ICP-OES (Varian ® Mod. 725-ES) para saber el contenido de Au presente en la biomasa seca fúngica. 8.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para la evaluación de proteínas, azucares totales, biomasa seca, lixiviación de Au, bioacumulacion Au y pH, se empleó un diseño experimental completamente al azar utilizando un factorial 3x2 (tres hongos, con y sin residuo de TCI). Cada tratamiento tuvo tres repeticiones. Los datos obtenidos fueron analizados 37 mediante análisis de varianza y la prueba de comparación de medias (Tukey, α=0.05) con el programa estadístico SAS (SAS Institute, 2010). 38 9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 9.1. ENSAYOS PRELIMINARES PARA LA SELECCIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO ADECUADAS PARA CADA TIPO DE HONGO Los ensayos preliminares realizados indican, que en el caso del hongo pluricelular Aspergillus niger MXPE6 la biomasa fúngica producida presenta diferencias significativas entre el cultivo sin agitación y el cultivo con agitación. Sin embargo, el biorreactor con oxigenación para el caso de este hongo en particular produjo una cantidad menor de biomasa. En cambio para la levadura B-20 se observó que bajo condiciones sin agitación se obtuvo menor cantidad de biomasa, y en condiciones con oxigenación y con agitación se encontraron diferencias estadísticas en la biomasa producida. Por otra parte, el pH de los medios de cultivo en condiciones con agitación y sin agitación para el hongo A. niger MXPE6 no presentan grandes diferencias al pH inicial del medio de cultivo (4.45). No obstante, el pH es más alto bajo condiciones de oxigenación en comparación con el pH inicial del medio de cultivo. Mientras que para la levadura B-20 el pH del medio de cultivo bajo condiciones de oxigenación es 1.7 veces mayor y con agitación es 1.45 veces menor que el pH inicial del medio de cultivo (4.45), aunque bajo condiciones sin oxigenación el pH es similar al pH inicial del medio de cultivo. En cuanto a la lixiviación de Au se puede observar que para el hongo A. niger MXPE6 la mejor condición de recuperación se dio en el sistema sin agitación con 6.20% de recuperación de Au mientras que en condiciones con oxigenación se recuperó 0.68 % y con agitación 1.60%. Entre tanto la Levadura B-20 solo recuperó Au (8.43%) bajo condiciones con agitación (Cuadro 9.1). 39 Cuadro 9.1. Biolixiviación de Au, biomasa fúngica seca y pH de los ensayos preliminares para el hongo A. niger MXPE6 y la levadura B-20 bajo diferentes condiciones de cultivo. Microorganismo Condición pH Aspergillus niger MXPE6 Sin agitación Oxigenacion Agitacion Sin agitación Oxigenacion Agitacion 2.83 3.63 2.86 4.40 2.75 2.66 Levadura B-20 Biomasa seca (g) 1.24 0.09 0.61 0.58 1.02 1.70 Material (g) 4.00 4.00 4.00 7.30 7.30 7.30 Recuperación de Au (%) 6.20 0.68 1.60 0.00 0.00 8.43 El hongo Aspergillus niger se desarrolló mejor en condiciones de cultivo sin agitación puesto que esta condición le permitio expandir su micelio sobre el material de TCI teniendo un mejor contacto e interactuando de una mejor manera con el material. En el caso de la levadura sabemos que es un hongo uricelular lo cual lo hace ser mas pequeño y no producir un micelio, incluso su inoculación al medio de cultivo es mediante una solución de UFC, por lo que la agitación le proporciona mayor cantidad de oxígeno necesario para su desarrollo, además se está incrementando la temperatura del medio lo cual tambien es favorable en su crecimiento. 9.2. LIXIVIACIÓN DE Au POR HONGOS UNICELULARES Y PLURICELULARES En base a los resultados preliminares, se tomó la decisión de emplear condiciones de cultivo con agitación para el caso de la levadura B-20 (Fig. 9.1) y condiciones de cultivo sin agitación para el hongo A. niger MXPE6 y el consorcio fúngico formado por A. niger MXPE6 + A. niger MX7 en los experimentos de biolixiviación de Au a partir de residuos de TCI (Fig. 9.2). 