inseminación artificial introducción - IRAC

CURSO DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA /2008
IRAC-OTEIMA-MIDA
INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
INTRODUCCIÓN
La Inseminación Artificial (IA) consiste en depositar el semen por vía
instrumental en el útero de una hembra antes de que ocurra la ovulación. El semen,
recogido mediante el uso de una vagina artificial o por electroeyaculador, es diluido,
congelado o no, y depositado en el cuerpo del útero por vía vagino-cervical. De esta
forma, el producto de una sola eyaculación puede servir para la inseminación de
un número elevado de hembras permitiendo multiplicar considerablemente la
capacidad reproductora de los machos y constituyendo un poderoso medio de mejora
genética y de selección. Representa también un medio eficaz de lucha contra las
enfermedades venéreas.
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OBJETIVOS
1. Comprender la importancia de la temperatura durante el manejo del semen
congelado para evitar producir daños en las células espermáticas por crecimiento
de los cristales intracelulares
2. Relacionar los conocimientos de transporte espermático y sitio de deposición del
semen para comprender su influencia en la eficiencia de la técnica.
3. Discutir la importancia de cada etapa del descongelado, siembra del semen y del
re entrenamiento de los inseminadores para mejorar los índices de preñez.
4. Comprender la necesidad de que se realice una identificación correcta de la
hembra bovina en celo para su inseminación.
5. Analizar los distintos factores que llevan a error en su diagnóstico, incluyendo los
aspectos que tienen que ver con el conocimiento de los signos primarios y
secundarios del celo.
6. Revisar los distintos métodos y/o dispositivos disponibles en la actualidad como
elementos de ayuda en la detección correcta del celo y del momento adecuado de
inseminación.
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CONTENIDOS
1. TÉCNICA DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
1.1. Almacenamiento del semen.
1.2. Descongelamiento del semen.
1.3. Procedimiento de Inseminación.
1.4. Sitio de deposición del semen.
1.5. Evaluación de semen Congelado.
2. NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL MANEJO DE LA DETECCIÓN DE
CELO.
2.1. Estro y Ciclo Estral
2.1.1 Qué ocasiona el celo y los signos de celo?
2.1.2 Características del celo Bovino
2.1.3. Qué afecta la expresión del celo?
2.1.4 Cuándo las vacas comienzan a ciclar y a mostrar signos de celo después
del parto?
2.2. Momento de la IA
2.3. Detección de celo
2.3.1. Diferentes aspectos de la detección del celo
2.3.2. Cómo debe detectarse celo?
2.4. Utilización de Dispositivos que ayudan en la detección del celo.
2.4.1. Formas No Automáticas de detectar el estro y periestro.
2.4.2. Métodos automáticos y telemétricos para detectar el momento de
inseminación.
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BIBLIOGRAFÍA BÁSICA UTILIZADA
Barth AD, Oko RJ. Abnormal Morphology of Bovine Spermatozoa. Iowa State
University Press, Ames, Iowa, USA, 1989.
Bailey T, Nebel R and Walker W. New technology for managing heat detection.
Britt JH, Scott RG, Armstrong JD, Whitacre MD. Determinants of estrus behavior in
lactating Holstein Cows. J. Dairy SC, 1986; 69:2195.
Hawk HW. Transport and Fate of Spermatozoa After Insemination of Cattle. J. of
Dairy Sci 1987; 1487-1503.
Kastelic JP. Conceptos actuales en la detección de celos en bovinos. Resumes Cuarto
Simposio Internacional de Reproducción Animal, Huerta Grande, Córdoba,
Argentina 2001; 73-82
Lefebvre ER. Manejo de semen y Termos. Técnicas de descongelación y siembra de
semen a campo. CABBIA 1988; 14:14-25.
Lehrer AR, Lewis GS and Aizinbud E. Estrus detection in cattle: recent
developments. Symposium 9, Cattle fertility problems, An Reprod Sci 1992;
28:355.
Saacke RG, Nadir S, Dalton J, Nebel RL and Bame J. Involvement of the bull and
inseminate in fertility and embryo quality. American Embryo Transfer
Association. Proc 13th Annual Convention. 1994; 43-65.
Senger PL. The estrus detection problem: New concepts, technologies and
possibilities. J Dairy Sci 1994; 77:2745.
Saacke RG, Dalton JC, Nadir S, Nebel RL, Bame JH. Relationship of seminal traits
and insemination time to fertilization rate and embryo quality. Anim Reprod Sci
60-61; 2000:663-677.
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1. TÉCNICA DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
Se tienen noticias de que la Inseminación Artificial fue utilizada por los
árabes en el siglo XIV, pero los primeros datos de utilización de la técnica aparecen
en 1779. El fisiólogo italiano Lázaro Spallanzani, inyectó en la vagina de una perra
en celo esperma recogido directamente del macho y esta parió tres cachorros. Datos
de la aplicación de la inseminación artificial en grandes animales aparecen en 1890
cuando Repiquet en Francia y Hoffman en Alemania, la aplican con éxito en la
yegua. Los datos de aplicación en la ganadería comienzan con la escuela rusa. Elie
Ivanov comienza aplicándola en la yegua y obtiene en 1912, 31 concepciones de 39
yeguas inseminadas y continúa aplicándola en ganado vacuno y ovino. Con sus
colaboradores, Ivanov pone a punto la vagina artificial y publica estudios de
fisiología del esperma. Pero el gran impulso de la IA se inicia después de la segunda
guerra mundial, cuando el método es adoptado y aplicado en todo el mundo y se
comienzan con la prácticas de congelado del semen.
La Inseminación Artificial es la técnica más importante creada para el
mejoramiento genético de animales. Unos pocos machos altamente seleccionados
producen suficientes espermatozoides para inseminar miles de hembras al año,
mientras que cada hembra seleccionada puede producir relativamente poca progenie,
incluso mediante transferencia de embriones.
La gran mejora genética lograda por IA en ganado lechero se debe al uso de
toros de calidad probada. Los toros jóvenes son seleccionados cuidadosamente
durante la prueba de progenie y a los sobresalientes se les colecta semen para
inseminar los rodeos. Es importante realizar una preparación, colecta y
procesamiento adecuado del semen para preservar la máxima cantidad de
espermatozoides viables de cada toro.
El desarrollo de la IA en ganado de carne ha sido más lento debido a
problemas de detección del estro y de manejo de grandes rodeos. Pero las nuevas
técnicas de sincronización del celo y la ovulación están ayudando a la difusión de la
técnica en estos rodeos.
La técnica de IA consiste en introducir una mano en el recto de la hembra
para poder fijar el cuello uterino y con la otra mano manipular un pistolette o una
pipeta introducida en la vagina para pasar a través del canal cervical y depositar el
semen en el cuerpo del útero.
Frecuentemente la baja fertilidad observada en trabajos de IA con semen
congelado se debe al mal manejo del semen por parte del inseminador, así como la
siembra fuera del lugar adecuado. Se debe tener cuidado cuando se maneja el semen
congelado, pequeños aumentos de temperatura producirán graves daños a los
espermatozoides por recristalización del líquido intracelular y las lesiones por la
reiteración de estos aumentos de temperatura serán acumulativas. Por otro lado,
debemos recordar que el 96 % de los espermatozoides depositados en el cuerpo del
útero estará en la vagina pocas horas después de la siembra, por lo que pequeñas
variaciones en el lugar de deposición pueden afectar en gran medida los porcentajes
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de preñez. En este punto describiremos estos factores y daremos algunos consejos
prácticos para realizar la técnica en forma satisfactoria.
1.1. Almacenamiento del semen.
Como es de amplio conocimiento en biología, el factor clave para la
preservación de las gametas por largo tiempo es la baja temperatura. En el caso del
semen, la temperatura de almacenamiento debe mantenerse todo el tiempo por
debajo de -130 °C para conservar el máximo de fertilidad. Sin embargo durante
la transferencia del semen entre termos y la manipulación de los canastillos, se
expone el semen a temperaturas mayores. Además, en el campo suelen ocurrir
gravísimas variaciones en la temperatura de almacenaje debido a bajo nivel del
Nitrógeno en el termo por descuido del personal responsable y por exposiciones
inadecuadas del semen en la boca del termo deteriorando la calidad seminal con el
consiguiente efecto inmediato y acumulativo. En la Figura 1 se encuentran indicadas
las relaciones de temperaturas existentes en la boca del termo de N2 líquido. La
temperatura del semen aumenta rápidamente cuando se expone a temperatura
ambiente y el porcentaje de ese calentamiento tiene que ver con la relación volúmensuperficie de la dosis por lo que las pajuelas serán muy vulnerables a estos cambios
de temperatura. En la Figura 2 podemos ver los resultados de un experimento en el
que se expuso distintos tipos de pajuelas a temperaturas ambiente simulando las
temperaturas de exposición durante la manipulación del semen en la boca del termo.
Figura 1. Rango de temperaturas en la boca de un termo (Adaptado de Lafebvre, 1988)
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Figura 2.
Temperatura del semen dentro de pajuelas sostenidas por fórceps, o de ámpulas
sostenidas a los canastillos metálicos durante la exposición a temperatura ambiente (20±
0.6 °C) Cada curva representa la media de cinco réplicas (Adaptado de Berndtson,
1976;1).
