Guía del Curso

Guía del Curso
Biología Molecular aplicada al
Diagnóstico
UCA 2009
1
Índice
Tecnología del ADN recombinante
3
¿Qué es clonar?
3
Pasos para llevar a cabo una clonación de un gen
3
Desarrollo
4
Otras enzimas utilizadas en tecnología recombinante
9
Vectores recombinantes
10
1- Identificación de ácidos nucleicos
13
Reacción en cadena de la polimerasa o PCR
13
Pasos de la PCR
14
Usos de la PCR
15
Secuenciación
20
Secuenciación manual
21
Secuenciación automática
21
Hibridación
21
Marcado de Sondas
22
Tipos de hibribación
22
2
Parte I
1- Tecnología del ADN recombinante
¿Qué es clonar?
-Utilizar tecnología de ADN especializada o “tecnología recombinante” para
producir múltiples copias exactas de un gen u otro segmento de ADN.
-ADN cromosomal eucariótico o procariótico que se inserta en diferentes
células huésped utilizando su maquinaria de replicación.
Objetivo: obtener suficiente material a estudiar.
ADN: material genético de la célula que consiste en un polímero de
nucleótidos
conectados
a
través
de
un
esqueleto
del
azúcar
fosfatodesoxirribosa.
Gen: Unidad de herencia formado por un segmento de ADN que contiene la
información necesaria para la síntesis de una proteína.
Pasos para llevar a cabo una clonación de un gen:
1- Extracción del ADN genómico total o del ADN plasmídico.
2- Recuperación del fragmento de interés a partir de ADN genómico.
3- Digestión (corte) del ADN doble cadena (ADNdc).
4- Digestión y desfosforilación del vector de clonado o expresión.
5- Ligación de los ADNdc.
6- Inserción de los productos ligados en la célula.
7- Selección de colonia conteniendo el clon buscado.
3
Desarrollo
1- La extracción del ADN genómico total permite la adquisición de todo
ADN dentro de la célula, ya sea cromosómico como extracromosómico (por
ej.: plasmídico). Es importante trabajar con todo el ADN si no se sabe
donde se localiza el fragmento de interés.
La extracción del ADN plasmídico se utiliza para obtener solamente los
plásmidos que contiene una célula. Este protocolo se utiliza para obtener
grandes cantidades del vector seleccionado para la clonación.
2- Existen diferentes métodos para la recuperación del fragmento de
interés. En la mayoría de las situaciones, no se conoce la localización, es por
ello que se debe trabajar con el ADN total.
Método clásico:
Este método es más largo e involucra varios pasos y técnicas diferentes. El
ADN total debe ser digerido (cortado) por una enzima de restricción
endonucleasa. Este enzima debe ser la misma que se utilizará para digerir
más adelante el vector (plásmido donde se insertará el fragmento).
Una vez digerido el ADN total, se migrará en un gel de agarosa, el cual al
ser revelado con bromuro de etidio y luz ultravioleta mostrará un
chorreado. Este chorreado es la causa de que las enzimas endonucleasas
poseen varios sitios de corte en un genoma completo.
Figura 1. Gel mostrando la restricción de ADN total
1
2
3
Calle 1: Marcado de peso molecular
Calle 2: ADN total sin digerir
Calle 3: ADN total digerido
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Nota: una endonucleasa puede cortar 1 vez en 4kb (tamaño de un vector);
los genomas tienen aproximadamente 4000kb, por ende puede haber
mínimamente 1000 sitios de corte.
Una vez digerido el ADN total, se debe ubicar la región del chorreado
donde está el gen. Para ello se llevará a cabo una hibridación mediante la
transferencia del ADN total digerido a una membrana de nitrocelulosa o
nylon. El ADN total digerido que se encontraba simple cadena fue
desnaturalizado (separación de las hebras) generando el ADN simple
cadena. Este ADN simple cadena será fijado en la membrana para que pueda
luego hibridarse con sondas radiactivas o no radiactivas (técnica de
Southern blot).
