Marcadores moleculares Raul Blas, 2010 Facultad de agronomia Dpto. Fitotecnia rblas@lamolina.edu.pe Marcador Que marca (señal que se pone a una persona o cosa para reconocerla), marca registrada … Marker (Cambridge, 2002) a sign wich shows where something is. an action which is understood to represent or show a characteristic of a person or thing or feeling. Qué es un marcador? Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede definirse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico o molecular. Se asocian marcadores con caracteres, para esclarecer la probabilidad de relación entre un locus genéticos y un carácter determinado Marcadores moleculares Desde el punto de vista de un análisis de relación genética los marcadores moleculares son: Puntos específicos fijados a un cromosoma La herencia es completamente Mendeliana Genética Primera ley de Mendel? En un diploide los dos Alelos de un gen segregan en los gametos con igual frecuencia individuo: Aa gametos: A 50%, a 50% Primera ley de Mendel y frecuencias F2? F1: Aa Aa gametos f1 macho gametos f1 hembra F1 1/2A 1/2A 1/4AA 1/2a 1/4Aa 1/2a 1/4Aa 1/4aa F2: 1/4AA 2/4Aa 1/4aa (codominante) 3/4A- 1/4aa (A dominante) F2: AA 1/4 Aa 2/4 aa 1/4 (codominante) A- 3/4 aa 1/4 (A dominante) No se puede distinguir AA o Aa Como se interpreta esto con marcadores moleculares: AA Aa aa Dominante AA Aa aa Co-dominante Tipos de marcadores genéticos 1. Marcadores morfológicos (Efecto combinado de muchos genes y el ambiente). Caracteres morfológicos son los más antiguos y ampliamente usados. Son profundamente afectados por fluctuaciones ambientales y por las etapas de desarrollo de la planta, así como por el vasto número de individuos a analizar. Marcador morfológico Visualización de los Fragmentos Amplificados 1 2 M 1 Polimorfismo 2 M Marcadores moleculares Cualquier señal o traza molecular que nos permite estudiar un caracter (Fenotipo) o gen (Genotipo) asociado a este, y de herencia mendeliana (Marcador Genético) y detectada como secuencias de ADN o proteínas Detección de variabilidad a nivel de secuencias de ADN. Fuentes de origen de MM 1. ADN cromosómico (genómico) ADN codificante ADN no codificante ADN altamente repetido 2. ADN extracromosómico ADN mitocondrial ADN de cloroplastos AFLP RAPD SSR Procedimientos Generales en el uso de MM: 1. Extracción de DNA 2. Generación de polimorfismo Enzimas de restricción Reacción PCR Combinación de los 2 anteriores (enzimas de restricción y PCR) 3. Electroforesis (horizontal, y/o vertical) 4. Detección de los fragmentos Sondas marcadas Bromuro de etidio, UV Quimioluminiscencia tincion en plata 5. Autoradiografía y/o fotografia 6. Evaluación de los fragmentos 7. Análisis estadístico Aislamiento de DNA Moler hojas + cloroformo Transferir sobrenadante + Eliminar isopropanol, Disolver en H20, TE DNA Proteina/polisacaridos ‘CTAB’ Marcos Malosetti, 2007 Wageningen University Conceptos Enzimas de restricción (Endonucleasas): Son proteínas que reconocen secuencias cortas de nucleótidos específicas y cortan ADN en esas zonas. Pst I ADN Iniciadores (“Primers”): Es una secuencia corta de ácido desoxirribonucleótido (ADN) que se ancla a una hebra del ADN molde. El cual se requiere para la síntesis de ADN in vitro (reacción de polimerización), ya que la ADN polimerasa solo no es capaz de iniciar la polimerización de ADN . RAPD 10-mer Set A Tube A-01 5'-CAGGCCCTTC-3' Tube A-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Tube A-03 