El almacenamiento de las pajuelas en gobelets de plástico reduce el rango de
cambio de temperaturas. Otro detalle importante para minimizar estos cambios es
mantener los gobelets con nitrógeno liquido (N2) durante la manipulación. La Figura
3 muestra que la exposición por medio minuto en esta condición no afectará al
semen, sin embargo se debe tener claro que si la temperatura del semen supera los
-130 °C éste comenzará a sufrir daño debido al crecimiento de los cristales
formados durante la congelación. Este fenómeno es conocido como
recristalización y produce daño irreversible en los espermatozoides.
Una recomendación práctica que surge de estos datos es que siempre se debe
manipular el semen dentro del termo lo más rápido posible protegiéndolo del viento
y del sol. Algunas veces debemos realizar varias inseminaciones por lo que se
levanta el canastillo repetidamente. Durante este procedimiento el semen se expone
varias veces a temperatura ambiente durante cortos períodos. Pickett et al., realizo un
experimento durante el cual midió la temperatura del semen durante la manipulación
del canastillo y observo que aunque el semen esté en contacto con N tiempo
suficiente como para que vuelva a enfriarse (-196 °C), en cada nueva exposición del
semen a temperatura ambiente éste alcanza temperaturas mayores (Figura 3).
Además si el nivel de N es bajo, el tiempo requerido para alcanzar nuevamente los 196 °C será más de 10 minutos.
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Temperatura
Bajo nivel de N2
Termo lleno
0
Figura 3.
2
4
6
8
10
12
Minutos
Influencia del nivel de N en la temperatura del semen dentro de pajuelas francesas de 0.5
ml, durante exposiciones repetidas en el cuello del termo (5 pajuelas/gobelets) (Adaptado
de Pickett, 1976; 11)
1.2. Descongelamiento del semen.
Las mayores diferencias de los inseminadores en el manejo del semen se
producen durante la descongelación. Se recomienda protocolos muy variados: agua a
35 a 37 °C, agua a 5 °C, ambos con tiempos variables de exposición, colocarlo en el
bolsillo para que llegue a temperatura corporal (se ha demostrado que nunca llega a
temperatura corporal), colocarlo en la vaginal de la vaca, etc. Sin embargo muchos
de ellos son inadecuados y no resultan en una fertilidad aceptable.
Para la selección del método de descongelado más práctico hay que
primeramente tener en cuenta la fertilidad resultante para continuar con otros
aspectos como facilidad de uso, tiempo y equipo requerido y la habilidad necesaria
por parte del inseminador para repetir con precisión rutinaria el procedimiento.
En un experimento realizado por Barth et al., se evaluaron distintos métodos
de descongelación de semen para encontrar un método simple y óptimo de
descongelado. Para esto se utilizó semen congelado con distintos medios y en
ampollas de 1 ml o pajuelas de 0,5 ml. Los resultados mostraron que el baño a 35 °C
fue el mejor método para ambos tipos de envases. También comparó distintos
tiempos de exposición a esta temperatura. En un principio se habían realizado
distintos experimentos comparando temperatura y tiempo de descongelado pero se
comprobó que el semen después de exponerlo durante 12 segundos a 37 °C
solamente alcanzaba 0 °C por lo que sufría shock térmico y consecuentemente
pérdidas de motilidad, de actividad metabólica, capacidad fertilizante y lesión de la
membrana plasmática. Barth en su experimento concluyó que luego de 30
segundos de exposición a 35 °C el semen llegaba a 30 °C y no sufría shock
térmico.
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En otro experimento realizado por Senger et al., se descongelaron pajuelas de 0,5 ml
a dos temperaturas (5 y 35 °C) para luego exponerlos a diferentes temperaturas
(imitando distintas posibilidades de temperatura ambiente) entre los que tenemos 1
°C, 20 °C y 37 °C. Como se puede ver en la Tabla 1 los mejores resultados,
expresados en motilidad espermática e integridad del acrosoma fue con 35 °C y
luego mantenidos entre 37 °C y 20 °C. Por lo tanto si no hay una temperatura
ambiente muy baja, no hay peligro de que ocurra un efecto adverso, siempre y
cuando se realice la IA rápidamente.
Tabla 1. Efecto del shock térmico post-descongelamiento sobre la motilidad y la integridad
acrosómica (Paj 0,5, 5 y 35 °C) (16).
Temperatura (°C) Temperatura (°C) post
Descongelamiento
descongelamiento
5
35
5
35
5
35
1
1
20
20
37
37
Porcentaje medio luego de 8
horas de incubación a 37 °C
Motilidad
Acrosomas íntegros
38 a
14 b
14 b
39 a
13 ab
31 b
20 c
47 c
11 a
30 b
21 c
49 c
En base a estos resultados podemos concluir que para pajuelas es
recomendable utilizar agua a 35-37 °C durante 30 segundos y para pastillas
aumentar el tiempo a 1 minuto. Además se recomienda mantener el semen en el
mismo baño a 35 °C hasta el momento de la inseminación que debe realizarse
dentro de los 15 minutos de descongelado. A partir de este momento la integridad
del acrosoma y la motilidad comenzarán a disminuir. Un factor a tener en cuenta
cuando se trabaja a campo con muy bajas temperaturas es la posibilidad de producir
shock térmico por la diferencia de temperatura de descongelado y la temperatura
ambiente. El semen debe protegerse desde el descongelado y durante el traslado
desde el lugar de descongelamiento hasta la vaca.
Aunque el semen sea de morfología normal, el porcentaje de preñez puede
ser afectado por el número de espermatozoides por dosis de semen. Los primeros
estudios realizados sobre la relación de concentración de células en la dosis y
porcentajes de no retorno al estro sugirieron que aumentando la concentración,
aumentaba el porcentaje de no retorno. Sullivan (21) mostró que los toros responden
en forma diferente al cambio en la concentración. En un experimento, se dividieron
los toros en grupos por nivel de fertilidad de acuerdo al porcentaje de no retorno
(bajo: 72,6%; medio: 75,4% y alto: 77,9%). Cuando aumentó progresivamente la
concentración de células mótiles en las ampollas de 5 a 10 millones hubo un
beneficio en los grupos de menor fertilidad, pero no se pudo explicar la disminución
del porcentaje de no retorno del grupo de mayor fertilidad (Figura 4).
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Porcentaje de no-retorno 60-90 días
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79
Toro de
fertilidad
baja
77
75
Toro de
fertilidad
media
73
71
69
Toro de
fertilidad
alta
67
65
5
10
15
Espermatozoides con motilidad
6
progresiva (x10 /ml)
Figura 4:
Promedio
Relación entre el porcentaje de no retorno y la concentración de células mótiles en toros
Holstein de distinta fertilidad (Adaptado de Sullivan, 1970; 21 ).
De estos resultados podemos concluir que la dosis de semen para la
mayoría de los toros debe contener al menos 10 millones de células mótiles
después del descongelado y que los toros con fertilidad menor al nivel medio
tendrán un beneficio si se aumenta la concentración a 15 millones o más de células
mótiles por dosis.
Otra recomendación importante al descongelar una pajuela de semen es secar
bien el envase. Una pequeña gota de agua puede producir shock osmótico a los
espermatozoides dañándoles irreversiblemente. Es muy raro encontrar una pajuela
rota, pero si esto sucediera, el contenido debe ser descartado.
1.3. Procedimiento de Inseminación.
Una vez que se ha identificado la hembra en celo se debe constatar que esté
debidamente señalada (caravana-tatuaje) y perfectamente inmovilizada. Se debe
lavar bien la zona del recto y vulva con agua, luego secar con toallas de papel para
evitar contaminación y contacto de la punta del pistolette o pipeta con agua. Ésta se
debe introducir abriendo los labios de la vulva con un ángulo de 45º y la punta del
pistolette hacia el techo de la vagina hasta que haga tope (20 a 25 cm.). Luego se
introduce la mano enguantada y lubricada por el recto para no producir daños
(utilizar lubricante no irritante), se toma el cuello uterino llevándolo hacia adelante
para evitar la formación de pliegues en la vagina que puedan dificultar la franca
llegada del pistolette al canal cervical.
Una vez que la punta del pistolette se encuentra tocando el cervix se debe
tratar de introducirlo en la luz del canal cervical y luego realizando movimientos
del cuello uterino se irá pasando a través del cervix hasta llegar al cuerpo del
útero donde se debe realizar la siembra. Para comprobar que la punta del pistolette
pasó el cuello uterino debemos tocar la misma con el dedo índice de la mano que
tenemos sujetando el cervix por delante de éste y casi llegando a la bifurcación de los
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cuernos uterinos. Si tenemos dudas de la ubicación es mejor sembrar dentro de uno
de los cuernos que sembrar en zona no definida.
Algunas veces el inseminador tiene que manejar un grupo de animales que
fue sincronizado, por lo que tiene que inseminar todos al mismo tiempo. En estos
casos es muy importante, antes de comenzar a trabajar, identificar el semen a
utilizar en cada hembra, y tener preparado el material necesario. Es muy
importante ser organizado y mantener la higiene para cumplir con todas las normas
de manipulación del semen en el paso del termo a la vaca, evitando el shock térmico
y la contaminación seminal. En los casos en que se inseminan muchos animales al
mismo tiempo es necesario un ayudante que vaya descongelando, lo que permite
mayor precisión y seguridad en cada paso.