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El ADN marcado con sondas será detectado y permitirá saber el tamaño del
fragmento de interés. En un nuevo gel, se migrará una nueva muestra del
ADN total digerido. A la altura del tamaño del fragmento, ya conocido por la
hibridación, se cortará el gel y se eluirá el ADN del mismo.
Al final, se obtendrá un ADNdc que contiene el fragmento de interés puro
con los extremos ya listos para la inserción en un vector.
Método moderno:
La recuperación de un gen de interés mediante este método requiere
conocer la secuencia completa del mismo y/o sus regiones adyacentes.
En un primer lugar, se diseñarán primers (cebadores) que abarcan desde el
primer hasta el último nucleótido del gen (en el caso de estudiar o desear la
expresión de una proteína). Estos primers pueden llevar en su secuencia
adicionados en el extremo 5´ los sitios de restricción que reconocen las
endonucleasas. Se amplificará el fragmento de interés a partir del ADN
total mediante PCR utilizando los primers diseñados. La ADN polimerasa
utilizada para la reacción de PCR deberá ser de bajo error de replicación,
como la Pfu o la Pfx, a fin de evitar mutaciones en el fragmento estudiado.
Se purificará el producto de la amplificación y se digerirá con la enzima
seleccionada (endonucleasa que reconoce los sitios adicionados y que
corresponde a la misma enzima que se utilizará para digerir el vector).
Al final, se obtendrá un ADNdc que contiene el fragmento de interés puro
con los extremos ya listos para la inserción en un vector, en menor tiempo.
5- En este paso deberá elegirse que tipo de vector se va a utilizar. Si se
desea estudiar un fragmento de ADN que no implica la síntesis proteica, se
puede utilizar un vector de clonado. Si es necesaria la síntesis proteica,
deberá utilizarse un vector de expresión.
Los vectores de clonado son moléculas de ADN extracromosómicas que
permiten la replicación de un fragmento de ADN. Estos vectores poseen
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sitios de restricción dispersos a lo largo de su secuencia, marcadores de
selección (genes de resistencia a antibióticos, genes para la degradación de
nutrientes, etc) y un origen de replicación (oriV).
Los vectores de expresión poseen las mismas propiedades que los vectores
de clonado, pero los sitios de restricción están generalmente ubicados en
sitios de clonación múltiples (MCS o polilinkers) río abajo de una región
reguladora (promotor) inducible. Además del marcador de selección, pueden
contener otros genes que permiten realizar un screening previo (por
ejemplo, gen lacZ, el cual identifica a las colonias que contienen el
fragmento de interés clonado con color blanco de aquellas colonias que no lo
tienen, de color azul).
Si se desea trabajar con un gen clonado en un vector en diferentes
sistemas celulares, se deberá seleccionar un vector shuttle. Estos vectores
poseen la información necesaria para su replicación (origen) y para la
selección en diferentes tipos de células.
Una vez elegido el vector al cual se le insertará el fragmento de interés. Se
deberá extraer el ADN y digerirlo con la misma enzima de restricción que
se utilizó para digerir el ADN total (paso 2).
Antes de ligar los ADNs, el vector deberá ser defosforilado con la enzima
Fosfatasa Alcalina. Esta enzima elimina el grupo fosfato del extremo 5´ del
ADNdc. Este paso asegura que los extremos del vector no vuelvan a unirse
cuando se pongan en contacto con la ligasa, aumentando la recuperación de
la unión entre el vector con el fragmento de interés.
6- Una vez listos el ADN del vector y del inserto, se procederá a ligarlo con
la enzima ligasa. Esta enzima require que al menos uno de los extremos 5´
posea el grupo fosfato. Como el vector fue defosforilado, solamente es
posible la ligación vector-inserto o inserto-inserto. Como el vector posee la
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maquinaria de replicación y selección en la célula, será solamente
seleccionadas las bacterias que contengan la combinación vector-inserto.
