III. Materiales y métodos

III. Materiales y métodos
III. Materiales y Métodos
1. INSTRUMENTACIÓN
A continuación se enumeran las técnicas instrumentales y los equipos utilizados en la
realización del trabajo experimental de la presente tesis.
Las medidas de peso se han realizado en una balanza electrónica Mettler AC 100, en
una Mettler XS 105 DU o bien en una balanza Mettler P1210.
Las medidas de pH se han realizado con un pH-metro Crisol GLP 21.
El agua desionizada utilizada en la elaboración de las disoluciones tampón para los
ensayos de degradación se ha obtenido mediante un sistema de purificación de agua
Mili-Q Millipore.
Los espectros de infrarrojo se han registrado en un espectrofotómetro de transformada
de Fourier, Perkin-Elmer de la serie 1600 FT-IR o un espectrofotómetro Jasco de la
serie FT/IR-4100. Este último está equipado con un accesorio ATR Specac MKII
Golden Gate con cristal de diamante para la medida de la reflectancia total atenuada
(ATR) y con un controlador de temperatura automático Specac West 6100+ que permite
calentar hasta 200 ºC. Se ha trabajado en un rango entre 4000 y 500 cm-1. La
preparación de las muestras se ha llevado a cabo por dispersión del sólido en KBr y
posterior prensado al vacío para el equipo Perkin-Elmer. Por otro lado, el
espectrofotómetro Jasco permite registrar el espectro de infrarrojo de las muestras en
polvo o en aceite sin tratamiento previo.
Los espectros de RMN se han registrado en un espectrómetro Brucker AMX-300 de
transformada de Fourier, operando a 300.13 MHz para el de protón y a 75.48 MHz para
el de carbono.
El tanto por ciento de encapsulamiento del fármaco en las microesferas sintetizadas se
ha determinado mediante espectroscopia UV-visible con un espectrofotómetro Varian
Cary 100 Bio.
57
III. Materiales y Métodos
Las concentraciones de principio activo en los medios de liberación se han determinado
mediante un cromatógrafo de líquidos Shimadzu LC-6A con detector de ultravioleta
Shimadzu SPD-6A y un programa para tratamiento de datos (Empower computer
programs, Waters).
Los puntos de fusión de los compuestos se han determinado con un equipo Mettler FP90 Central Processor equipado con un horno Mettler FP-82 Hot Stage.
La determinación de la viscosidad intrínseca de los polímeros sintetizados se ha
realizado mediante un micro-viscosímetro Cannon-Ubbelohde sumergido en un baño de
agua a una temperatura de 25 ± 0.1 ºC.
Las curvas de distribución de peso molecular, así como los valores promedio de peso
molecular se han determinado con un cromatógrafo de líquidos (Shimadzu, model LC8A) equipado con un detector de índice de refracción (Shimadzu RID-10A) y un
programa para tratamiento de datos Empower (Waters). Se ha utilizado una columna PL
HFIPgel 300 x 7.5 mm (Polymer Lab) termostatizada a 37 ºC.
Los análisis térmicos se han realizado en un calorímetro diferencial de barrido de
potencia compensada Perkin-Elmer DSC-Pyris 1 o en un calorímetro de flujo de calor
TA-Instruments DSC Q-100. Este último está dotado con un sistema de refrigeración y
control programado para ciclos de ascenso y descenso de temperatura (RCS), que
permite alcanzar una temperatura de hasta -90 ºC. El calibrado se ha realizado con indio
(Tf = 429.75 K, ∆Hf = 3.267 kJ·mol-1).
Los análisis termogravimétricos se han efectuado con una termobalanza Perkin-Elmer
TGA 6, acoplada a un sistema de control por microprocesador y una estación de
procesamiento de datos.
Para la preparación de películas se ha utilizado una prensa Perkin-Elmer, dotada con
placas Specac que pueden calentarse hasta una temperatura máxima de 300 ºC mediante
un controlador de temperatura automático Specac de la serie P/N 20160. Para lograr el
espesor de película deseado, se utilizaron moldes de acero inoxidable de 200 µm.
58
III. Materiales y Métodos
La evaluación de las películas utilizadas para el estudio de degradación se ha realizado
mediante un medidor de espesores de modelo Uno-Check Fe. El aparato se calibró con
galgas de 293 µm.
Las fotografías de microscopia electrónica de barrido se han realizado con un equipo
JEOL JSM 6400 a 20 kV o con un equipo Electroscan 2020. Las muestras se fijaron en
cinta adhesiva de carbono de doble cara y fueron recubiertas con oro utilizando un
evaporador Balzers SCD-004.
Los cristales simples de polímero, para el análisis morfológico y estructural mediante
microscopia electrónica de transmisión, se han obtenido empleando baños termostáticos
Precis-bat. Los cristales fueron separados por centrifugación en una centrífuga Sorvall
RC5B plus.
Las muestras cristalizadas se han observado previamente en un microscopio óptico
Nikon Labophot equipado con objetivos de contraste de fase.
La preparación de rejillas para microscopia electrónica y el posterior sombreado de las
muestras se han realizado en un evaporador Balzers constituido por las unidades de
control gauge control PKG 202, evaporation control BSV 080 y control unit EVM 052a.
Las fotografías de microscopia electrónica de transmisión se han obtenido en un
microscopio Philips Tecnai 10. Las micrografías se han registrado con una cámara
digital MegaView II, mientras que para el registro de las difracciones de electrones se
ha utilizado una película fotográfica sensible Maco EM-Film EMS. El calibrado de los
diagramas de difracción de electrones se realizó con oro (d111 = 2.35 Å).
La difracción de rayos X se ha realizado utilizando cámaras de tipo Statton (W. H.
Warhus, Wilmington, Delaware, USA) con filtro de níquel incorporado que selecciona
la radiación Kα del Cu (λ = 1.542 Å) y un generador Philips modelo PW 1130/90
provisto de un tubo Philips sellado (PW 2113/90 de 1200 W) de foco plano. El
calibrado se realizó con calcita dB = 3.305 Å.
59
III. Materiales y Métodos
Antes de realizar los análisis por difracción de rayos X, las fibras de polímero se
observaron mediante un microscopio de luz polarizada Carl Zeiss modelo Standard,
para determinar si las fibras se hallaban suficientemente orientadas.
Las micrografías para el estudio de cristalización y observación de la morfología
esferulítica se han realizado con un microscopio Olympus BX5 equipado con un
accesorio Linkam THMS 600 en el que las muestras se cristalizaron isotérmicamente a
diferentes temperaturas. También se tomaron micrografías ópticas con un microscopio
óptico Axioskop 40 Pol Carl Zeiss equipado con una cámara digital AxioCam MRC5.
Para la determinación del signo de la birrefringencia de las esferulitas se empleó un
“first order red tint plate” (lámina de onda roja de primer orden) bajo polarizadores
cruzados.
Los datos de monocristal se han recogido a temperatura ambiente en un difractómetro
Enraf-Nonius CAD4, equipado con un generador Enraf-Nonius modelo FR590D. Se ha
utilizado la radiación CuKα y un monocromador de grafito. Para la resolución de la
estructura se ha utilizado el programa SHELXS-97
programa SHELXL-97
[1]
[1]
y se ha refinado mediante el
que, mediante el método de mínimos cuadrados, ajusta los
parámetros (coordenadas, factores de escala, factores de ocupación, factores de
temperatura) para obtener una mejor concordancia entre los factores de estructura
observados y calculados.
Previamente los monocristales se analizaron en una lupa de luz transmitida y polarizada
Carl Zeiss modelo 47 50 52-9901.
Los experimentos simultáneos en resolución temporal de dispersión de rayos X a bajo
ángulo (SAXS) y de difracción (WAXD) con radiación sincrotrón se llevaron a cabo
para el Poli[Glc-alt-4Hb] en la estación 6.2 del Daresbury Synchrotron Radiation
Source. El haz, altamente colimado, fue monocromatizado a una longitud de onda de
0.1542 nm. El capilar que contenía la muestra se colocó en una platina Linkam con
control de temperatura. Los perfiles de SAXS y WAXD se recogieron simultáneamente
mediante dos detectores: el detector de SAXS fue calibrado con diferentes órdenes de
difracción del colágeno de cola de rata (L = 65 nm), mientras que el detector de WAXD
se calibró con un estándar de una muestra cristalina de silicio en polvo. Los perfiles de
60
III. Materiales y Métodos
difracción se normalizaron según la intensidad del rayo y se corrigieron considerando el
capilar vacío. La deconvolución de los espectros de WAXD se realizó con el programa
Galactic Peak Solve program (versión 1.05).
En el caso del poli[6HH-alt-Glc], los experimentos de sincrotrón se llevaron a cabo en
la línea BM16 del European Synchrotron Radiation Facility de Grenoble. El haz,
altamente colimado, fue monocromatizado a una logitud de onda de 0.098 nm. El
capilar que contenía la muestra se colocó en una platina Linkam con control de
temperatura. Los perfiles de SAXS y WAXD se recogieron simultáneamente mediante
dos detectores
[148]
: el detector de SAXS fue calibrado con diferentes órdenes de
difracción del behenato de plata, mientras que el detector de WAXD se calibró con un
estándar de alúmina (Al2O3). Los perfiles de difracción se normalizaron según la
intensidad del rayo y se corrigieron considerando el capilar vacío. La deconvolución de
los espectros de WAXD se realizó con el programa PeakFit v4 (Jandel Scientific
Software) utilizando la función matemática conocida como “Gaussian and Lorentzian
area”. Los cálculos de la función de correlación se han llevado a cabo mediante el
programa CORFUNC
[149]
proporcionado por el Collaborative Computacional Project
13 para Difracción de fibras/ Difracción No-Cristalina, CCP13.
2. DISOLVENTES Y REACTIVOS.
Los disolventes han sido suministrados por Panreac y Scharlau. Para los procesos de
síntesis y purificación se ha utilizado calidad PA-ACS. Para las técnicas
cromatográficas de HPLC (High Performance Chromatography), GPC (Gel Permeation
Chromatography) y análisis en UV se ha empleado calidad PAI (UV-IR-HPLC). Los
disolventes deuterados utilizados en los análisis de RMN han sido suministrados por
Merck o Aldrich con un grado de deuteración mínimo de 99.8 %. Todos los disolventes
se han utilizado sin purificación previa.
En la preparación de los medios de degradación y de liberación de fármacos se ha
empleado agua mQ.
Los reactivos de síntesis han sido suministrados por Sigma-Aldrich-Fluka y Acros con
calidad PA-ACS y se han empleado sin purificación previa.
61
III. Materiales y Métodos
El suero bovino y la mezcla en polvo “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”
utilizados para la preparación del medio celular fueron proporcionados por Sigma y se
utilizaron sin purificación previa.
Las enzimas empleadas en los ensayos de biodegradación fueron la proteinasa K de
Tritirachium album, suministrada por Sigma-Aldrich y la lipasa de Pseudomonas
cepacia, suministrada por Fluka.
3. MÉTODOS SINTÉTICOS.
3.1. Síntesis de polímeros.
En el presente trabajo se han obtenido por primera vez copoliésteres de ácido glicólico
y ω-hidroxiácidos con una distribución alternada por el método de policondensación
de sales metálicas.
Los polímeros se han sintetizado adaptando una ruta sintética que se ha revelado
efectiva para la obtención de distintas poliesteramidas
[96-98, 100]
y cuyo método se basa
en los trabajos realizados por Epple et al. [85, 88, 91].
Como comonómeros del ácido glicólico se han elegido la ε-caprolactona y la
butirolactona y se han diseñado dos procedimientos de síntesis para la obtención de
éstos poliésteres:
a) El primer procedimiento de síntesis, mostrado en el esquema 1, consta de las
siguientes etapas: en la primera se hidroliza el éster de la ε-caprolactona y se aísla el
ácido 6-hidroxihexanoico que, en una segunda etapa, se cloroacetila. Posteriormente, se
neutraliza el ácido obtenido con el hidrogenocarbonato de un catión monovalente o
divalente a 0 ºC para evitar la hidrólisis del éster. En la etapa final, se polimerizan las
diferentes sales obtenidas por inducción térmica.
62
III. Materiales y Métodos
ε-caprolactona
1)
2)
ClCH2COCl
+
NaOH
HCl
HOCH2CH2CH2CH2CH2COOH
CHCl3
ClCH2COOCH2CH2CH2CH2CH2COOH
MHCO3/H2O
0 ºC
M = Na+, K+, Cs+, Ca2+
ClCH2COOCH2CH2CH2CH2CH2COOM
Vacío
∆
-[OCHCOOCH2CH2CH2CH2CH2CO]xPoli[Glc-alt-6HH]
+
x MCl
Esquema 1
Esta ruta sintética resulta efectiva para la síntesis de copolímeros de ε-caprolactona pero
no es aplicable para la obtención de copolímeros de butirolactona. En la primera etapa
de reacción, donde se hidroliza el éster de la butirolactona, se observa que al bajar el pH
del medio para obtener el compuesto ácido, éste vuelve a ciclar obteniéndose el
producto de partida. La imposibilidad de aislar el ácido 4-hidroxibutírico nos condujo al
diseño de un segundo proceso de síntesis que se detalla en el siguiente apartado.
b) El esquema 2 muestra la síntesis ideada para la obtención de copolímeros de
butirolactona. En primer lugar, se cloroacila el ácido glicólico con cloruro de
clorobutirilo y se neutraliza el ácido obtenido a 0 ºC, para evitar la hidrólisis del éster
formado, con el hidróxido de un catión monovalente. En este procedimiento el grupo
éster formado no es tan electrófilo como el éster producido en la primera síntesis
descrita, donde hay un átomo electronegativo, el cloro, en posición alfa respecto al
grupo carbonilo. Por esta razón, es posible utilizar un hidróxido para la neutralización
63
III. Materiales y Métodos
del ácido. Finalmente, se obtiene el polímero deseado por condensación térmica de las
distintas sales metálicas.
La síntesis se ha estudiado únicamente a partir de sales monovalentes puesto que se ha
comprobado que las sales divalentes, descritas en el apartado anterior, no polimerizan
térmicamente.
ClCH2CH2CH2COCl
+
HOCH2COOH
CHCl3
ClCH2CH2CH2COOCH2COOH
MOH/H2O
0 ºC
M= Na+, K+, Cs+
ClCH2CH2CH2COOCH2COOM
Vacío
∆
-[OCH2CH2CH2COOCH2CO]xPoli[4Hb-alt-Glc]
+
x MCl
Esquema 2
La obtención de los copolímeros de caprolactona mediante esta segunda ruta es factible.
Sin embargo, teniendo en cuenta los buenos resultados obtenidos mediante el primer
método y el elevado coste del cloruro de clorohexanoilo, se ha considerado innecesario
explorar su síntesis mediante esta vía.
3.2. Síntesis de compuestos modelo.
En muchos casos las policondensaciones tienen lugar en estado sólido por lo que es
interesante conocer la estructura de los monómeros. Para ello, se han sintetizado
pequeñas moléculas con la finalidad de determinar su estructura cristalina mediante
difracción de rayos X. En el esquema 3 se muestra la síntesis de los compuestos modelo
estudiados en la presente tesis.
64
III. Materiales y Métodos
2 XCH2COX
+
HOCH2CH2CH2CH2OH
CHCl3
XCH2COOCH2CH2CH2CH2OCOCH2X
2 ClCH2COCl
+
X = Cl, Br
H2NCH2CH2CH2CH2NH2
NaOH
ClCH2CONHCH2CH2CH2CH2NHCOCH2Cl
ClCH2COCl
+ H2NCH2COOH
1)
2)
NaOH
HCl
ClCH2CONHCH2COOH
NaOH
O
O
Celite/ ∆
Vacío
O
ClCH2CONHCH2COONa
N
H
Esquema 3
4. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA.
Los polímeros obtenidos se han caracterizado mediante espectroscopia de infrarrojo
(IR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (1H-RMN) y de carbono
(13C-RMN), viscosimetría, cromatografía de permeación en gel (GPC), calorimetría
diferencial de barrido (DSC) y termogravimetria (TGA). Además, se han realizado
estudios de degradación de los mismos.
Los monómeros así como los compuestos modelo se han caracterizado por
espectroscopia de infrarrojo (IR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear de
protón (1H-RMN) y de carbono (13C-RMN). También se han determinado los puntos de
fusión.
65
III. Materiales y Métodos
Para la cuantificación de los principios activos encapsulados en las microesferas y la
determinación de concentraciones en los medios de liberación se han utilizado las
técnicas instrumentales de UV-visible y cromatografía líquida de alta resolución.
4.1. Espectroscopia de infrarrojo.
La espectroscopia de infrarrojo se ha empleado para la caracterización de los
compuestos sintetizados. Además, esta técnica espectroscópica ha permitido seguir la
evolución de las reacciones de polimerización constatándose la desaparición de los
grupos carboxilo de los monómeros, así como la intensificación de los grupos éster del
polímero que se forman durante la reacción.
Cuando la luz infrarroja pasa a través de una muestra, algunas de las frecuencias son
absorbidas y otras transmitidas. La espectroscopia de infrarrojo se fundamenta en las
vibraciones moleculares que tienen lugar mediante la absorción de la radiación infrarroja.
En la zona del espectro electromagnético, con longitudes de onda del infrarrojo medio
(entre 4000 y 400 cm-1), se suelen observar una serie de bandas de absorción
provocadas por las vibraciones entre átomos de la molécula.
Durante la excitación es necesaria una variación del momento dipolar de la molécula
para que se produzca una absorción en el IR que pueda asociarse a vibraciones de
tensión (simétrica o asimétrica) o de deformación. Así, los grupos polares muestran
absorciones intensas mientras que los grupos apolares dan lugar a absorciones débiles.
La detección de los grupos funcionales presentes es la principal aplicación de la técnica.
