La brucelosis - Instituto de Investigaciones Biotecnológicas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE
GENERAL SAN MARTIN
Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas
“Factores de virulencia en Brucella abortus:
Caracterización del sistema VirB y su rol en la
colonización de la célula huesped”
“Desarrollo de un sistema de expresión de
proteínas recombinantes en Brucella abortus S-19”
AUTOR
Diego J. Comerci
DIRECTOR
Rodolfo A. Ugalde
Tesis para optar al Título de Doctor en Biología
Molecular y Biotecnología de la Universidad
Nacional de Gral. San Martín
2002
Publicaciones II
Parte de los resultados de esta tesis han sido publicados en los siguientes
artículos:
“Essential role of the VirB machinery in the maturation of the Brucella abortuscontaining vacuole”. 2001. Diego J. Comerci, María J. Martínez-Lorenzo, Rodrigo Sieira,
Jean-Pierre Gorvel and Rodolfo A. Ugalde. Cellular Microbiology. 3:159-168
“A homologue of an operon required for DNA transfer in Agrobacterium is required in
Brucella abortus for virulence and intracellular multiplication”. 2000. Rodrigo Sieira,
Diego J. Comerci, Daniel O. Sanchez and Rodolfo A. Ugalde. Journal of
Bacteriology.182:4849-4855
Vector development for the expression of foreign proteins in the vaccine strain Brucella
abortus S-19. 1998. Diego J. Comerci, Guido D. Pollevick, Ana M. Vigliocco, Alberto C. C.
Frasch and Rodolfo A. Ugalde. Infection and Immunity. 66:3862-3866
Resumen III
El análisis sistemático de secuencias genómicas al azar de Brucella abortus condujo a la
identificación del locus virB. El mismo está organizado como un operón conformado por 13
ORFs. El análisis de secuencia de los genes y los productos codificados indican que el operón
virB pertenece a la familia de los sistemas de secreción tipo-IV, maquinarias bacterianas
supramoleculares dedicadas a la secreción de proteínas y complejos nucleo-proteínas
involucradas en una gran variedad de procesos biológicos que implican interacción entre
células. El análisis mutacional de distintos componentes del sistema virB indica que el mismo
es esencial para el proceso de multiplicación intracelular de Brucella y el establecimiento de la
infección en animales, por lo tanto constituye uno los principales factores de virulencia del
patógeno. El estudio de los eventos celulares del proceso de colonización de la célula huesped
indica que el sistema VirB es necesario para la evasión de la vía endocítica degradativa y el
establecimiento del nicho de replicación intracelular en el retículo endoplásmico, sugiriendo
que probables moléculas efectoras secretadas por el mismo son las responsables de redirigir el
tráfico intracelular de la vacuola que contiene a la bacteria.
En la segunda parte se describe el desarrollo de vectores de expresión para Brucella y la
expresión de distintos antígenos recombinantes con el fin de explorar el diseño de una nueva
generación de cepas vacunales recombinantes.
A systematic gene discovery project of Brucella abortus led us to the identification of the virB
locus, a collinear arrangement of 13 ORFs organized as an operon. The sequence analysis of
the operon indicates that it belongs to the family of type-IV secretion system, bacterial
supramolecular complexes involved in several biological processes implicating cell-cell
interactions. Mutational analysis of different components encoded indicates that the virB
operon is essential for intracellular multiplication and virulence in mice, suggesting that this
system is a major determinant of B. abortus virulence. The analysis of the intracellular pathway
followed by different virB mutants indicates that a functional virB operon is essential to bypass
interactions with the endocytic pathway and to establish an intracellular replication niche in the
RER. This suggests that putative effector molecules secreted by the virB system are responsible
to modulate the biogenesis of the Brucella-containing vacuole.
The second part of this work describes the development of expression vectors for Brucella and
the expression of different recombinant antigens in order to explore the generation of novel
recombinant vaccine strains.