7- Los productos de la ligación serán insertados en las bacterias mediante
el método de electroporación (método físico que involucra un pulso
eléctrico) o por método químico de transformación (células con la pared
debilitada). Solo algunas bacterias podrán adquirir las moléculas ligadas.
Para discriminar aquellas células que poseen dichas moléculas de las que no
las poseen, se utilizará medio sólido adicionados con el marcador que aporta
el vector (antibiótico o nutriente) durante el crecimiento.
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Otras enzimas utilizadas en tecnología recombinante:
Nucleasas
Endonucleasas Sitio específicas: son enzimas llamadas comúnmente “de
restricción”. Estas enzimas cortan uniones fosfodiester de generando
extremos romos o cohesivos. Como condición para llevar a cabo el corte del
ADN, estas enzimas requieres de una secuencia específica.
5´ cohesivo
3´ cohesivo
romo
Endonucleasas No Sitio específicas: Hay diferentes tipos de enzimas que
cortan en uniones fosfodiester al azar en ADN simple o doble cadena, en
ARN simple o doble cadena, así como
Exonucleasas Corta los ácidos nucleicos doble o simple cadena sólo por los
extremos, como por ejemplo, la actividad de proofreading durante la
replicación del ADN.
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Polimerasas: son las enzimas encargadas de la síntesis de ácidos nucleicos
mediante la adición de nucleótidos en sentido 5´´ 3´. Existen dos grupos:
las ADN polimerasas y las ARN polimerasas. Las ARN polimerasas son las
encargas de sintetizar el ARN mensajero. Requieren de un promotor y de un
factor transcripcional para iniciar la síntesis. Las ADN polimerasas son las
encargas de sintetizar el ADN durante la replicación. En este grupo se
encuentras las polimerasas termoestables, las cuales gracias a su capacidad
de tolerar altas temperaturas son utilizadas en la técnica de PCR.
Kinasas: son enzimas que adicionan grupos fosfato a los extremos 5´ del
ADNdc. Estas enzimas son utilizadas para el marcado radiactivo de sondas
para ser utilizadas en diferentes técnicas, como ser en la hibridación.
Metilasas: son enzimas que digieren todo ADN que posee las adeninas o los
citosinas metiladas. Este enzima se lo utiliza para separar el ADN sintético
de aquel extraído de una célula, ya que estas últimas protegen su ADN
mediante la metilación.
Vectores recombinantes
Un vector es un agente que puede insertar un fragmento de ADN dentro de
una célula huésped.
Los vectores se clasifican según la célula a la cual serán insertados:
Bacterianos: plásmidos, fagos, cósmicos, BAC.
Eucarióticos: plasmídicos, virales, integrativos, lineales, YAC.
Plásmidos (ver pág. 6-7)
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Permiten la inserción de hasta 12kb de un fragmento de ADN. Es el sistema
más común, el cual debe contener al menos un marcador de selección y un
origen de replicación (oriV).
Los plásmidos pueden ser de alto o bajo número de copias. El número de
copias es indicativo de la cantidad de moléculas que hay de cada plásmido en
una bacteria. Los vectores plasmídicos deben insertarse en una célula
bacteriana mediante la transformación química (menos efectivo) o la
electroporación (más efectivo pero más agresivo).
Fagos
Los fagos o bacteriófagos son virus que infectan células bacterianas.
Existen
dos
tipos
principales
de
fagos
utilizados
en
tecnología
recombinante, los filamentos o los de Tipo 1 (T1). A diferencia de los
plásmidos pueden adquirir hasta 23kb de un fragmento exógeno e insertarlo
en una bacteria, mediante el evento de transducción. Este evento le provee
a los fagos una mayor eficiencia en la inserción de material genómico en una
bacteria, con respecto a los plásmidos.
Al infectar el fago la bacteria, su material genómico podrá integrase al
genoma de huésped, aprovechando la capacidad lisogénica de los virus.