40 Figura 9.1. Bioensayos de lixiviación bajo condiciones con agitación para la levadura B20. Figura 9.2. Bioensayos de lixiviación bajo condiciones sin agitación del consorcio fúngico A. niger MXPE6 + A. niger MX7. El consumo de glucosa para el hongo A. niger MXPE6 es ligeramente mayor en los biorreactores con residuo de TCI a partir del día 16 que en su respectivo control (Fig. 9.3a). Sin embargo, para el consorcio fúngico no se observaron diferencias estadísticas (P≤0.001) entre los tratamientos con residuos de TCI y sus respectivos controles (Fig. 9.3b). No obstante, para el caso de la levadura B-20 el consumo de glucosa también aumento en los tratamientos con residuos de TCI (Fig. 9.3c). Además se observa que el consumo de glucosa en presencia de residuos de TCI es mayor para el caso de la levadura B-20 (98%) en comparación con el consumo de los hongos pluricelulares en el día 16. Con lo que respecta a 41 los hongos filamentosos utilizados no se encuentran diferencias significativas (P≤0.001) para el consumo de glucosa entre el consorcio fúngico y el A. niger MXPE6 a las 4, 8,12, 30 y 32 h. Dichos resultados son similares a los encontrados por Madrigal-Arias (2012) para A. niger MXPE6, en el caso de los tratamientos con residuos de TCI, aunque es importante señalar que sus ensayos se realizaron bajo condiciones de agitación en un periodo más corto de tiempo (16 días). Ambos resultados son indicativos del metabolismo fúngico, lo cual resalta la importancia de incluir una fuente de carbono para proveer la energía necesaria que satisfagan las funciones metabólicas y la biosíntesis de los constituyentes celulares que ayuden al hongo a desarrollarse en condiciones de estrés y no estrés (Cooke, 1968; Wainwright, 1988). 42 Figura 9.3. Consumo de glucosa en los medios de cultivo para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 43 Por otra parte se evaluó la concentración de proteínas intracelulares en la biomasa fúngica para observar como fue el crecimiento metabólico de los hongos, Aspergillus niger MXPE6 muestra un aumento del día 12 al día 20 en los tratamientos con residuos de TCI y disminuye de los días 24 al 28 en comparación con sus controles (Fig. 9.4a). Para el caso del consorcio fúngico de Aspergillus se encuentra un comportamiento ligeramente diferente entre los tratamientos con residuos de TCI y sus respectivos controles (Fig. 9.4b). En cambio la levadura B-20 presenta un aumento en la concentración de proteínas intracelulares del día 2 al día 6, luego se observó que esta concentración comenzó a disminuir a partir del día 10 en los tratamientos con residuos de TCI en comparación de sus controles (Fig. 9.4c). Además se logró observar que la mayor concentración de proteínas intracelulares se encuentra en la biomasa del hongo A. niger MXPE6 (3 mg g-1) en los tratamientos con residuos de TCI en el día 32. Finalmente no se encontraron diferencias (P≤0.001) estadísticas entre los tratamientos con residuos de TCI y los controles de cada microorganismo con lo que respecta a las proteínas intracelulares de la biomasa fúngica. Para las proteínas intracelulares no ha sido posible comparar los resultados obtenidos, debido a. la escasa información referente sobre hongos expuestos ante residuos de TCI. 44 Figura 9.4. Concentración de proteínas en la biomasa fúngica para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 45 Cabe mencionar que adicionalmente se determinó la concentración de proteínas extracelulares presentes en el medio de cultivo. Sin embargo, únicamente los tratamientos inoculados con la levadura B-20 mostraron la presencia de este tipo de proteínas y se observa una mayor concentración de éstas del día 2 al día 12 en los tratamientos con residuos de TCI en comparación con los controles, ya que después de este tiempo comienza a disminuir su concentración (Fig. 9.5). Figura 9.5. Concentración de proteínas extracelulares presentes en el medio de cultivo de la levadura B-20 para los tratamientos con y sin residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). En el caso de las