A continuación se detallan el número de onda de las absorciones más importantes en los
compuestos estudiados y el tipo de vibración que se produce:
66
-
Vibración de tensión del –COOH: 3500-2400 cm-1.
-
Vibración de tensión asimétrica del CH2: 2940 cm-1.
-
Vibración de tensión simétrica del CH2: 2860 cm-1.
-
Vibración de tensión del C=O de ácido: 1770-1750 cm-1.
-
Vibración de tensión del C=O de éster: 1745-1725 cm-1.
-
Vibración de tensión asimétrica del CO2- (sal de ácido): 1610-1550 cm-1.
III. Materiales y Métodos
-
Vibración de deformación de tijera del CH2: 1460 cm-1.
-
Vibraciones de tensión simétrica del CO2- (sal de ácido): 1400 cm-1.
-
Vibraciones de tensión asimétrica y simétrica del C-O (éster, ácido y sal):
1320-1000 cm-1.
Cabe comentar que los desplazamientos que se indican son aproximados ya que el valor
experimental obtenido es variable dependiendo de la conformación propia de cada
compuesto.
4.2. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear.
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), que representa una de las
técnicas más importantes en la determinación estructural de compuestos orgánicos, ha
permitido identificar y comprobar la pureza de los compuestos sintetizados.
La técnica espectroscópica de RMN se basa en la medida de absorción de radiación
electromagnética en la región de las radiofrecuencias aproximadamente de 4 a 600
MHz. En contraste con la espectroscopia de infrarrojo, en el proceso de absorción están
implicados los núcleos de los átomos. La técnica se basa en las propiedades magnéticas
de los núcleos atómicos y la interacción del momento magnético nuclear con un campo
magnético externo Bo que conduce a la generación de un diagrama formado por
diferentes niveles energéticos. La transición entre estos niveles puede ser detectada,
amplificada y registrada en lo que sería una línea espectral o señal de resonancia. De
esta forma, se generan los espectros de RMN para compuestos con núcleos de momento
magnético distinto de cero, entre los que se encuentran el protón (1H) y el carbono 13
(13C). Es importante saber que para un mismo tipo de núcleo, las frecuencias de
resonancia son distintas ya que los entornos químicos son diferentes. La posición, que
está asociada a la identidad de los diferentes grupos vecinos, se expresa como
desplazamiento químico en ppm respecto a la señal de un grupo de referencia.
Para la asignación de las señales en los espectros de 13C se han realizado experimentos
bidimensionales de correlación heteronuclear HETCOR (correlación 1H-13C) (figura
4.1a). Ocasionalmente, también se han realizado otros experimentos bidimensionales,
por ejemplo, para identificar los carbonilos de éster, de la sal carboxílica o del ácido
67
III. Materiales y Métodos
carboxílico se han realizado experimentos COLOC (figura 4.1b) que detectan los
acoplamientos 1H-13C a distancias superiores a un enlace.
a)
b)
Figura 4.1.
Espectros bidimensionales HETCOR (a) y COLOC (b).
Se ha utilizado la espectroscopia de 1H-RMN para confirmar la distribución alternante
de los polímeros sintetizados, así como para evaluar el peso molecular (Mn) de las
muestras de reducido tamaño molecular. En este sentido, la técnica resulta útil para el
seguimiento de la degradación de polímeros. Además, la aparición de nuevas señales o
la disminución de la intensidad de otras existentes en el espectro inicial del polímero
sirven para conocer el avance de la degradación.
La preparación de las muestras se ha realizado utilizando un disolvente deuterado
adecuado y añadiendo una gota de una sustancia de referencia (TMS). La disolución
resultante se introduce en un tubo de vidrio especial de 5 mm de diámetro.
4.3. Espectroscopia ultravioleta visible.
La espectroscopia visible es una de las técnicas más amplia y frecuentemente empleada
en el análisis químico, tanto cuantitativo como cualitativo, de muestras sólidas, líquidas
o gaseosas. El rango visible se considera de los 380 a los 750 nm mientras que el rango
del ultravioleta cercano es de 190 a 380 nm.
68
III. Materiales y Métodos
El espectro ultravioleta-visible de las moléculas está asociado a transiciones electrónicas
entre los diferentes niveles energéticos de ciertos grupos o átomos de la molécula. Por
tanto, no caracteriza a la molécula como entidad.
Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el ultravioleta, se conocen como
grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y heteroatómicos que tienen
pares de electrones no compartidos, son cromóforos potenciales. Éstos son la base para
la elucidación de grupos estructurales en las moléculas activas en el UV cercano. En la
figura 4.2 se representan las transiciones posibles en una molécula.
σ* (antienlazante)
n −−−> σ∗
π* (antienlazante)
π −−−> π∗
n −−−> π∗
n (no enlazante)
π (enlazante)
σ −−−> σ∗
σ (enlazante)
Figura 4.2.
Diagrama de niveles energéticos para diferentes orbitales moleculares y las
transiciones posibles entre éstos.
El espectro ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente para complementar al
espectro infrarrojo de la misma especie que sirve como dato confirmativo de la ausencia
o presencia de ciertos grupos funcionales. Desde el punto de vista del estudio
estereoquímico y de grupos funcionales en una molécula orgánica, la espectroscopia UV
no rivaliza con otras técnicas que tienen el mismo propósito, especialmente con la
espectroscopia IR por las razones mencionadas anteriormente, sin embargo su
aplicación en la cuantificación de sustancias que absorben radiación UV la hacen una
técnica insustituible.
69
III. Materiales y Métodos
1
0.8
λmáx = 281 nm
Absorbancia
Cl
OH
O
0.6
Cl
Cl
0.4
0.2
0
250
Figura 4.3.
300
λ (nm)
350
400
Espectro ultravioleta del triclosán.
El espectro que se obtiene es un gráfico de intensidad de absorción (absorbancia o
transmitancia) frente a frecuencia o longitud de onda (λ) (figura 4.3). La base de la
espectroscopia UV-visible consiste en medir la intensidad de la absorbancia a una
longitud de onda específica comparándola con la de otras soluciones de concentración
conocida (soluciones estándar) que contengan la misma especie absorbente. Esta
relación viene definida por la Ley de Lambert-Beer,
A = − log( I / I 0 ) = ε ·b·c
(4.1)
donde I0 es la intensidad de luz incidente a una determinada longitud de onda λ; I es la
intensidad de luz transmitida a dicha longitud de onda; ε es el coeficiente de
absortividad molar; b es el camino óptico de la cubeta que contiene la muestra y c es la
concentración de la disolución. La preparación de las muestras se detalla en la sección
7.
70
III. Materiales y Métodos
4.4. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica se ha empleado para la cuantificación del triclosán (2,4,4’-tricloro-2’hidroxidifenil éter) en los dos medios de liberación ensayados, el medio Sörensen y el
medio celular.
La cromatografía líquida de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente
utilizada dada su sensibilidad así como su exactitud en las determinaciones
cuantitativas. Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla
basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y
la columna cromatográfica.
En la cromatografía líquida de alta resolución, los componentes de la muestra,
previamente disueltos en un disolvente adecuado (fase móvil), son forzados a atravesar
la columna cromatográfica gracias a la aplicación de altas presiones. El material interno
de la columna, fase estacionaria, está constituido por un relleno capaz de retener de
forma selectiva los componentes de la mezcla. La resolución de esta separación depende
de la interacción entre la fase estacionaria y la fase móvil, pudiendo ser manipulada a
través de la elección de diferentes mezclas de disolventes y distintos tipo de relleno.
Como resultado final los componentes de la mezcla salen de la columna separados en
función de sus tiempos de retención en lo que constituye el cromatograma (figura 4.4).
Éste permite realizar la identificación cualitativa y cuantitativa de las especies separadas
dado que el área de cada pico es directamente proporcional a su concentración.
71
III. Materiales y Métodos
Cl
OH
O
Cl
mV
Cl
3.00
Figura 4.4.
3.50
4.50
4.00
t (min)
5.00
5.50
Ejemplo de cromatograma obtenido mediante HPLC del triclosán.
Existen cuatro tipos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido que se
diferencian según la naturaleza de los mecanismos de retención que controlan la
separación:
1. Cromatografía de reparto o líquido-líquido, separa los solutos basándose en
la solubilidad. Cada soluto presenta un coeficiente de partición entre las dos
fases según su mayor o menor grado de hidrofobicidad o hidrofilicidad.
2. Cromatografía de adsorción o líquido-sólido, se basa en la afinidad de
adsorción.
3. Cromatografía iónica, separa los solutos según su carga iónica.
4. Cromatografía de exclusión por tamaños o en gel, separa los solutos según su
peso molecular.
Por otra parte, existen dos tipos de cromatografía de reparto:
1. Cromatografía de fase reversa.
2. Cromatografía de fase normal.
En la cromatografía de fase reversa la fase estacionaria es apolar mientras que la fase
móvil es relativamente polar. La retención se produce en una especie de capa líquida
72
III. Materiales y Métodos
depositada químicamente en la fase estacionaria como consecuencia de la distinta
solubilidad relativa entre la fase estacionaria y la fase móvil. La fase móvil más
comúnmente empleada es una mezcla de agua y un solvente orgánico miscible como el
metanol o el acetonitrilo.
En la cromatografía de fase normal, a diferencia de la anterior, la fase estacionaria es
polar y la móvil apolar. La retención, como en el caso de fase reversa, tiene lugar en la
capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad
relativa en la fase estacionaria y la fase móvil. El analito menos polar será el primero
que se eluye y el más polar el último en eluir.
En la presente tesis se ha empleado la modalidad de fase reversa. Concretamente, se ha
utilizado una columna Tracer Extrasil ODS1 3 µm de espesor de fase y unas
dimensiones 10 × 0.4 cm (Teknokroma). Las condiciones cromatográficas se describen
con detalle en la sección 7.
4.5. Medidas de puntos de fusión.
El punto de fusión es la temperatura a la cual el estado sólido y el estado líquido de una
sustancia coexisten, en equilibrio térmico, a una presión de una atmósfera. Dicha
temperatura depende de las fuerzas intermoleculares que son propias de cada sólido en
particular.
La temperatura de fusión es la constante más utilizada para conocer el grado de pureza
de una sustancia. Habitualmente se expresa como un rango de temperaturas desde que el
material empieza a fundir hasta que ha fundido completamente y que no ha de superar
los 2 ºC. Cuanto más impuro sea un compuesto, más bajo será su punto de fusión. Un
efecto similar se produce cuando el sólido está húmedo, por lo que debe procederse a un
secado cuidadoso antes de determinar el punto de fusión. La impurificación de un
sólido orgánico con un producto inerte, como por ejemplo sales inorgánicas, partículas
de polvo, etc., no produce un descenso del punto de fusión de la sustancia.
73
III. Materiales y Métodos
4.6. Evaluación del peso molecular.
El peso molecular de los polímeros obtenidos se ha evaluado mediante viscosimetría y
mediante cromatografía de permeación en gel (GPC).
En un polímero, la variable fundamental que controla sus características y propiedades
es el peso molecular. Sin embargo, debido a que los métodos de síntesis son procesos
aleatorios y estadísticos en los que el crecimiento de la cadena que polimeriza está
influenciado por multitud de variables, el resultado final corresponde a la obtención de
un producto formado por cadenas macromoleculares de distinta longitud. Es decir, no se
consigue un peso molecular único sino una distribución de pesos moleculares, más o
menos estrecha, dependiendo del proceso de síntesis. Por ello, los métodos
experimentales de determinación del peso molecular proporcionan un valor medio, que
vendrá definido según la técnica empleada.
Fracción
Másica
Mn
Mv
Mw
Mz
Peso molecular
Figura 4.5.
Ejemplo de curva de distribución de pesos moleculares, indicando la
posición relativa de los pesos moleculares promedio.
En la figura 4.5 se muestra una curva típica de distribución de pesos moleculares para
un polímero sintético. Se puede observar que existen cantidades apreciables de distinto
tamaño, desde los oligómeros hasta las especies de muy elevado peso molecular. A
continuación se definen los diferentes promedios de peso molecular:
i) Peso molecular promedio en número, M n o <Mn>, se define como:
74
III. Materiales y Métodos
Mn =
∑N M =∑xM
∑N
i
i
i
(4.2)
i
i
donde Ni es el número de especies de peso molecular Mi; N = ΣNi es el número total de
especies y xi = Ni/N es la fracción en número de la especie de peso molecular Mi. Se
determina experimentalmente a partir de propiedades coligativas como la presión
osmótica, ya que éstas dependen del número de moléculas presentes.
ii) Peso molecular promedio en peso, M w o <Mw>, se define como:
Mw =
∑W M = ∑ w M
∑W
i
i
i
i
(4.3)
i
donde Wi es el peso de las especies de peso molecular Mi; W = ΣWi es el peso total de la
muestra y wi = Wi/W es la fracción en peso de la especie de peso molecular Mi. Se
determina experimentalmente a partir de técnicas de dispersión de luz de soluciones
macromoleculares y técnicas de ultracentrifugación.
iii) Pesos moleculares promedio, M z y M z +1 , se definen como:
Mz
∑N M
=
∑N M
∑N M
=
∑N M
3
i
2
i
i
i
M z +1
i
i
(4.4)
4
i
3
i
(4.5)
Se determinan experimentalmente a partir de técnicas de ultracentrifugación.
iv) Peso molecular viscosimétrico, M v , se define como:
 ∑ N i M ia +1 
Mv = 
 ∑ N M 
i
i 

1/ a
(4.6)
donde a es un parámetro comprendido entre 0.5 y 1. Se determina experimentalmente a
partir de medidas de viscosidad de disoluciones del polímero.
75
III. Materiales y Métodos
Para un polímero polidisperso el valor relativo de cada uno de los promedios es:
M n < M v < M w < M z < M z +1
Teniendo en cuenta que M i = ni M 0 , donde ni es el grado de polimerización de la especie
i y M0 el peso molecular de la unidad repetitiva, se define el grado de polimerización
promedio en número, X n , y en peso X w , como:
X n = ∑ xi X i
(4.7)
X w = ∑ wi X i
(4.8)
El índice de polidipersidad D, nos indica la anchura de la distribución de tamaños
moleculares y corresponde a la relación entre el promedio en peso y en número:
D=
Mw Xw
=
Mn Xn
(4.9)
Cuando el índice de polidispersidad es igual a la unidad se dispone de una muestra
monodispersa, mientras que cuanto más alejado de la unidad sea su valor, más
polidispersa será la muestra y más ancha la distribución. El índice de polidispersidad da
sólo una idea de la variabilidad de pesos moleculares en la muestra, pero no nos permite
conocer como es la distribución completa de los pesos moleculares.
4.6.1. Viscosimetría.
Una de las técnicas más utilizadas para la determinación del peso molecular medio de
un polímero es la viscosimetría ya que es una técnica fácil y rápida. Cuando el
polímero presenta un indice de polidispersidad reducido, el promedio viscosimétrico se
aproxima al promedio en peso.
La viscosidad es la propiedad de todo fluido que caracteriza su comportamiento de
flujo. A escala microscópica, la mayor o menor viscosidad de un fluido es consecuencia
de la facilidad con que las partículas que lo constituyen se deslizan unas respecto a
otras, ya que la viscosidad está relacionada con el rozamiento interno del fluido.
76
III. Materiales y Métodos
La viscosidad de un polímero en disolución depende de la naturaleza del polímero y del
disolvente, de la distribución de pesos moleculares, de la concentración y de la
temperatura. La viscosidad de disoluciones poliméricas es bastante elevada ya que,
debido al elevado tamaño (volumen hidrodinámico) de las partículas disueltas, éstas
experimentan gran resistencia al movimiento.
La viscosidad de un fluido se puede relacionar con el tiempo de flujo t, requerido para
que un volumen determinado de disolución pase a través de un capilar por efecto de la
gravedad. Esta relación puede obtenerse a partir de la ecuación de Hagen-Poiseuille:
υ=
π ·∆P·r 4
8·η ·l
(4.10)
donde υ es el flujo volumétrico del fluido, ∆P es la diferencia de presión que mantiene
el flujo, r es el radio del capilar, η es la viscosidad y l es la longitud del capilar.
La expresión anterior puede reordenarse para obtener una relación de la viscosidad con
el tiempo:
η=
π ·∆P·r 4 ·t
8·V ·l
(4.11)
donde V representa el volumen de fluido desplazado en el tiempo t.
En el caso de disoluciones, es frecuente medir la viscosidad por comparación de la
viscosidad de la disolución con la del disolvente puro. Los parámetros resultantes son la
viscosidad relativa (ηr) y la viscosidad específica (ηsp), definidas mediante las
siguientes expresiones:
ηr =
η sp =
η t
≈
η 0 t0
(η − η0 )
η0
=
(t − t0 )
t0
(4.12)
(4.13)
77
III. Materiales y Métodos
donde η y η0 son, respectivamente, las viscosidades de la disolución y la del disolvente
puro, t y t0 son respectivamente los tiempos necesarios para que la disolución y el
disolvente fluyan a través de las marcas de un capilar.
Cuando se quiere tener en cuenta el efecto de la concentración (c) en la viscosidad, se
pueden utilizar otros dos parámetros, conocidos como viscosidad reducida (ηred) y
viscosidad inherente (ηinh):
ηred =
ηinh =
η sp
=
c
(t − t0 ) 1
·
t0 c
(ln η sp )
(4.14)
(4.15)
c
La relación entre la viscosidad y la concentración fue demostrada empíricamente por
Huggins y Kramer y puede ser descrita mediante las expresiones:
η sp
2
= [η ] + k H [η ] c
(4.16)
ln ηred
2
= [η ] + kk [η ] c
c
(4.17)
c
Para disoluciones diluidas, las formas de estas curvas se aproximan a dos líneas rectas
que, extrapoladas a concentración nula, coinciden en el parámetro correspondiente a la
viscosidad intrínseca [η] (figura 4.6). Este parámetro puede relacionarse directamente
con el peso molecular del polímero a través de la ecuación de Mark-Houwink-Sakurada:
[η ] = K ·M va
(4.18)
Los parámetros K y a son las llamadas constantes de Mark-Houwink-Sakurada y
dependen del polímero, del disolvente y de la temperatura. Estos parámetros se pueden
encontrar tabulados en la bibliografía para algunos polímeros.