IV
INDICE
Introducción
La brucelosis
1
Patobiología de la brucelosis
2
El género Brucella
2
La biogénesis del fagolisosoma
3
Distintas estrategias para la subversión de la biogénesis del fagolisosoma
5
La internalización de Brucella en la célula huesped
8
Tráfico intracelular de Brucella
9
Los sistemas de secreción bacterianos
14
Los sistemas de secreción tipo IV
18
La búsqueda de factores de virulencia de Brucella
25
Aspectos inmunológicos de la brucelosis
29
Requerimientos de una vacuna ideal contra la brucelosis
31
Vacunas corrientes contra la brucelosis
32
Resultados - Parte I
Identificación de un fragmento genómico de B. abortus con alta similitud a sistemas de secreción tipo
IV
Análisis de secuencia del locus virB
35
36
Proteínas codificadas en el locus virB
37
Los genes virB constituyen un operón que se transcribe al comienzo de la fase estacionaria
42
Los genes virB son esenciales para la replicación intracelular
43
Efecto de distintas mutaciones en virB10 sobre la replicación intracelular
46
virB10 es esencial para la virulencia en ratón
48
Análisis del tráfico intracelular de las mutantes virB10
49
Las mutantes virB10 interaccionan con endosomas tempranos
50
La mutante polar virB10 es incapaz de evadir la vía endocítica y sufre un proceso degradativo
50
La mutante no-polar virB10 es incapaz de formar el nicho replicativo en el RE
55
La mutante no-polar virB10 es reciclada a la superficie celular
57
Resultados -Parte II
Diseño y construcción de vectores de expresión para Brucella abortus
61
Expresión de un gen reportero en pBEV
62
El antígeno recombinante es inmunogénico en ratones
63
Subtipos de inmunoglobulinas específicas contra el antígeno recombinante
64
Expresión de otros antígenos heterólogos en pBEV
66
Expresión de VP1 en pBEVσ32
68
Discusión -Parte I
El sistema virB de Brucella abortus
74
Discusión -Parte II
La expresión de antígenos recombinantes en Brucella abortus S-19
82
V
Conclusiones
Procedimientos experimentales
87
Cepas y plásmidos
89
Medios y condiciones de cultivo
90
Purificación de ADN genómico
90
Southern blots
90
Clonado de la región virB
91
Secuenciación del locus virB
91
Construcción de la mutante polar virB1
92
Generación de mutantes en virB10
93
Generación de fusiones transcripcionales en virB10
93
Generación de la doble mutante B. abortus virB1::Kan virB10::lacZ-Gm
94
Generación de la mutante B. abortus virB9::Gm
94
Generación de la mutante polar B. abortus ORF13::Kan
94
Deleción del gen virB11
95
Cultivo de células
95
Ensayos de infección en células
96
Ensayos de infección en ratones
97
Anticuerpos y sondas fluorescentes
97
Inmunofluorescencia analítica y cuantitativa
97
Construcción del vector de expresión pBEV
98
Shock osmótico de Brucella
99
Western blots
100
Inmunización de ratones y ensayos de protección
100
ELISA
101
Inoculación experimental de bovinos
102
Bibliografía
103
Introducción 1
La brucelosis
La brucelosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias pertenecientes al
género Brucella. La misma se transmite al hombre por contacto directo con animales infectados
o por consumo de productos contaminados derivados de animales. Esta característica hace que
la enfermedad sea una de las zoonosis más distribuidas en el mundo (Corbel, 1997). Los
diferentes nombres que ha recibido el mal en distintos lugares a lo largo de los siglos: fiebre
ondulante, fiebre de Malta, fiebre de Gibraltar, fiebre del Mediterráneo, fiebre Napolitana,
aborto infeccioso o enfermedad de Bang, dan cuenta de la amplia distribución del mismo en la
cuenca del mediterráneo y de la complejidad de su sintomatología.
La suceptibilidad a la infección de la mayoría de los mamíferos domésticos y salvajes
explica la prevalencia de la brucelosis en las principales áreas agrícolas del mundo. Por cierto
muy pocos son los países que han escapado a la enfermedad y los que parecen estar libres en
general son los que no han implementado acciones sistemáticas para su detección. Las áreas
más afectadas se encuentran en Europa (en particular los países de la cuenca mediterránea),
Medio Oriente, América y en menor medida Africa y el Lejano Oriente, siendo Oceanía el
único continente donde la enfermedad se presenta en las poblaciones animales en forma rara y
esporádica (WHO fact sheet N173, 1997).
Patobiología de la brucelosis
La característica principal de la enfermedad en los animales, aunque la sintomatología
varía según la especie, es la placentitis y el aborto en las hembras preñadas y la infección del
tracto genital en los machos que en general deriva en orquitis y esterilidad (Nicoletti,1989;
Corbel, 1997).
En humanos la infección se desarrolla en varios estadios. El período de incubación
transcurre entre dos a cuatro semanas posteriores a la entrada del germen y es seguido por un
período agudo que resulta de la diseminación septicémica de la bacteria, caracterizado por
fiebres altas o moderadas, estacionarias u ondulantes, con una duración que puede variar entre
dos a cuatro meses en ausencia de tratamiento activo. El período agudo puede estar
acompañado por la formación de un foco secundario de infección localizado en articulaciones,
ganglios abdominales, genitales y meninges. La brucelosis crónica puede presentarse
rápidamente o bien varios meses o años después de la infección, incluso puede ocurrir sin que
el período agudo se manifieste. Los síntomas de la fase crónica suelen ser difusos pero en
Introducción 2
general
se
manifiestan
complicaciones
osteoarticulares,
endocarditis,
abscesos
hepatoesplénicos y desórdenes neurológicos (Smith y Ficht, 1990).
El género Brucella
Brucella pertenece a la división α-2 de las Proteobacterias, junto a otros géneros que
incluyen bacterias que viven en asociación íntima con células eucariotas como rizobacterias,
Agrobacterium y Rickettsiae (Moreno et al, 1990). Los miembros del género Brucella son
patógenos intracelulares facultativos.
Si bien los estudios de hibridación DNA-DNA determinaron que todos los miembros
del género comparten más del 95% de homología, por lo que debería considerárselo un género
monoespecífico (Verger et al, 1985), la antigua clasificación en 6 especies basada en la
preferencia de huésped y características antigénicas y bioquímicas sigue siendo ampliamente
usada. Sin embargo estudios recientes indican que la estructura y organización genómica de
una dada especie o aún de cada biovar dentro de una especie, tiene características únicas y
distintivas, lo que sugiere que el género consiste en linajes clonales, cada uno adaptado en
forma específica, aunque no exclusiva, a su huésped mamífero (Michaux-Charachon et al,
1997; Jumas-Bilak et al, 1998). Se pueden distinguir por lo tanto seis especies dentro del
género: B.melitensis, B.suis, B. abortus, B. ovis, B. canis y B.neotomae.