5'-AGTCAGCCAC-3' Tube A-04 5'-AATCGGGCTG-3' Tube A-05 5'-AGGGGTCTTG-3' Tube A-06 5'-GGTCCCTGAC-3' Tube A-07 5'-GAAACGGGTG-3' Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' Tube A-19 5'-CAAACGTCGG-3' Tube A-20 5'-GTTGCGATCC-3' RAPD 10-mer Set B Tube B-01 5'-GTTTCGCTCC-3' Tube B-02 5'-TGATCCCTGG-3' Tube B-03 5'-CATCCCCCTG-3' Tube B-04 5'-GGACTGGAGT-3' Tube B-05 5'-TGCGCCCTTC-3' Tube B-06 5'-TGCTCTGCCC-3' Tube B-07 5'-GGTGACGCAG-3' Tube B-08 5'-GTCCACACGG-3' Tube B-09 5'-TGGGGGACTC-3' Tube B-10 5'-CTGCTGGGAC-3' Tube B-11 5'-GTAGACCCGT-3' Tube B-12 5'-CCTTGACGCA-3' Tube B-13 5'-TTCCCCCGCT-3' Tube B-14 5'-TCCGCTCTGG-3' Tube B-15 5'-GGAGGGTGTT-3' Tube B-16 5'-TTTGCCCGGA-3' Tube B-17 5'-AGGGAACGAG-3' Tube B-18 5'-CCACAGCAGT-3' Tube B-19 5'-ACCCCCGAAG-3' Tube B-20 5'-GGACCCTTAC-3' La reacción en cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction - PCR): Es una técnica in vitro de amplificación enzimática del ADN. Mediante el cual se obtiene millones de copias de secuencias específicas del genoma de un organismo. ciclos, consta de 3 pasos: 1. Denaturación: es una denaturación termal de la muestra de ADN, a 94- 95°C. 2. Anclaje de iniciadores (Renaturación): la temperatura de la mezcla es enfriada hasta los 3560°C. 3. Síntesis (polimerización): La temperatura es elevada a 70 - 85 °C, la temperatura óptima (72°C) Los componentes de amplificación para la reacción PCR son: •primers sintéticos, que son regiones complementarias a las cadenas opuestas que flanquean a la región de ADN blanco que se desea amplificar. • Una secuencia blanco en una muestra de ADN •Una enzima, la ADN Polimerasa termoestable que pueda resistir altas temperaturas de calentamiento (95° C a más). • Los cuatro deoxiribonucleótidos (dNTPs). • Un buffer para darle las condiciones adecuadas al sistema en conjunto. 2x-2x, x= número ciclos Preparación de gel para electroforesis Electroforesis: Es el movimiento de una partícula cargada (ion) en un campo eléctrico. El movimiento se realiza en medio líquido que está sostenida por sustancia sólida inerte, como papel o gel semisólido. Sistema de marcadores DNA probe ******* Basados en hibridación DNA RFLP, VNTR, oligonucleotide fingerprinting Basados en amplificación DNA RAPD, DAF, AFLP, SSR, MP-PCR, ISSR, IRAP, REMAP, STS, SCAR, CAPS Basados en secuenciamiento ATTAGTCTTACCTAGGAATCGATT TAATCAGAATGGATCCTTAGCTAA EST, SNP, DNA microarray Gupta et al., 1999 Tipo de polimorfismo Alta resolucion: Al nivel de par de bases Baja resolucion: Al nivel de fragmentos de restriccion o fragmentos amplificados RFLP RAPD AFLP SCAR CAPS SSR i-SSR RFLP DNA genómico + Enzimas de restricción = digestión Papel toalla Electroforesis en geles de agarosa Membrana Gel Esponja Southern Blot Perfil de polimorfismo obtenido Hibridación con sonda Membrana con DNA transferido RFLP Esta técnica se vale de la capacidad que tienen las enzimas de restricción para poder reconocer secuencias especificas a lo largo del genoma, de modo que una mutación puntual dentro del sitio de restricción resultará en la pérdida o ganancia de una secuencia de reconocimiento, dando origen a un fragmento de restricción de diferente longitud a la del original. Las mutaciones causadas por una inserción, deleción o inversiones en el DNA también llevan a variación en la longitud de los fragmentos de restricción. Los fragmentos del genoma generados por las enzimas de restricción son separados en un gel de agarosa para luego ser transferidos a un soporte