78
III. Materiales y Métodos
1.20
1.00
[η] (dl/g)
0.80
0.60
0.40
ηred
ηinh
0.20
0.00
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
Concentración (g/dl)
Figura 4.6.
Ejemplo ilustrativo de la determinación de la viscosidad intrínseca
mediante la extrapolación de las viscosidades reducida e inherente.
Para determinar el valor de los parámetros K y a, se requiere un calibrado con muestras
de peso molecular conocido. En ausencia de patrones, se utiliza la correlación existente
para un polímero de naturaleza similar en el mismo solvente y temperatura. No
obstante, de este modo se ignoran interacciones específicas del polímero en estudio por
lo que el valor que se obtiene únicamente es orientativo. Por este motivo, a efectos de
comparación se ha utilizado simplemente la viscosidad intrínseca como parámetro
indicador del peso molecular.
Experimentalmente la determinación de la viscosidad intrínseca se ha realizado
midiendo el tiempo de flujo, a través del capilar de un micro-viscosímetro del
disolvente puro y de distintas disoluciones diluidas del polímero. En todos los casos se
ha utilizado el ácido dicloroacético como disolvente, el rango de concentraciones se ha
mantenido entre 1 g·dl-1 y 0.35 g·dl-1, y la temperatura se ha fijado a 25 ºC.
4.6.2. Cromatografía de permeación en gel.
Actualmente, la cromatografía de permeación en gel (GPC), también conocida como
Cromatografía de Exclusión (SEC), constituye la técnica de separación más utilizada
79
III. Materiales y Métodos
para la separación de las moléculas de una muestra polimérica en función del tamaño
molecular.
Las macromoléculas disueltas se separan según sus dimensiones y no por su afinidad
con la fase estacionaria, eluyente o solvente. En GPC las moléculas eluyen en orden de
mayor a menor tamaño. Esta separación se produce como consecuencia de la diferente
penetración de las macromoléculas a través de los poros de un gel dispuesto en el
interior de una columna cromatográfica. Los materiales de relleno de la columna son
principalmente poliestireno poroso (entrecruzado e hinchado) y vidrio poroso.
Cuando una disolución polimérica, con diferentes tamaños moleculares, es introducida
en el interior de una columna cromatográfica tiene lugar un fraccionamiento en función
de su tamaño molecular y de la distribución de tamaño de poro del gel polimérico. Las
moléculas de mayor tamaño se arrastran con el disolvente, tardan menos tiempo en
atravesar la columna y son las primeras en abandonarla, mientras que las de menor
tamaño son retenidas durante un tiempo superior. A la salida de la columna se registra la
variación entre el índice de refracción del disolvente puro y de la fracción eluida. Para
conocer los valores de los pesos moleculares se requiere un calibrado con patrones.
Los pesos moleculares medios se han determinado utilizando estándares de
polimetilmetacrilato de baja dispersidad. Los polímeros fueron disueltos en
hexafluoroisopropanol y eluidos en hexafluoroisopropanol conteniendo CF3COONa
(0.05 M) a una velocidad de flujo de 0.5 ml·min-1. El volumen inyectado fue de 100 µL
y la concentración de las muestras de 2.5 mg·ml-1.
4.7. Análisis térmico.
El análisis térmico comprende un conjunto de técnicas cuyo objetivo es el estudio de los
cambios físicos o químicos que ocurren en una sustancia o material en función de la
temperatura cuando la muestra se calienta con un programa de temperaturas, o en
función del tiempo cuando la muestra se mantiene a una temperatura dada (isoterma).
La determinación de propiedades térmicas de los polímeros, concretamente la
temperatura de fusión (Tf), transición vítrea (Tg) y cristalización (Tc) así como los
80
III. Materiales y Métodos
valores de entalpía asociados (∆Hf, ∆Hc), se han llevado a cabo mediante calorimetría
diferencial de barrido (DSC). Además, mediante esta técnica, también se ha estudiado
la cinética de polimerización de las sales así como la cinética de cristalización de los
polímeros obtenidos tal y como se detalla más adelante en la sección 6. La estabilidad
térmica de los polímeros y de las sales se ha estudiado mediante termogravimetría
(TGA).
4.7.1. Calorimetría diferencial de barrido.
Existen en el mercado dos clases de calorímetros, los que funcionan por compensación
de potencia y los que funcionan por flujo de calor. En el presente trabajo se han
utilizado calorímetros de ambos tipos. En el primer caso, se mide la potencia que hay
que aportar o retirar del sistema para que la muestra y una referencia se mantengan a la
misma temperatura cuando se someten a un programa de calentamiento. En el segundo
caso, se mide la diferencia de temperatura que se establece entre la muestra y la
referencia cuando son calentadas es un horno único.
En la Calorimetría Diferencial de Barrido de potencia compensada, el calorímetro
consta de dos celdas gemelas dotadas de calefacción. En una de ellas se coloca la
cápsula que contiene la muestra a analizar, mientras que en la otra se sitúa una cápsula
vacía. Las celdas que contienen la muestra y la referencia están equipadas con un
sensor, para la medida de la temperatura, y una resistencia de calentamiento. Puesto que
las capacidades caloríficas de la muestra y la referencia van a ser diferentes, se
necesitará comunicar potencia térmica a través de la resistencia a la celda más fría para
mantener ambas celdas a la misma temperatura. Dicha potencia es proporcional a la
diferencia entre las capacidades caloríficas de las dos celdas siempre y cuando se
calienten simultáneamente y a la misma velocidad. La energía suministrada (potencia)
se mide como una función de la temperatura y del tiempo, teniendo como requerimiento
el hecho de mantener en todo momento la igualdad de temperatura entre las dos celdas.
De esta manera, el termograma obtenido muestra el flujo de calor frente al tiempo o a la
temperatura.
El calorímetro de flujo de calor, por el contrario, consta de una única celda que dispone
de dos plataformas, una para la muestra a analizar y otra para la referencia. Entre las dos
81
III. Materiales y Métodos
plataformas se encuentra situado un sensor, para la medida de temperatura, y una
resistencia de calentamiento que mantiene el equilibrio térmico entre muestra y
referencia. El flujo de calor entre la muestra y la referencia queda registrado y se
representa en el termograma frente al tiempo o la temperatura.
En los materiales poliméricos, las transiciones térmicas más importantes que pueden
observarse en DSC son la temperatura de transición vítrea (Tg) y la temperatura de
fusión (Tf). En los polímeros amorfos la Tg es la única transición que se registra y
aparece como un cambio abrupto de la línea base. La fusión se manifiesta en un pico
endotérmico con subida más o menos gradual y regular según la naturaleza e historia
térmica de la muestra, y bajada brusca hasta recobrar la línea base. Cuando tras la
fusión, la línea base se mantiene puede considerarse que el material es térmicamente
estable respecto al proceso de fusión. Lo contrario es indicio de descomposición y debe
estudiarse con más detalle mediante análisis termogravimétrico.
La cristalinidad se evalúa usando como referencia el calor de fusión de un material
100% cristalino que puede estimarse a partir de las contribuciones de grupo y los datos
tabulados por diferentes autores. Los valores utilizados fueron 4.0 kJ·mol-1 para el grupo
metilénico, mientras que para el grupo éster los valores tabulados son -2.5 kJ·mol-1 [91] y
5 kJ·mol-1 [151].
En la determinación de las propiedades térmicas de los polímeros se ha seguido un
protocolo consistente en cuatro barridos. El primero corresponde a un calentamiento,
generalmente realizado a 20 ºC·min-1, en el que se obtiene información de la fusión de
la muestra obtenida del proceso de síntesis y, por lo tanto, del grado de cristalinidad
inicial. Después de la fusión, se efectúa un segundo barrido en el que la muestra se
enfría, normalmente a 10 ºC·min-1, para observar la cristalización a partir del fundido.
El tercer barrido consiste en un calentamiento para verificar la fusión de la muestra
anteriormente cristalizada y comprobar la reproducibilidad del proceso de fusión. Por
último, se somete la muestra a un enfriamiento rápido desde el estado fundido con la
finalidad de llevarla al estado amorfo, registrándose posteriormente un tercer
calentamiento (cuarto barrido) en el que se determina la temperatura de transición vítrea
del polímero junto con las posibles cristalizaciones en frío y en caliente, así como la
fusión.
82
III. Materiales y Métodos
Las medidas se realizaron con muestras en polvo (5-10 mg) depositadas en cápsulas de
aluminio y bajo una corriente de nitrógeno anhidro.
4.7.2. Análisis termogravimétrico.
El análisis termogravimétrico (TGA) es una técnica que mide la variación de masa en
un compuesto sometido a un determinado tratamiento térmico. Las variaciones de
temperatura no siempre implican un cambio en la masa de la muestra; existen, sin
embargo, cambios térmicos que sí se acompañan de una modificación en la masa del
compuesto, como la descomposición, la sublimación, la reducción, la desorción, la
absorción y la vaporización. Estos cambios pueden ser medidos con el analizador
termogravimétrico.
El análisis de TGA representa una forma fácil y rápida para analizar la estabilidad
térmica de los polímeros. Esta información resulta relevante al evaluar las posibilidades
de transformación de un material por encima de su temperatura de fusión. Además,
mediante esta técnica se puede determinar si la temperatura de polimerización del
monómero se encuentra próxima o lejana a la temperatura de descomposición del
polímero.
Con esta técnica básicamente se realizan dos tipos de ensayo, el análisis dinámico o no
isotérmico y el isotérmico o estático. En el primero, la temperatura se aumenta a
velocidad constante, mientras que en el segundo se mantiene constante la temperatura
midiéndose las variaciones de masa a lo largo del tiempo. Del análisis dinámico se
obtiene la temperatura de descomposición inicial (Td,0) y la temperatura a la que la
muestra pierde la mitad de su masa inicial (Td,1/2). Mediante el análisis estático se puede
observar el efecto del tiempo sobre la estabilidad térmica de la muestra a una
temperatura determinada.
La muestra se coloca sobre una balanza electrónica situada en el interior de un horno.
Un programador de temperaturas permite realizar gradientes térmicos controlados así
como mantener una temperatura fija. De este modo, se registran la temperatura a la que
está sometida la muestra y las variaciones de peso que experimenta.
83
III. Materiales y Métodos
En el presente trabajo los ensayos se realizaron en régimen dinámico a 10 ºC·min-1 a
partir de muestras en polvo (10-20 mg), bajo atmósfera de nitrógeno y en el rango de 50
a 600 ºC.
4.8. Estudios de solubilidad.
La disolución de un polímero es un proceso lento que tiene lugar en dos etapas. En la
primera, las moléculas de disolvente difunden lentamente hacia en interior del polímero
hinchándolo, hasta lograr la separación de las cadenas y su incorporación en la
disolución. El proceso de disolución puede detenerse en esta fase, si las fuerzas
intermoleculares polímero-polímero, relacionadas con aspectos de reticulación o de
cristalinidad, son lo suficientemente grandes como para impedir la completa disolución.
En caso de que estas fuerzas puedan superarse por la formación de interacciones
intensas polímero-disolvente, tendrá lugar la segunda etapa de la disolución. En ésta, el
polímero hinchado se desintegra gradualmente originando una verdadera disolución. Al
añadir más polímero no se observa saturación, sino que el material se disuelve. Por este
motivo la solubilidad suele expresarse de forma cualitativa con términos como
insoluble, soluble a temperatura ambiente y soluble a alta temperatura.
Una de las principales aplicaciones de los poliésteres diseñados en este trabajo
corresponde a su aplicación como dispositivo liberador de fármacos. Existen diferentes
métodos para la preparación de microesferas, en este trabajo se ha utilizado el método
de evaporación del solvente tal y como se explicará en la sección 7. Por esta razón, es
importante determinar la solubilidad de los poliésteres obtenidos en disolventes
orgánicos volátiles, por lo que se han realizado estudios de solubilidad.
El protocolo seguido ha consistido en depositar una pequeña cantidad de polímero (~1
mg) en un tubo de ensayo al que se añade alrededor de 0.5 ml de disolvente. Se agita
durante unos minutos y se examina para ver si se logra la disolución o cambia el aspecto
del polímero. Cuando no se aprecian cambios a temperatura ambiente, se repite el
ensayo calentando el tubo de ensayo a una temperatura que no exceda la temperatura de
ebullición del disolvente y se realizan las mismas observaciones. Cuando se aprecian
cambios pero no se llega a una completa disolución se considera que el polímero se ha
disuelto parcialmente.
84
III. Materiales y Métodos
4.9. Estudios de degradación.
Se han realizado ensayos de degradación hidrolítica y enzimática in vitro de los
polímeros obtenidos. La degradación hidrolítica es lenta y requiere tiempos de
incubación largos. Por ello, la hidrólisis se ha estudiado en tampón fosfato
(Na2HPO4/KH2PO4 0.1 M, pH 7.4) en condiciones aceleradas por efecto de la
temperatura. En concreto los ensayos se han efectuado a 50 ºC para el poli[Glc -alt6HH] y a 70 ºC para el poli[4Hb-alt-Glc].
La biodegradación suele ser más rápida y tiene lugar en la superficie del material debido
a la imposibilidad de las enzimas de penetrar en el interior del material
[152]
. La
degradación enzimática de los poliésteres sintetizados se ha estudiado también en
condiciones fisiológicas (Na2HPO4/KH2PO4 0.1 M, pH 7.4) con dos enzimas distintas y
a una concentración de 1 mg·ml-1: la proteinasa K de Tritirachium Album, que es una
enzima tipo proteasa y la lipasa de Pseudomonas Cepacia, que es de tipo estearasa.
Para todos los medios acuosos se ha utilizado agua desionizada Millipore y se ha
añadido un 0.03 % (p/v) de azida sódica para evitar la proliferación de
microorganismos. Los medios de degradación se han renovado cada tres días para
asegurar una actividad, más o menos, continua y estable.
El seguimiento del proceso se ha efectuado en base a la pérdida de masa que
experimenta la muestra, mediante pesada con balanza analítica, y a la evaluación de
pérdida de peso molecular determinada mediante GPC. Por otro lado, los cambios en la
estructura química se han estudiado mediante espectroscopia de 1H-RMN. Además, la
degradación enzimática de los poliésteres se ha evaluado mediante microscopia
electrónica de barrido y mediante microscopia de transmisión electrónica de cristales
simples de polímero. Estas técnicas se explicarán con detalle en el apartado de
caracterización morfológica y estructural (apartado 5).
Los ensayos de degradación se han llevado a cabo a partir de placas de polímero. Éstas
se han obtenido mediante prensado de las muestras en estado fundido (a 5 ºC por
encima de su temperatura de fusión) y empleando moldes metálicos. La presión
85
III. Materiales y Métodos
alcanzada fue de 5 toneladas. Inicialmente, a partir de aproximadamente 300 mg de
polímero, se obtuvieron placas de 3 cm x 3 cm y 0.2 mm de espesor. Mediante cortes
con cuchilla, cada placa se dividió en otras de 1.5 cm x 1.5 cm. En los ensayos de
degradación hidrolítica las muestras se incubaron en 30 ml de medio y en los
enzimáticos en 10 ml. Las muestras se extrajeron cuidadosamente tras decantar el medio
de degradación y se dejaron secar al aire sobre un papel de filtro. Cuando las mismas
provienen de medio enzimático, el procedimiento incluye la desactivación de la enzima
mediante lavados con una disolución de HCl a pH 2 y posteriores lavados con agua
desionizada Millipore.
4.10. Determinación de la densidad por el método de flotación.
Para determinar la densidad de los polímeros obtenidos se utilizó el método de flotación
en disoluciones de 2-metil-2,4-pentanodiol y tetracloruro de carbono a 27 ºC y a 0 ºC.
Pequeñas películas de polímero cristalizado en frío o en caliente se sumergieron en una
probeta con 5 ml de 2-metil-2,4-pentanodiol y 5 ml de tetracloruro de carbono. Se fue
añadiendo tetracloruro de carbono hasta que la muestra se elevó del fondo y se mantuvo
suspendida en el interior del líquido. En este momento, se determinó la densidad del
mismo con un picnómetro y se promedió con la obtenida por el mismo método, pero
empezando con una disolución de 1 ml de 2-metil-2,4-pentanodiol y 9 ml de
tetracloruro de carbono. En este caso la mezcla presenta una mayor densidad que la
muestra, por lo que debe añadirse posteriormente 2-metil-2,4-pentanodiol para
equilibrar la densidad.
5. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y ESTRUCTURAL.
La estructura y morfología de los polímeros se ha estudiado mediante técnicas de
difracción de rayos X y difracción de electrones (microscopia electrónica de
transmisión). El estudio estructural de los polímeros se ha completado con experimentos
simultáneos en resolución temporal de dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS)
y de difracción (WAXD) con radiación sincrotrón.
86
III. Materiales y Métodos
Mediante microscopia electrónica de barrido (SEM) se ha observado la morfología de
la superficie de las placas de polímero sometidas a un proceso de degradación, así como
la forma y textura de las microesferas sintetizadas.
Por otro lado, se ha estudiado la estructura cristalina de pequeñas moléculas,
compuestos modelo, mediante difracción de rayos X.
5.1. Difracción de rayos X.
Los rayos X son una radiación electromagnética cuya longitud de onda se encuentra
comprendida entre la radiación UV y los rayos γ. Las propiedades más importantes de
esta radiación fueron descritas por Röntgen en 1896, pero no fue hasta principios del
siglo pasado que von Laue (1912) y Bragg (1913) demostraron que los cristales, debido
a su ordenación regular, podían difractar los rayos X dispersados por todos los átomos
que los constituyen, según unas direcciones determinadas. Este descubrimiento resultó
muy útil para la determinación de la estructura tridimensional de numerosas moléculas
biológicas [153], pero también en el caso de los polímeros sintéticos [154].