B. melitensis presenta tres biovares y suele encontrase en ovejas y cabras aunque
también infecta camellos y dromedarios. Es la responsable de la forma más severa de la
enfermedad en humanos, incluso la aparición de brucelosis bovina debida a la infección por B.
melitensis se está transformando en un serio problema de salud pública en Medio Oriente y el
Mediterráneo.
B. abortus, la principal responsable de la brucelosis bovina, es la especie más
diseminada en el mundo y por lo tanto entraña un gran riesgo para el hombre. Recientemente se
ha descripto su presencia en poblaciones naturales de búfalos y renos de Norteamérica.
B. suis se encuentra habitualmente en cerdos, liebres, caribús, renos y alces. Las
especies menos distribuidas son B. ovis que afecta ovejas, B. canis que infecta perros y B.
neotomae aislada de ratas silvestres del género Neotoma.
Recientemente se aislaron nuevas especies de Brucella a partir de carcasas de
mamíferos marinos como cetáceos y pinnípedos. Esta nueva especie dentro del género posee
Introducción 3
características genéticas diferentes a las especies clásicas por lo que recibió el nombre aún no
oficial de B.maris o B. delphinii (Jahans et al, 1997; Miller et al, 1999).
Todas las especies, con excepción de B. ovis y B. neotomae, son patógenas para
humanos.
La biogénesis del fagolisosoma
La fagocitosis es el paso inicial para la degradación de las células en proceso de
muerte, de partículas inertes y de agentes infecciosos. Juega un rol central en procesos
biológicos relevantes como inflamación, inmunidad y desarrollo. La fagocitosis ocurre no sólo
en células fagocíticas como neutrófilos y macrófagos, también ha sido descripta en células nofagocíticas como fibroblastos, células endoteliales y epiteliales.
Luego de la internalización en la célula huésped, las partículas inertes como bolas de
látex o levaduras fijadas se localizan en un compartimento limitado por una membrana,
conocido como el fagosoma naciente. Inicialmente las membranas de los fagosomas nacientes
presentan una composición proteica similar a la de la membrana plasmática de la cual se
originan, pero rapidamente comienzan a reciclar los componentes de las mismas y a adquirir
marcadores de endosomas tempranos como Rab5 y EEA1, lo que les permite fusionarse con las
organelas endocíticas (Duclos y Desjardins, 2000). Comienza entonces un proceso de fusión
secuencial caracterizado por la adquisición de marcadores de endosomas tardíos y lisosomas
como las glicoproteínas de membrana LAMP, la H+-ATPasa, el receptor de manosa-6-fosfato
(MPR), el complejo mayor de histocompatibilidad MHC-II y varias hidrolasas de la familia de
la catepsina (Duclos y Desjardins, 2000). Todos estos cambios contribuyen a la formación del
fagolisosoma, un compartimento acídico e hidrolítico que permite matar, degradar y procesar a
los microorganismos para presentar luego los antígenos en la superficie celular.
Se ha propuesto que este proceso ocurre por múltiples eventos de fusión transitoria,
siguiendo un mecanismo conocido como “kiss-y-run” (Desjardins et al., 1994; Mayorga et al.,
1991; Desjardins M., 1995). De acuerdo con esta hipótesis, el fagososma y el endosoma se
mueven a lo largo de los elementos del citoesqueleto e interactúan en puntos focales donde
ocurre un evento de fusión transitoria entre ambas membranas, con la formación del poro de
fusión que se expande lo suficiente como para permitir el intercambio de contenidos solubles
entre ambas organelas. Sin embargo, en lugar de ocurrir un evento de fusión completa, el poro
de fusión se cierra y las organelas se separan para poder iniciar otro ciclo de fusión. Por lo tanto
Introducción 4
la hipótesis “kiss-y-run” predice que el intercambio de contenidos entre el fagosoma y el
endosoma debe ser transitorio, parcial y selectivo en cuanto al tamaño de las partículas que se
intercambian. Esta predicción fue confirmada experimentalmente analizando los eventos de
fusión luego de la fagocitosis de partículas de oro coloidal de diferente tamaño (Duclos y
Desjardins, 2000). El mecanismo “kiss-y-run” confiere ciertas ventajas a la célula: permite a
las organelas intercambiar sus contenidos luminales sin mezclar completamente sus
membranas, lo que minimiza la necesidad de un posterior proceso de reciclado a gran escala y
evita la formación de una organela gigante; restringe la capacidad de los patógenos para invadir
y colonizar el camino endocítico completo; el intercambio limitado de moléculas de membrana
tiene el potencial de permitir la transformación gradual de la organela tal como se observa a lo
largo del proceso de maduración del camino endocítico (Duclos y Desjardins, 2000). El
proceso de maduración secuencial del fagosoma naciente en un fagolisosoma es controlado
enteramente por la célula.