1.4. Sitio de deposición del semen.
El proceso de transporte espermático en el tracto femenino tiene una fase
rápida y otra fase prolongada del transporte. En la primera, los mecanismos
fisiológicos del tracto femenino transportan los espermios hasta el oviducto sin la
participación activa de éstos. Durante la fase prolongada los espermatozoides pueden
permanecer hasta 18 h en la región caudal del istmo del oviducto para luego avanzar
hasta el sitio de fertilización cerca de la unión del istmo con la ámpula. También se
mencionó que sólo una pequeña porción del esperma depositado en vacas llega al
sitio de fertilización ya que la mayor parte de ellos es fagocitada o eliminada al
exterior junto con el mucus cervical (Figura 5)
Figura 5.
Esquema que resume el trabajo de muchos laboratorios que muestran las principales
barreras al transporte del semen en el tracto femenino. (Adaptado de Saake, 1982; 13)
Se han realizado varios trabajos que muestran la distribución del semen luego
de la deposición en el cuerpo del útero. En la Tabla 2 se muestran los resultados de
un experimento realizado por Suga y Higaki (17) en el que se depositó 300 millones
de espermatozoides en el cuerpo del útero de vacas lecheras. Luego se recogió el
tracto reproductivo completo en el matadero para verificar la distribución los
espermatozoides. Los resultados mostraron que entre 30 y 60 minutos después de
la IA la mayoría de los espermatozoides fueron recuperados de la vagina y
cervix y que sólo unos cuantos cientos fueron recuperados del útero.
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Tabla 2. Recuperación de espermatozoides desde el tracto reproductivo de vacas lecheras después
de inseminación en el cuerpo del útero. (Adaptado de Suga y Higaki, 1971; 17).
N de espermatozoides recuperados 2
Tiempo desde IA
Vagina
(106)
0.07
4.0
4.3
20.0
22.0
1
(h:min)
0:03-0:30
0:30-0:60
1:00-2:00
2:00-3:00
3:00-5:00
1
2
Cervix
(103)
38
87
3
300
2
Útero
(103)
35,000
13
7
2
0.3
Oviductos
30,000
142
21
194
319
Tres vacas en cada momento después de la inseminación.
Inseminación por vaca: aproximadamente 300 millones de espermatozoides.
Otros estudios también demostraron el movimiento retrógrado de los
espermatozoides. Los resultados de Larsson y Larsson (6) mostraron que dos horas
después de la deposición del semen en el cuerpo del útero, pudieron recuperar el
14,6 % del total del semen y que el 98,5 % de ese semen recuperado estaba en la
vagina y cervix. A 12 h pos IA recuperaron el 0,6 % de lo inseminado y de esto, el
73,7 % estaba en vagina y cervix. Dobrowolski y Hafez (3) realizaron otro
experimento con vacas Hereford en el cual depositaron 2.000 millones de
espermatozoides y realizaron necropsia de las vacas 1, 8 o 24 h pos IA. Del total de
espermatozoides depositados en el cuerpo del útero, sólo el 13,4 % se recuperó 1
hora más tarde, el 3.8 % a 8 h y el 0,9 % a las 24 h en el útero. Los resultados se
muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Espermatozoides recuperados desde el tracto reproductivo de vaquillonas Hereford
(Dobrowolski, 1990; 3)
Número de espermatozoides recuperados 2
Tiempo totales
desde IA
(h) 1
(106)
1
269
8
76
24
18
1
2
%
Vagina
Cervix
Útero
(%)
13.4
3.8
.9
(106)
207
51
10
(106)
59
20
5
(106)
2.9
5.3
2.7
Unión útero
tubárica
(103)
40
150
60
Oviductos
(103)
24
200
15
Cinco vacas en cada intervalo de tiempo
Inseminado por vaca: 2 billones de espermatozoides
Si tenemos en cuenta que una dosis de semen para IA tiene entre 10 y 30
millones de espermatozoides, luego de 24 horas de la inseminación se encontrará
en el útero entre 10.000 y 100.000 espermatozoides. Además del movimiento
retrógrado normal de los espermatozoides, debemos sumarle la pérdida producida
por la manipulación y deposición. Una estimación de estas pérdidas están indicadas
en la Tabla 4.
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Tabla 4. Espermatozoides recuperados y perdidos de vacas dentro de 12 horas de inseminadas en el
cuerpo del útero. (Adaptado de Mitchel 1985, 9)
Número, 106
%
Espermatozoides recuperados
Total mucus
mucus
orina equipamiento
descargado aspirado
306
255
19
0.24
5.5
73.0
60.7
4.4
0.06
tracto
reproductivo
27.3
1.3
6.5
Aparentemente los espermatozoides transportados a los oviductos
rápidamente después de la IA, no están involucrados en la fertilización. Se realizó
un experimento en el cual se sirvió un grupo de vacas temprano en el celo y se ligó el
oviducto en diferentes momentos post servicio. Cuando se ligó el oviducto 6 h
después del servicio, sólo 1 de 11 ovocitos recuperados resultó fertilizado; cuando se
ligó a las 8 o 10 h post servicio, la fertilización llegó al 40 % y cuando se ligó a las
12 h post servicio el porcentaje de fertilización fue del 70 %. Los resultados,
indicados en la Tabla 5, mostraron que los espermatozoides que entran al
oviducto rápido después del servicio no permanecen en el mismo, o si está
presente en el momento de la ovulación, no son capaces de fertilizar el ovocito.
Tabla 5. Porcentaje de fertilización después de ligar y seccionar el istmo de vaquillonas después del
servicio (Adaptado de Wilmut, 1984, 19)
Intervalo del servicio a
la ligadura
(h)
6
8
10
12
Recuperados
(N)
11
10
12
10
Ovocitos
Fertilizados
(N)
1
4
5
7
(%)
9
40
42
70
Estos resultados demuestran que los espermatozoides capaces de fertilizar
alcanzan el oviducto cerca de 8 h después del servicio y es almacenado en el istmo
del oviducto por 18 h o más hasta el momento de la ovulación.
Considerando el gran porcentaje de pérdida de espermatozoides a través del
cervix se postuló que si la deposición del semen se hacía más profundo en el tracto
reproductivo, esto podría mejorar la fertilidad. Distintos experimentos dieron
resultados contradictorios. Senger (15) reportó un incremento de la fertilidad cuando
realizó inseminación en ambos cuernos. También Zavos (20) reportó mejor
fertilidad. Sin embargo, Marshall (8) mostró un leve efecto negativo (54 vs 50 %).
Un aporte valioso fue el trabajo de Larsson (5) que demostró la migración
transuterina después de la IA en vaquillonas recuperando espermatozoides en el
cuerno uterino opuesto al que había realizado la siembra siendo capaces de fertilizar
ovocitos de ambos ovarios. En este experimento se re-entrenaron inseminadores para
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depositar el semen a uno u otro cuerno uterino. La primera observación fue que
muchos inseminadores que decían depositar el semen en el cuerpo del útero, lo
hacían en realidad en el cervix y luego de ser entrenados para depositar el semen en
el cuerno uterino aumentaron los índices de preñez. Por lo tanto la conclusión más
importante de este trabajo fue que los inseminadores mejoraron su porcentaje
de preñez cuando fueron re-entrenados y depositaron el semen en el útero en
lugar del cervix.
De los experimentos anteriores no se obtuvieron conclusiones concretas.
Peters (10) y Swain (18) demostraron a través de técnicas radiográficas que cuando
se piensa que se deposita el semen en el cuerpo del útero, en realidad entre un 23 % y
25 % de las veces, la siembra se realiza en el último tramo del cervix. (Tabla 6).
Tabla 6. Ubicación de la punta de la pipeta en distintas zonas del tracto reproductivo de la vaca.
(Adaptado de Senger, 1991, 14)
Lugar anatómico
ubicación de la punta de la
pipeta de 40 inseminadores
(%) n= 586 a
25
ubicación de la punta de la
pipeta de 70 inseminadores
(%) n= 376 b
23
Cuerpo del útero
39
37
Cuerno izquierdo
13
16
Cuerno derecho
23
24
Cervix
a Peters et al., 1984
b Swain et al., 1986
Gallager y Senger (Figura 6 y 7; 4) demostraron a través de recolección de
material vaginal que no existen diferencias en la eliminación de espermatozoides
cuando la siembra se realiza en cuernos o en el cuerpo del útero. Pero sí que hay
diferencias significativas cuando se toman los mismos tipos de muestras comparando
siembra en los cuernos con siembra en el cervix. Esta mayor pérdida de
espermatozoides sería la causa de una menor fertilidad. Esto indica que es muy
importante adiestrar o re-adiestrar a los inseminadores y/o veterinarios para que estén
seguros de que están sembrando en el cuerpo del útero y no el último tramo del
cervix.
