DOCTORADO EN CIENCIAS MENCIÓ MENCIÓN INGENIERÍ INGENIERÍA GENÉ GENÉTICA VEGETAL AISLAMIENTO DE UN cDNA DE PAPAYA CHILENA QUE MUESTRA UNA ALTA HOMOLOGÍA CON EXPANSINAS Carlos Gaete-Eastman, Cristian Balbontín, Raúl Herrera & M. Alejandra Moya-León Calidad de los frutos • Buen color • Buena textura • Sin daños • Sin infecciones • Buen aroma • Buen sabor Durante la maduración de los frutos se produce un descenso de la firmeza Intenso y/o rápido ablandamiento corta vida de almacenaje productos elaborados de calidad deficiente El factor mas importante que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la pared celular (Gray et al, 1992) ¿ Cómo es la pared celular de un fruto? La pared celular está compuesta por dos redes co-extensivas de polisacáridos (Buchanan et al, 2000) El factor mas importante que contribuye al ablandamiento lo constituyen las modificaciones en la estructura de la pared celular (Gray et al, 1992) ¿Cuáles cambios? • Solubilización y depolimerización de pectinas • Depolimerización de hemicelulosas • Pérdida de azúcares neutras ¿Cuáles enzimas? • poligalacturonasa • pectina metilesterasa • pectato liasa • endo (1-4) β-D-glucanasa • xiloglucano endo-transglicosidasa • expansina (Giovannoni, 2001) Expansinas •Son proteínas de entre 25-28 kD •Induce relajación de la pared celular no hidrolíticamente, permitiendo su extensibilidad y una expansión celular. (Cosgrove, 2000) • Existen 2 familias de expansinas (α y β), con una limitada homología de secuencia. • Se han identificado un grupo de expansinas asociadas a la maduración de diferentes frutos. frutos La papaya cultivada en Chile (Vasconcellea pubescens) con centro de origen en Colombia y Ecuador • 2n =18 • Antitusivo y cicatrizante • Agradable sabor y aroma • Alto contenido de vitaminas (A, B y C) • Antioxidantes • Gran cantidad de proteasas Determinación del descenso de firmeza de la papaya 6,5 6,0 Penetrómetro Firmeza (Kg) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 0 2 4 6 8 Tiempo (Días) 10 12 14 Determinación del descenso de firmeza de la papaya 6,5 6,0 Penetrómetro Metodología destructiva Firmeza (Kg) 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 Alta dispersión de los datos 3,0 0 Colaboración Dr Per Bro 2 4 6 8 Tiempo (Días) 10 12 14 Preguntas ¿Existen expansinas en Vasconcellea pubescens asociadas al proceso de maduración? Si es así, ¿son homólogas a las expansinas aisladas en otras especies? Métodos • Se colectaron las muestras de papaya durante Marzo del 2004, en huertos comerciales en la localidad de Lipimávida (VII Región). • Las muestras fueron almacenadas en una cámara a 20 °C. • A partir de frutas maduras, se extrajo RNA total según Chang et al., 1993 • Luego se sintetizó cDNA de doble cadena utilizando el kit SMART (BD Bioscience) • Se aisló la expansina de papaya mediante PCR, utilizando los siguientes partidores: EXPP–F EXPP-R 5’-ATG-GGI-GGI-GCN-TGY-GGN-TAY-G-3’ 5’-YTG-CCA-RTT-YTG-NCC-CCA-RTT-3’ • El fragmento amplificado fue aislado y purificado utilizando el sistema Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek), clonado mediante el sistema TOPO TA Cloning (Invitrogen) y finalmente secuenciado en un secuenciador ALFexpress II (Amersham). RNA Isolation Papaya sample Total RNA cDNA cDNA Synthesis Synthesis RTRT-PCR Sequenciation PCR product amplified using primers EXPPEXPP-F y R Resultados Como resultado de la secuenciación, obtuvimos un fragmento de 496 pb ATGGGGGGGGCCTGTGGTTACGGAAATCTGTACAGCCAAG GTTATGGGACAAACACTGCTGCACTAAGCACTGCTCTATTC