La hipótesis KISS-Y-RUN. En el gráfico se esquematiza el proceso de fusión entre un fagosoma naciente
conteniendo una bacteria y un endosoma temprano. La formación del poro de fusión está regulada por un complejo
proteico en los que intervienen la GTPasa Rab5 y los efectores EEA1 y Sintaxina 13 entre otros.
Los patógenos intracelulares han desarrollado estrategias para evitar el proceso de
maduración progresiva de la vacuola que los contiene en un fagolisosoma, evadiendo de esta
forma los mecanismos de destrucción celulares y estableciendo un nicho intracelular rico en
nutrientes en donde proliferan (Garcia del Portillo y Finlay, 1995; Sinai y Joiner, 1997;
Meresse et al., 1999). En los últimos años, varios laboratorios se han dedicado a caracterizar los
compartimentos intracelulares en los cuales residen distintos patógenos. El refinamiento de las
Introducción 5
técnicas de microscopía junto al mayor conocimiento sobre los eventos de maduración de la vía
endo y exocítica han permitido demostrar, usando un conjunto limitado de marcadores, que
estos nichos presentan características tanto de organelas endocíticas, organelas del aparato
biosintético o del núcleo (Duclos y Desjardins, 2000). A diferencia de las características del
fagolisosoma, estas vacuolas especializadas carecen de las propiedades líticas necesarias para
matar y degradar a los patógenos y en cambio les confieren un ambiente apropiado para
sustentar su supervivencia y proliferación. El proceso de formación de las vacuolas que
contienen patógenos intracelulares en un nicho de replicación idiosincrático es controlado por
los patógenos que las ocupan.
En consecuencia, durante el desarrollo de esta tesis se usará la nomenclatura propuesta
por Meresse et al, dejando el término fagosoma para aquellos compartimentos que contienen
partículas inertes y que entran en la vía endocítica clásica hasta formar un fagolisosoma y se
usará el término vacuola para describir los fagosomas especializados cuyo proceso de
maduración es afectado por los patógenos que las ocupan (Meresse et al. 1999).
Distintas estrategias para la subversión de la biogénesis del fagolisosoma
Varios estudios recientes han comenzado a ampliar el conocimiento sobre los procesos
que conducen a la formación de los nichos de replicación de los patógenos intracelulares. Sin
embargo, muy poco es lo que se conoce aún sobre los efectores bacterianos y los blancos
celulares que determinan la biogénesis de estas vacuolas especializadas. Los mecanismos
utilizados por los patógenos para evadir las defensas de la célula huésped son múltiples y
sofisticados como para agruparlos en categorías aunque es posible, para su mejor comprensión,
delinear tres grandes estrategias: (i) la lisis de la membrana vacuolar, (ii) el arresto del proceso
de maduración de la vacuola y (iii) el escape de la vía endocítica.
Una de las formas en que los patógenos intracelulares evitan las condiciones hostiles
que resultan de la fusión de sus vacuolas con los compartimentos endocíticos degradativos es
escapar rápidamente del fagolisosoma naciente hacia el citoplasma. Esta estrategia es usada por
Trypanosoma cruzi (Andrews et al.,1990), Shigella (Theriot J.A., 1995), Listeria, y Rickettsia
(Heinzen et al., 1999). Estos últimos, una vez que alcanzaron el citoplasma de la célula
huésped, adquieren movilidad gatillando la polimerización polarizada de actina lo que les
permite diseminarse entre células adyacentes y replicar libremente en el citosol.
Introducción 6
Estrategia de supervivencia de Patógenos Intracelulares. En el gráfico se esquematizan las estrategias seguidas
por patógenos que evaden la vía endocítica relocalizando sus vacuolas en la vía biosintética como Brucella,
Legionella, Rickettsia, Chlamydia y Toxoplasma; aquellos que arrestan el proceso de maduración a distintos
niveles de la vía endocítica como Mycobacterium y los promastigotes de Leishmania; o aquellos que resisten el
ambiente hostil del fagolisosoma con Coxiella y los amastigotes de Leishmania.
Una segunda alternativa usada por los patógenos para evitar el ambiente hostil del
lisosoma es arrestar el proceso de maduración de la vacuola naciente a distintos niveles de la
vía endocítica, transformándola en una vacuola no-fusogénica. La vacuola que contiene a
Mycobacterium tuberculosis conserva las características de un endosoma temprano que no
madura en un endosoma tardío/lisosoma ni se acidifica (Deretic et al., 1999). Por ejemplo, la
vacuola que contiene a M. bovis retiene la GTPasa de endosomas tempranos Rab5 pero excluye
la GTPasa de endosomas tardíos Rab7, indicando un arresto temprano en la maduración (Vía et
al., 1997). Un estudio proteómico mostró que la vacuola que contiene a Mycobacterium retiene
una proteína celular llamada TACO, que usualmente es liberada del fagosoma antes de que
ocurra el evento de fusión (Ferrari et al., 1999). Se propuso entonces que la bacteria retiene esta
proteína para bloquear o evitar las propiedades fusogénicas de su vacuola. Esta hipótesis fue
confirmada al observarse que los macrófagos hepáticos, que normalmente no expresan TACO,
eliminan rápidamente a Mycobacterium.