Cuando los electrones emitidos por un filamento calentado a temperatura elevada se
hacen incidir sobre un ánodo metálico, de forma que se produzcan excitaciones de los
electrones situados en las capas más internas de los átomos, se generan rayos X cuya
longitud de onda se sitúa entre 10-7 y 10-11 m. Normalmente se utiliza un ánodo de cobre
y se obtiene un espectro de rayos X formado por una banda ancha responsable de la
radiación blanca y unas líneas características (CuKα y CuKβ) que se pueden separar
mediante filtros adecuados. Para el estudio de polímeros se ha empleado la línea
CuKα caracterizada por una longitud de onda, λ, de 0.154 nm.
Esta radiación debe separarse tanto de la radiación CuKβ como de la radiación continua,
existiendo dos procedimientos:
a) Utilización de un filtro de níquel que se sitúa en la trayectoria del haz, en algún punto
entre la fuente de rayos X y el sistema de detección. Este filtro absorbe selectivamente
la línea espectral
Kβ, aunque diminuye la intensidad del doblete Kα. La ventaja
87
III. Materiales y Métodos
principal del filtro de níquel es su simplicidad y bajo coste, mientras que su principal
inconveniente es la presencia de un continuo de radiación blanca en el haz filtrado, que
se pone de manifiesto en forma de manchas radiales alargadas en las fotografías de
difracción de muestras orientadas.
b) Utilización de un monocromador consistente en un monocristal con una de sus caras
cortada paralelamente a un conjunto de planos cristalinos característico. El uso de
monocromadores tiene la ventaja de producir fotografías de difracción exentas también
de la radiación blanca, pero conlleva una disminución apreciable de la intensidad del
haz.
Cuando un haz de rayos X monocromático incide sobre una muestra pueden tener lugar
dos procesos. Si la muestra tiene una estructura periódica (regiones cristalinas), los
rayos X inciden coherentemente, sin producir cambios en la longitud de onda y sin
pérdida de relaciones de fase entre los rayos incidentes y los dispersados. Cuando la
muestra está compuesta de regiones amorfas y cristalinas que dan lugar a una cierta
periodicidad, pueden observarse también efectos de dispersión que corresponden a
espaciados elevados. El primer proceso se mide por difracción de rayos X a ángulo alto
(WAXD, Wide Angle X-ray Diffraction) y el segundo por dispersión de bajo ángulo
(SAXS, Small Angle X-ray Scattering).
Una red cristalina está compuesta por una familia de planos paralelos que se extienden a
través de los átomos que la forman y que se define por un triplete de números enteros
llamados índices de Miller. La difracción de rayos X sigue el principio de Huyggens,
donde cada rendija actúa como foco emisor de ondas que interfieren constructiva o
destructivamente para producir la difracción. Únicamente se produce interferencia
constructiva cuando se cumple la ley de Bragg:
nλ = 2d hkl senθ
(5.1)
donde dhkl es el espaciado de los planos de Miller, θ el ángulo de incidencia o reflexión,
n el número de orden y λ la longitud de onda de la radiación utilizada. La geometría de
la difracción de rayos X se muestra en la figura 5.1. El conjunto de espaciados
88
III. Materiales y Métodos
cristalográficos permite determinar la celdilla unitaria. Ésta se halla definida mediante
los parámetros a, b, c y los ángulos existentes entre ellos α, β, γ. Esta celdilla representa
la unidad más pequeña a partir de la cual puede generarse el cristal por simples
movimientos de traslación.
a)
Haz difractado
λ
Haz incidente
λ
b)
Muestra Desorientada
(polvo cristalino)
2θ
θ
θ
θ θ
D
Rayos X
dhkl
L
tan 2θ = D/2L
Átomos
Figura 5.1. a) Geometría de difracción de rayos X, b) Relación entre el diámetro del anillo
de difracción (D) y el ángulo de difracción (θ
θ) asociado.
El diagrama de difracción de una fibra puede reflejar un elevado grado de orientación y
proporcionar una información más precisa que un diagrama de difracción de polvo
(muestra totalmente desorientada), en cuanto a la asignación de los índices de Miller
correspondientes a los planos difractados y a la determinación de la simetría cristalina.
Las propiedades térmicas y el peso molecular del polímero son condicionantes para
poder preparar fibras orientadas. Debido a que el polímero es estirado según el propio
eje molecular, las cadenas poliméricas se orientan según la dirección del estirado. Los
diagramas de difracción correspondientes se caracterizan por la aparición de manchas
relacionadas con la repetitividad de cadena con orientación meridional (M) o fuera del
meridiano (oM) según el sistema cristalino y manchas ecuatoriales (E), relacionadas con
el empaquetamiento cristalino.
La orientación de la muestra se consigue a partir del estirado de la masa polimérica
fundida. El grado de orientación de la fibra se estima cualitativamente, observando la
birrefringencia de la muestra con un microscopio de luz polarizada.
89
III. Materiales y Métodos
Por otro lado, en la presente tesis se realizaron experimentos simultáneos en resolución
temporal de dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS) y de difracción (WAXD)
con radiación sincrotrón en la línea BM16 (ESRF, Grenoble) y también en la línea 6.2
(Daresbury). La radiación sincrotrón es una radiación electromagnética de alta
intensidad, emitida por electrones o positrones de alta energía y con una distribución
espectral continua. La radiación sincrotrón es producida cuando partículas cargadas y de
muy alta energía (E >> mc2) son desviadas por un campo magnético intenso.
Las propiedades de la radiación sincrotrón de mayor interés para los experimentos de
dispersión son:
- Poder originar un espectro continuo que abarca la región del infrarrojo (λ ~ 10-2 mm)
hasta la región de los rayos X duros (λ ~ 10-2 nm).
- Presentar una intensidad que es de varios órdenes de magnitud mayor a la de las
fuentes convencionales.
- Originar un haz altamente colimado (0.14 mrad en la región de los rayos X).
- Producir una radiación altamente polarizada, con el vector del campo eléctrico en el
plano orbital.
Un sincrotrón consiste básicamente en un anillo cuyo diámetro puede ir desde unos
pocos metros hasta algunos centenares de metros. En el anillo se mantiene un vacío de
unos 10-7 mbar y en él se pueden aplicar campos eléctricos y magnéticos intensos.
Previamente se acelera un paquete de electrones o positrones en un acelerador lineal,
hasta obtener energías de entre 40 y 360 MeV. Estas partículas son inyectadas en el
sincrotrón, donde son aceleradas de nuevo hasta conseguir una energía de varios GeV.
Esto se consigue gracias a una serie de imanes que focalizan y giran el haz de electrones
o positrones a lo largo de su trayectoria. Entre los campos magnéticos existen zonas del
anillo con camino recto, donde la energía del haz se incrementa mediante campos
eléctricos. Cuando las partículas han alcanzado la elevada energía requerida
(típicamente unos 3 GeV), son inyectadas en un anillo de almacenamiento. En este
anillo, que es similar al sincrotrón, los electrones y positrones orbitan por caminos
paralelos y en direcciones opuestas. Tanto los electrones como los positrones tienen las
mismas propiedades en lo que se refiere a la radiación sincrotrón. El tiempo de vida de
90
III. Materiales y Métodos
este paquete de partículas en el anillo de almacenamiento varía entre 2 y 20 horas.
Durante este tiempo, la corriente inicial de unos 300 mA decrece hasta unos 100 mA.
Una de las características más atractivas de la radiación sincrotrón para los
experimentos en materiales poliméricos es su elevada intensidad. Gracias a ella es
posible obtener diagramas de difracción en unos tiempos muy cortos, lo que permite el
estudio de procesos dinámicos como son por ejemplo los de cristalización. En las
secciones 5.1.1 y 5.1.2 se detalla el estudio de la cinética de cristalización mediante
experimentos simultáneos en resolución temporal de dispersión de rayos X a bajo
ángulo (SAXS) y de difracción (WAXD) de radiación sincrotrón.
En la figura 5.2 se muestra un esquema del montaje de la linea BM16 (ESRF, Grenoble)
para experimentos simultáneos en resolución temporal. El detector de WAXD es una
cámara CCD PI SCX90-1300 de Roper Scientific con una superficie activa de 65 x 65
mm2 y 1242 x 1152 píxeles. El detector de SAXS es una cámara marCCD de X-Ray
Research, GmbH, Norderstedt, Alemania, con una superficie activa de 165 mm de
diámetro y 2048 x 2048 píxeles. El goniómetro está montado con su eje de rotación
perpendicular a la dirección del haz. La muestra se coloca en la intersección entre el eje
del goniómetro y el haz.
Detector de WAXD
Cámara de vacío
Goniómetro
Detector de SAXS
Haz
Figura 5.2.
Esquema de la línea de polímeros BM16 (ESRF, Grenoble) para
experimentos simultáneos de SAXS y WAXD [148].
91
III. Materiales y Métodos
Los datos de difracción pueden darse también en función del vector de dispersión, q ,
que se de define como:
q = k f − ki
(5.2)
donde k i y k f son los vectores de onda de las ondas planas incidente y dispersada
respectivamente. En los experimentos de dispersión elástica, la frecuencia de la
radiación incidente y dispersada permanece fija,
k f = ki =
2π
(5.3)
λ
El vector de dispersión (q ) está relacionado con el ángulo de dispersión mediante:
4π
q =
senθ
(5.4)
λ
Se observa una interferencia constructiva si existe algún tipo de periodicidad en los
elementos constitutivos de la muestra y se cumple que el vector de dispersión coincide
con un vector de la red recíproca cristalina [155].
Dependiendo del ángulo θ, la escala de longitudes exploradas es diferente. Para ángulos
2θ mayores de 2.5º se habla de dispersión de rayos X de ángulo altos (WAXD) y para
ángulos 2θ menores de 1º, se habla de dispersión de bajo ángulo (SAXS).
En ángulos altos, la ley de Bragg [156], predice que hay máximos de difracción cuando:
2π
q =
d hkl
(5.5)
donde dhkl es la distancia entre planos cristalográficos consecutivos con índices de
Miller hkl.
92
III. Materiales y Métodos
Para ángulos bajos, el vector de onda q permite explorar distancias del orden de las
centenas de Å. En esta escala, la información obtenida proviene de las lamelas
cristalizadas cumpliéndose la relación:
2π
q =
L
(5.6)
donde L es el valor correspondiente al espaciado interlamelar.
5.1.1. Dispersión de rayos X a ángulos bajos (SAXS).
Las muestras isotrópicas de polímeros cristalinos pueden considerarse como el resultado
de un apilamiento de lamelas cristalinas dispuestas paralelamente (figura 5.3). Si las
dimensiones de los apilamientos en las direcciones paralela y perpendicular a la
superficie lamelar son superiores a las distancias interlamelares, la dispersión de Rayos
X puede relacionarse con una función de densidad electrónica ρe(z) medida según la
dirección (z) perpendicular a las superficies lamelares [157]. En esta dirección la densidad
pasa a través de regiones amorfas con densidad electrónica ρe,a y regiones cristalinas
con densidad ρe,c. La función de correlación corresponde a la transformada de Fourier
de la función de densidad electrónica y permite obtener información relativa a las
dimensiones de las zonas cristalinas de las lamelas, las zonas amorfas y el espaciado
interlamelar.
lc
la
Lγ
ρe,c
ρe(z)
ρe,a
z
Figura 5.3.
Representación esquemática del modelo bifásico.
93
III. Materiales y Métodos
Así, el análisis mediante dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS) permite analizar
la distribución de los tamaños del cristal en las muestras. Como se ha comentado
anteriormente, la periodicidad media del espaciado interlamelar puede calcularse a
partir de la posición angular del máximo en el espectro de SAXS mediante la ecuación
5.6.
Experimentalmente, los perfiles de SAXS se analizan considerando la función de
correlación unidimensional normalizada [158], γ(r), que corresponde a la transformada
de Fourier del perfil de SAXS aplicando la corrección de Lorentz (Iq2vs q):
∞
∞
∞
γ (r ) = ∫ q I (q) cos(qr )dq / Q = ∫ q I (q) cos(qr )dq / ∫ q 2 I (q)dq
2
2
0
0
(5.7)
0
Las integraciones deben calcularse en el rango entre 0 y ∞, por lo que es necesario
extrapolar la intensidad de dispersión a valores altos y bajos de q. La extrapolación a
valores bajos de q se ha llevado a cabo empleando el modelo de Vonk [159] mediante el
programa CORFUNC
[149]
que asume que el perfil de la intensidad de dispersión está
definido por la siguiente ecuación:
I ( q ) = H1 − H 2 q 2
(5.8)
donde H1 y H2 son constantes.
Por otro lado, la extrapolación a valores elevados de q se ha llevado a cabo
considerando la ley de Porod [156]:
I ( q ) = I b (q ) + K / q 4
(5.9)
donde Ib es la intensidad de “background” y K es la constante de Porod.
El análisis de la función de correlación conduce a la determinación de: (1) el espaciado
interlamelar (long period), Lγ; (2) la cristalinidad de la lamela XcSAXS; (3) el espesor
lamelar, lc, y el espesor amorfo, la, y (4) la invariante, Q. La figura 5.4 muestra como se
determinan estos parámetros: Lγ corresponde al valor de r para el primer máximo de la
94
III. Materiales y Métodos
función de correlación; la corresponde al valor de r en la intersección de la regresión
lineal del triángulo de autocorrelación (RLTA) con la ordenada correspondiente al
primer mímimo de la función de correlación; lc corresponde a Lγ − la y XcSAXS se calcula
como lc/Lγ .
γ(r)
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
Lγ
0.20
0.00
0.00
-0.20
la
50.00
r (Å)
100.00
150.00
200.00
250.00
-0.40
-0.60
Figura 5.4.
Función de correlación calculada a partir de un perfil de SAXS utilizando
el programa CORFUNC [149].
La forma concreta que se observa en la función de correlación evidencia tal y como se
muestra en la figura 5.5 distribuciones no homogéneas en el espaciado interlamelar, en
el espesor lamelar y también la existencia de interfases no perfectamente delimitadas.
Figura 5.5.
Distribución de densidad electrónica y función de correlación para un
sistema perfectamente ordenado (a). Efectos en la función de correlación
ocasionados por la variación de las distancias interlamelares (b), por la
variación del espesor lamelar (c) y por las interfases difusas (d).
95
III. Materiales y Métodos
La invariante (Q) corresponde al denominador de la función de correlación:
∞
Q = ∫ q 2 I (q)dq
(5.10)
0
De esta manera, es posible analizar la evolución de los parámetros morfológicos con el
tiempo en los procesos de cristalización tanto isotérmicos como no isotérmicos.
5.1.2. Difracción de rayos X a ángulos altos (WAXD).
Mediante difracción de rayos X a ángulos altos, es posible realizar un cálculo de la
fracción cristalina en peso, Xc, dividiendo la suma de las intensidades de las reflexiones
cristalinas Ic entre la intensidad total I
[160]
. La deconvolución de los perfiles obtenidos
se realizó con el programa PeakFit v4, ajustando tanto el halo amorfo como las
reflexiones cristalinas a curvas Gaussianas-Lorentzianas. De esta manera, puede
analizarse también la evolución de la cristalinidad con el tiempo.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos de SAXS y WAXD se pueden
combinar para verificar la asignación de la y lc. Así, el cociente entre X cWAXD y X cSAXS es
una estimación de la fracción de volumen ocupado por las lamelas, XS. Este cociente
debe tener valor inferior a la unidad puesto que la cristalinidad está sobrevalorada en los
experimentos de SAXS al existir fracciones amorfas entre las regiones cristalinas.
Cuando los parámetros la y lc se intercambian este cociente tiene un valor superior a la
unidad, lo cuál carece de sentido físico y es indicativo de una asignación errónea de
dichos parámetros.
5.2. Microscopia electrónica de transmisión.
En la ciencia de los polímeros, generalmente el término morfología se refiere a la
organización a un nivel superior al orden atomístico y el término estructura se refiere a
los detalles de la disposición atomística y molecular.
96
III. Materiales y Métodos
La microscopia electrónica de transmisión (TEM) permite tanto resolver estructuras a
nivel atomístico y molecular como efectuar un análisis a nivel morfológico. Su principal
limitación es el efecto destructivo que ejercen los electrones sobre los polímeros y las
muestras orgánicas en general. Aunque morfológicamente la muestra parece inalterada,
se manifiesta un deterioro de la estructura cristalina mediante la extinción progresiva del
diagrama de difracción. No sólo se destruyen las interacciones moleculares de tipo
secundario, sino también los propios enlaces covalentes. Por ello es conveniente
controlar rigurosamente la dosis de radiación y emplear sistemas de registro
extraordinariamente sensibles para obtener buenos diagramas de difracción de
electrones.
El carácter ondulatorio de los electrones es el responsable del fenómeno de difracción.
Cuando un haz electrónico coherente incide sobre una muestra, los electrones pueden no
desviarse de la trayectoria inicial o ser desviados elástica o inelásticamente
dependiendo, respectivamente, de que la interacción sea con el núcleo o con algún
orbital electrónico de alguno de los átomos que forman el material. Los electrones
desviados de forma inelástica experimentan un cambio en su velocidad como
consecuencia de la energía perdida en la colisión, mientras que los desviados
elásticamente mantienen su velocidad y son los responsables de los fenómenos de
difracción. Los electrones no desviados y los desviados elásticamente, son los únicos
que contribuyen de forma constructiva a la formación de la imagen. Los electrones
desviados inelásticamente son los responsables del ruido de fondo presente en toda
imagen de microscopia electrónica. La proporción de electrones dispersados
elásticamente se maximiza cuando su energía aumenta. Los experimentos de difracción
se realizan a un voltaje de 100 kV para tener una mayor resolución y los de análisis
morfológico a 80 kV para incrementar el contraste.