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Unidad 1
% acumulado de espermatozoides
recuperados
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Cuernos
Cuerpo del útero
Horas después de la IA
Porcentajes de espermatozoides recuperados con muestras de mucus vaginal después de
inseminación en los cuernos o cuerpo del útero. Las barras representan medias s.e.m. para
9 muestras por tratamiento. (Adaptado de Gallager y Senger, 1989; 4)
% acumulado de espermatozoides
recuperados
Figura 6.
Cercix
Horas después de la IA
Figura 7.
Porcentajes de espermatozoides recuperados con muestras de mucus vaginal después de
inseminación en los cuernos o parte media del cervix. Las barras representan medias
s.e.m. para 9 muestras por tratamiento. (Adaptado de Gallager y Senger, 1989; 4)
15
Unidad 1
CURSO DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA /2008
IRAC-OTEIMA-MIDA
Por lo tanto podemos concluir con estos trabajos que existe un beneficio
asociado con la deposición en los cuernos a través de la eliminación de los
errores de deposición en el cervix. Teniendo plena seguridad de haber pasado con
la punta de la pipeta la totalidad del cervix el lugar de siembra es el correcto.
Otro detalle a tener en cuenta durante la IA es el momento de deposición del
semen. Macmillan y Watson (7) inseminaron un grupo de vacas durante el comienzo,
la mitad, el final y después del estro con semen de toros con porcentajes de fertilidad
debajo del promedio, dentro del promedio, o sobre el promedio (Tabla 7).
Tabla 7. Porcentaje de no retorno de IA en distintos momento del estro con toros con tres niveles de
fertilidad. (Adaptado de Macmillan y Watson, 1975; 7)
% de no retorno 1
Momento del estro
Toro de alta
Toros de fertilidad
a la IA
fertilidad
media
comienzo
74.3
62.7
mitad
71.1
70.7
final
78.6
75.1
después
73.3
71.3
1 % de no retorno a los 49 días de 6012 inseminaciones.
Toro de baja
fertilidad
58.4
65.8
71.8
73.8
Estos resultados sugieren que la fertilidad de semen de toros con baja
fertilidad puede ser mejorada retrasando el momento de la IA hasta después del
final del estro, pero siempre varias horas antes de la ovulación.
En otro experimento se evaluó el efecto del momento de la IA sobre el
porcentaje de fertilidad y calidad de los embriones de vacas holando superovuladas.
Las vacas fueron constantemente monitoreadas utilizando HeatWatch para
determinar el comienzo del estro que fue definido por la primera monta mayor de 2
segundos. El momento de la ovulación de vacas holando monitoreadas por este
sistema fue determinada a 27,6 ± 5,4 h después de la primera monta (Walker et al.,
1996). Las vacas fueron inseminadas a las 0 h (comienzo del estro), 12 h o 24 h
después de la primera monta. Los embriones fueron colectados 6 días después de la
IA. El porcentaje de preñez y calidad de los embriones se muestran en la Figura 8.
Los resultados muestran que el porcentaje de fertilización fue mayor cuando la IA se
realizó 24 h después del comienzo del estro. Sin embargo, cuando se examinó la
calidad de los embriones, las vacas inseminadas al comienzo del estro tuvieron una
mejor calidad de embriones (mayor cantidad de embriones excelentes o buenos) y las
vacas inseminadas más tarde (24 h) tuvieron menor calidad de embriones: menor
cantidad de embriones de buena calidad y mayor cantidad de embriones
degenerados.
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Unidad 1
Embriones excelentes/buenos (%)
Embriones fertilizados (%)
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85
80
75
70
65
60
55
50
12 h
24 h
Embriones degenerados (%)
Embriones regulares/malos
(%)
0h
100
50
40
30
20
10
0
0h
12 h
24 h
80
60
40
20
0
0h
12 h
24 h
50
40
30
20
10
0
0h
12 h
24 h
Inseminación (horas desde comienzo del estro)
Inseminación (horas desde comienzo del estro)
Figura 8. Efecto del momento de la IA sobre la fertilización y calidad de los embriones colectados 6
días después de la IA (n=117; Dalton et al., 1998)
Porcentaje de Preñez (%)
60
50
Bajo %
fertilización
Alta calidad
Alto %
preñez
Baja calidad
40
30
20
Optimo momento
Inadecuada sobrevida
del espermatozoide?
Ovocito envegecido?
Menos selección
espermática?
10
0
0h
12 h
24
Momento de la IA (horas desde comienzo del estro)
Figura 9. Porcentaje de preñez calculado desde los datos presentados en la Figura 8 basado en la
clasificación de los embriones. El momento óptimo de la IA se determinó en base a que la
IA tempranas fueron inadecuadas debido a la gran cantidad de ovocitos infertilizados, y las
IA tardías se caracterizaron por la cantidad de embriones de baja calidad (22).
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Unidad 1
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1.5. Evaluación de Semen Congelado
El semen al ser congelado sufre una serie de procesos que pueden alterar la
calidad del semen original. Muchas veces semen de alta calidad al momento de la
congelación ha resultado en semen de mediana y baja calidad al ser descongelado.
De aquí, la importancia de evaluar el semen luego de la congelación.
Efecto del Congelado y el Descongelado sobre las Células Espermáticas
Sin tener en cuenta la complejidad de los procesos biológicos que ocurren
dentro de la célula, la congelación es un proceso parecido a una deshidratación de la
célula.
La cristalización del agua comienza con la formación de núcleos. Un núcleo
es la agregación de moléculas que han perdido energía debido a la baja temperatura y
que adquieren una forma particular a la cual se adhieren nuevas formaciones de
cristalización. La formación de núcleos de agua pura ocurre entre los -3 y -45 ºC.
Cualquier partícula extraña dentro del agua puede actuar como un núcleo y así
resultar en la cristalización. Una vez que la cristalización ha sido completada otro
fenómeno similar puede ocurrir, la recristalización. La recristalización es el
crecimiento de grandes cristales de hielo a expensas de los pequeños cristales. Este
proceso ocurre cuando el descongelado es lento. Aunque el punto de congelación
celular es por debajo de los -10 ºC, las células permanecen sin congelarse hasta los 15 ºC. Durante la congelación las células comienzan a equilibrarse con el medio
debido a la pérdida de agua intracelular. Esta deshidratación resulta en una
disminución de la presión intracelular y un incremento en la concentración del
soluto.
Por lo tanto, la congelación lenta le permitirá a la célula el continuo
equilibrio con el exterior. Es por eso que a los -10 o -15 ºC la cantidad de agua
intracelular es muy pequeña. Una congelación muy rápida no permitiría ese
intercambio y por consiguiente a la temperatura de -10 la célula poseerá mucha agua
intracelular. De todas maneras durante la congelación las células pierden agua y hay
un aumento de la concentración de los solutos intra y extra celulares.
Existen dos eventos de los cuales depende la sobrevida de los
espermatozoides a la congelación.
- Las células congeladas a temperaturas por debajo de la velocidad crítica son
destruidas por una prolongada exposición al soluto, también llamado crioprotector. A
medida que se va congelando el agua de la solución crioprotectora, el medio se
vuelve hiperosmótico con respecto a las células y produce su muerte.
- Las células congeladas a velocidades por encima del valor crítico tienen un
insuficiente período de tiempo para el intercambio osmótico por lo cual no pueden
expulsar la totalidad del agua intracelular y se forman cristales de hielo dentro de la
célula que producen su muerte.
Los mecanismos por los cuales se causa daño celular durante la congelación son
resumidos como sigue:
18
Unidad 1
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-
Ruptura mecánica de los elementos celulares por la formación de cristales.
Desnaturalización por la alta concentración de electrolitos.
Cambios en el pH.
Deshidratación excesiva que precipita las proteínas de la solución.
Deshidratación que lleva a las proteínas al contacto y la producción de uniones
anormales
- Efecto sobre la remoción de agua estructuralmente importante de la célula.
La primera congelación exitosa de semen fue reportada en los experimentos
de Polge y col en 1949 y de Smith y Polge en 1950. Se utilizó en estos trabajos el
glicerol adicionado al diluyente del semen que actúa reduciendo la concentración de
electrolitos en el agua residual no congelada dentro y alrededor de la célula. También
posee un efecto protector de la superficie celular.
El punto crítico durante la congelación y la descongelación son las
temperaturas de -10 a -50 ºC. Por lo tanto es importante atravesar esta zona
rápidamente. Se ha comprobado que la descongelación rápida posee mejores
resultados que la lenta.
Los resultados de los experimentos de inseminación son siempre el mejor
reflejo de la calidad seminal. El evaluador debe tener un cuidado extremo y trabajar
en forma ordenada con cada muestra para no tener evaluaciones erróneas.
Ocasionalmente ha pasado que toros de alta performance, campeones en
exposiciones y del más alto pedigree produce semen insatisfactorio.
Muchas pruebas han sido diseñadas con el objeto de evaluar la calidad
seminal. Algunas de ellas en base a la motilidad y a la morfología. Otras suman a
estos parámetros la integridad del acrosoma, concentración, microbiología,
propiedades químicas, bioquímicas, y la viabilidad in vitro o in vivo.