Salmonella typhimurium genera una vacuola caracterizada por la adquisición transitoria
de marcadores endosomales tempranos seguido por el enriquecimiento progresivo en ATPasa
vacuolar y algunas glicoproteínas lisosomales (Steele-Mortimer et al., 1999). Sin embargo, a
diferencia de la maduración de los fagosomas, estas vacuolas carecen del receptor de manosa-
Introducción 7
6-fosfato y de enzimas lisosomales (Garcial del Portillo et al., 1995). Se produce entonces la
formación de estructuras tubulares enriquecidas en glicoproteínas lisosomales que se conectan
con la vacuola que contiene a Salmonella y comienza la proliferación bacteriana. El significado
biológico de estas estructuras es aún desconocido (Garcia del Portillo et al., 1993).
Una tercera estrategia es el escape de la vía endocítica para replicar en una vacuola
localizada en el camino biosintético, en donde la mayoría de las enzimas degradativas están
pobremente representadas o son expresadas como precursores inactivos.
El ejemplo paradigmático de esta estrategia está ilustrado por Toxoplasma gondii. Su
estrategia para la sobrevida intracelular es excluir o remover rápidamente de su vacuola
proteínas que fueron derivadas de la membrana plasmática del huésped, privando de esta forma
a la vacuola de las señales de reconocimiento para la fusión con los compartimentos
endocíticos (Sinai y Joiner, 1997; Suss-Toby et al., 1996). Luego, la exocitosis secuencial de
proteínas de Toxoplasma modifican la composición de la membrana vacuolar. Estas vacuolas
se asocian posteriormente a mitocondrias y RE y adquiere poros que permiten la libre
importación de ATP y pequeñas moléculas del citoplasma del huésped (Schawb et al., 1994).
De esta forma, aislando su vacuola del camino degradativo, Toxoplasma contribuye a la
formación de un nicho competente para su replicación intracelular.
Ejemplos de esta estrategia entre las eubacterias se encuentran en Legionella
pneumophila y Chlamydia. Luego de la entrada de L. pneumophila a la célula huésped, la
vacuola que la contiene se asocia secuencialmente con vesículas lisas, mitocondrias y RE.
Eventualmente se reubican en una posición cercana al núcleo donde se cubren de ribosomas. La
vacuola replicativa carece del receptor de transferrina y es incapaz de adquirir marcadores de
endosomas tardíos/lisosomas, aunque presenta características morfológicas y funcionales
similares a los autofagosomas (Vogel y Isberg, 1999; Swanson y Isberg, 1995). El destino
intracelular de L. pneumophila está determinado por la presencia de un sistema de secreción
tipo-IV codificado por 24 genes de virulencia denominados dot/icm (Segal et al., 1998; Vogel
et al., 1998). La vacuolas que contienen mutantes de L. pneumophila en los genes dot/icm se
fusionan rápidamente con lisosomas, lo que resulta en un severo defecto en el crecimiento
intracelular. Las mutantes dotA acumulan rápidamente Lamp1 y Rab7 en sus vacuolas
indicando que el producto de este gen juega un rol fundamental en la inhibición de la fusión
vacuola-lisosoma (Roy et al.,1998). Sin embargo esta mutante avirulenta tiene la capacidad de
multiplicarse en una vacuola formada por una cepa salvaje, lo que sugiere que factores
Introducción 8
secretados por el sistema Dot/Icm son necesarios y suficientes para la formación del nicho
replicativo (Coers et al., 1999).
La bacteria parásita intracelular obligada Chlamydia reside en una vacuola que es
completamente excluida del camino endocítico. Sin embargo su vacuola es capaz de
interaccionar selectivamente con vesículas derivadas del aparato de Golgi que le proveen una
fuente de nutrientes necesarios para su crecimiento (Sinai y Joiner, 1997). Chlamydia
trachomatis trafica hacia el área de Golgi en donde su vacuola intercepta y se fusiona con
vesículas cargadas de esfingomielina, pero no de glicoproteínas, que derivan de Golgi y estaban
destinadas originalmente a la membrana plasmática (Scidmore et al., 1996). A pesar de este
intercambio, la membrana de la vacuola clamidial excluye proteínas del RE, de Golgi y de la
red endosómica y adquiere proteínas bacterianas (Scidmore-Carlson et al., 1999).
La evasión de la vía endocítica y la localización de la vacuola en el camino biosintético
es la estrategia que sigue Brucella para establecer su nicho de replicación intracelular.
La internalización de Brucella en la célula huésped
No ha sido descripto aún el mecanismo por el cual Brucella se une e ingresa a la célula
huésped. En comparación a otras gram (-) intracelulares como Salmonella, Shigella o
Legionella, el número de brucelas que se adhieren a la superficie de la célula huésped es
sorprendentemente bajo (Pizarro-Cerdá et al, 1998a; Sola-Landa et al., 1998). Por cierto, está
ampliamente descripto que cepas lisas avirulentas y mutantes rugosas se adhieren más
eficientemente a la superficie celular que las cepas virulentas (Detilleux et al. 1990, Allen et al.