proteínas intracelulares también ha sido imposible comparar los resultados obtenidos, debido a. la escasa información referente sobre hongos expuestos ante residuos de TCI. Con respecto al pH se observa que A. niger MXPE6 tuvo valores mayores de pH en los tratamientos con residuos de TCI en comparación con sus controles (Fig. 9.6a). En cambio para el consorcio fúngico el pH es muy similar entre los tratamientos con residuos de TCI y sus controles (Fig. 9.6b). De igual forma en los 46 experimentos con la levadura B-20 se presentaron valores mayores de pH en los tratamientos con residuos de TCI (4.2) en comparación de sus respectivos controles (3.4) (Fig. 9.6c). Cabe mencionar que Aspergillus niger es un hongo ampliamente estudiado por producir altas concentraciones de ácidos orgánicos como ácido cítrico, oxálico, glutámico, etc., además de acidificar su ambiente hasta valores de 1.5 (Grewal y Kalra, 1995; Legisa y Gradisnik, 1995). Los valores de pH encontrados en los controles de Aspergillus niger MXPE6 (2.71) y del consorcio fúngico de Aspergillus niger (2.73) son bajos, reflejando lo anteriormente mencionado. Sin embargo, cuando son expuestos a los residuos de TCI, el valor de pH para los tratamientos inoculados con Aspergillus niger MXPE6 se incrementan, no obstante, esto no sucede para el consorcio fúngico, ya que el pH es muy similar al de los controles. En el gráfico de la levadura B-20 también se encuentra un incremento en los valores de pH de los tratamientos con residuos de TCI en comparación con sus respectivos controles. Situación que ya ha sido mencionada por Brandl et al. (2001) para Thiobacillus thioxidans, T. ferrooxidans y A. niger, pero en este caso empleando polvo de REEE. Posteriormente Pham et al. (2009) también reportan lo mismo pero para las bacterias Chromobacterium violaceum y Pseudomonas fluorescens. Ambos autores señalan que la lixiviación de otros metales además del metal de interés puede ser la causa por la cual se incrementa el pH en el medio de cultivo en presencia de REEE. 47 Figura 9.6. Comportamiento del pH para los tratamientos con y sin residuo de TCI. a) A. niger MXPE6, b) A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y c) Levadura B-20 (n=3, Media ± error estándar). 48 La biomasa fúngica seca de los tratamientos con residuos de TCI presentó diferencias significativas (P≤0.001) en comparación de sus respectivos controles. El consorcio fúngico A. niger MXPE6 + A. niger MX7 es el que mayor biomasa seca produjo ante residuos de TCI (Fig. 9.7). Figura 9.7. Biomasa fúngica seca de los tratamientos con y sin residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). Tampoco ha sido posible comparar los resultados obtenidos de biomasa seca fúngica, debido a la escasa información referente sobre hongos expuestos ante residuos de TCI. Sin embargo podemos decir que el medio mineral inoculado inicialmente era pobre en metales debido a esto los microorganismos comenzarán a nutrirse de los metales que contenga la TCI y que le favorescan en su desarrollo. La lixiviación de Au por los hongos filamentosos muestra diferencias significativas (P≤0.001), encontrando que los tratamientos inoculados con el consorcio fúngico tienen mayor lixiviación en todos los tiempos evaluados y una lixiviación máxima del 56% de Au, en cambio el hongo A. niger MXPE6 tuvo una recuperación del 17% de Au en el primer tiempo de evaluación (Fig. 9.8). Lo que contrasta, con la 49 no lixiviación de la levadura B-20 en ninguno de los días evaluados, resultados no esperados al considerar los resultados obtenidos en los ensayos preliminares. Ya ha sido informada la capacidad que tiene A. niger para lixiviar metales, tal es el caso de Ren et al. (2009) donde se reporta que este hongo es capaz de remover el 56%, 100%, 30% y 19% de Cu, Cd, Pb y Zn respectivamente, al ser inoculado en medios de cultivo con suelo contaminado con metales, mientras que al tratarse el suelo directamente con el sobrenadante obtenido del medio de