Evaluación de la Motilidad Espermática luego del Descongelado
Se utilizan las pruebas de evaluación de motilidad y morfología para predecir
la calidad del semen antes de su uso a campo. Esta se puede hacer por visión directa
con la ayuda de un microscopio o por medio de fotomicrografía y de contadores
electrónicos computarizados.
La observación directa es el método más viejo y el más utilizado dada la
facilidad en el diagnóstico y lo económico de cada determinación. Este método
permite la evaluación de una gran cantidad de muestras por día a un bajo costo pero
posee la desventaja que es una medida subjetiva y altamente influenciada por el
evaluador.
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La motilidad puede ser evaluada siguiendo la siguiente escala:
0:
1:
2:
3:
4:
5:
sin movimiento
leve movimiento de cola sin desplazamiento progresivo
lento movimiento de cola con algo de movimiento progresivo
movimiento progresivo a velocidad lenta
movimiento progresivo rápido
movimiento progresivo rápido donde es difícil seguir a una célula determinada
El movimiento progresivo se debe evaluar inmediatamente después del
descongelado y luego de 2 horas de incubación a 37 ºC. El mínimo aceptable de
motilidad es de 25 % de células mótiles a una velocidad 3 inmediatamente después
del descongelado y un 15 % de células mótiles a una velocidad de 2 luego de 2 h. de
incubación a 37 ºC.
La motilidad por sí sola no tiene un valor de predicción de la fertilidad si
no va acompañada de la morfología y la integridad del acrosoma.
Test de Resistencia osmótica.
Este test es una prueba de Integridad Celular utilizado por algunos centros de
IA. Se coloca el contenido de una pajuela en una solución hiposmótica de fructosa y
citrato de sodio (100 mosm/l). Se utilizan 2 µl y 1 µl de la solución hiposmótica para
el contenido de pajuelas de 0.5 y 0.25 respectivamente. Se incuba en baño María a
37º-38º C durante 60 minutos. Luego se coloca una pequeña gota (6 µl) entre porta y
cubreobjeto y se cuentan 200 espermatozoides a 400X. Los espermatozoides con
colas enrolladas están vivos (reaccionados). Cuanto más colas enrolladas, mejor
calidad de semen. Debe haber un 40 % de reaccionantes. La observación de los
espermatozoides se realiza a las 0 h, 1 h y 2 h. La solución contiene 9 g de fructosa,
4.9 g de citrato trisódico y c.s.p. 1000 µl de agua destilada.
Integridad del Acrosoma
Las enzimas del acrosoma son de real importancia para la penetración de la
zona pelúcida durante la fertilización. La visualización de la integridad acrosomal se
logra con la observación de la muestra con un microscopio de contraste de fase. Para
la evaluación se coloca una gota de 2 a 4 mm de semen sobre un porta objetos más
una gota similar de glutaraldehído al 0.2% diluida en buffer fosfato salino. El
glutaraldehído detiene el movimiento de las células y previene el deterioro celular. El
extendido se observa con un microscopio de contraste de fase y se cuentan 100
células. El semen se debe evaluar nuevamente a las dos horas de incubación. El
defecto puede ser la falta del capuchón acrosómico o su perdida en distintas
proporciones. Este método es altamente repetible con un error de no más del 6%. Al
menos el 50% de las células deben presentar acrosomas intactos, y el 35% luego de
las 2 horas de incubación.
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Unidad 1
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Evaluación de la Morfología Espermática luego del Descongelado
La motilidad y la integridad del acrosoma son dos características muy
afectadas durante el proceso de la congelación y la descongelación. La morfología en
general se mantiene sin grandes cambios. Sin embargo es muy importante hacerlo
porque cambios bruscos en la calidad seminal pueden pasar desapercibidos por el
centro de IA en su fase más temprana. La evaluación se realiza al igual que para
semen fresco; una gota de semen más una gota de eosina-nigrosina y se cuentan al
menos 100 células. Recordemos que el mínimo aceptable es 70 % de los
espermatozoides normales.
Microbiología del Semen
La inseminación artificial es una técnica de mucho valor para prevenir
enfermedades venéreas. Sin embargo una gran cantidad de gérmenes patógenos se
pueden transmitir por medio del semen. Hay algunas enfermedades propias del toro
de las cuales debe ser libre para evitar transmisión y otras que surgen del proceso de
congelación.
Los microorganismos patógenos específicos que el toro puede transmitir con
el semen son los siguientes: Aftosa, Mycobacterium bovis, Mycobacterium
paratuberculosis, Brucella abortus, Trichomonas fetus, Campylobacter fetus
veneralis, Leptospira sp.
Otros patógenos que son difíciles de controlar dado que se encuentra en la
población de vacunos son: IBR, BVD y PI3.
Algunos gérmenes patógenos que pueden contaminar durante el proceso de
congelación del semen son: Pseudomona areuginosa, Corynebacterium pyogenes,
Estafilococos y Estreptococos, E. Coli, Hongos y Levaduras. Esto se puede evitar
con higiene durante la colección y el procesado.
Si uno sospecha de las condiciones de higiene del laboratorio de donde
proviene la muestra de semen se puede proceder al aislamiento de bacterias y virus
presentes en el semen. Es una tarea normalmente pasada por alto pero que no deja de
ser de suma importancia.
La calidad bacteriológica del semen es testigo indirecto de la calidad
higiénica del centro de IA y se mide en cantidades de unidades formadoras de
colonias (UFC). Un buen semen debería tener < 500 UFC por ml
Certificado de Evaluación de Semen congelado.
A continuación se incluyen el Certificado de Evaluación de Semen
Congelado y esquema de Anormalidades espermáticas como guía. Éste ha sido
confeccionado basado en los certificados que otorga la Sociedad de Theriogenología
de Norte América y nuestra propia experiencia. Normalmente se trata de pedir al
productor o al centro de IA 2 dosis de semen para evaluarlo. No obstante puede
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haber casos donde el semen es muy caro y entonces se podría tomar la muestra en el
campo cuando se realiza una IA (aunque esto no es lo más aconsejable).
En el Certificado de Evaluación de Semen Congelado se consignan los datos
del propietario y del toro. Está integrado por tres partes donde se anotan los
resultados de los tres exámenes que se realizan al semen descongelado:
a. Viabilidad. Se consignan los datos de % de motilidad progresiva, grado de
motilidad y % de acrosomas intactos inmediatamente después de descongelado y
luego de dos horas (mantenido en baño maría a 37 ºC, de acuerdo a las pruebas
descriptas).
MÍNIMO ACEPTABLE
Motilidad progresiva:
0 h = 25 % con grado 3
2 h = 15 % con grado 2
Acrosoma:
0 h = 60 % intactos
2 h = 40 % intactos
b. Morfología. Se cuentan por lo menos 100 células y se anotan los % de normales y
de las principales anormalidades.
MÍNIMO ACEPTABLE
70 % normales
no más del 15-20 % de defectos de cabeza
no más del 25 % de defectos de acrosoma y cola
c. Concentración. Se puede utilizar la cámara para contar glóbulos rojos de acuerdo
a lo descripto para contar el total de células y luego, de acuerdo al % de motilidad
progresiva a las 0 h, se determina la cantidad de células mótiles por dosis.
El número ideal es alrededor de 10 millones de células viables por dosis
El semen puede resultar Satisfactorio cuando supera los mínimos
establecidos en Viabilidad, Morfología y Concentración. Cuestionable cuando
existe uno de estos parámetros ligeramente por debajo del mínimo exigido e
Insatisfactorio cuando existe un parámetro muy por debajo del mínimo, o dos o los
tres ligeramente disminuidos.
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Resumen
1. Sobre la temperatura de almacenamiento:
Mantenerla todo el tiempo por debajo de -130 °C para conservar el máximo de
fertilidad.
2. Sobre la elección de un procedimiento de descongelado:
Para pajuelas, descongelar en agua a 35-37 °C durante 30 segundos.
Una vez descongelado, mantener el semen en el mismo baño a 35 °C hasta el
momento de la inseminación.
La inseminación debe realizarse dentro de los 15 minutos de descongelado.
3. Sobre el lugar de deposición del semen:
Hacer todo el esfuerzo para localizar la punta de la pipeta en el cuerpo del útero.
Si se hace en el cervix, un mayor porcentaje de los espermatozoides saldrá hacia
la vagina que si se deposita en el cuerpo del útero. Hay dos fases de transporte
espermático, pero los espermatozoides con capacidad de fertilizar llegarán al
istmo entre 8 y 12 h post IA.
4. Sobre el control de la Calidad Seminal
Es de suma importancia evaluar la Calidad Seminal del Semen Congelado antes
de programar un sistema de IATF ya que uno de los factores que más interviene
en los resultados es la Calidad del semen que tiene que ser Muy Bueno o
Excelente. La evaluación de la Calidad Seminal debe hacerse siempre antes de
iniciar un protocolo de Sincronización.
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2. NUEVAS TECNOLOGÍAS PARA EL MANEJO DE LA
DETECCIÓN DEL CELO
Partiendo de los elementos que llevan a una comprensión acabada de los
diferentes signos que permiten identificar a una hembra bovina en celo,
profundizaremos en los aspectos que puedan minimizar errores de detección, para
luego entrar en la descripción de una serie de métodos disponibles como ayuda a la
constatación visual, e incluso algunos que se proponen a futuro como lo
suficientemente eficientes y exactos como para prescindir de la observación directa.