1998, Ugalde J, observaciones no publicadas). El hecho de que las cepas rugosas avirulentas se
adhieran en mayor número y sean internalizadas con mayor eficiencia por la célula que las
contrapartes virulentas lisas, sugiere que la cadena O del LPS juega un rol antifagocítico
importante, tal vez ocultando zonas hidrofóbicas o cargas iónicas en la superficie de la cepas
lisas para evitar que interactúen en forma inespecífica con la célula animal.
Por lo tanto, sólo la eficiencia de la penetración y la posterior replicación y
supervivencia intracelular correlacionan efectivamente con la virulencia de Brucella. Tampoco
se ha descripto aún la presencia de fimbrias o pilis por lo que se considera que estas estructuras
no participan del proceso de unión a la célula.
Brucella opsonizadas son ingeridas y destruidas más eficientemente por los macrófagos
y polimorfonucleares que las no-opsonizadas (Young et al., 1985), lo que sugiere que la
Introducción 9
bacteria penetra los fagocitos de los huéspedes no-inmunizados por mecanismos aún
desconocidos que no involucran receptores Fc y complemento. El suero inmune o nativo no es
necesario para la invasión de Brucella en fagocitos no-profesionales como celulas epiteliales o
trofoblásticas, lo que sugiriere que la bacteria posee un mecanismo para invadir estas células
mediado tal vez por la interacción de un ligando bacteriano aún no descripto y un receptor
celular. Por cierto, mutantes de B. abortus en el sistema de dos componentes BvrR-BvrS son
prácticamente incapaces de invadir células HeLa y macrófagos murinos, lo que indica que la
bacteria promueve activamente su internalización (Sola-Landa et al. 1998).
Tráfico intracelular de Brucella
Una vez que se produjo la entrada en la célula huésped, Brucella sobrevive y replica en
compartimentos rodeados de membranas, tanto en células fagocíticas como no fagocíticas
(Price et al., 1990; Smith y Ficht, 1990; Baldwin y Winter, 1994). Los fagocitos profesionales,
como macrófagos y polimorfonucleares, constituyen la primera línea de defensa de los
mamíferos, sin embargo Brucella es capaz de eludir la actividad bactericida y replicar dentro de
ellos. Estos fagocitos transportarán la bacteria a los nódulos linfáticos del animal, diseminando
la infección. En etapas posteriores la bacteria puede localizarse en tejido óseo, articulaciones y
sistema nervioso. En ungulados es característico el tropismo hacia órganos reproductivos y
placenta, pudiendo replicar activamente en los trofoblastos. (Smith y Ficht, 1990; Enright,
1990). Las células epiteliales también son un lugar para la replicación de Brucella.
Recientemente varios estudios han descripto en forma detallada los eventos tempranos y
tardíos del tráfico intracelular de Brucella en células fagocíticas profesionales y noprofesionales, en particular el comportamiento intracelular en células HeLa y en la línea celular
murina J774.
En células HeLa, durante los primeros 15 min p.i., Brucella es detectada
transitoriamente en vacuolas caracterizadas por la presencia de marcadores de endosomas
tempranos, como transferrina y la proteína periférica de membrana de endosomas tempranos
EEA1 (Pizarro-Cerdá et al. 1998b). Las misma interacción fue observada usando cepas
atenuadas de B. abortus.
A diferencia del destino intracelular que siguen los fagosomas que contienen partículas
inertes como bolas de látex, que expresan marcadores de endosomas tardíos como el receptor
de manosa-6-fosfato prelisosomal (M6PR), a los 30-60 min p.i. las vacuolas que contienen a
Introducción 10
Brucella no adquieren M6PR en su forma catión dependiente ni catión independiente (PizarroCerdá et al 1998b). Estos resultados indican que Brucella, en forma similar a S. typhimurium
(García del Portillo y Finlay, 1995) se ha desviado del camino endocítico.
En el período postinfección que va de los 40 minutos hasta las 4 horas, las bacterias se
localizan en vacuolas que adquieren glicoproteínas lisosomales como LAMP1 y LAMP2, pero
no hidrolasas lisosomales como catepsina-D (Pizarro-Cerdá et al, 1998b). Estudios
ultraestructurales revelaron que estos compartimentos poseen características morfológicas
similares a autofagosomas multimembranosos cubiertos de ribosomas (Pizarro-Cerdá et al.,
1998b). Estructuras similares habían sido ya observadas en 1990 por P. G. Detilleux y col. en el
modelo de infección en células Vero. Estos investigadores habían observado alrededor de las
12-24 hs p.i. que, a diferencia de las monocapas control, en las monocapas infectadas era más
frecuente observar vesículas autofágicas, muchas de las cuales poseían brucelas en su interior y
las denominaron “figuras en forma de mielina” por las múltiples membranas concéntricas que
rodean a la bacteria (Detilleux et al.,1990). Varias líneas de evidencias, más allá de las
características ultraestructurales, apoyan la idea de que Brucella explota transitoriamente el
camino autofágico de la célula huésped. Primero, el compuesto autofluorescente
monodansylcadaverina (MDC), que se acumula específicamente en autofagosomas (Biederbick
et al., 1995), colocaliza con las bacterias internalizadas a partir de las 2 hs p.i.. Segundo, la
proteína traslocadora reticular sec61β se encuentra en estas vacuolas junto con LAMP1 y
LAMP2 pero no catepsina-D, ribophorina ni BiP, lo que confirma que los autofagosomas
nacientes se originan de subcompartimentos del RE (Pizarro-Cerdá et al., 1998b; Dunn, 1990
a,b). Tercero, inhibidores de la autofagia como wortmanina y 3-metiladenina reducen la
replicación intracelular de Brucella, mientras que potenciadores de la vía autofágica como el
hambreado de aminoácidos aumentan la recuperación de bacterias intracelulares (Pizarro-Cerdá
et al.,1998ª). Una vez que Brucella ha alcanzado el autofagosoma, la vacuola es incompetente
para fusionarse con compartimentos endocíticos cargados con materiales administrados
exógenamente. Dos fuertes evidencias apoyan esta noción: primero, cuando se administra
seroalbúmina bovina acoplada a fluorsceína (BSA-FITC) a células infectadas por varias horas,
la marca fluorescente no llega al compartimento que contiene a Brucella (Pizarro-Cerdá et al.,
1997). Segundo, la bacteria es capaz de proliferar intracelularmente bajo concentraciones
bactericidas de gentamicina y estreptomicina en el medio de cultivo celular (Baldwin y Winter,
1994; Pizarro-Cerdá et al., 1998). En cambio, en el caso de la infección con mutantes de
Introducción 11
Listeria incapaces de escapar al citoplasma de la célula huésped, el antibiótico es conducido a
la vacuola que contiene al parásito impidiendo su replicación (Drevets et al., 1994).