El microscopio electrónico de transmisión (figura 5.6) consta de un cañón electrónico
(fuente de electrones), un sistema de iluminación formado por dos lentes
condensadoras, un sistema de imagen con una lente objetivo, una difractora, una
intermedia y una proyectora, y un portamuestras.
97
III. Materiales y Métodos
Haz de electrones
Lentes condensadoras
Lente objetivo
Muestra
Lente difractora
Lente intermedia
Lente proyectora
Figura 5.6.
Esquema del microscopio electrónico de transmisión.
La fuente de electrones generalmente es un filamento de wolframio. En el cañón
electrónico los electrones son acelerados por la elevada diferencia de potencial a la que
son sometidos. Las lentes condensadoras determinan la intensidad y la talla del haz
electrónico. Estas lentes enfocan el haz hacia la muestra disponiéndolo en una dirección
casi perpendicular a la superficie de la misma. La muestra es atravesada por este haz
coherente y la imagen es ampliada por la lente objetivo para obtener una imagen I1. Esta
es posteriormente aumentada por la lente intermedia para formar una imagen I2, siendo
ésta aumentada de nuevo y proyectada en la pantalla por las lentes proyectoras.
La imagen final puede ser registrada en material fotográfico o bien mediante una
cámara digital. El diagrama de difracción de electrones correspondiente a la zona
iluminada, se obtiene al insertar una apertura en el plano donde se forma la primera
imagen y cambiar la configuración de las lentes.
98
III. Materiales y Métodos
La capacidad para formar una imagen es una ventaja importante de esta técnica frente a
la de difracción de rayos X. La imagen se obtiene con una resolución (d) que depende
de la longitud de onda del haz de electrones (λ) según la ecuación:
d=
λ
(5.11)
n·senθ
siendo n el índice de refracción y θ el ángulo de apertura de las lentes del microscopio.
La longitud de onda del haz de electrones depende del voltaje (V) según la fórmula
λ = (1.5 / V )1/ 2 . Así, para voltajes de 80 kV y 100 kV las longitudes de onda de los
electrones son 0.00418 nm y 0.00370 nm, respectivamente
[161]
. Se obtiene mayor
resolución con longitudes de onda más cortas, es decir, con diferencias de potencial más
elevadas y lentes de gran apertura. Generalmente, para una sustancia estable en un
microscopio operando correctamente, la resolución práctica viene determinada por la
aberración cromática causada por la presencia de electrones inelásticos. Dado que su
proporción aumenta de forma exponencial con la cantidad de materia con la que éstos
colisionan, el espesor de la muestra es decisivo para la obtención de buenas imágenes
5.2.1. Morfología cristalina.
Los niveles de organización supramolecular de un polímero cristalino se identifican con
dos tipos de morfologías: las lamelas y las esferulitas. Así pues, un fenómeno peculiar
en la organización molecular de los polímeros cristalinos es el plegamiento molecular
con la consiguiente formación de la estructura lamelar (figura 5.7). Las lamelas son
monocristales de espesor muy pequeño (< 25 nm) y dimensiones basales que pueden
llegar a ser de decenas de micrómetros. En estos cristales, la cadena molecular se
dispone más o menos perpendicularmente a las bases y se pliega sobre sí misma con una
cierta periodicidad que determina el grosor de los mismos.
99
III. Materiales y Métodos
Figura 5.7.
Modelo de la formación de lamelas cristalinas en polímeros con una única
dirección de puentes de hidrógeno que determina la dirección de
crecimiento preferente.
Monocristales de tamaño adecuado para su edtudio mediante microscopia electrónica se
pueden obtener por cristalización a partir de disoluciones diluidas. Existen diversos
métodos de cristalización, aunque en este trabajo se ha empleado únicamente la
cristalización isotérmica. Ésta se realiza a partir de disoluciones muy diluidas
alrededor de 1 mg de polímero en 1ml de disolvente. El polímero se solubiliza en un
disolvente a temperatura elevada y se deja cristalizar isotérmicamente en un baño a
temperatura inferior. Estos ensayos, se efectuaron a diversas temperaturas y
concentraciones, empleando los siguientes disolventes: 1,4-butanodiol, 2-metil-2,4pentanodiol, 1,6-hexanodiol y glicerina. El seguimiento del proceso de cristalización y
la selección de las preparaciones más idóneas se efectúa mediante microscopia óptica.
En el caso de haber empleado un disolvente no volátil, los cristales obtenidos se separan
por centrifugación y se lavan con un no-solvente volátil dejándolos en suspensión.
En general, los monocristales están constituidos por pequeñas lamelas de 50-100 Å de
grosor, que dan lugar a imágenes de bajo contraste. Las imágenes de TEM corresponden
a los electrones que atraviesan toda la muestra por lo que no dan información del relieve
de su superfície. Estos inconvenientes se solucionan sombreando las muestras con una
fina capa de un metal pesado (Cr, Pt, Pd, U, etc.). El metal es evaporado a alto vacío
(10-4 – 10-5 torr) sobre las rejillas a un ángulo de 15 º. Conociendo el ángulo de
sombreado y midiendo la longitud de las sombras resultantes se puede conocer el grosor
aproximado de las lamelas cristalinas (figura 5.8).
100
III. Materiales y Métodos
Figura 5.8.
Esquema del proceso de sombreado que se realiza para la observación de la
superficie y la determinación del grosor lamelar.
La decoración con polietileno permite determinar la dirección de plegamiento local de
las cadenas moleculares en las superficies de las lamelas y la sectorización asociada a
una orientación privilegiada de plegamientos en diferentes zonas de crecimiento. Esta
técnica fue desarrollada por Wittmann y Lotz en 1985
[162]
y, fundamentalmente,
consiste en depositar una sustancia de estructura cristalina conocida (polietileno) sobre
monocristales de polímero. El polietileno cristaliza epitaxialmente si la superficie del
cristal está ordenada. La observación detallada de los cristales poliméricos sugiere que
debe existir un cierto plegamiento regular, por ejemplo se acepta que éste debe ser
paralelo a la dirección de crecimiento del cristal
[163]
cuando se establecen puentes de
hidrógeno.
En la práctica se evaporan lentamente bajo vacío (10-4 – 10-5 torr) aproximadamente 2
mg de polietileno (Mw=20000, Mw/Mn=1.1) en un filamento de tungsteno. Durante este
proceso se produce la escisión parcial de las cadenas moleculares de polietileno que
cristalizan epitaxialmente en forma de pequeñas barritas alargadas sobre las lamelas del
polímero a decorar (figura 5.9). Todas las muestras son sombreadas con Pt/C después de
la decoración para su observación microscópica.
101
III. Materiales y Métodos
a)
Figura 5.9.
b)
Representación esquemática de la decoración de cristales con polietileno.
Disposición de las lamelas: parafina exenta de plegamiento, que da lugar a
una disposición al azar del polietileno (a) y polietileno con planos de
plegamiento (110,) que origina una decoración sectorizada (b)
La morfología de los cristales es un buen indicador, aunque no infalible, de la simetría
presente en la estructura cristalina. En general las celdillas tetragonales proporcionan
cristales de base cuadrada, las hexagonales y trigonales proporcionan cristales de forma
hexagonal y las rómbicas cristales en forma de rombo.
La esferulita consiste en un agregado esférico con un tamaño que puede oscilar entre
décimas de micrómetros y varios milímetros por lo que puede observarse claramente en
el microscopio óptico. Una morfología esferulítica se obtiene por cristalización del
polímero a partir del estado fundido o por la cristalización del polímero a partir de
disoluciones muy concentradas y evaporación lenta del disolvente. En el microscopio
óptico de luz polarizada son fácilmente reconocibles como círculos fuertemente
birrefringentes que exhiben una cruz de malta característica (figura 5.10a) debido al
diferente índice de refracción de la luz polarizada cuando atraviesa un cristal con
diferentes direcciones ópticas. Existen dos direcciones perpendiculares entre sí,
denominadas eje óptico mayor y menor, en las cuales el índice de refracción adquiere
valores máximo y mínimo respectivamente. El grado de birrefringencia depende de la
estructura molecular y es la suma de dos contribuciones, la correspondiente a la
polarizabilidad paralela a la cadena polimérica y la perpendicular a ella.
102
III. Materiales y Métodos
a)
Figura 5.10.
b)
Esferulitas observadas en el microscopio de luz polarizada: a)
caracterizada por la extinción en forma de cruz de malta y b) anillada.
La birrefringencia se observa intercalando la muestra entre el polarizador y el analizador
del microscopio. Si además se inserta un “first order red tint plate” (lámina de onda
roja de primer orden) entre la muestra y el analizador, puede determinarse el signo de la
birrefringencia. Observando si el radio de la esferulita corresponde al eje óptico mayor o
menor, se determina si se trata de esferulitas positivas o negativas, respectivamente. La
lámina de onda se orienta entre el polarizador y el analizador de forma que únicamente
la fracción roja del espectro de luz es rotada 90 º, por tanto, el fondo observado a través
del objetivo resulta de color rojo al ser ésta la única radiación que atraviesa el
analizador. Si la esferulita es positiva los cuadrantes paralelos al eje óptico de la lámina
de onda aparecen de color azul, mientras que los cuadrantes alternados resultan
amarillos (figura 5.11). En el caso contrario la esferulita es negativa. La mayoría de los
polímeros presenta una birrefringencia negativa al corresponder el eje óptico mayor con
la dirección de las cadenas moleculares y, por tanto, perpendicular al radio de las
esferulitas.
103
III. Materiales y Métodos
(a)
(b)
Bandas de extinción
Lámina de onda
Figura 5.11.
Determinación del signo de la esferulita empleando una lámina de onda: (a)
esferulita negativa y (b) esferulita positiva.
Las esferulitas están constituidas internamente por lamelas que irradian del centro. En
muchos casos las lamelas se retuercen sobre sí mismas, de forma que la orientación del
eje molecular gira alrededor del radio esferulítico (figura 5.12). Este fenómeno se refleja
en la esferulita como una serie de bandas de extinción concéntricas que muestran una
periodicidad dependiente de las condiciones en que ha cristalizado (figura 5.10b).
Dirección de
crecimiento radial
Dirección de
crecimiento radial
Centro de la
esferulita
Oscuro
Figura 5.12.
104
Brillante
Oscuro
Representación esquemática del retorcimiento lamelar y de las extinciones
observadas en el microscopio.
III. Materiales y Métodos
5.2.2. Difracción de electrones.
Los diagramas de difracción de electrones obtenidos a partir de monocristales
consisten en retículos puntuales que representan la proyección de la red cristalina sobre
el plano perpendicular al haz electrónico. Las manchas de difracción, se indexan como
hk0 suponiendo que la radiación electrónica es paralela al eje cristalográfico c, aunque
en ocasiones pueden observarse reflexiones hkl con l distinto de 0 debido a una
inclinación parcial de los cristales o bien a una disposición no ortogonal de la celdilla
unitaria.
El diagrama de difracción de una muestra refleja su organización estructural a escala
atómica y molecular. Para muestras amorfas consiste en un halo difuso que rodea a una
mancha central correspondiente a la radiación no desviada, mientras que para las
muestras cristalinas se observan diagramas con máximos y mínimos, cuya disposición
en el espacio viene determinada por el tipo de estructura presente. La información
extraída responde por una parte a la distribución espacial de las reflexiones, que viene
determinada por el tipo de estructura presente, y por otra parte a las intensidades, que
dependen de la organización de las moléculas en el interior de la celdilla cristalina.
Las posiciones de las reflexiones definen los espaciados de los planos cristalográficos,
aplicando la ley de Bragg. Dado que los ángulos θ con que son difractados los
electrones son muy pequeños (del orden de 1º) se puede admitir la igualdad entre
tag(2θ) y 2·senθ, que permite simplificar la ley de Bragg:
tg(2θhkl ) =
R
L
R·d hkl = λ ·L
2·dhkl ·sen θhkl = n·λ
donde R es el radio de la reflexión, dhkl es el espaciado interplanar, característico de la
reflexión, λ es la longitud de onda y L la longitud de cámara del microscopio (distancia
entre la muestra y la placa de registro). El producto λL se denomina constante de
cámara (figura 5.13).
105
III. Materiales y Métodos
Haz de electrones incidente
dhkl
Muestra
Placa fotográfica
Figura 5.13.
Geometría de la cámara de difracción del microscopio electrónico.
El análisis de la difracción de electrones requiere un calibrado previo del aparato para
poder correlacionar las manchas de difracción obtenidas en el diagrama con las
distancias reales de la red cristalina. Los valores de λ y L pueden variar de un registro a
otro debido a inestabilidades del circuito eléctrico, pequeños desajustes del alto voltaje
utilizado o de la corriente en las lentes objetivas y proyectoras. Por esta razón, se debe
determinar de forma precisa la constante de cámara para cada conjunto de lentes
utilizadas. El calibrado de la constante de cámara se realiza evaporando una fina capa de
un material policristalino sobre las rejillas con la muestra problema. Sustancias
cristalinas que presenten espaciados próximos a los del problema como (Au, Al, TlCl,
etc.) son adecuadas como patrones. En el campo de los polímeros se utiliza
normalmente oro (reflexiones características a 0.408, 0.235, 0.204, 0.144, 0.123, 0.118
y 0.102 nm) como sustancia patrón para calibrar la constante de cámara. Su evaporación
sobre las rejillas se realiza a partir de 1 cm de un filamento de 0.25 mm de diámetro
cuidadosamente enrollado alrededor de otro filamento, en este caso de tungsteno.
5.3. Microscopia electrónica de barrido.
El microscopio electrónico de barrido (SEM) forma la imagen con los electrones
secundarios que se generan en la interacción de la radiación electrónica con una capa
106
III. Materiales y Métodos
depositada en la superficie del material y de un reducido espesor, efectuándose un
proceso de rastreo.
El microscopio electrónico de barrido y el microscopio electrónico de transmisión
tienen ciertas características comunes tales como un cañón de electrones donde se
genera el haz, lentes condensadoras y objetivo, y un sistema de vacío. La diferencia
principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Mientras el
TEM permite el estudio de la morfología a partir de muestras delgadas, el SEM
posibilita conocer la morfología de la superfície de muestras gruesas, por ejemplo, en
nuestro caso de microesferas de polímero.
La preparación de las muestras consiste sencillamente en su metalización que, además
de hacer conductiva la superficie, permite eliminar la electricidad estática, minimizar el
daño por radiación y aumentar la reflectividad electrónica. Normalmente, el metal
utilizado suele ser oro en presencia de una atmósfera ionizante de argón. En la presente
tesis, se ha estudiado la morfología de microesferas de polímero y de placas de polímero
sometidas a diferentes condiciones de degradación tal y como se ha detallado en la
sección 4.9.
5.4. Estudio de oligómeros modelo.
5.4.1. Obtención de monocristales.
El crecimiento de un cristal en disolución debe ser lento para que las moléculas o iones
formen una disposición regular interna altamente ordenada que conducen a la obtención
de un monocristal con dimensiones adecuadas para su análisis por difracción de rayos
X. El estado de saturación de una disolución del compuesto promueve la formación de
algunos núcleos cristalinos que posteriormente llegarán a formar cristales de tamaños
mayores. Cuando se inicia la cristalización, el sistema evoluciona hacia un equilibrio
entre las partículas de la fase sólida y la fase líquida, lo suficientemente lento como para
que las moléculas puedan ordenarse en una red cristalina. El proceso depende de
factores tales como la solubilidad, la temperatura, la fuerza iónica, la nucleación y el
crecimiento del cristal. El posterior crecimiento depende de la naturaleza de las fuerzas
107
III. Materiales y Métodos
en la superficie del cristal, de la concentración de la muestra y del medio de
cristalización.
La cristalización de una sustancia conlleva la determinación de las condiciones óptimas.
Entre las diferentes técnicas utilizadas para la obtención de monocristales se destacan
las dos empleadas en este trabajo:
a) La evaporación lenta del disolvente es un método para la obtención de cristales de
alta calidad que puede aplicarse para moléculas orgánicas de reducidas dimensiones. La
velocidad de crecimiento se regula por el ajuste de condiciones (concentración inicial,
temperatura, velocidad de evaporación) tal que los cristales se obtienen en pocos días.
La velocidad de evaporación se ajusta cubriendo la solución con un vidrio de reloj. La
solución se deja en reposo evitando cualquier tipo de perturbación posible.
Experimentalmente, se disuelve el compuesto y el producto cristaliza al dejar evaporar
lentamente el disolvente.
b) El enfriamiento lento de una disolución saturada. La cristalización tiene lugar
cuando se produce una disminución en la solubilidad de la sustancia al disminuir la
temperatura. El tamaño de los cristales resultantes depende de la velocidad de
enfriamiento de la disolución. Así, un enfriamiento rápido producirá cristales pequeños,
mientras que un enfriamiento lento producirá cristales grandes.
Experimentalmente, se disuelve en caliente la muestra, se aísla el recipiente y se deja
enfriar lentamente.
Los cristales obtenidos deben ser analizados previamente en una lupa binocular de luz
polarizada. Los criterios para su selección son los siguientes:
• que posean una estructura interna uniforme y, por lo tanto, que no correspondan a
maclas cristalinas o diversos dominios cristalinos. Los cristales tampoco pueden estar
fracturados ni tensionados. En la realidad, sin embargo, los cristales son imperfectos ya
que están compuestos de pequeñas regiones algo desorientadas que dan lugar al término
denominado mosaicidad.
108
III. Materiales y Métodos
• que tengan un tamaño y una forma apropiados, siendo la dimensión lateral óptima del
orden de 0,2-0,4 mm. En todo caso el grosor óptimo debe situarse alrededor de 2/µ,
donde µ es el coeficiente de absorción lineal.