2.1. Estro y Ciclo Estral
Es bien conocido que el ciclo estral en los bovinos tiene un promedio de 21
días, con la mayoría de los ciclos que duran entre 17 y 24 días. La duración del estro
varía mucho entre los animales del mismo rodeo, tanto como entre los diferentes
estudios realizados. En un estudio con vacas de tambo lactando (Dransfield y col.
1998, 6), la duración del celo (definido como el intervalo entre el primer evento de
quietud de monta hasta el último, detectado por un dispositivo preso-sensor
radiotelemétrico) fue 7,1±5,4 h (media ± DS; con un rango entre 33 min. a 35,8 h;
n=2055 períodos estrales), con 8,5±6,6 montas en cada estro. Usando un equipo
similar, la duración del estro en vacas de tambo (n=89) en pastoreo fue 8,6±4,3 h
(con un rango de 1 a 21,3 h; 31). En vaquillonas de tambo, la duración del estro fue
de 10,3±5,9 h y 12,8± 6 h en vaquillonas Holando y Jersey respectivamente, y el
número de montas por celo fue de 16,3±11,6 y 28±17,9 (22). Las diferencias en
edad, manejo, tamaño del rodeo, método y frecuencia de detección, y la definición
del inicio del estro pueden ser la causa de parte de la variación entre los estudios en
cuanto a la duración del estro y el número de montas (21).
2.1.1 ¿Qué ocasiona el celo y los signos de celo?
El celo o estro es el momento culminante del ciclo estral durante el cual la
hembra es sexualmente receptiva. En este momento la hembra presenta un
conjunto de signos característicos que denotan su receptividad, este es el único
momento del ciclo en que la hembra se mantiene quieta al ser monta.
El perfil hormonal que puede llevar a la expresión del celo en la vaca es un alto
nivel de estrógenos en sangre en presencia de un bajo nivel de progesterona. Esta
situación hormonal normalmente existe cuando hay un folículo preovulatorio maduro
secretando estrógenos en ausencia de un cuerpo lúteo funcional. Otras condiciones
que pueden llevar a la manifestación de celo incluyen la presencia de folículos
quísticos y altos niveles de estrógenos con bajos niveles de progesterona en las vacas
preñadas cerca del parto.
Mientras que altos niveles de estrógenos y baja concentración de progesterona
son considerados pre requisitos para la expresión del celo, estas hormonas no son las
que en última instancia inducen el comportamiento clásico del celo. Estas señales
son desconocidas, pero incluyen neurotransmisores y posiblemente neuropéptidos.
Algunos signos fisiológicos del estro como el edema e hiperemia de los genitales y la
secreción del mucus vaginal y cervical son involuntarios. Pero los signos de
25
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comportamiento más importantes, como la quietud ante la monta, monta, lamido,
cabeceo y el apoyo de quijada son reflejos voluntarios que se encuentran
influenciados en gran medida por las condiciones existentes en el ambiente
inmediato de la vaca.
2.1.2 Características del celo Bovino
Características del comportamiento.
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
La Pasividad ante la monta es el único indicador de que la vaca se encuentra
en celo. Consiste en la inmovilidad de la hembra durante 5 a 7 segundos al ser
montada por el toro u otra compañera del grupo.
Existe un grupo de manifestaciones que no son específicas del celo pero que
lleva a que el grupo interactúe conformando un grupo sexualmente activo.
Dichas características se manifiestan unas 12 a 18 horas antes de comenzar el
celo hasta las 18 horas después de finalizado el mismo. El 95% de las hembras
en celo montan otras hembras, pero sólo el 35% de las vacas que montan se
encuentran en celo, de allí que no debe ser tomada como un indicador único de
celo.
Las hembras en celo se encuentran inquietas, caminan con mayor frecuencia,
mugen, y se frotan la cabeza y cuello entre ellas.
Durante el periestro las hembras olfatean y lamen los genitales de sus
compañeras.
Signos Físicos
ƒ
ƒ
ƒ
Sin dudas que el principal signo físico del estro es la descarga de mucus
cervical, más evidente en las vaquillonas que en las vacas.
Como consecuencia de la actividad de monta, los pelos de la zona del anca se
encuentran revueltos o inclusive depilados en las zonas de saliencia de los
huesos.
La edematización vulvar es un signo provocado por los altos niveles de
estrógenos que causan un incremento de la irrigación de los genitales externos.
2.1.3 ¿Qué afecta la expresión del celo?
Si bien los signos involuntarios del celo no están influenciados por el
ambiente en que se encuentra la vaca, para que éstos se manifiesten hacen falta al
menos dos animales. Se ha visto que los signos secundarios como el cabeceo, lamido
y apoyo de quijada están menos influenciados por el ambiente que el signo primario
de permanecer quieta al ser montada y montar a otras. La mayoría de los
observadores experimentados utilizan estos signos secundarios para detectar las
vacas que probablemente estén en celo aún cuando las condiciones ambientales
limiten la presentación de la actividad de monta. Los signos de comportamiento
voluntario del celo están sujetos a diversas influencias. Los factores que tienen
mayor influencia en la expresión del celo en muchos tambos son:
ƒ
ƒ
ƒ
Días pos-parto.
Número de animales sexualmente activos en el grupo.
Libertad para que los animales sexualmente activos interactúen.
26
Unidad 1
CURSO DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA /2008
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ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Ausencia de actividades que interfieran.
Temperatura ambiente.
Condiciones podales.
Suelo resbaloso.
2.1.4 ¿Cuándo las vacas comienzan a ciclar y a mostrar signos de celo después
del parto?
Aunque muchas de las vacas de tambo bien alimentadas y sanas comenzarán
a ciclar alrededor de 3 semanas luego del parto, los celos tempranos no son muy
evidentes. La intensidad de los celos aumenta a medida que pasan los días en el
posparto, resultando en un aumento de la tasa de detección de celo cuando el
intervalo posparto es mayor (7).
Este aumento en la expresión del estro durante los primeros tres ciclos
posparto está probablemente relacionado con las diferencias en el patrón ovárico de
secreción de esteroides durante estos tres ciclos. La expresión del estro en respuesta
a los elevados niveles de estrógeno es aumentada si la vaca tuvo una exposición
previa (imprinting) con progesterona. La primera ovulación posparto ocurre sin la
exposición previa a progesterona por ausencia de CL, por lo que probablemente ésta
sea la causa de una deficiente manifestación de celo en este primer ciclo. En forma
similar, el nivel de secreción de progesterona entre la primera y segunda ovulación
posparto es menor que entre la segunda y tercera. El hecho de que tome alrededor de
tres ciclos posparto antes de que la intensidad del celo alcance su pico, es
relativamente poco importante en la mayoría de las vacas, ya que el tercer ciclo
comenzaría alrededor de la 8a. ó 9a. semana posparto, lo que se corresponde con el
inicio del período óptimo para dar servicio.
2.2 Momento de la IA
Hay un límite de tiempo (aproximadamente 24 h cada 3 semanas) para que la
inseminación resulte en preñez. Los eventos biológicos que dictan el momento de la
IA (21) son la viabilidad y funcionalidad del esperma y el ovocito (aproximadamente
24-30 h y 6-10 h, respectivamente) y el tiempo requerido por el espermatozoide para
ser transportado desde el sitio de inseminación hasta el lugar de fertilización
(aproximadamente 4-8 h). Inseminaciones tempranas producen una baja tasa de
fertilización y embriones de buena calidad, mientras que inseminaciones tardías
resultan en una alta tasa de fertilización pero embriones de baja calidad (24). Por lo
tanto, el momento óptimo de IA pareciera estar entre estos dos extremos, resultando
en un equilibrio entre tasa de fertilización y calidad embrionaria.
La ovulación ocurre alrededor de 27 h después de iniciado el estro (29). En
un estudio (6) que utilizó los transmisores electrónicos para detectar la actividad de
monta (17 rodeos y 2661 inseminaciones), las tasas de concepción fueron mayores
cuando las vacas fueron inseminadas entre las 5 y 16 de iniciado la actividad de
monta (Figura 1). En forma similar, en otro estudio que utilizó podómetros y signos
vitales de celo, el momento óptimo de IA fue estimado alrededor de 11,7 h de
iniciado el estro (14). No obstante, si la observación del estro se realiza solamente
27
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dos veces al día, se recomienda que la IA se haga dentro de las 6 h de la primera
detección de celo (21).
6
5
5
5
4
4
4
3
3
3
2
1
0
0-
>4 -
>8 -
>12 -
>16 -
>2
Figura 1. Índices de preñez en vacas lecheras inseminadas en distintos momentos desde la primera
monta sobre 2661 IA en 17 rodeos (Dransfield y col., 1998; 6).
2.3 Detección de Celo
La detección de celos es el mayor factor individual que limita la optimización
de la eficiencia reproductiva en rodeos bovinos que utilizan inseminación artificial
(IA). Se acepta generalmente que la eficiencia de detección de celos es <50 % en la
mayoría de los tambos, con una media para el DHIA en USA del 43 % (3,1). Incluso
este dato no tiene en cuenta la exactitud de la detección. Con la utilización de
análisis de progesterona en sangre o leche las investigaciones indican que entre el 5 y
el 30 % de las IA se realizan en vacas que no están en estro (20).