Cósmidos
Los cósmidos fueron sintetizados en el laboratorio aprovechando las
propiedades de los plásmidos y los fagos. Su propagación es similar a la de
un plásmido pero utilizan la transducción para la inserción del material
genético, ya que contienen la información necesaria para infectar la célula y
sintetizar su envoltura al igual que los fagos.
Los cósmidos permiten insertar hasta 45kb de un fragmento exógeno.
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BAC (bacterial artificial chromosome)
Los BAC son vectores sintéticos que simulan cromosomas bacterianos y
permiten introducir hasta 350kb de un ADN externo.
Celulas huésped
Existen diferentes tipos de células huésped para el estudio de ADN, ARN
y/o proteínas provenientes de diferentes sistemas, ya sean procarióticos o
eucarióticos.
Entre los sistemas procarióticos de referencia desarrollados se encuentran
E. coli o P. aeruginosa para bacterias gram negativas, o Bacillus subtilis,
S.aureus, Streptommyces para bacterias gram positivas. Estas células
huésped son utilizados generalmente para el estudio del material genético
de bacterias, virus o levaduras.
En el caso de los sistemas eucarióticos, las células utilizadas en tecnología
recombinante son Saccharomyces cereviseae y Pichia pastoris para
levaduras, o diferentes lineas célulares mamíferas. Aún cuando en muchos
casos se puede utilizar sistemas bacterianos, la célula huésped debe ser
aquella que posea una funcionalidad igual o similar al sistema original de
donde proviene el material genético a estudiar. Por otro lado, debe tenerse
en cuenta que existe varias diferencias en la síntesis de proteínas en
eucariotas y procariotas. La utilización de sistemas diferentes puede llevar
a una alteración en la interpretación ya que estas condiciones no equivalen
en las condiciones reales.
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PARTE II
1- Identificación de ácidos nucleicos
Existen diferentes métodos para la identificación de ácidos nucleicos. Entre
ellos, la técnica de PCR, la secuenciación automática y la hibridación son los
más comunes.
Reacción en cadena de la polimerasa o PCR
La PCR consiste en la amplificación de material genético (ADN o ARN) con
secuencias nucleotídicas únicas y presentes en cada especie
Permite caracterizar, analizar y sintetizar cualquier fragmento de ADN o
ARN.
Es una metodología rápida, barata y simple para producir grandes
cantidades de copias de un fragmento de ADN o ARN (aún cuando la
calidad y cantidad sean pobres).
Para realizar una PCR es necesario adicionar:
-ADN templado o molde: Este ADN puede ser total o plasmídico y debe
estar puro.
-dNTPs: desoxirribonucleótidos.
-Primers (2): Los primers son fragmentos de ADN simple cadena de
aproximadamente 25 nucleótidos de largo que se aparean específicamente
con el ADN templado.
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-ADN polimerasa termoestable: Las polimerasas son enzimas que sintetizan
el ADN utilizando un molde incorporando un dNTP a la vez, manteniendo la
complementariedad A:T y G:C. Existen diferentes tipos de enzimas según su
funcionalidad:
Las polimerasas con baja relación de error, que son ideales para amplificar
producto que luego serán clonados en un vector (Pfu o Pfx).
Las polimerasas con elevada robustez, que permite amplificar productos de
mayor longitud.
Las polimerasas de bajo costo, utilizadas generalmente para la detección de
fragmentos de ADN y estudios epidemiológicos (Taq).
-Mg2+: sal de cloruro o sulfato de magnesio. El catión Mg2+ es necesario para
la funcionalidad de la ADN polimerasa ya que actúa como co-factor de la
enzima.
Pasos de la PCR
Hay tres pasos básicos en la reacción de amplificación:
1- Desnaturalización del ADN templado por calor. Durante este paso, se
calientan las muestras a 94°C durante 5 min aproximadamente.
2- Apareamiento del ADN con los primers. Este paso, se realiza a una
temperatura de apareamiento que depende del largo y cantidad de G
y C del primer. Dichas propiedades son tenidas en cuenta durante el
diseño de cada primer. En general, deben utilizarse temperaturas
entre 50-65°C.