cultivo se encuentra una lixiviación del 97.5% Cu, 88.2% Cd, 26% Pb y 14.5% Zn. Además estos autores evidencian que las remociones encontradas son debidas a la producción de ácidos orgánicos por A. niger (Rezza et al., 2001). Esto también es mencionado en la investigación de Sayer et al. (2001) quienes indican que los ácidos orgánicos producidos en los cultivos de A. niger son capaces de enlazar a Co y Zn más eficientemente en algunos casos que lo ácidos orgánicos comerciales. La habilidad que tiene A. niger para lixiviar igualmente ha sido puesta a prueba en minerales de baja ley, informando que es capaz de solubilizar 68% de cobre, 46% de zinc y 34% de níquel (Mulligan et al., 2004). Sin embargó, para la lixiviación de metales a partir de REEE Brandl et al. (2001) mencionan que A. niger es capaz de lixiviar un 65% de Cu y Sn, pero más del 95% de Al, Ni, Zn y Pb a partir de polvo de REEE. Para el caso de metales preciosos como el Au proveniente de REEE Madrigal-Arias (2012) indica una lixiviación de Au del 42% para Aspergillus niger MXPE6 bajo condiciones de agitación utilizando TCI de teléfonos celulares. Sin embargo, los resultados encontrados en el presente trabajo indican que el consorcio fúngico de Aspergillus (56%) presenta una lixiviación más alta bajo condiciones estacionarias que en la investigación de Madrigal-Arias (2012), dicho resultado es bastante satisfactorio por las ventajas energéticas que tiene en comparación de los procesos fisicoquímicos existentes. 50 Figura 9.8. Biolixiviación fúngica de Au para los tratamientos con residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). Adicionalmente los resultados obtenidos de lixiviación se ven reflejados en la apariencia del material al final de los experimentos, debido a que el material expuesto al consorcio fúngico formado por A. niger MXPE6 + A. niger MX7 (Fig. 9.9) presenta mayores alteraciones en sus características iniciales, tales como cambio de color de la parte plástica del material, pérdida del aspecto dorado y aglomeración del material (debido a la posible secreción de polisacáridos). Después del material expuesto al consorcio fúngico, se tiene al material expuesto al hongo A. niger MXPE6 que también presenta alteraciones en sus características iniciales aunque no tan grandes como las del consorcio. Mientras que el material expuesto a la levadura B-20 es el que menos presenta alteraciones en sus características iniciales. Es importante mencionar que en todos los experimentos de biolixiviación se utilizó el mismo material, el cual se muestra en la figura 9.9. 51 Figura 9.9. Cambios del material cortado de las TCI al ser expuestas a los dos hongos y al consorcio fúngico. . 52 9.3. BIOACUMULACIÓN FÚNGICA DE Au La bioacumulación de Au por los hongos muestra diferencias significativas (P≤0.001), encontrando que la levadura B-20 tuvo la mayor acumulación de Au en su biomasa (47%), mientras que la bioacumulación en los hongos pluricelulares es inferior con 10% para el consorcio fúngico A. niger MXPE6 + A. niger MX7 y 7% para el caso de A. niger MXPE6 (Fig. 9.10.). Lo que esta reportado en la literatura es que A. niger tiene la capacidad de acumular Au y Ag proveniente de soluciones de cianuro (de la industria minera) en la superficie del hongo primordialmente (Gomes et al., 1997). Los resultados encontrados en este estudio corroboran lo anteriormente mencionado, no obstante la acumulación encontrada en el presente trabajo es de forma intracelular. Figura 9.10. Bioacumulación fúngica de Au para los tratamientos con residuo de TCI (n=3, Media ± error estándar). 