Una vez obtenido el monocristal y después de haber comprobado su calidad, se fija en el
extremo de un capilar por medio de un adhesivo amorfo para no interferir en la
difracción. El soporte consiste de una base de metal (pieza de latón) a la cual se pega
con cera al capilar (vidrio) (figura 5.14). El cristal, una vez montado, se coloca en la
cabeza goniométrica del difractómetro.
cristal
adhesivo
capilar
cera
pieza de latón
Figura 5.14.
El cristal se fija a la punta de un capilar.
5.4.2. Recogida de datos.
Los difractómetros utilizan una geometría ecuatorial en la que el haz difractado se mide
siempre en un plano horizontal definido por el haz incidente y la rotación del detector
alrededor de un eje que atraviesa el cristal. El detector sólo se mueve en este plano y
forma un ángulo de 2θ (entre 0-160º, dentro del rango del instrumento) con el haz
incidente. El goniostato más utilizado es el de geometría euleriana que da lugar al
difractómetro de cuatro círculos con tres rotaciones para el cristal (ω, χ y ϕ) y una para
el detector (2θ) (figura 5.15). Dependiendo de si χ es perpendicular o no a ω, el
goniómetro se denomina de geometría Euler o Kappa, respectivamente.
109
III. Materiales y Métodos
a)
b)
Figura 5.15.
Esquema del difractómetro CAD4 (a) y esquema de las rotaciones que
mueven el cristal (b)
El goniómetro gira y orienta el cristal de forma que cada familia de planos cumpla la
condición de difracción de Bragg. La cabeza goniométrica, que produce la rotación ϕ
(tipo spin) en el cristal, descansa sobre el bloque κ soportado por el bloque ω que a su
vez es colineal con 2θ. El centro del sistema (donde se coloca el cristal) y el detector
están en un plano perpendicular al eje ω/2θ. Para evitar la pérdida de intensidad por la
absorción del aire hay un túnel de helio en el camino del haz difractado.
La recogida de un espectro consta de las siguientes etapas:
1) Selección, montaje y centrado del cristal.
2) Determinación de la celda unidad. A partir de la rotación del ángulo ϕ y registrando
las difracciones sobre un film Polaroid® o buscándolas aleatoriamente en un rango de
θ, se encuentran 25 reflexiones a partir de las cuales se selecciona automáticamente una
celda compatible con el espacio recíproco estudiado. Se definen dos matrices: la matriz
de orientación, que relaciona las dimensiones de la celda y su orientación respecto al
sistema de coordenadas del difractómetro, y la matriz métrica recíproca que informa de
las dimensiones y simetría de la celda recíproca.
110
III. Materiales y Métodos
3) Estudio de la calidad del cristal a partir del diagrama ω/θ. Se determinan los
parámetros de recogida del espectro de difracción que dependen del tamaño,
dimensiones de la celda y calidad del cristal.
4) Recogida del espectro. La medida de las intensidades difractadas se realiza hasta un
valor máximo de 2θ, habiendo determinado previamente la zona del espacio recíproco a
investigar a partir de la celda hallada. Durante el proceso de recogida se mide
periódicamente la intensidad de tres reflexiones para controlar que el cristal no se ha
descentrado ni ha sido dañado por la radiación.
5) Reducción de datos. Con las intensidades obtenidas se procede al cálculo de los
factores de estructura observados, |F(hkl)|0. Se aplican las correcciones de Lorentz y
polarización y, si fuera necesario, las de absorción o decaimiento.
5.4.3. Resolución y refinamiento de la estructura. [164]
Los métodos estructurales de resolución se pueden dividir en dos tipos según la
estrategia que siguen para resolver el problema de la fase, así tenemos los métodos
directos e indirectos. Los métodos indirectos se basan en la localización de un átomo
pesado en la estructura sin tener un conocimiento previo de las fases. Por otro lado, los
métodos directos acceden directamente a las fases a partir de las intensidades de los
haces difractados, no siendo necesario tener información estructural previa. Éstos
métodos suponen la asignación de una fase probable a un cierto número de factores de
estructura y son óptimos en el caso de compuestos con átomos de número atómico
parecido, como es el caso de los compuestos orgánicos.
La base del desarrollo de los métodos directos estriba en las características de la función
de densidad electrónica: real, positiva y continua en toda la celda. Esta se localiza en
zonas aproximadamente esféricas conocidas como átomos que deben estar situados a
determinadas distancias y ángulos para formar moléculas químicamente razonables, lo
que restringe mucho las posibilidades. El problema estructural se plantea desde un
punto de vista más práctico admitiendo el principio de aditividad de la densidad
111
III. Materiales y Métodos
electrónica. El objetivo no es una descripción exhaustiva de la densidad electrónica,
ρ (x, y, z), sino la localización de sus máximos.
Como hay muchos más datos que parámetros, no todos los factores de estructura son
independientes por lo que deben existir relaciones de algún tipo en las que estén
implicadas sus amplitudes y fases. En primer lugar, la resolución por métodos directos
implica la formulación de relaciones de fases en las que participen varios factores de
estructura. Éstas deben ser independientes a la elección del origen. Las relaciones
expresan la probabilidad de que una fase tenga un determinado valor, calculado a partir
de los valores de la amplitud escogidos. Posteriormente, hay que fijar el origen de la
celda para eliminar la indeterminación de las fases a él ligadas, y así pasar de relaciones
de fases a conjuntos probables de fases. La elección del origen no es totalmente
arbitraria, intentándose que coincida con uno o más elementos de simetría presentes en
la celda.
Existen diferentes estrategias para abordar el problema de la asignación de las fases a
los factores de estructura. Los métodos de multisolución son los más utilizados en la
aplicación de los métodos directos, pues en ellos se basa el programa SHELXS-97
[1]
con el que se ha trabajado. El programa trata de obtener una solución estructural
múltiple, mediante varios conjuntos de fases, uno de los cuales debe corresponder a la
solución correcta.
Una vez resuelto el problema de fases, se dispone de un conjunto de parámetros que
especifican la situación de cada átomo dentro de la celda unidad. Como las fases
obtenidas en la resolución son aproximadas, dado que ésta se efectúa con un número
selecto de reflexiones, es necesario realizar un proceso de refinamiento de los valores
obtenidos. Los métodos de refinamiento son dos: series de Fourier sucesivas y mínimos
cuadrados. En el primero, se realiza una síntesis de Fourier con los |F(hkl)|0 a los que se
les asigna la fase que se deduce de los F(hkl)c, calculados a partir de las coordenadas de
que se dispone. En el segundo caso, se minimiza por mínimos cuadrados la diferencia
entre el factor de estructura observado y el calculado a partir de las coordenadas y los
coeficientes de agitación térmica que se disponen de la estructura. La función es del tipo
Rw = ∑ whkl [ F (hkl )0 − F (hkl )c ]2 en la que el coeficiente whkl expresa el peso que se
112
III. Materiales y Métodos
atribuye a F(hkl)0 y corresponde al inverso del cuadrado de la desviación estándar de su
correspondiente medida (whkl = 1/σ2hkl). De esta forma se da más importancia a las
reflexiones de menor desviación estándar.
Con el método de mínimos cuadrados, el programa SHELXL-97 ajusta los parámetros
(coordenadas, factores de escala, factores de ocupación, factores de temperatura) para
obtener una mejor concordancia entre los F(hkl) observados y los calculados que se
cuantifica mediante el índice de acuerdo, R. Este método permite calcular las
desviaciones estándar de los parámetros atómicos, que se emplean para determinar las
incertidumbres en las longitudes y ángulos de enlace. Todo proceso de afinamiento se
acompaña con una síntesis de diferencias, cuya finalidad es determinar la posición de
los átomos que no se afinan y de aquellos que no se han localizado (átomos de bajo
número atómico, como el hidrógeno).
6. ESTUDIO CINÉTICO DE POLIMERIZACIÓN Y CRISTALIZACIÓN.
6.1. Cinética de polimerización.
El estudio de la cinética de polimerización se puede realizar mediante calorimetría
diferencial de barrido utilizando dos metodologías de trabajo. Pueden emplearse
métodos dinámicos o bien isotérmicos. En el análisis dinámico se realizan barridos a
distintas velocidades de calentamiento o enfriamiento, mientras que en el análisis
isotérmico se realizan barridos a temperatura constante, estudiándose los cambios que
tienen lugar en función del tiempo de reacción. Para los experimentos isotérmicos, el
grado de conversión se calcula como:
t
∫ ( dH / dt ) dt = ∆H
α=
∫ ( dH / dt ) dt ∆H
0
∞
t
(6.1)
tot
0
donde ∆Ht es el calor liberado a tiempo t, obtenido a partir de la integral parcial de la
señal calorimétrica, y ∆Htot es el calor total de reacción.
De la misma manera, para procesos dinámicos, el grado de conversión se calcula como:
113
III. Materiales y Métodos
Tt
( dH / dT ) dT ∆H
∫
α=
=
∆H
d
H
/
d
T
d
T
(
)
∫
T0
T∞
T
(6.2)
tot
T0
donde ∆HT es el calor liberado a temperatura T, obtenido a partir de la integral parcial
de la señal calorimétrica, y ∆Htot es el valor medio del calor total de reacción calculado
a partir del calor de polimerización obtenido dinámicamente a diferentes velocidades.
La cinética de polimerización se ha estudiado mediante un análisis isoconversional que
permite determinar la energía de activación en función del grado de conversión. Este
método isoconversional se basa en la suposición de que a una conversión constante la
velocidad de reacción sólo es función de la temperatura [165-167].
Asumiendo que la variación de la constante de velocidad con la temperatura sigue la
ecuación de Arrhenius, la cinética de reacción se describe mediante la siguiente
ecuación:
dα
 E 
= k (T ) f (α ) = A exp  −
 f (α )
dt
 RT 
(6.3)
donde t es el tiempo, T es la temperatura absoluta, dα/dt es la velocidad de reacción que
depende de la temperatura y f(α) es la función diferencial de conversión. Los
parámetros de energía de activación y factor frecuencia de la ecuación de Arrhenius son
E y A, respectivamente.
6.1.1. Cinética de polimerización isotérmica.
Integrando la ecuación 6.3 en condiciones isotérmicas se obtiene la siguiente expresión:
 g (α )  E
ln t = ln 
+
 A  RT
(6.4)
donde la forma integrada del modelo de reacción, g(α), es la siguiente función del grado
de conversión:
114
III. Materiales y Métodos
g (α ) = ∫
α
0
dα
f (α )
(6.5)
El modelo de reacción viene dado por diferentes ecuaciones
[168, 169]
, tal y como se
recoge en la tabla 6.1, según sea el mecanismo de reacción. Para cada grado de
conversión, la ecuación 6.4 muestra una relación lineal entre el logaritmo del tiempo
necesario para alcanzar dicha conversión y la inversa de la temperatura. Así,
representando el ln t frente a 1/T para cada grado de conversión, se obtienen las líneas
isoconversionales a partir de las cuáles se determina la energía de activación, E, y la
constante ln[g(α)/A] a partir de la pendiente y de la ordenada en el origen,
respectivamente.
Tabla 6.1.
Expresiones algebraicas de f(α
α) y g(α
α) de los modelos cinéticos
considerados.
Símbolo
Modelo de reacción
f(α)
g(α)
A3/2
Nucleación y crecimiento.
Ecuación de Avrami (n=1.5)
Nucleación y crecimiento.
Ecuación de Avrami (n=2)
Nucleación y crecimiento.
Ecuación de Avrami (n=3)
Nucleación y crecimiento.
Ecuación de Avrami (n=4)
Difusión unidimensional
Difusión bidimensional
( ecuación de Valensi)
Difusión tridimensional
(ecuación de Jander)
Difusión tridimensional
(ecuación de Ginstling-Brounshtein)
Nucleación con un único núcleo en cada
partícula
2(1-α)[-ln(1-α)]1/3
[-ln(1-α)]2/3
2(1-α)[-ln(1-α)]1/2
[-ln(1-α)]1/2
3(1-α)[-ln(1-α)]2/3
[-ln(1-α)]1/3
4(1-α)[-ln(1-α)]3/4
[-ln(1-α)]1/4
1/2(1-α)-1
-ln(1-α)
α2
(1-α)ln(1-α) +
α
[1 - (1-α)1/3]2
A2
A3
A4
D1
D2
D3
D4
F1
n+m=2;
n=1.9
n+m=2;
n=1.5
n=2
n=3
Power
R2
R3
3/2(1-α)2/3[1 - (1-α)]-1/3
3/2(1-α)1/3[1 - (1-α)]-1/3
(1-α)
(α)0.1(1-α)1.9
(1-α)2
(1-α)3
2(α)1/2
2(1-α)1/2
[(1-α)α-1]0.9
(0.9)-1
[(1-α)α-1]0.5
(0.5)-1
-1 + (1-α)-1
2-1[-1 + (1-α)-2]
(α)1/2
1 - (1-α)1/2
3(1-α)2/3
1 - (1-α)1/3
(α)0.5(1-α)1.5
Segundo orden
Power law
Contracción del área
(simetría cilíndrica)
Contracción del volumen
(simetría esférica)
(1 – 2/3α) (1α)2/3
-ln(1-α)
115
III. Materiales y Métodos
6.1.2. Cinética de polimerización no isotérmica.
Integrando la ecuación de velocidad (ecuación 6.3) en condiciones no isotérmicas se
obtiene la siguiente expresión:
g (α ) = ∫
∞
0
dα
A T
 E
= ∫ exp − 
f (α ) β 0
 RT

 dT

(6.6)
donde β = dT / dt es la velocidad de calentamiento.
Existen numerosas relaciones que permiten determinar los parámetros de Arrhenius para
los experimentos dinámicos. Cada uno de ellos se basa en una forma aproximada de la
integral en función de la temperatura y de la reordenación e integración de la ecuación
6.6. Una de estas aproximaciones es la ecuación de Coats-Redfern [170]:
ln
 AR   2 RT  E
g (α )
= ln 
 1 − E  − RT
2
T
βE 

(6.7)
donde T es la temperatura experimental media.
Teniendo en cuenta la aproximación de Coats-Redfern, es decir, 2 RT / E << 1 , la
ecuación 6.7 se puede escribir de la siguiente manera:
ln
 AR  E
g (α )
= ln 
−
2
T
 β E  RT
(6.8)
Para un modelo cinético dado, la representación lineal de ln[g(α)/T2] frente a 1/T
permite determinar los parámetros E y A a partir de la pendiente y de la ordenada en el
origen, respectivamente.
Además, la ecuación 6.8 se puede reordenar obteniéndose:
116
III. Materiales y Métodos
ln
 AR  E
= ln 
−
T
 g (α ) E  RT
β
(6.9)
2
De esta manera, la representación lineal de ln(β/T2) frente a 1/T permite determinar E y
el parámetro cinético ln[AR/g(α)E] para cada grado de conversión.
La constante ln[AR/g(α)E] está directamente relacionada con R/E y con el valor de
ln[A/g(α)], que se deduce del ajuste isotérmico, (ecuación 6.4). Los métodos
isoconversionales permiten obtener la energía de activación en función del grado de
conversión. Esta dependencia se determina sin suponer el modelo de reacción (g(α)),
por lo que los resultados cinéticos obtenidos de los ajustes isotérmicos y no isotérmicos
han de concordar entre sí.
La ecuación 6.3 se puede reordenar, obteniéndose la relación isocinética que refleja la
existencia de un efecto compensatorio entre la energía de activación y el factor
frecuencia cuando el grado de conversión cambia:
ln Aα = aEα + b = Eα / RTiso + ln[(dα / dt )α / f (α )]
(6.10)
donde a y b son constantes y el sufijo α se refiere al grado de conversión.
La existencia de una relación isocinética implica que sólo existe un mecanismo de
reacción, mientras que hay múltiples mecanismos cuando no existe una relación lineal
entre ln Aα y Eα. La pendiente (a = 1/RTiso) y la ordenada en el origen (b = ln kiso) de la
relación lineal están relacionados con la temperatura isocinética (Tiso) y con la constante
isocinética (kiso), respectivamente. Se ha demostrado
[171]
que el modelo cinético
describe el proceso de reacción cuando el valor determinado para Tiso está dentro del
rango de temperaturas experimentales.
117
III. Materiales y Métodos
6.2. Cinética de cristalización.
La cristalización de un polímero puede llevarse a cabo, bien desde el estado fundido o
bien desde el estado amorfo que corresponden a la cristalización en caliente y en frío,
respectivamente. Este proceso da lugar de manera ideal a una estructura bifásica con
una disposición periódica de cristales e interfases amorfas. Además, puede hacerse de
forma isotérmica, es decir, con una temperatura de cristalización constante o bien de
forma no isotérmica. En este último caso, la temperatura del pico de cristalización varía
con una velocidad de calentamiento o de enfriamiento constante. El tratamiento de los
datos experimentales en cada uno de estos casos es distinto.
En condiciones isotérmicas, a partir de los resultados experimentales, puede
determinarse la evolución de la cristalinidad de una muestra con el tiempo. El avance de
la cristalinidad viene representado por χ(t). La cristalinidad total que se alcanza en unas
condiciones determinadas corresponde al valor de χ(t) = 1 y es proporcional a la energía
implicada en el proceso, es decir, a la integral de todo el pico de cristalización, ∆H∞.
Para un tiempo t, se tendrá una fracción de dicha cristalinidad total, χ(t), que se
corresponde con la integral parcial del pico en ese tiempo concreto, ∆Ht, y se calcula
como:
t
∫ ( dH / dt ) dt = ∆H
χ (t ) =
∫ ( dH / dt ) dt ∆H
0
∞
t
(6.12)
∞
0
En general, la representación gráfica de χ(t) en función del tiempo tiene forma
sigmoidal, tal como se muestra en la Figura 6.1.
χ(t)
100
0
t
Figura 6.1.
118
Curva típica del avance de la cristalinidad en función del tiempo.