3- Elongación del ADN. Este paso se lleva a cabo a 72°C, que
corresponde a la actividad óptima de funcionamiento de la Taq
polimerasa.
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Para llevar a cabo la detección de los productos de la amplificación por PCR,
se debe migrar una alícuota de la reacción en un gel de agarosa con bromuro
de etidio y exponer a luz ultravioleta.
Usos de la PCR
•
Diagnóstico
•
Biología Molecular
•
Estudios Evolutivos de ADN ancestros
•
Sistemática Moderna
•
Estudios Ecológicos
•
Comportamiento Animal
•
Proyectos Genoma
•
Genética Forense
Hay muchos tipos de PCR y a medida que avanza la tecnología se van
renovando. Aún así, el principio sigue siendo el mismo.
Entre las PCR más comunes se encuentran las siguientes:
-Hot Star PCR: Esta PCR utiliza los mismos reactivos que la PCR Standard.
A diferencia de la PCR Standard, en la cual la polimerasa se adiciona al
preparar la mezcla de reactivos, en la PCR Hot Star la enzima se adiciona
luego, cuando la reacción ya se encuentra a 95C. Esta modificación permite
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aumentar la especificidad de la reacción, eliminando la cantidad de producto
no deseado y aumentando la cantidad de producto deseado.
-PCR Multiplex: Esta PCR se caracteriza por lograr la amplificación de
varios productos en una misma reacción. Para ello, se utilizan las condiciones
de la PCR Standard con la diferencia que en este caso se adicionan varios
pares de primers (hasta 5 pares), en vez de un solo para de primers. Este
tipo de PCR es ideal para el diagnóstico rápido ya que permite detectar
varios genes de interés a partir de una sola muestra. A su vez, tiene como
desventaja que la puesta a punto de la técnica es larga, e inclusive puede no
se lograda, ya que puede dar fácilmente falsos positivos. Estos falsos
positivos son causados por la alta variedad de combinaciones posibles que
proveen los primers.
-Nested PCR: Esta PCR consiste en la utilización de dos pares de primers
que serán adicionados secuencialmente. En un primer paso, se realizará una
PCR Standard durante los primeros ciclos. Luego, un segundo par de primers
será adicionado a la reacción. Este nuevo par de primers deberán ser
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“internos”, es decir que deberán aparearse en el ADN templado o molde
unos residuos más adentro del gen de interés. Esta PCR se lo utiliza
generalmente para incrementar la cantidad del producto de amplificación y
la especificidad de la reacción.
Primer par de primers
(externos)
Segundo par de primers
(externos)
-Touchdown PCR: Esta PCR utiliza las mismas condiciones que la PCR
Standard. En este caso la modificación ocurre en los ciclos utilizados. A
diferencia de llevar a cabo un paso de apareamiento a una misma
temperatura, en esta PCR se va reduciendo 1C en cada ciclo. Por ejemplo, si
la PCR posee una temperatura de 60C de apareamiento en el ciclo 1, la
misma será de 59C en el 2, 58 en el 3, 57 en el 4, y así sucesivamente. Esta
modificación le provee a la PCR una mayor especificidad.
-AFLP PCR (Amplified Fragment Length Polymorphisms-PCR): Esta PCR
requiere la utilización del ADN total, el cual será digerido con una enzima de
restricción. Una vez llevado a cabo este paso, se deben adicionar mediante
la ligación con la enzima Ligasa (ver Otras enzimas Parte I) unos fragmentos
de ADN doble cadena llamados adaptadores, que proveen la secuencia
nucleotídica que será reconocida por los primers utilizados en la reacción de
amplificación. De esta forma, se obtendrán fragmentos de diferentes
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tamaños, que le darán a cada organismo un patrón de bandas. Esta PCR se la
utiliza como aproximación para determinar la clonalidad de los organismos.