sólido que puede ser una membrana de nylon o nitrocelulosa. La transferencia de los fragmentos de DNA desde la matriz de agarosa hasta la membrana se realiza por capilaridad. Una vez que se encuentran en el soporte sólido, el DNA digerido y separado, puede ser hibridizado con una sonda (DNA de una sola hebra) que debe estar marcada para su fácil detección. La sonda se hibridará en el lugar donde encuentre la zona complementaria a su secuencia. Para hacer visible el lugar donde se ha hibridado la sonda, ésta debe tener algún tipo de señal (marcaje) Obtención de marcadores RFLP. RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Amplificación de ADN anónimo con cebadores de secuencia arbitraria RAPD: iniciaodores unicos , cortos y aleaoritos Temperatura de Hibridizacion: 36-42C Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo, utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud RAPD:AMPLIFICA MULTIPLES REGIONES (MULTILOCI) Correspondencia entre fragmentos amplificados y bandas en un gel _ + Los RAPDs son marcadores dominantes A A a A 1 2 3 a a 1 2 3 AA Aa aa Ventajas Requiere baja cantidad de DNA Facil de obtener Aplicabilidad a cualquier genoma Bajo costo Desventajas Problemas de reproducibilidad Presencia de homoplasia en las bandas Nivel de información limitada debido a su naturaleza dominante (no se puede diferenciar un heterocigoto de un homocigoto, el locus se reduce a un solo alelo) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Reaccion PCR Primers deben encontrar secuencias complementarias entre 200 – 2500 pb Tincion (bromuro de etidium) RAPD Reaccion PCR Electroforesis Tinción y visualización de los fragmentos de amplificaci Polimorfismo con la técnica RAPD AFLPs Amplified Fragment Length Polymorphism Metodología de obtención de Marcadores AFLP ADN Genómico Mse I Eco RI Digestión Eco adapter Mse adapter Ligación PCR1:Preamplificación Eco primer N N Mse primer Eco primer NNN Pcr2:Amplificación selectiva NNN Mse primer Electroforesis Autoradiografía Tinción Nitrato de plata Principios de la técnica AFLP GAATTC TTAA CTTAAG AATT Eco RI Mse I AATTC G T 1. Digestión del ADN Genómico Liberación de fragmentos con terminales Eco RI y Mse I AAT TA TTAA Adaptador Eco RI Adaptador EcoRI: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5’ AATTCN TTAAGN Adaptador Mse I 2. Ligación con adaptadores de secuencia conocida Adaptador Msel: 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’ NTTA NAAT Primer EcoRI+1(E+1): 5’-GACTGCGTACCAATTCN 5 T AATTCN TTAAGN AATTCTNN TTAAGANN Primer Msel+1 (M+1): 5’-GATGAGTCCTGAGTAAN’ 3. Amplificación preselectiva NTTA NAAT G 5 NNCTTA NNGAAT 4. Amplificación selectiva 5’ TTG AATTCTNN TTAAGANN AATTCTTG TTAAGAAC NNCTTA NNGAAT AGG TCCTTA AGGAAT Electroforesis en geles de poliacrylamida 5’ Obtención de marcadores AFLP Polimorfismo en Arracacha, según la combianción de los iniciadres E-AAC/M-CTT. Ventajas Reproducibles Elevado número de bandas obtenidas por gel No se necesita información previa para su desarrollo (sondas o iniciadores específicos) Desventajas Presencia de homoplasia en las bandas Nivel de información limitada debido a su naturaleza dominante Raul Blas SSR Simple Sequence Repeat Sinónimos Microsatélites STR - Short Tandem Repeat STMS - Sequence Tagged Microsatelite Site SSLP - Simple Sequence Length Polymorphism ¿Que son microsatélites? Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivas de secuencia simple. Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 pares de bases y su grado de repetición es relativamente bajo. Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para su amplificación TTTTTTTTTT = T10 AGAGAGAGAGAG = AG6 CATCATCATCATCATCAT = CAT6 TAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGT = TAGT6 Mononucleotido Dinuclotido Trinucleotido Tetranucleotido (TC)14 ADN genómico Microsatélite ......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT...... ......GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA...... OBTENCION DE MICROSATELITES http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm Tipos de SSR Perfectos: (CA)n Imperfectos: (CA)n – CCA – (CA)m n, m y r = número de repeticiones del motivo Compuestas: (CA)n (TG)m Compuesta interrumpido: (CA)n –TG-(TG)m Compleja: (CA)n –TG-(TG)m (TA)r GTn los mas extendidos en genoma de mamíferos Atn la mas extendida en genoma de vegetales GAn mas abundante en cebada y arroz Marcadores microsatélite 2. Electroforesis en geles Poliacrilamida o agarosa (casos muy limitados) Etapas de la técnica SSR incluyen: 1000 pb 1. Reacción PCR, con dos iniciadores especificos para un locus SSR 100 pb M P1 P2 1 2 3 4 5 6 F1 stop Gene Amp F2 F3 F4 F5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 enter 0 ce IBT I I I II Huamani, 2008 III PCR en P1, 3 y 6 II II III PCR en P2, 2 y 5 III PCR en 1 y 4 DNA individuo 1 AT12 ATATATATATATATATATATATAT Región conservada Región Conservada Iniciador 1 Iniciador 2 ATATATATATATATATAT DNA individuo 2 AT9 Los SSR son marcadores codominantes 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Extrategias de desarrollo de iniciadores SSR 1. Clonamiento, secuenciamiento y diseño de iniciadores 2. Identificación de primers microsatélite a partir de marcadores ISSR 3. Búsqueda de marcadores SSR en la base de datos del Genbank. 4. Transferibilidad de otras especies afines (empleo de iniciadores disponibles) Ventajas Poseen alta variabilidad en sus loci, apropiado para los análisis de diversidad genética. Se encuentran distribuidos por todo el genoma permitiendo hacer un buen muestreo genético del material en estudio. Desventajas Su Su caractierizacion es especifica por especie identificacion(descubrimiento) y hacerlo usable es costoso. Requiere secuenciamiento de librerias de DNA Aplicacion de marcadores moleculares Analisis de la diversidad genetica Herencia y mapeo Genes candidatos Herramienta de seleccion: Seleccion asisitida por marcadores moleculares (MAS) Raul Blas, 2010 Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad 1. Gestion de recursos 2. Cambios en los genotipos 3. Selección (selección estabilizadora), 4. Multiplicación del genotipo mejorado Mejoramiento genetico de plantas Idiotipo Biologia Tecnologia Tiempo Materiales Presupuesto Métodos de mejoramiento Poblaciones naturales, variedades nativas, … Ganancia genética Objetivos Contexto: Agronomico Industrial Alimenticio social Fases sucesivas en la creación de una nueva variedad 1. Gestion de recursos genéticos 2. Cambios en los genotipos 3. Selección (selección estabilizadora), 4. Multiplicación del genotipo mejorado Selección asistida por marcadores moleculares – Molecular assisted selection (MAS) Es la selección indirecta por la presencia o ausencia de un fenotipo o componente fenotípico deseado, basado en la secuencia o patrones de banda de los marcadores moleculares ubicadas dentro o cerca de genes que controlan el fenotipo. La secuencia polimorfico o patron de banda del marcador