Lograr una performance reproductiva aceptable, requiere un primer
servicio hecho a tiempo, y una rápida identificación de las vacas que quedan
vacías, así son servidas nuevamente.
Los errores en la detección de celo constituyen un problema individual de
cada rodeo y deben ser siempre considerados como causa de baja tasa de concepción.
Debido a que además de las instalaciones y el buen manejo, el personal es el
principal componente de la detección de celo, las pérdidas económicas ocasionadas
por dicha tarea tienen dos orígenes:
ƒ
No observación de animales en celo. Este problema disminuye la eficiencia en
la detección de celo.
ƒ
Error en la detección de los celos, es decir considerar en celo animales que no
lo están; mayormente a consecuencia de conceptos equivocados sobre los
signos de celo o bien por fallas en la identificación de los animales y/o
registros. Estos problemas disminuyen la exactitud en la detección de celo.
28
Unidad 1
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Para visualizar mejor la problemática, es interesante considerar que
mundialmente se pierden entre 20 y 50% de los celos y que más del 30% de las vacas
son inseminadas cuando no están en celo (P.J.H. Ball y J.E.D. Cowpe, 1987; 2)
En resúmen, la incorrecta detección de celos resulta en pérdidas de ingresos
referidas a: 1) la falta de explotación del potencial de producción láctea y de la
producción de terneros por la prolongación de los intervalos entre partos; 2) gastos
en un reemplazo excesivo de vaquillonas y en inseminaciones infértiles, y 3) en la
reducción de la tasa de progreso genético.
Debido a que la efectividad en la detección de celos es muy variable y a la alta
demanda laboral que insume el hacerlo visualmente, se estimuló la investigación y el
desarrollo de formas de ayuda en la detección del celo y maneras de determinar el
Momento Apropiado de Inseminación (MAI), sin la necesidad de detectar las
manifestaciones de comportamiento de celo.
2.3.1 Diferentes aspectos de la detección del celo.
Es necesario que, especialmente los veterinarios y consultores que trabajan con
productores tamberos, comprendan los factores que influencian la detección de celo
para proveer asistencia efectiva a los mismos en la mejora de la performance
reproductiva de su rodeo.
El obstáculo más difícil que uno debe superar en el asesoramiento a
productores sobre el mejoramiento de la detección de celos, es la manera sutil de
transmitirles que una mala detección de celo les resta parte de su potencial ingreso
económico. Las fallas en detección de celo no llevan a una inmediata pérdida en la
producción de leche, por el contrario las pérdidas se desplazan hacia adelante en
semanas y a veces meses.
2.3.2 ¿Cómo debe detectarse celo?
La buena detección de celo es un arte. Los ganaderos experimentados
reconocen muchos cambios en el comportamiento de la vaca antes de que se inicie el
celo. Todos los individuos que trabajan con hacienda en cada establecimiento
debieran ser entrenados en el arte de la detección de celo. Siendo que se trata de
identificar a la hembra que se queda quieta al ser montada solo por algunos
segundos, la observación deberá ser meticulosa durante todo el período de detección.
Las vacas que se aproximan al estro mostrarán un aumento del interés de montar a
otras, estarán más nerviosas y activas, mostrarán interacciones de cabeza a cabeza
("topeteo") y pueden tener una descarga de mucus claro por vulva. Fue comprobado
por algunos autores (7) que más del 85 % de las vacas que intentan montar a otras
por el frente estaban en celo, por lo que consideran que este puede considerarse un
signo secundario confiable de celo.
Los animales debieran observarse durante períodos en los que no se distraen
por otras actividades y cuando están en libertad de interactuar. No se debieran hacer
observaciones durante o inmediatamente luego de la entrega de alimento o cuando
están amontonadas en el corral previo al ordeñe. Los mejores momentos para
29
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observar las vacas es temprano en la mañana, a media tarde, o al caer la tarde.
Cada período de detección debiera ser de no menos de 30 minutos. El
movimiento de las vacas a un lugar diferente para la detección promueve el aumento
de actividad de monta y mejora la detección.
2.4 Utilización de dispositivos que ayudan en la detección del celo.
Hay una variedad de ayudas para la detección de celos. Muchas de ellas son
beneficiosas como complemento de un programa bien organizado de detección visual
y no debieran ser considerados como sustitutos de la observación.
Idealmente las tecnologías que provean una solución a los problemas de
detección de celo debieran asegurar lo siguiente: continuo seguimiento del animal
(24 h/día), automática y exacta identificación del animal en celo, funcionar durante
la vida productiva de la vaca, minimizar los requerimientos de mano de obra y tener
alta exactitud en identificar el apropiado evento fisiológico o de comportamiento que
esté altamente correlacionado con la ovulación (27).
Revisaremos los desarrollos en esta área en los últimos tiempos. Los métodos
de detección de estro y momento adecuado de inseminación (MAI) se discuten en
términos de su eficiencia y exactitud (23), considerando a la eficiencia como: n° de
detecciones correctas / n° total de períodos estrales, o por períodos no luteales
determinados por dosaje de progesterona x 100. Por otra parte se considera
exactitud al: n° de detecciones correctas / n° total de detecciones x 100.
Debido a los esfuerzos dispersos en el desarrollo de herramientas automáticas
y computarizadas para el manejo de tambo, Lehrer y col (12) clasifican a los
sistemas de ayuda de detección de celo y MAI según su compatibilidad con el
monitoreo automático (incluida la radiotelemetría) y la computarización "on-line".
2.4.1 Formas No Automáticas de detectar el estro y periestro.
Este grupo comprendería los indicadores visuales suplementarios del
comportamiento sexual incluyendo:
a. Planilla de detección de celo: Este calendario de 21 días es útil en la predicción del
día en que se espera se produzca el próximo estro, si un celo previo ha sido
detectado. En rodeos grandes esto puede ser hecho con programas de computación.
Este sistema sencillo permite identificar problemas de detección de celos en un
rodeo, ya que puede ser utilizado para estimar el porcentaje de celos detectados. En
este sentido es importante anotar todos los celos en cada vaca independientemente
que si el animal es inseminado o no.
b. Detectores de monta (25,15,9): Estos dispositivos incluyen los parches detectores
adheribles a la grupa y la pintura en la cola. En todos los casos, están diseñados para
mostrar que la vacas han sido montadas, pero no es prueba absoluta de que el animal
esté en celo. La tasa de error con estos sistemas es generalmente entre el 10 y 30%,
indicando que se pueden cometer errores si estos dispositivos no se utilizan en
conjunción con una buena observación e información sobre celos anteriores. Estos
30
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productos son de utilidad cuando a las vacas se las puede observar de cerca cada día
para verificar si el parche ha sido activado o la pintura ha sido removida; ayudando
especialmente para la detección de esas vacas "difíciles". Algunos autores (4)
encontraron estos dispositivos de gran utilidad para la detección de celo en
vaquillonas índicas habiendo resultado significativamente superiores con respecto a
la detección visual, pintura de cola y novillos estrogenizados con bozal marcador.
c. Animales detectores con o sin adminículos marcadores (16): Tanto vacas,
vaquillonas como novillos pueden ser tratados con testosterona o con estrógenos, con
el objeto de inducir en ellos el aumento de actividad de monta. Los animales tratados
muestran una actividad sexual incrementada y "funcionan" en forma permanente
como sexualmente activos. Las hembras deben tener una exposición previa con
testosterona a razón de 200 mg tres veces por semana durante 2 ó 3 semanas. Luego
para mantener la actividad de monta se aplican 400-500 mg de testosterona cada dos
semanas. Los novillos deben recibir alrededor de 8 mg de estradiol cada 250 kg de
peso corporal por semana. Los novillos tratados con estrógenos no realizarán (en
general) la intromisión del pene por lo que no habría problemas en cuanto a la
transmisión de enfermedades venéreas de vaca a vaca. Otra alternativa recientemente
descripta es la utilización de implantes de SYNOVEX H (Anabólicos con 200 mg de
propionato de testosterona y 20 mg de benzoato de estradiol por implante) en vacas y
vaquillonas. El tratamiento más efectivo consiste en la administración de testosterona
inyectable (500 mg im y 1500 mg sc) en el momento de la colocación de 8 implantes
(4 en cada oreja). Estos mantendrán al animal marcador activo por aproximadamente
60 o 90 días (17). Otra alternativa utilizada es la del toro “retajo” o “marcador” al
que previamente se le ha realizado una operación para imposibilitar la cópula o la
eyaculación en el tracto genital femenino.
d. Filmación continua del rodeo (2): En todos estos métodos no automáticos la
eficiencia varia entre 56% y 94% generalmente superando a los grupos control en los
que el celo se detectó mediante observación directa. Por su lado la exactitud se
aproxima al 50% y es menor que en la detección visual.
e. Test de progesterona rápido en leche: La utilización del test rápido de
progesterona en leche es útil en determinar la exactitud de detección de celo y para
identificar también a las vacas "difíciles"(19). La progesterona es baja en el día del
estro, por lo que la colección de muestras de vacas identificadas en celo puede ser
utilizada para su verificación.