El autofagosoma sin embargo no es el nicho de replicación intracelular. A partir de las
12-24 hs p.i., las bacterias comienzan un período de replicación exponencial en un
compartimento que ha excluido LAMP1 y LAMP2, que ya no se marca con MDC pero que
retiene aún la marcación con Sec61β y adquiere calnexina y calreticulina, lo que indica que se
trata del RE como habían sugerido estudios previos en células Vero y trofoblastos bovinos
(Anderson y Cheville,1986; Meador y Deyoe, 1989; Detilleux et al., 1990; Pizarro-Cerdá et
al.,1998b). Otra proteína reticular como la disulfuro isomerasa (PDI) está presente en la
membrana del compartimento replicativo de Brucella. El hecho de que la Brefeldina A1
provoque la redistribución del complejo de Golgi alrededor de la bacteria, sugiere que Brucella
replica en un compartimento que retiene no sólo las características morfológicas sino las
propiedades funcionales del retículo endoplásmico. Este hecho es demostrado también por la
vacuolización del compartimento replicativo después del tratamiento de la células HeLa
Introducción 12
infectadas con proaerolisina de Aeromonas hydrofila, una toxina conocida por su capacidad de
desorganizar específicamente los sáculos del retículo endoplásmico (Abrami et al., 1998).
Resumiendo, en células fagocíticas no-profesionales como HeLa o Vero, Brucella
interacciona con endosomas tempranos, se desvía de los compartimentos endocíticos tardíos y
explota transitoriamente la vía autofágica de la célula huésped para posteriormente alojarse en
el retículo endoplásmico donde comienza la etapa de replicación exponencial.
El tráfico intracelular de Brucella en macrófagos no ha sido investigado tan
exhaustivamente como en células fagocíticas no-profesionales. Los trabajos realizados por el
grupo de Gorvel concluyeron que durante los primeros minutos de la infección en macrófagos,
Brucella es capaz de interaccionar con endosomas tempranos caracterizados por la presencia de
EEA1 en forma similar a lo observado en HeLa, y que posteriormente la bacteria colocaliza en
compartimentos LAMP-positivos/catepsinaD-negativos para terminar formando un nicho
replicativo en el RE (Pizarro-Cerdá et al., 1997; J-P. Gorvel, comunicación personal), por lo
que los autores concluyen que la bacteria sigue caminos intracelulares similares a los descriptos
en células fagocíticas no-profesionales.
Sin embargo un trabajo reciente del grupo de Mayorga, estudiando el camino seguido
por B. abortus en la línea macrofágica murina J774, ha arrivado a conclusiones diferentes. Los
investigadores observaron, por medio de microscopía electrónica, la cinética de fusión de las
vacuolas que contienen a Brucella con lisosomas preformados cargados de partículas de oro
coloidal. Sus resultados indican que durante las primeras horas de la internalización, Brucella
retrasa significativamente la fusión de su vacuola con lisosomas preformados, evita la fusión
con los endosomas nacientes y con compartimentos proteolíticos, en concordancia con lo
observado en HeLa. Sin embargo, en las etapas tardías, los autores no observan colocalización
de la bacteria con el marcador autofágico MDC, ni con el marcador reticular 3,3’dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6). En cambio, un porcentaje significativo de bacterias se
encuentran en grandes fagosomas que se han acidificado y están cargados con oro coloidal, lo
que sugiere que se trata de fagolisosomas (Arenas et al., 2000). La diferencia observada en el
transporte de Brucella en células fagocíticas profesionales y no-profesionales son interpretadas
por los autores como dos alternativas de la misma estrategia de sobrevida intracelular. En el
caso de la internalización en fagocitos profesionales, que poseen una vía endocítica mucho más
activa que HeLa, el retraso de la fusión con lisosomas no sería suficiente para evitar la fusión
con compartimentos tardíos por lo que se forma el fagolisosoma. A pesar de que estos
Introducción 13
compartimentos se acidifican, los autores observan que la morfología de Brucella parece
normal, por lo que sugieren que resiste la digestión en el fagolisosoma (Arenas et al. 2000). Sin
embargo en este estudio no se caracteriza la naturaleza del compartimento replicativo y el único
criterio para determinar la viabilidad bacteriana es la observación morfológica y no el recuento
de bacterias intracelulares viables.