53 10. CONCLUSIONES Los objetivos que se plantearon para este estudio se cumplieron parcialmente puesto a que Aspergillus niger y el consorcio de A. niger MXPE6 + A. niger MX7 lograron lixiviar Au en condiciones sin agitación, sin embargo, en los experimentos con la levadura B-20 no se cumplieron, pues ésta no lixivió Au bajo condiciones con agitación. Adicionalmente se concluye: 1) la utilización de consorcios fúngicos incrementa la lixiviación de Au a partir de TCI, 2) el uso de consorcios fúngicos no incrementa el pH del medio de cultivo por presencia del residuo de TCI, 3) la bioacumulación fúngica de Au se ve incrementada en hongos unicelulares, 4) el empleo de cultivos sin agitación presenta ventajas energéticas para la recuperación de Au a partir de TCI y 5) son necesarias investigaciones sobre los mecanismos microbianos para llevar a cabo la lixiviación, bioacumulación y biosorción de metales a partir de REEE que ayuden a incrementar su eficiencia de recuperación. En los trabajos realizados a escala laboratorio no se han obtenido grandes rendimientos comparados con los procesos conocidos de hidrometalurgia y pirometalurgia, sin embargo tampoco se han empleado gastos energéticos o grandes gastos monetarios, pues simplemente se han utilizado recipientes sencillos como biorreactores y no un biorreactor comercial el cual generalmente tiene un costo arriba de los 500,000 pesos, los biorreactores utilizados para este trabajo fueron completamente sencillos y podemos concluir que hubo resultados favorables encontrando oro en los lixiviados. También se contribuye al reciclaje de residuos considerados basura, los cuales tienen un impacto ambiental negativo. Se espera que más adelante se realicen investigaciones enfocadas en encontrar microorganismos reductores de oro (en algunas investigaciones ya hacen referencia a estos microorganismos) para que el proceso sea completamente sustentable, de no ser así el oro deberá ser reducido por métodos químicos. De esta manera se concluye está investigación. 54 11. RECOMENDACIONES Con lo que respecta a biorreactores es necesario buscar el material adecuado que pueda resistir a la esterilización, además que su composición no altere el crecimiento de los microorganismos, verificar que no haya fugas en el biorreactor y buscar materiales de bajo costo para evitar grandes gastos económicos. Otro factor importante a tomar en cuenta es el tamaño de las partículas de la TCI, ya que a menor tamaño más fácil será para el hongo estar en contacto con el residuo, si la partícula es más grande y se encuentra en condiciones de agitación se sedimentará al fondo del biorreactor evitando el contacto. Las partículas más grandes podrían ser utilizadas en cultivos sin agitación. Realizar ensayos con consorcios fúngicos donde se inoculen tres o cuatro hongos para ver si estos pueden incrementar la eficiencia de recuperación de metales. 55 LITERATURA CITADA Alexander, M., 1994. 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Reactivos: Fenol al 5% (5 g de fenol en 100 mL de agua desionizada) Ácido sulfúrico concentrado Glucosa para preparar la curva de calibración Procedimiento: a) Preparación de la muestra Colocar en un tubo estéril de 15 mL, 0.5 µL del medio mineral donde creció el hongo y adicionar 12999.5 μL de agua desionizada, finalmente mezclar. b) Preparación de la curva de calibración Diluir 0.01g de glucosa en 100 mL de agua desionizada (concentración 1000 mgL-1). Preparar otra solución con 20 mL de la solución 1000 mg L-1 de glucosa y 30 mL de agua desionizada (concentración final de 400 mg L-1). Preparar los puntos en la curva de calibración: 62 Estándar μL de stock de glucosa (400 mg L-1) μL de H2O [ ] de glucosa mg L-1 1 0 2 150 3 300 4 450 5 600 6 750 3000 0 2850 10 2700 20 2550 30 2400 40 2250 50 c) Determinación de azúcares totales en el medio mineral donde creció el hongo y los estándares Colocar en un tubo de ensayo de vidrio, 2 mL de la muestra o de los estándares Adicionar 1 mL de fenol al 5% y 5 mL de ácido sulfúrico concentrado Llevar al vortex para mezclar Poner el tubo de ensayo en un baño de agua a 30°C por 15 minutos Transferir cada muestra y estándares a la celda Leer la absorbancia a 490 nm d) Curva de calibración para el método de Dubois 63 ANEXO II Método colorimétrico para determinar proteínas (Bradford, 1976) Reactivos: Tris-HCl 1 M, pH=8.6 (6.05 g y 1.05 mL de HCl