2.4.2 Métodos automáticos y telemétricos para detectar el momento de
inseminación.
A diferencia del grupo descrito anteriormente, la forma en que se realiza la
detección en este grupo es a través del monitoreo de variables coincidentes con el
periestro, pero sin que éstas sean estrictamente de comportamiento sexual o
actividades sexuales. Los trabajos más relevantes investigaron las cuatro variables
siguientes.
a. Actividad monitoreada por podómetros: El número de pasos por hora de las vacas
en estro es alrededor de dos a cuatro veces mayor que las que están en diestro (11);
31
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ésta es la base biológica para la detección del MAI con podómetros adosados a uno
de los miembros posteriores de la vaca. La eficiencia varía del 60 al 100 % según
diferentes estudios. No obstante la podometría mostró ser más eficiente que dos
detecciones visuales diarias y tan eficiente como cuatro observaciones diarias en la
detección del inicio del celo. Sumado a esto, la podometría detectó el 63-79 % de
los períodos no luteales u ovulaciones no acompañadas de comportamiento éstrico.
En cuanto a la exactitud de los podómetros, ésta varía entre 22 y 100% según
los trabajos. Los bajos niveles de exactitud (debido a una gran cantidad de falsos
positivos) se han atribuido a las limitaciones técnicas de los podómetros y las poco
favorables o inestables condiciones ambientales y de manejo. De hecho, el uso de
podómetros electrónicos en rutinas altamente repetibles y cotidianas, resulta en tasas
de 91% de eficiencia y 92% de exactitud (5). La eficiencia esperada y la exactitud
deben ser optimizadas en condiciones específicas de campo. La podometría ha sido
incorporada en sistemas computarizados de manejo de rodeo y utilizada con éxito
como único método de detección de celo (28).
b. Impedancia eléctrica intravulvar e intravaginal: El periestro está asociado con el
aumento de la hidratación de los genitales con respecto al diestro. La hidratación de
los tejidos se encuentra inversamente relacionada a la impedancia eléctrica tisular
(IE); ésta es la base biológica de la detección del MAI mediante el monitoreo de los
cambios de impedancia en los genitales. La IE ha sido medida utilizando sondas
insertadas periódicamente en el lumen de la vagina anterior y por medio de
electrodos implantados en forma fija dentro del tejido vulvar. Se encontró que en la
mayoría de los casos, tanto la IE intravaginal como la vulvar, declinan alrededor del
estro. En general, el grado de declinación de la IE intravaginal está relacionado en
forma inversa con la tasa de concepción. Las mediciones de la IE intravaginal han
sido exitosamente utilizadas para determinar el MAI y mejorar la tasa de concepción,
con una eficiencia que va desde el 65 al 82% y una exactitud entre el 57 y 82%. La
IE intravaginal es considerada no confiable por la mayoría de los autores, debido a
que tiene un patrón impredecible y se verifican variaciones marcadas dentro y entre
animales.
La IE intravaginal fue radiotelemetrada usando censores suturados en la
mucosa vaginal y removidos antes de cada IA y parto. En otro estudio se implantaron
censores radiotelemétricos dentro del tejido vulvar de 22 vacas por 116 períodos no
luteales (12). La eficiencia y exactitud de la detección de estos períodos fue de 91%
y 80% respectivamente. La verificación de la utilidad práctica de la
radioimpedometría vulvar se encuentra en desarrollo.
c. Elevación de la temperatura intravaginal y láctea: Algunos autores monitorearon
picos de temperatura vaginal de 0,3-1,1 °C (radiotelemétricamente en algunos casos)
alrededor del estro y 12-21 h antes de la ovulación (18); mientras que otros no
pudieron detectar un aumento de la temperatura vaginal relacionado con el estro
(10).
Se detectó un aumento en la temperatura de la leche de 0,2-0,4 °C en el 35 al
74% de los períodos estrales. Con un 50% de eficiencia de detección, la exactitud fue
de 55% (26). El monitoreo frecuente de los cambios de temperatura puede ayudar en
32
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la detección del celo, pero no parece un dato suficientemente confiable para ser
utilizado como único elemento de detección.
d. Sistema HeatWatch (HW™, detector de celo; 16): Es un sistema electrónico que
combina censores-transmisores electrónicos de presión, un receptor que obtiene
información de los transmisores individuales de cada vaca cuando los censores se
activan, y un buffer que almacena la información hasta que ésta es requerida. Los
censores-transmisores de presión tienen aproximadamente 2 cm de alto, 5 cm de
ancho y 7,5 cm de largo y se adhieren sobre el sacro de las vacas a las que se intenta
detectar celo. La antena receptora se coloca en una parte alta del establecimiento
permitiendo la recepción de señal de hasta 400 m. Si hiciese falta se puede agregar
una "repetidora" para hacer llegar la señal a la base, donde la información se
almacena automáticamente en un buffer, que puede ser consultada en cualquier
momento en una computadora personal.
El sistema HW registra el momento del día y la duración en segundos de cada
monta de la que el animal es objeto. El sistema genera dos listas principales: la de
"sospechosas de estar en celo" y la de "en celo". La información provista al sistema
con respecto a la frecuencia y duración de las montas, adjudica a los animales a
alguna de las dos listas, pudiendo ser modificada para cada situación particular. Por
ejemplo, una vaca sospechosa puede tener 2 montas de 3 segundos de promedio en
un período de 4 horas, mientras que para otro productor se colocaría dentro de este
grupo con 3 montas de igual duración.
Este sistema ha sido testado en la universidad de Virginia Tech desde el año
1994 obteniéndose una eficiencia de detección de celo del 94% con un nivel de
exactitud del 95%. Aún cuando existen sólo resultados parciales, se verificó una
disminución del período de vaca vacía posparto de alrededor de 30 días,
incrementando la tasa de preñez en un 20% y disminuyendo en 0,5 el número de
servicios por preñez. Si bien su costo es alto aún (unos U$D6000 el sistema instalado
para un rodeo de 120 vacas) dependerá de la evaluación de pérdidas por fallas en la
detección de celos que se produzca en cada situación particular para determinar si se
justifica la inversión. Por último, se está desarrollando otro sistema que consiste en
un detector de presión y un marcador lumínico. Estos sistemas están todavía en etapa
experimental.
En resumen podemos decir que la efectiva detección de celos es uno de los
puntos más críticos en los programas de IA, tanto sea en rodeos lecheros como en
rodeos de carne. Los elementos auxiliares para detectar celo y MAI son en general
más eficientes, pero no necesariamente más exactos que las observaciones directas,
aunque algunos métodos son alternativas confiables a la detección visual.
Diferencias en las condiciones de manejo produjeron resultados conflictivos
obtenidos por el mismo método de detección: el aumento de la temperatura de la
leche y la actividad física durante el estro fue menos aparente en animales
estabulados comparado con aquellos libres a corral. Por ejemplo, el monitoreo
manual de la IE intravaginal fue considerado impráctico en rodeos grandes en USA y
de gran utilidad en pequeñas granjas familiares en Alemania. Así mismo, la pintura
en la cola fue poco efectiva en pequeños corrales en Gran Bretaña y altamente
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efectiva en rodeos lecheros pastando en Nueva Zelandia. Es poco probable que algún
sistema llegue a tener aplicación universal.
La eficiencia de detección de celo y del MAI pueden ser mejoradas por el uso
consecutivo o simultáneo de más de un método: detectores de monta o pruebas de IE
intravaginal fueron usados sólo luego de la caída en progesterona indicada con el test
en leche. Casos no detectados por un método, fueron muchas veces detectados por el
uso simultáneo de otro/s (Tabla 1).
Tabla 1. Eficiencia individual y combinada (%) de métodos y/o dispositivos de detección de celo. De
Lehrer y col.1992 (12)
Eficiencia individual
Observación Pintura en
Novillos
visual
cola
androgenizados
68
51
66
61
79
77
74
Eficiencia Ref.
Temperatura en Podómetros
leche
74
93
(30)
80
(8)
88
(8)
69
91, 97*
(13)
*Los tres métodos combinados
Por último la podometría y el Heatwatch son actualmente los métodos
comercialmente disponibles para la detección automática y computarizada del MAI.
Métodos potenciales adicionales como censores de presión con indicadores
lumínicos, de la impedancia vulvar o vaginal y de la temperatura corporal o láctea
están en desarrollo.
Hay coincidencia entre los diferentes autores en cuanto a que habría una
tendencia hacia el aumento de la confianza en la detección del MAI por la
combinación radiotelemétrica de más de una variable. La actividad física y en el
futuro la impedancia vulvar, son las variables más promisorias monitoreables para
ser incorporadas en los sistemas de manejo de rodeos lecheros.
Aunque los métodos de detección de celo computarizados tengan un
potencial importante para mejorar la detección de celo y la performance
reproductiva, complementan un buen manejo pero no lo reemplazan.
Prepararon el Texto: Humberto Tríbulo, Lucas Cutaia, Gabriel Bó.
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Unidad 1