PCR inversa
Amplifica secuencias
desconocidas
Fragmento conocido
1° paso: digestión con
enzima de restricción
Los primers se dirigen
hacia afuera de la
región conocida
2° paso:
ligación
Fragmento conocido
3° paso: PCR
y luego
secuenciación
-PCR inversa: La PCR inversa utiliza los mismos reactivos y las mismas
condiciones que la PCR Standard. La única diferencia consiste en diseñar
primers que se direccionan hacia fuera del gen o fragmento de interés, para
lograr obtener las regiones adyacentes al mismo. Como paso previo para
esta técnica, se debe extraer el ADN total, digerirlo con una enzima de
restricción con varios sitios de corte y luego ligar al azar todo el ADN. Esta
ligación al azar generará fragmentos circulares de ADN que tendrán un
menor tamaño y podrán ser amplificados mediante una PCR. Esta PCR se
utiliza para conocer las regiones donde se localizan o que rodean al gen de
interés.
-RT-PCR: Esta PCR es la combinación de dos reacciones. La primera consiste
en obtener el ADN copia a partir de un ARN utilizando la ADN polimerasa
transcriptasa reversa. Para ello, se debe extraer el ARN total de la célula y
combinarlo con un primer específico o random junto con dNTPs y la enzima.
Una vez obtenido el ADN copia, se procede con la PCR en condiciones
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Standard. La sola presencia de un gen no es indicativo que exista la síntesis
de una proteína. Es necesario que haya una región reguladora que permita la
transcripción y una región de unión al ribosoma para lograr la síntesis
proteica. Esta técnica permite conocer si un gen se transcribe o no en la
célula. En el caso de combinarlo con un equipo para una PCR real time, se
puede inclusive cuantificar dicha transcripción. La RT-PCR tiene como
desventaja que el ARN debe estar muy puro y no arrastrar contaminación
con ADN, lo cual la vuelve laboriosa.
-RACE-PCR: Así como en la RT-PCR, esta PCR combina de la síntesis del
ADN copia a partir de un ARN utilizando la ADN polimerasa transcriptasa
reversa, seguida por la amplificación del producto por PCR. A diferencia de
la RT-PCR, la RACE adapta la técnica para lograr obtener los extremos de
los ARN mensajeros. En el caso del extremo 5´, una vez obtenido el ADN
copia se sintetiza una cola de poli A con la enzima terminal transferasa.
Luego se continúa con la PCR utilizando un primer complementario a la cola
poliA, formado por una secuencia poli T.
En el caso del extremo 3´, se sintetiza el ADN copia usando la cola de poli A
adicionada naturalmente en dicho extremo. Luego se combinan primers
específicos para la PCR Standard.
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-PCR de colonia: Esta PCR utiliza los mismos reactivos que la PCR Standard
a partir de una colonia. En este ensayo cada reacción corresponde a una
colonia. Éstas serán hervidas para extraer todo el ADN y expuestas a
condiciones Standard de PCR. La ventaja de esta técnica es una rápida
detección de un gen para diagnóstico a una gran variedad de colonias en
poco tiempo.
-Real time PCR: La técnica de real time posee el mismo principio de la PCR
pero con algunos reactivos diferentes y un equipo más avanzado. En primer
lugar, se debe utilizar primer con fluoróforos que emitirán una luz
fluorescente, la cual es detectada en la fase exponencial de la PCR. Esta
detección temprana permite ahorrar mucho tiempo y obtener el resultado
anticipadamente. A su vez, debido a que la emisión es proporcional a la
cantidad de producto, esta técnica es utilizada para la cuantificación de los
mismos.
Por otro lado, también se puede diferenciar los alelos de una célula ya que
cada uno de los productos posee una Tm diferente. Además del menor
tiempo de obtención de los resultados, esta técnica tiene la ventaja de que
puede ser adaptada para RT-PCR y Multiplex.
Secuenciación
Existen dos tipos de secuenciación.
-Manual
-Automatico
Ambos utilizan el método de Sanger.