molecular es indicativo de la presencia o ausencia de un gen específico o segmento cromosomal que es conocido y que lleva un alelo deseado. Capel et al. (2000) … Molecular assisted selection (MAS) Es la posibilidad de disponer de marcadores ligadas a los genes implicados en la variacion de los caracteres seleccionados. MAS tiene los siguientes objetivos: •Dirigir las recombinaciones para acumular en un mismo genotipo los genes o segmentos cromosomicos favorables •Facilitar la selección (selección eficaz) Aspectos a considerar en MAS •Distancia genética (Mapas de ligamiento) Marcadores asociados con caracteres de interes (< 5cM) (Kelly, 1995) En algunos cultivos existen mapas bien definidos y densos : Arroz, maiz, trigo, tomate, papa •Modo de herencia (Calidad marcador) Codominantes (capacidad de identificar los genotipos) •Tipo de marcador •Material genético Generación de un mapa genético Mapa genético: Representacion de marcadores/ genes en los cromosomas (orden + distancias) Requisitos: – poblaciones segregantes – Determinación de los genotipos de los marcadores – Estimación de las frecuencias de recombinación entre todos los pares de marcadores – Determinación de grupos asociados – Determinación el orden por grupo de asociación Tamaño de la población Determinado por el numero de semillas y de marcadores disponibles, es importante establecer el numero minimo de individuos a utilizar para conocer la precision del calculo de las frecuencias de recombinacion que permitan construir un mapa fiable. Usualmente la progenie a evaluar se cosntitule de >100 individuos a fin de reducir el error estandar Otros autores consideran suficiente un numero de 50 individuos Poblacion de mapeo Los descendientes mas usados tienen como punto de partida dos parentales homocigotas, esto por cruzmiento produce f1 todos identicos y heterocigotas para todo los locus que han sido fijados alelos diferentes en los parentales Se debe buscar parentales geneticamente bien alejadas para que el numero de locus polimorficas no sean limitantes Tres tipos principales de poblacion de cartografia pueden ser derivados de estos cruzamientos Tipos de poblaciones para mapeo AA x F1 F1xBB BC1F1 AB, BB X F2 AA, AB, BB BB AB X X X X X duplicacion RIL AA, AB? BB Retrocruza: BC1F1 Poblacion segregante filial 2: F2 Lineas endogamicas recombinantes: RILs Lineas de haploides duplicados: DH DH AA, BB Determinación del orden Ejemplo: Par Frecuencia de Recombinación ---------------A-B 0.1 B-C 0.1 A-C 0.2 A B C +----------+----------+ <- 0.1 -> <- 0.1 -> <0.2 -> No es posible otro orden!!! Tres marcadores Ejemplo con tres marcadores 0 Marcador 1 14 Marcador 3 • Tabla de conteo de recombinaciones • Marcador 1 <–> Marcador 2 = 30 • Marcador 1 <–> Marcador 3 = 15 • Marcador 2 <–> Marcador 3 = 20 – Cuáles son las posibilidades? 15 M1 30 M2 M3 M1 M3 M2 20 M2 M1 M3 33 30 20 15 20 30 15 Marcador 2 Gebhart (2004) Determinacion de sexo en plantas Phoenix dactylifera L Ubicacion taxonomica: Family:Palmaceae Sub-family: Coryphyoideae Tribe:Phoeniceae Genus: Phoenix El genero Phoenix, presenta ~ 12 especies, incluida CONVERTIR LOS MARCADORES AFLP A SCAR Secuenciar el fragmento y elaborar iniciadores especificos SCAR “Sequence-characterized amplified regions” Aplicaciones Búsqueda de co-dominancia • Selección asistida • Análisis de asociación Aplicabilidad de marcadores PVY-LB para mejoramiento Objectivos: Identificación de clones con el gen Ry adg y Rysto para inmunidad