III. Materiales y Métodos
De manera similar, para los procesos dinámicos el avance de la cristalinidad a cada
temperatura se determina a partir de la siguiente expresión:
Tt
( dH / dT ) dT ∆H
∫
=
χ (T ) =
∆H
H
T
T
d
/
d
d
(
)
∫
T0
T∞
T
(6.13)
∞
T0
Se puede tener una relación entre el grado de cristalinidad y el tiempo teniendo en
cuenta que el tiempo y la temperatura están relacionados mediante la velocidad:
(t − t 0 ) = (T0 − T ) φ = (T − T0 )
(6.14)
β
donde T0 es la temperatura a la que empieza la cristalización (t = t0) y φ y β son los
valores de las velocidades de enfriamiento y calentamiento, respectivamente.
1.1.
6.2.1. Cristalización isotérmica y regímenes de cristalización.
La cristalización desde el estado fundido por subenfriamiento, se describe
convenientemente mediante el modelo clásico de nucleación y posterior crecimiento
esferulítico. Es decir, la aparición inicial de núcleos cristalinos, de manera homogénea o
heterogénea, y después el crecimiento de las lamelas cristalinas. La nucleación
heterogénea es debida a las impurezas existentes en el polímero, ya sean residuos
existentes en el polímero que no han fundido por completo o agentes nucleantes. La
nucleación homogénea, también llamada “nucleación esporádica”, ocurre por medio de
fluctuaciones térmicas en el fundido que originan la formación y desaparición continua
de cristalitos. La nucleación homogénea tiene lugar de forma rápida a un alto grado de
subenfriamiento. Según las teorías de cristalización
[172,173]
, grupos de segmentos
moleculares pueden llegar a comportarse como núcleos primarios. El estudio de
cristalización isotérmica se ha llevado a cabo mediante calorimetría diferencial de
barrido (DSC) y microscopia óptica (OM).
119
III. Materiales y Métodos
Para el primer caso el análisis de la cinética de cristalización isotérmica se ha realizado
utilizando el modelo Avrami, el cual nos da información acerca de la variación del
contenido cristalino con el tiempo a una temperatura de cristalización constante [174-176]:
[
n
1 − χ (t ) = exp − Z (t − t 0 )
]
(6.15)
donde χ(t) es el grado de cristalinidad y n es el exponente de Avrami, que refleja el
modo de nucleación y el crecimiento. La ecuación de Avrami permite en primer lugar,
calcular la constante de velocidad normalizada, k = Z 1/ n , a partir del valor de la
constante Z y el exponente de Avrami n y, en segundo lugar, determinar el tipo de
nucleación existente y la geometría de crecimiento según el valor que adopte el
exponente, tal como se recoge en la Tabla 6.2.
Tabla 6.2.
Valores del exponente de Avrami según el tipo de nucleación y geometría
de crecimiento.
n
Tipo de nucleación
Geometría
1
Heterogénea
Varillas (1D)
2
Homogénea
Varillas (1D)
2
Heterogénea
Discos (2D)
3
Homogénea
Discos (2D)
3
Heterogénea
Esferulitas (3D)
4
Homogénea
Esferulitas (3D)
El estudio calorimétrico puede realizarse tanto para la cristalización en caliente (a partir
de una muestra fundida), como en frío (a partir de una muestra en estado vítreo).
Los resultados obtenidos mediante microscopia óptica con control de temperatura
permiten determinar la velocidad de crecimiento radial de la esferulita, G, a cada
temperatura de cristalización. A partir de estos datos, aplicando la ecuación de
120
III. Materiales y Métodos
Lauritzen-Hoffman
[172]
(Ecuación 6.16) se pueden determinar los regímenes cinéticos
de la cristalización, es decir, que tipo de proceso de cristalización se produce, así como
sus constantes de nucleación Kg asociadas a cada régimen.




*

G = dR / dt = G0 exp −U R (Tc − T∞ )  exp −Kg Tc ( ∆T ) f 




Factor de transporte
(6.16)
Factor de nucleación
donde G0 es el factor preexponencial que incluye a aquellos factores independientes de
la temperatura, R es la constante de los gases, Kg es el parámetro de nucleación, Tc es la
temperatura de cristalización, U* representa la energía de activación del transporte, T∞
es una temperatura hipotética por debajo de la cual cesaría cualquier flujo viscoso
( T∞ = Tg − C1 , donde C1 es una constante que generalmente toma valores de 30 K [177] y
51,6 K
[178]
y Tg es la temperatura de transición vítrea), ∆T es el grado de
subenfriamiento medido como Tm0 − Tc (donde Tm0 es la temperatura de fusión en el
equilibrio) y f es un factor de corrección empírico que tiene en cuenta la variación de la
entalpía de fusión con la temperatura f = 2Tc (Tc + Tm0 ) .
(
)
Kg se define mediante la siguiente expresión:
Kg =
nb0σσ eTm
∆H 0 k
(6.17)
donde σ y σe son las energías libres interfaciales lateral y basal respectivamente, n es un
parámetro cuyo valor depende del régimen de cristalización (4 para los regímenes I y III
y 2 para el régimen II), ∆H 0 es el calor de fusión, b0 es el espesor de la capa en
crecimiento y k es la constante de Boltzman.
La existencia de un máximo en la velocidad de cristalización se puede discutir en
términos de la ecuación 6.16, al existir un término referido a la energía de nucleación y
un término de transporte. A muy bajas temperaturas de cristalización, si bien la energía
necesaria para la nucleación es grande, el término de transporte es el predominante y la
velocidad de cristalización es pequeña. A medida que la temperatura aumenta, el
121
III. Materiales y Métodos
término de transporte va haciéndose menos importante, por lo que la velocidad de
cristalización aumenta hasta un valor máximo, pasado el cual, si sigue aumentando la
temperatura de cristalización el sistema va alcanzando las condiciones de equilibrio
termodinámico, por lo que se hace preponderante el término de energía de nucleación,
disminuyendo de nuevo la velocidad del proceso.
Reordenando la ecuación 6.16 y aplicando logaritmos se obtiene la siguiente expresión:
ln G + U * R·( Tc − T∞ )  = ln G0 −  K g Tc ·( ∆T )· f 
(6.18)
Al representar ln G + U * R·(Tc − T∞ ) frente 1 Tc ·(∆T )· f se puede observar que en
general no se obtiene una representación lineal con una única pendiente (Kg) sino que
pueden distinguirse zonas asociadas a regímenes de cristalización definidos por distintas
constantes de nucleación (figura 6.2). Las constantes de nucleación asociadas a los
regímenes I y III son el doble de la constante asociada al régimen II como se ha
mencionado anteriormente.
ln G + U*/R ·(Tc-T∞ )
Régimen III
K gIII = K gI = 2 K gII
Régimen II
Régimen I
1/Tc ·(∆T) ·f
Figura 6.2.
Regímenes de cristalización y relación entre las constantes asociadas.
La teoría de Lauritzen-Hoffman indica que la cristalización puede tener lugar bajo tres
diferentes regímenes (Figura 6.3), los cuales dependen de la temperatura de
cristalización:
122
III. Materiales y Métodos
Régimen I: A elevadas temperaturas, es decir, pequeños subenfriamientos, la
cristalización de una capa evoluciona completamente antes de que aparezca la
nucleación de la siguiente y, por lo tanto, la velocidad de crecimiento lateral es mucho
más rápida que la de crecimiento radial.
Régimen II: A subenfriamientos moderados, se forman varios núcleos en la capa en
crecimiento y permiten el crecimiento simultáneo de nuevas capas que se extienden
lentamente. La velocidad de crecimiento lateral es similar a la del crecimiento radial.
Régimen III: A temperaturas inferiores a las del régimen II, la separación entre los
núcleos alcanza su valor mínimo, produciéndose una nucleación múltiple sobre una
misma capa.
d)
a)
e)
RÉGIMEN I
b)
RÉGIMEN II
c)
RÉGIMEN III
Figura 6.3.
Representación esquemática de los regímenes de cristalización I (a, d), II
(b, e) y III (c).
La cristalización que tiene lugar en las distintas regiones se asocia a veces con el
desarrollo de distintas morfologías. De esta forma, el régimen I se asocia a axialitas, el
régimen II a esferulitas anilladas y el régimen II a esferulitas fibrilares.
Este análisis también se puede llevar a cabo mediante calorimetría utilizando la
constante de velocidad normalizada. Asumiendo un proceso de nucleación atérmica, es
123
III. Materiales y Métodos
decir, una cristalización en el cuál los núcleos primarios permanecen constantes con el
tiempo, la ecuación de Lauritzen-Hoffman se puede reformular sustituyendo la
velocidad de crecimiento radial por el inverso del tiempo requerido para la cristalización
del 50 %
[179-181]
, 25 %
[182]
o5%
[183]
. También se ha aceptado la utilización de la
constante cinética normalizada (k) [184-187]:
[
] [
k = k 0exp − U * / R(Tc − T∞ ) exp − K g / Tc (∆T ) f
]
(6.19)
La desviación de los resultados experimentales respecto al modelo de Avrami cuando el
grado de cristalinidad alcanza valores elevados ha llevado a plantear la posibilidad de
una cristalización en dos etapas: una cristalización primaria y una secundaria. Se han
propuesto varios modelos para incluir en el análisis la cristalización secundaria, uno de
los más aceptados es el modelo de Hiller [188], según el cual, la cristalización primaria
corresponde al crecimiento de las esferulitas, mientras que la secundaria tiene lugar en
el interior de éstas.
Debido a que el mecanismo de este fenómeno no está claro, se han desarrollado varias
aproximaciones. Verhoyen et al.
[189]
consideran que la cristalización secundaria ocurre
después de que termine la primaria, transcurriendo un tiempo entre ambas. Una
simplificación que puede por tanto hacerse, considera que la cristalización secundaria
empieza inmediatamente después que la primaria. El proceso primario se puede modelar
mediante una ecuación de Avrami ligeramente modificada:
n1
χ ( t ) = χ p ,∞ 1 − exp  − Z1 ( t − t0,1 ) 
{
}

(6.20)

donde χp,∞ es la cristalinidad fraccional al final de la cristalización primaria, y t0,1 el
tiempo en que ésta se inicia.
Para la cristalización secundaria, y considerando t0,2 como el tiempo en el que empieza
este proceso, la ecuación se modifica según la siguiente ecuación:
n2
χ ( t ) = χ p ,∞ + (1 − χ p ,∞ ) 1 − exp  − Z 2 ( t − t0,2 ) 
{
124

}

(6.21)
III. Materiales y Métodos
De esta manera, pueden hacerse dos análisis análogos al anterior, uno para la zona de
cristalización primaria y otro para la de la secundaria.
Cuando la cristalización isotérmica se estudia a temperaturas muy por encima de la
temperatura de transición vítrea los valores exactos de U* y T∞ no tienen una gran
influencia y pueden utilizarse valores standard. Así, los valores que comúnmente se
emplean son los propuestos por autores como Williams-Landel-Ferry (WLF)
[178]
(U*=
4120 cal·mol-1 y T∞ = Tg-51,6 K) o los estimados por Suzuki y Kovacs [177] (U*= 1500
cal·mol-1 y T∞ = Tg-30 K).
6.2.2. Cristalización no isotérmica.
1.2.
En la cristalización no isotérmica, es posible seguir nuevamente los procesos de
cristalización en frío y en caliente. Para ello se realizan experimentos con distintas
velocidades de calentamiento a partir de una muestra en un estado completamente vítreo,
es decir, por debajo de la temperatura de transición vítrea, o bien con distintas velocidades
de enfriamiento a partir de muestras fundidas. Para analizar el comportamiento noisotérmico se han aplicado los modelos descritos por Avrami, Ozawa y Cazé que se
detallan a continuación.
6.2.2.1. Modelos cinéticos para el análisis del comportamiento no isotérmico.
6.2.2.1.1. Modelo de Avrami.
En experimentos no isotérmicos obtenemos la evolución del grado de cristalinidad con
la temperatura a una velocidad de calentamiento o de enfriamiento constante. El hecho
de que este grado de cristalinidad también se pueda expresar en función del tiempo
(ecuación 6.14) permite que el modelo de Avrami descrito para experimentos
isotérmicos (sección 6.2.1) sea aplicable a este tipo de experimentos.
125
III. Materiales y Métodos
6.2.2.1.2. Modelos de Ozawa.
Ozawa
[190]
propuso una ecuación modificada en la que se considera el efecto de la
velocidad de enfriamiento:
1 − χ (T ) = exp ( − R(T ) / φ m )
(6.22)
donde R(T) es la llamada función de enfriamiento que sólo varía con la temperatura del
proceso y m es el exponente de Ozawa. Éste depende de la geometría cristalina y del
proceso de nucleación y tiene un significado físico similar al exponente de Avrami. Se
obtiene a partir de la representación lineal de log{− ln[1 − χ (T )]} frente a log φ .
Desafortunadamente, este método está limitado por las desviaciones significativas de la
linealidad que se producen debido al distinto grado de subenfriamiento que se da en la
muestra a diferentes velocidades de enfriamiento. Además se generan errores con la
superposición de los distintos procesos de cristalización, primario y secundario, cuando
los valores de cristalinidad a una temperatura dada corresponden a procesos primarios
para algunas velocidades de enfriamiento y a procesos secundarios para velocidades de
enfriamiento mas bajas.
De forma similar, se puede aplicar la ecuación anterior a los experimentos de
cristalización en frío, sustituyendo la velocidad de enfriamiento por la de calentamiento.
6.2.2.1.3. Modelo de Mo.
Mo et al.
[191]
han abordado recientemente el estudio no isotérmico, empleando una
nueva ecuación cinética, que combina las expresiones de Avrami y Ozawa:
log φ = log F (T ) − a log(t − t 0 )
(6.23)
donde F(T) es un parámetro relacionado con la velocidad de enfriamiento y a es la
relación entre los exponentes de Avrami y Ozawa (a = n m ) .
126
III. Materiales y Métodos
6.2.2.1.4. Modelo de Cazé.
Cazé et al. proponen otro método para determinar los exponentes de Ozawa
[192]
,
asumiendo que las exotermas de cristalización tienen forma gaussiana. El método
permite calcular una temperatura teórica del pico exotérmico, Tp’, y una nueva
constante, a’:
ln − ln 1 − χ (T )  = a′ (T − Tp′ )
{
}
(6.24)
La temperatura del pico de cristalización está relacionada con la velocidad de
enfriamiento según la siguiente ecuación:
Tp′ = ( m a′ )·ln φ − b′ a′
(6.25)
donde b’ es una nueva constante. La representación de Tp’ frente a (ln φ)/a’ es una línea
recta cuya pendiente corresponde al exponente de Ozawa, m.
Para la cristalización en frío se puede aplicar un tratamiento similar utilizando la
velocidad de calentamiento (β) en lugar de la velocidad de enfriamiento (φ), y teniendo
en cuenta las siguientes ecuaciones:
ln − ln 1 − χ (T )  = a′ (Tp′ − T )
{
}
Tp′ = ( m a′ ) ln β − b′ a′
(6.26)
(6.27)
La principal restricción de este método es el hecho de que únicamente se puede aplicar a
la cristalización primaria.
6.2.2.2. Determinación de la energía de activación.
6.2.2.2.1. Modelo de Kissinger.
127
III. Materiales y Métodos
El método de Kissinger permite evaluar la energía de activación para procesos de
cristalización en condiciones no isotérmicas. Teniendo en cuenta la variación de la
temperatura, Tp, con la velocidad de calentamiento, β, la energía de activación en un
proceso no isotérmico, de cristalización en frío, se puede evaluar según la expresión
[193]
:
d ln ( β Tp2 ) 
= −E R
d (1 Tp )
(6.28)
donde E es la energía de activación del proceso y R es la constante universal de los
gases.
El método de Kissinger se basa en que en el máximo del pico de cristalización, es decir
cuando (d 2α / dt 2 )Tp es igual a 0, existe una relación entre Tp y la velocidad de
calentamiento (β). Integrando y aplicando logaritmos a la ecuación 6.28, se obtiene la
siguiente expresión:
ln
β
T
2
p
=−
E
+A
RT p
(6.29)
donde A es una constante.
Por lo tanto, la representación gráfica del ln β T p2
(
)
en función de 1 T p para las
distintas temperaturas Tp, obtenidas a diversas velocidades de calentamiento, β , tiene un
comportamiento lineal cuya pendiente es (− E R ) . Así, este método conduce a la
determinación de la energía de activación E del proceso.
Algunos autores han intentado aplicar el modelo para los procesos de cristalización en
caliente, sustituyendo simplemente la velocidad de calentamiento (β), por la de
enfriamiento (φ). Recientemente se ha demostrado que el proceso no es válido ya que no
se puede sustituir una velocidad negativa por su valor modular en el cálculo del término
logarítmico
[194]
. Otra crítica que puede hacerse al modelo es que supone un valor
constante para la energía de activación.
128
III. Materiales y Métodos
6.2.2.2.2. Modelo de Ozawa.
El método de Ozawa, junto con el de Kissinger, es uno de los métodos más empleados
para calcular de la energía de activación. Está basado en la utilización de múltiples
velocidades de calentamiento o enfriamiento para la determinación de la temperatura
máxima de cada termograma, de manera similar al modelo de Kissinger.
La energía de activación, según el modelo de Ozawa
[195]
, se determina mediante la
ecuación:
d log ( β ) 
d (1 Tp )
=
−(0.4567 E )
R
(6.30)
Si integramos la ecuación anterior se obtiene la siguiente expresión:
log β = −
0.4567 E
+B
RTp
(6.31)
donde B es una constante.
En este método la energía de activación, E, se obtiene a partir de la representación
gráfica del log β en función de 1 T p , que tiene un comportamiento lineal cuya
pendiente es ( − E R ).
Por las mismas razones anteriormente expuestas, el modelo pierde su validez cuando se
aplica para la cristalización en caliente.