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Secuenciación manual
La secuenciación manual consiste en sintetizar el ADN utilizando la T7
polimerasa y tres especies de nucleótidos: los deoxinucleótidos (dNTPs),
los dideoxinucleótidos (ddNTPs) y un dNTP marcado para la deteción. Los
dNTPs son los mismos que se utilizan para la amplificación en la técnica de
PCR, mientras que los ddNTPs son modificaciones de los dNTPs, ya que
carecen del grupo 5´ fosfato necesario para continuar la síntesis de ADN.
Al adicionarse al azar un ddNTP a la hebra de ADN sintentizada para la
reacción, permitiendo obtener fragmentos de diferentes largos. Cada uno
de los ddNTP (A, G, T o C) es adicionado en un tubo independiente para
identificar cual fue el último nucleótido agregado en cada fragmento. Por
último, la detección de los distintos fragmentos es lograda usando un dNTP
marcado radiactivamente.
Secuenciación automática
La secuenciación automática utiliza un equipo automatizado que permite en
una misma corrida ensayar los cuatro ddNTP utilizando fluoróforos. La
utilización de este tipo de secuenciación tiene las siguientes ventajas:
mayor resolución y secuenciación de hasta 96 muestras por corrida.
El resultado de la secuenciación se obtiene en tres formatos: archivos pdf,
archivos txt y archivos para ser utilizados con softwares específicos
(archivos abi). Los archivos abi contienen el cromatograma, el cual permite
evaluar la calidad de la secuenciación.
Hibridación
La hibridación es una técnica que permite detectar ácidos nucleicos
utilizando secuencias cortas de ADN marcado.
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Marcado de sondas
El marcado puede ser radiactivo o no radiactivo.
-Marcado radiactivo de sondas: se logra utilizando el radioisótopo 32P, el
cual se compra adicionado a un dATP (nucleótido de adenosina). Este
nucleótido de dATP conteniendo 32P es adicionado al extremo 5´ del
fragmento de ADN o sonda mediante la enzima T4 polinucleotido kinasa (ver
kinasas en Parte I).
Otra forma de marcar radiactivamente es adicionando el 32P de un dCTP.
Para ello se lleva a cabo la amplificación del ADN a ser utilizado como sonda
adicionando el dCTP-32P a la reacción Standard de PCR.
-Marcado no radiactivo de sondas: En este caso la marcación se logra
utilizando compuestos químicos o colorimétricos (digoxigenina o biotina), los
cuales fueron adicionados a un ddNTP. Este ddNTP es insertado al ADN
sonda usando la enzima Terminal Transferasa (ver polimerasas en Parte I).
Tipos de hibridación
Dot blot: Esta hibridación permite determinar la presencia o ausencia de un
fragmento de ADN o ARN de interés. Tiene como ventajas que es un
método rápido ya que no hace falta hacer una migración ni transferencia de
ADN.
Southern blot: Esta técnica consiste en hibridar sondas de ADN contra
ADN total o plasmídico digerido o sin digerir. Los pasos del Southern son:
extracción
del
ADN,
digestión
del
ADN,
migración
en
agarosa,
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transferencia a una membrana (nitrocelulosa o nylon), hibridación y
detección. A diferencia del dot blot, el Southern permite localizar tanto el
gen o fragmento de interés como el contexto en el cual se encuentra y la
cantidad de copias en el genoma.
Hibridación de Colonia: Esta metodología tiene la ventaja de ser más rápida
puesto que no involucra la extracción del ácido nucleico. Se utiliza
generalmente para la determinación de la frecuencia de eventos específicos
así como para realizar screenings.
Hibridación in situ (FISH): Esta técnica consiste en la detección de
cromosomas o porciones de ellos, con moléculas fluorescentes (marcado no
radiactivo). Es útil para identificar anomalías cromosómicas y elaborar
mapas génicos y genéticos.
Northern blot: Esta técnica es similar al Southern blot con la diferencia
que se hibridan sondas de ADN contra el ARN de un organismo,
particularmente ARN mensajero. Permite evaluar la transcripción de genes,
así como la cantidad de los mismos.
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