a PVY. Identificación de clones con genes R dem o R blb o QTLs (que gobiernen un alto porcentaje de la resistencia observada) para resistencia rancha (tizón). Material vegetal Se analizó en total 61 clones, mas 5 controles: 36 clones avanzados resistentes y/o tolerantes a TT y PVY: población B3 población LTVR hibridos somaticos 25 cultivares nativos (Huanuco) de adg, gon y phu: 14 clones resistentes a LB 11 clones susceptibles a LB Métodos: Se utilizaron marcadores alelo-específicos (iniciadoresSCARs, CAPs) seleccionados en CIP and Max Plant Institute: Identificación de clones con resistencia a PVY Se han identificado y validado 4 iniciadores: •Adg: RYSC3 •stolon (M5, M6 y M17) Primers and its sequences used in genotipes screening Marker Ry-linked Primer polymorphism name RYSC3 3.3.3S Adg23R M5 MseI, Tru M5-m M5-p M6 Rsa I M6Rsa M6Taq M17 Pst I M17-m M17-1 Sequence 5’-ATA CAC TCA TCT AAA TTT GAT GG-3’ 5’-AGG ATA TAC GGC ATC ATT TTT CCG A-3’ GCT GTT CAC AAT GGG AAC ATG G CAT ACA AAC TAC TTC TAC CAC G TCC GAA ATG TTT GGG CTG ACA TC AAG GGA TCC AAA AAG GTG GTT CA GAC TGC TTT CTC TCC ACG TGG C GAT CAC AGA TGT TTT ACC TTC GAT G Resultados Tamizado para PVY Perfil de amplificación para 14 clones (primer M5) M M M M= marcador de peso molecular (cada 100pb), la flecha indica el marcador con un peso molecular de 400bp ... Tamizado para PVY Perfil de amplificación para 18 clones (primer M17) Identificacion de genes para resistencia a la rancha Estrategia de trabajo para mapeo genetico S. phureja Clon 618 S. circaeifolium CIP-761030 (6b.25; 6b.39) x F1 plantulas (~300) Analisis fenotipico Analisis molecular selected clones AFLP invernadero campo 92 Analisis de datos, mapeo SSR Procedimiento para la aplicacion de MM en la seleccion: MAS •Extraccion de DNA •PCR (amplificacion del marcador de interes) •Electroforesis •Visualizacion de DNA •Evaluacion de polimorfismo (lectura de geles) •Descarte de individuos sin alelo de interes •Plantas seleccionadas Identificación de progenies hibridas MM como herramienta en Mejoramiento Confiabilidad y repetibilidad Marcadores con estrecho ligamiento a genes de caracteristicas importantes Muy importante para caracteristicas dificiles (aquellas que no pueden ser facil o confiablemente medidos usando metodologias tradicionales (e.g. resistencia a nematodes…) Otros pueden no ser visibles o solo detectados en plantas maduras Otros son muy dificiles o costosas para el tamizado La posibilidad de manejar poblaciones de mejoramiento de gran tamaño (en espacio reducido) Limitaciones de la Tecnica MAS Mapa genetico denso para el cultivo Marcador ligado al gen (<5 cM) Equipamiento Tecnicos calificados para lab. Producción de semillas y uso de marcadores moleculares Caracterización de cultivares Pureza genética de cultivares Identificación de variedades Dos cultivares de soya Pureza genética Conclusion: Marcadores moleculares pueden tener numerosas aplicaciones en los diferentes fases de la seleccion: Optimizacion de la conservacion de recursos geneticos Seleccion de los parentales Identificacion de alelos interesantes Construccion de genotipos acumulando alelos interesantes Finalmente, los MM dispone al mejorador para gestionar y valorizar la variabilidad genética Consideración La selección asistida por marcadores y la selección fenotípica tradicional no son estrategias excluyentes y los programas de mejoramiento genético de mayor eficiencia se logran mediante una combinación de ambas estrategias.