concentrado en 48.95 mL de agua desionizada) Tris-HCl 0.1 M, pH=8.6 (5 mL de la solución Tris-HCl 1M, en 45 mL de agua desionizada; ajustar el pH a 8.6 con NaOH) Reactivo Bradford Albumina de bovino para preparar la curva de calibración Procedimiento: a) Preparación y extracción de la muestra Pesar aproximadamente 0.025 g del tejido fúngico Colocar el material fúngico en un mortero estéril Adicionar 1 mL de Tris-HCl 0.1M, pH=8.6 Macerar el tejido fúngico con el buffer Tris-HCl 0.1M, pH=8.6 Pasar el macerado a un tubo estéril de 1.5 mL Centrifugar a 14, 000 rpm (~29,000 g) por 10 min Colocar el sobrenadante en un tubo estéril de 1.5 mL nuevo b) Preparación de la curva de calibración 64 Diluir 0.05 g de albumina de bovino en 50 mL de agua desionizada (concentración 1000 mg L-1) Preparar otra solución con 2.5 mL de la solución 1000 mg L -1 de albumina de bovino y 47.5 mL de agua desionizada (concentración final de 50 mg L -1 ) Preparar los puntos de la curva de calibración. Colocar 9 mL de cada uno de los estándares en la celda Leer la absorbancia a 595 nm Estándar Volumen de stock de albumina de bovino (50 mg L-1) (μL) Volumen de H2O (μL) [ ] de albumina de bovino mg L-1 1 0 2 360 3 720 4 1080 5 1440 6 1800 7200 0 6840 2 6480 4 6120 6 5760 8 5400 10 c) Determinación de proteínas en la muestra fúngica Colocar en un tubo estéril de 15 mL, 500 µL del extracto de la muestra fúngica Adicionar 1800 µL del reactivo Bradford y 6700 μL de agua desionizada Llevar al vortex para mezclar Colocar 9 mL de cada muestra fúngica en la celda Leer la absorbancia a 595 nm Expresar los resultados en mg g-1 de tejido fúngico d) Curva de calibración para el método de Bradford 65 66 ANEXO III Biomasa y parámetros cinéticos del crecimiento de los hongos Para el cálculo de la velocidad de crecimiento (µ) en el caso de la levadura se empleó la siguiente ecuación: Ec.1 Donde dX es el incremento en el número de células o en biomasa y dt es el intervalo de tiempo para que se diese dicho incremento celular. Por lo que µ se obtuvo graficando InX contra t, mientras que para los hongos filamentosos se empleó la ecuación de Koch, ya que su crecimiento no es exponencial: Ec. 2 Donde W corresponde a la concentración micelial o de la biomasa fúngica, t es la variable tiempo y µ es la constante de velocidad de crecimiento, y µ se obtuvo graficando W 1/3 contra t. Por otro lado, la ecuación matemática que representa el rendimiento en biomasa es: ⁄ Ec. 3 En donde x y s representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente. Si además se forma algún producto en particular el rendimiento se expresa como: ⁄ Ec. 4 67 Donde p y s representan la concentración del producto y sustrato respectivamente. El rendimiento en biomasa y producto se realizó utilizando las ecuaciones 3 y 4 respectivamente, mientras que con la ecuación 1 se calculó la velocidad de crecimiento para la levadura y con la ecuación 2 la velocidad de crecimiento para los hongos filamentosos empleados en la presente investigación. Los resultados indican que en el caso de los tratamientos expuestos a residuo de TCI, para el caso de la levadura B-20 y del hongo Aspergillus niger MXPE6, el balance de sustrato es inferior con respecto a sus respectivos controles, sin embargo, no hay diferencias considerables entre el control del consorcio fúngico y el tratamiento expuesto a residuo de TCI. Entre tanto, el balance de producto es mayor para el consorcio fúngico que para el Aspergillus niger MXPE6. Finalmente la velocidad de crecimiento es mayor para los tratamientos con y sin residuo de TCI inoculados con Aspergillus niger MXPE6 (Cuadro 1). Cuadro 1. Parámetros cinéticos para las cepas fúngicas con y sin residuo de TCI. Cepa fúngica A. niger MXPE6 A. niger MXPE6 A. niger MXPE6 + A. niger MX7 A. niger MXPE6 + A. niger MX7 Levadura B-20 Levadura B-20 Tratamiento Sin TCI Con TCI Sin TCI Con TCI Sin TCI Con TCI Yx/s 1.111 0.505 2.516 2.225 4.996 0.247 Yp/s 0.003 0.009 µ 0.205 0.322 0.194 0.199 0.079 0.151 68