6.2.2.2.3. Modelo de Friedman.
Dadas las limitaciones de los métodos de Kissinger y Ozawa, los métodos
isoconversionales (avanzados
[196, 197]
y de Friedman
[198]
) son los más utilizados para
evaluar la energía de activación efectiva. Estos métodos se basan en el principio de que,
a un grado de conversión constante, la velocidad de cristalización sólo es función de la
129
III. Materiales y Métodos
temperatura. Así, las energías de activación se pueden evaluar a cada grado de
conversión que se indica con el correspondiente subíndice (Eχ).
El método isoconversional de Friedman considera que la variación de la energía de
activación con la cristalinidad para el proceso de cristalización no isotérmico sigue la
siguiente ecuación:
 dχ ( T ) 
 − Eχ 

 = A 'exp 
 f  χ (T ) 
 RT 
 dt  χ
(6.32)
donde A’ es un factor preexponencial y f [χ (T )] es el modelo de cristalización.
En este método la energía de activación, Eχ, se obtiene a partir de la representación
gráfica del ln ( dχ (T ) dt ) en función de 1 T , que tiene un comportamiento lineal cuya
pendiente es ( − Eχ R ). El método asume que la energía de activación es únicamente
constante para un determinado grado de conversión y para la estrecha región de
temperatura asociada a esta conversión.
El método de Friedman se aplica a diferentes grados de cristalinidad, relacionando el
logaritmo de la velocidad de cristalización con la inversa de la temperatura para cada
grado de cristalinidad. Como en el método de Ozawa, se precisa conocer las
temperaturas, de cada barrido calorimétrico, para un porcentaje de cristalinidad dado. La
ventaja del método de Friedman, y aquí está la diferencia con respecto al modelo de
Ozawa, es que pueden obtenerse los valores de ln dχ (T ) dt  a diferentes temperaturas
y a diferentes conversiones para los diferentes experimentos no isotérmicos,
independientemente de que éstos se realicen con velocidades de enfriamiento o de
calentamiento. Es decir, el método de Friedman es adecuado para estimar la energía de
activación en procesos no isotérmicos de cristalización tanto en frío como en caliente.
6.2.2.2.4. Modelo de Vyazovkin.
Los parámetros de Lauritzen y Hoffman también se pueden determinar a partir de las
cristalizaciones
130
no
isotérmicas
utilizando
una
aproximación
isoconversional
III. Materiales y Métodos
desarrollada recientemente por Vyazovkin
[194]
. Se han realizado estudios de
cristalización desde el estado fundido para diferentes polímeros y éstos concuerdan
perfectamente con los realizados en condiciones isotérmicas
[199-203]
. Además, este
método también resulta útil para la cristalización desde el estado vítreo [204].
Esta metodología considera que la dependencia de la velocidad con la temperatura no
tiene un comportamiento de Arrhenius ya que la ecuación de Lauritzen-Hoffman
(ecuación 6.16) tiene dos funciones exponenciales implicadas
Vyazovkin y Sbirrazzuoli
[200]
[205]
. Por esta razón,
utilizan la ecuación clásica para deducir la dependencia
de energía de activación efectiva de la cristalización con la temperatura:
E (T ) = − Rd ln G / dT −1 = U *[T 2 /(T − T∞ )2 ] + K g R[(2∆T − Tm f ) /(∆T ) 2 f ] (6.33)
Se puede obtener una expresión similar para la energía de activación efectiva de la
cristalización teniendo en cuenta la equivalencia entre los derivados logarítmicos de la
velocidad
del
crecimiento
cristalización (dχ / dt )
[206, 207]
microscópico
(G)
y de
la
velocidad
total
de
:
d ln(dχ / dt ) / dT = d ln G / dT
(6.34)
que, tras alguna transformación conduce a:
− R·d ln G / dT −1 = − R·d ln(dχ / dt ) / dT −1 = E (T )
(6.35)
La energía de activación esta determinada por los parámetros que representan la barrera
de energía del transporte (U*) y de la nucleación (Kg). Además, la contribución relativa
de estos dos procesos depende de la temperatura. La energía efectiva resultante es
negativa y aumenta con la extensión de la cristalización desde el estado fundido en la
región controlada por la velocidad de nucleación, mientras que es positiva y disminuye
con la extensión de la reacción de la cristalización desde el estado amorfo en la región
controlada por el transporte.
131
III. Materiales y Métodos
6.2.3. Picos múltiples de fusión en polímeros.
6.2.3.1. Teoría del doble pico de fusión.
Los polímeros semicristalinos presentan frecuentemente termogramas con múltiples
picos de fusión, cuyas magnitudes y temperaturas dependen de las condiciones de
cristalización.
Este
comportamiento
queda
reflejado
en
los
termogramas
correspondientes a la fusión de las muestras después de ser cristalizadas.
El fenómeno de múltiples endotermas en polímeros se ha atribuido a diferentes causas
como son el polimorfismo, diferencias en tamaño cristalino y distribución de tamaños o
a la existencias de procesos de fusión y recristalización con posterior fusión.
Rim y Runt
[208]
proponen un mecanismo en el que se supone que durante el
calentamiento de la muestra en el calorímetro se produce un proceso de reorganización
que implica fusión, recristalización de los cristales originales y fusión del material
anteriormente recristalizado.
En la Figura 6.4 se representa de manera esquemática este mecanismo; en la parte
superior se muestra la fusión de los cristales originales (M), la recristalización de los
mismos (C) y la fusión del material recristalizado (Mr), según distintas velocidades de
calentamiento: lenta, intermedia y rápida; en la parte inferior se muestran los
termogramas correspondientes que se observarían experimentalmente.
132
III. Materiales y Métodos
VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO:
Mr
M
RÁPIDA
INTERMEDIA
LENTA
M
Mr
No hay
reorganización
C
C
Tmc
Tmb
Tma
M: Fusión de los cristales originales
Figura 6.4.
Mr: fusión del material recristalizado
Tma > Tmb >Tmc
C: cristalización
Representación esquemática del mecanismo de fusión múltiple de Rim y
Runt.
Para una velocidad de calentamiento lenta, los cristalitos originales disponen de tiempo
suficiente para reorganizarse, por lo que en la fusión global existirá una aportación
importante de los procesos de recristalización y fusión del material recristalizado. El
termograma correspondiente, será, por lo tanto, la suma de las contribuciones
correspondientes a la endoterma de fusión de los cristales originales (M), la exoterma de
recristalización (C) y la endoterma de fusión del material recristalizado (Mr),
observándose dos picos de fusión bien diferenciados. A medida que aumenta la
velocidad de calentamiento, los cristales disponen cada vez de menos tiempo para
reorganizarse, por lo que la exoterma de recristalización y la posterior endoterma de
fusión decrecen en magnitud, siendo por tanto también menor su contribución. Como
consecuencia, la resolución de los picos en el termograma es cada vez menos acusada,
llegando incluso a observarse un único pico de fusión cuando la velocidad de
calentamiento es rápida.
6.2.3.2. Temperatura de fusión en el equilibrio.
Un parámetro importante que interviene en los cálculos cinéticos es la temperatura de
fusión en el equilibrio, Tm0 , que se define como la temperatura de fusión que tendría un
133
III. Materiales y Métodos
cristal de tamaño infinito y que además coincidiría con la temperatura de cristalización
de dicho cristal. Un método desarrollado para obtener Tm0 se basa en el hecho de que el
equilibrio termodinámico es totalmente reversible, por lo tanto, los procesos inversos de
cristalización y de fusión deben poderse realizar en el punto de equilibrio en el que
Tm = Tc = Tm0 siendo Tc , la temperatura de cristalización y Tm la temperatura de fusión
experimental. La relación entre Tm , Tc y Tm0 viene dada por la ecuación de HoffmanWeeks [209]:
Tm = Tm0 − ϕ ·(Tm0 − Tc )
(6.36)
donde ϕ es el parámetro de estabilidad, también llamado parámetro morfológico, que
depende del espesor y de las energías superficiales de los cristalitos. Si se cristalizan
muestras del polímero a diferentes temperaturas de cristalización, Tc , y se determina la
temperatura de fusión de cada una ellas, Tm , se puede obtener el valor de Tm0 , tal y como
se puede observar en la Figura 6.5. Concretamente la representación gráfica de Tm
frente a Tc permite determinar la temperatura de equilibrio que corresponde al punto en
el cual esta representación corta a la línea de reversibilidad perfecta (Tm = Tc ) .
250
Tm (ºC)
200
Tm0
150
Tc = Tm
100
100
150
200
250
Tc (ºC)
Figura 6.5.
134
Representación de Hoffman-Weeks.
III. Materiales y Métodos
El término ϕ es un parámetro característico de la estabilidad del cristal que puede
adoptar valores comprendidos entre 0 y 1. El valor cero supondría que supondría Tm0 =
Tm , mientras que el valor unidad implicaría que Tm = Tc . Los cristales serán más
estables si el valor de ϕ es próximo a 0.
El punto de corte en el diagrama de Hoffman-Weeks cumple tanto el comportamiento
experimental como el requisito de igualdad entre Tm y Tc , pudiéndose entender como
la verdadera temperatura de fusión reversible para el polímero.
7. SISTEMAS DE LIBERACIÓN CONTROLADA DE FÁRMACOS.
La liberación controlada de fármacos emplea dispositivos de encapsulamiento capaces
de liberar dichos fármacos a velocidad controlada durante largos periodos de tiempo,
que pueden comprender desde días hasta meses. Tales sistemas ofrecen numerosas
ventajas respecto a los métodos tradicionales de suministro de fármacos. Entre ellas
destacan las siguientes: la posibilidad de mantener una concentración sistémica de
fármaco adecuada y constante, evitando los picos de inefectividad y toxicidad típicos de
los métodos convencionales; la protección de fármacos susceptibles a algún tipo de
degradación y el incremento en la calidad de vida del paciente que implica el hecho de
prescindir de una administración periódica, así como la disminución de la intensidad de
los posibles efectos secundarios.
Las microesferas poliméricas son vehículos para numerosas aplicaciones de liberación
controlada, debido a su capacidad para encapsular una gran variedad de fármacos, a su
biocompatibilidad, elevada disponibilidad y características de liberación sostenida a
largo plazo.
7.1. Síntesis y caracterización de microesferas.
Existen diferentes métodos empleados en la preparación de microesferas poliméricas.
Entre ellos se encuentran los métodos de polimerización interfacial
[212]
, emulsión
[213]
, dispersión
[214]
[210, 211]
, suspensión
, el método de emulsión-extracción/evaporación de
135
III. Materiales y Métodos
solvente [215-217], la extrusión de polímero [218], el “spray drying”
o precipitación
[220]
[219]
y la coacervación
. Estos métodos difieren en el tipo de material que puede ser
utilizado y el tipo de fármacos que pueden ser encapsulados eficientemente.
En el presente trabajo las microesferas se han preparado mediante el método de
emulsión-extracción/evaporación de solvente. Éste es uno de los procedimientos más
empleados en la preparación de microesferas a partir de polímeros ya sintetizados dada
su facilidad de aplicación y su compatibilidad con gran cantidad de polímeros comunes.
No obstante, cabe decir que aunque el proceso es conceptualmente simple, muchas
variables pueden influir en el producto final, tanto en las propiedades físico-químicas,
como en el comportamiento en la liberación del fármaco. La eficiencia de
encapsulación, el estado físico del fármaco y el polímero en el sistema, el tamaño y la
morfología (forma, porosidad y textura) de las partículas son características físicoquímicas. El estado físico [221], el tamaño [222] y la morfología [223] influyen a su vez en la
cinética de liberación.
Las variables que suelen considerarse son: la velocidad de agitación en la
emulsificación
[224]
, el tipo y concentración de tensioactivo
volúmenes entre las fases dispersa y continua
fase dispersa
[227]
[226]
, la relación de
, la concentración del polímero en la
, el peso molecular del polímero
temperatura en las que el solvente es evaporado
[225]
[228]
[229]
, las condiciones de presión y
y la naturaleza química tanto del
polímero como del fármaco, dado que éstas determinan las interacciones del sistema
[230,231]
.
El método consiste en emulsionar una disolución, que contiene el polímero y el
fármaco, en una fase no-solvente, llamada fase continua, que contiene una pequeña
cantidad de estabilizador. Los disolventes más comúnmente empleados en la
preparación de microesferas son el diclorometano y el acetato de etilo con una fase
acuosa continua, que contiene un estabilizador, habitualmente alcohol polivinílico
(PVA). En la emulsión, el solvente es extraído por la fase continua, de manera que ésta
puede penetrar en las gotas ricas en polímero mientras se produce la evaporación del
disolvente. Como consecuencia, la fase dispersada se enriquece progresivamente en
polímero hasta que las gotas “se endurecen” para transformarse en partículas, ocluyendo
136
III. Materiales y Métodos
el fármaco en su interior. Finalmente las microesferas se recogen mediante filtración o
centrifugación, se lavan y se dejan secar.
En este trabajo se prepararon microesferas a partir de los poliesteres Poli[4Hb-alt-Glc] y
Poli[Glc-alt-6HH], empleando diclorometano como solvente (50 mg·ml-1) y una
disolución acuosa al 0.8 % (w/v) de PVA y 1 % (w/v) de cloruro sódico, como fase
continua. La emulsión se consiguió mediante agitación mecánica aproximadamente a
1300 rpm. Las microesferas se recogieron por filtración y se lavaron con agua.
La caracterización de las microesferas constituidas por un determinado sistema
polímero-fármaco comprende el análisis morfológico mediante microscopia electrónica
de barrido, el cálculo de tres parámetros básicos, que son la eficiencia de encapsulación
(EE), el rendimiento de la preparación (R) y la carga farmacológica (% de fármaco en
las microesferas) y el estudio de la liberación del fármaco. Dichos parámetros se definen
mediante las siguientes expresiones:
EE =
R=
mf
m f0
× 100
mmsf
m f0 + m p0
% fármaco =
(7.1)
× 100
mf
mmsf
×100
(7.2)
(7.3)
donde m f es la masa de fármaco contenida en las microesferas obtenidas; m f0 es la
masa de fármaco añadida en la síntesis de microesferas; mmsf
es la masa de
microesferas obtenida y m p0 es la masa de polímero añadida en la síntesis de
microesferas.
En el presente trabajo se han sintetizado microesferas con triclosán. La cuantificación
de dicho fármaco se ha llevado a cabo mediante espectroscopia UV-visible. El
procedimiento experimental fue el siguiente: se pesaron exactamente 10 mg de
microesferas y se disolvieron en cloroformo en un matraz aforado de 25 ml. Las
medidas de absorbancia se realizaron a 281 nm determinando la cantidad de fármaco
presente en la muestra por interpolación en una recta de calibrado realizada en las
137
III. Materiales y Métodos
mismas condiciones y a partir de patrones de concentración conocida. Cada
determinación se realizó por triplicado.
7.2. Cinéticas de liberación.
En principio el perfil de liberación más deseable sería aquel que es constante con el
tiempo. Éste correspondería a una cinética de orden cero. No obstante, en la mayoría de
los casos el perfil de liberación es más complicado y presenta dos procesos principales.
En una primera fase se produce una liberación brusca del fármaco. En esta fase inicial,
conocida como “burst”, se libera el fármaco fácilmente accesible, que está adherido a la
superficie y en el interior de canales y poros. En una segunda fase se produce una
liberación más constante proveniente de la difusión del fármaco a través de la matriz
polimérica, de la degradación
[232,233]
de la misma o de una combinación de ambos
procesos. También se pueden obtener perfiles más complejos, aunque ajustables a
aplicaciones concretas [234].
Dado que la liberación del fármaco puede ser debida a difusión y degradación, para
elucidar el mecanismo por el cual tiene lugar se efectúan estudios de degradación del
sistema en cuestión. En el presente trabajo se realizaron ensayos de degradación
hidrolítica a 37 ºC en una solución Sörensen (0.1 M Na2HPO4/KH2PO4) a pH 7.42 con
un 0.03 % en peso de azida sódica para evitar la proliferación de microorganismos. Las
muestras se prepararon en viales, añadiendo 10 mg de microesferas de entre 45 y 80 µm
de diámetro y 20 ml de la solución. A determinados intervalos de tiempo las partículas
se recogieron por filtración y se dejaron secar al vacío. El seguimiento de la
degradación se realizó mediante medida del peso molecular promedio en peso y en
número por GPC. De este modo, puede comprobarse si el proceso de degradación
contribuye o no al mecanismo de liberación de fármaco de las matrices de ambos
polímeros.
Las cinéticas de liberación se obtuvieron mediante experimentos in vitro en un
incubador agitador a 37 ºC y 60 rpm. Los ensayos se realizaron en dos medios
simuladores fisiológicos distintos a un pH de 7.42: la solución Sörensen y un medio
celular (constituido por Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium con 7.5 % en peso de
hidrogenocarbonato
138
sódico
y
un
10
%
en
volumen
de
suero
bovino).
III. Materiales y Métodos
Experimentalmente, se pesaron 10 mg de microesferas de entre 45 y 80 µm de diámetro
en viales posteriormente rellenados con 20 ml de medio de liberación. El seguimiento se
realizó midiendo la concentración del fármaco en el medio, a intervalos de tiempo
adecuados, mediante HPLC con detector UV-visible. Cada medida se realizó por
duplicado y se obtuvo el valor por interpolación utilizando una recta de calibrado
realizada en las mismas condiciones y empleando patrones de concentración conocida.
El procedimiento experimental para la determinación de la concentración de fármaco en
el medio de liberación fue el siguiente: se tomaron alícuotas de 100 µl mediante una
jeringa con algodón en la punta de la aguja como filtro y se inyectaron 20 µl de muestra
en el sistema cromatográfico. La muestra se eluyó con la siguiente mezcla de
disolventes (% vol): acetonitrilo/agua/ácido acético (59/39/2) a un flujo de 0.8 ml·min-1
y tomando las medidas de absorbancia a 281 nm.
139