AATAATGGGCTTGCTTGTGGAGCCTGTTTTGAAATTAAATG TGTGAATGATGGTAGGTGGTGTCTACCAGGATCTATCATGG TCACAGCAACAAATTTCTGCCCTCCAAACAATGCTCTTGCAA GCAATGCAGGAGGATGGTGTAACCCTCCTCTGCGTCATCTC GATCTCTCTCAGCCTGTTTTCCAGCACATAGCTCACTACAAA GCAGGAATCGTACCTGTCCAATACAGAAGGGTTAGTTGCAG GAAGAGTGCTGGGATTAGGTTCACCATAAACGGACACTCAT ACTTCAATCTKGTGCBAATAAGCAATGTTGGAGGAGCTGGC GATGTTGTGTCYGTATCCATCAAAGGTTYTAGGACTGGCTG GCAAGCCATGTYYCATAACTGGGGGTCAGAACTGGCAG Análisis BLASTn gi|29421117|dbj|AB104442.1| Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1 gi|14718274|gb|AF226701.1| Fragaria x ananassa exp 4 gi|16923360|gb|AF319473.1| Cucumis sativus exp 7 gi|16305104|gb|AF367459.1| Prunus persica exp 1 % E Ident. Value 84 9e-24 83 7e-17 83 3e-16 83 2e-14 Análisis BLASTx gi|29421118|dbj|BAC66694.1| Vitis labrusca x Vitis vinifera exp 1 gi|14718275|gb|AAK72875.1| Fragaria x ananassa exp 4 gi|17484121|gb|AAL40354.1| Prunus cerasus exp 5 gi|10180019|gb|AAG13983.1| Prunus avium exp 2 83 83 83 83 1e-80 1e-79 1e-79 1e-79 El resultado de la traducción de la secuencia obtenida arroja un ORF de 174 aas. ORF 1 A L Met G G A C G Y G N L Y S Q G Y G T N T A A L S T A L F N N G L A C G A C F E I K C V N D G R W C L P G S I Met V T A T N F C P P N N A LASNAGGWCNPPLRHLDLSQPVFQHIAHYKAGIVP VQYRRVSCRKSAGIRFTINGHSYFNXVXISNVGGA G D V V X V S I K G X R T G W Q A Met X H N W G S E L A E G X X P A HWG Resultado del análisis de motivos estructurales por MotifScan: prf: EXPANSIN_EG45 pos. 4 - 116 E-value = 2,1e-23 pfam: POLLEN_ALLERG_1 pos. 117 - 174 E-value= 2,8e-12 Se observa un alto grado de homología entre la secuencia de papaya y las presentes en otras especies. Se pueden identificar algunos de los residuos críticos para la función biológica propuesta. Se observan los dos dominios estructurales descritos para las expansinas. Se observa un alto grado de homología entre la secuencia de papaya y las presentes en otras especies. Se pueden identificar algunos de los residuos críticos para la función biológica propuesta. Se observan los dos dominios estructurales descritos para las expansinas. Análisis filogenético de genes de expansinas 79 C 55 100 A partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de 39 secuencias de expansinas. 93 100 70 72 B 85 93 77 51 70 74 D 67 65 Mediante Clustal V y PAUP v4.0, utilizando MP y análisis bootstrap (1000 rep.) 100 80 96 A 100 Conclusiones • Se aisló un fragmento de un cDNA con alta homología con expansinas. • El fragmento posee los dos dominios propuestos para las expansinas, con sus residuos aminoacídicos característicos. • El análisis filogenético sitúa a la expansina de papaya como miembro del subgrupo C, junto a otras α-expansinas asociadas a maduración . Perspectivas • Aislar y secuenciar el extremo 3’ de la expansina de papaya. • Analizar el patrón de expresión de la expansina de papaya. • Correlacionar dicho patrón con cambios en la composición de hemicelulosas durante el ablandamiento de la papaya. • Construir el modelo de la estructura tridimensional de la expansina de papaya (Colaboración Dr Danilo González) Dominio1 Dominio 2 ¿Parecidos? Bolsillo catalítico Residuos aromáticos Puentes disulfuro Hendidura Del CBD Agradecimientos Financiamiento: • Proyecto Fundación Andes C-13855/12. • Proyecto Mecesup TAL-105. • Centro Regional en Biotecnología Colaboradores: • Dr. Claudio Ramírez • Lic. Mario Moya • Lic. Carlos Figueroa • Lic. Rubén Almada Análisis fisiológico del proceso de maduración de la papaya Control Medición etileno 1-MCP Medición firmeza