El hecho de que Brucella resista la acidificación de su vacuola en macrófagos está de
acuerdo con los hallazgos del grupo de Montpellier, Francia. Estos autores observaron que en
J774, la acidificación a pH 4.3 de la vacuola que contiene a B. suis, es esencial para la
supervivencia intracelular. Distintos inhibidores de la ATPasa vacuolar y neutralizadores del
pH inhiben la replicación intracelular de B. suis (Porte et al., 1999). Por lo tanto, la
acidificación temprana de la vacuola brucélica es esencial para la sobrevida del patógeno, tal
vez porque aporta un señal que es percibida por la bacteria para activar un conjunto de genes
necesarios para remodelar o alterar su tráfico intracelular.
Recientemente, un estudio ingenioso demostró cuán adaptada está Brucella a la
sobrevida en la vacuola. Por medio de ingeniería genética, los investigadores lograron
introducir en B. suis un sistema de expresión de citolisina híbrida conteniendo listeriolisina de
Listeria monocytogenes junto al sistema de secreción de hemolisina de E. coli, lo que resulta en
la secreción de listeriolisina activa por parte de Brucella. En contraste a lo que ocurre en los
monocitos humanos infectados con la cepa parental control, las vacuolas que contienen a las
brucelas hemolíticas aparecen dañadas al microscopio electrónico y esta ruptura correlaciona
con la incapacidad de la cepa para replicar en la línea macrofágica humana (Köhler et al.,2001).
La pérdida de la capacidad de replicación intracelular podría ser explicada como consecuencia
de una neutralización temprana del pH intravacuolar debido a la lisis de la membrana vacuolar
por la acción de la listeriolisina. Además, resulta interesante comprobar que un factor de
virulencia esencial para un Gram(+) como L. monocytogenes, adaptada para escapar al
citoplasma de la célula huésped, cuando es expresado en un Gram(-) como B. suis inhibe
completamente la capacidad de replicación intramacrofágica, lo que demuestra que la estrategia
intracelular específica que despliega un patógeno no puede ser fácilmente alterada.
En un trabajo posterior, los investigadores analizaron in vivo las propiedades
fusogénicas de la vacuola brucélica en la línea J774, demostrando que los fagosomas
conteniendo bolas de látex se fusionan a lisosomas aún en presencia de Brucella. Este resultado
indica que la inhibición de la fusión a lisosomas se restringe a la vacuola que contiene al
Introducción 14
patógeno sin alterar la maquinaria celular de fusión, a diferencia de lo que ocurre con
Salmonella y otras enterobacterias (Naroeni et al. 2001). En el mismo trabajo los autores
desarrollaron un ensayo de reconstitución in vitro usando citometría de flujo para estudiar la
interacción entre vacuolas conteniendo B. suis vivas o muertas con lisosomas de la línea J774.
Sus resultados indican claramente que las vacuolas que contienen B. suis muertas se asocian a
lisosomas en una forma que es dependiente de componentes del citosol, energía y temperatura
(maduración normal del fagosoma). Sin embargo no se observó interacción entre vacuolas
conteniendo bacterias vivas y lisosomas (Naroeni et al., 2001). Por lo tanto, estos resultados
indican que la inhibición del reconocimiento entre la vacuola brucélica y el lisosoma es un
fenómeno restringido a la vacuola del patógeno, debido tal vez a modificaciones en la
membrana vacuolar y que esta modificación depende de un metabolismo bacteriano activo,
confirmando los resultados obtenidos en células HeLa por el grupo de Gorvel.
Todos estos estudios recientes sobre el tráfico que sigue Brucella, ya sea en fagocitos
profesionales o no-profesionales, sugieren que probables efectores secretados por la bacteria
son los responsables de (i) inhibir el proceso normal de maduración del fagosoma en un
fagolisosoma y la subsecuente degradación del patógeno por la maquinaria de defensa celular y
(ii) de redirigir el tráfico de la vacuola brucélica hacia el RE para el establecimiento del nicho
de replicación intracelular. Actualmente los factores bacterianos implicados en estos procesos
son completamente desconocidos.
Los sistemas de secreción bacterianos
Uno de los hallazgos más sorprendentes de la última década de investigación en
genética y bioquímica bacteriana es el descubrimiento de que los procariotas poseen múltiples
mecanismos para la secreción de proteínas. Para las bacterias patógenas, en particular para las
patógenas intracelulares, la secreción de proteínas efectoras hacia compartimentos
extracelulares constituye un rasgo clave de la virulencia, dado que la mayoría de los pasos del
proceso infectivo involucran alguna forma de interacción con el ambiente exterior (ya sea el
lumen intestinal, una mucosa, el citosol o una vacuola) y los productos proteicos deben por lo
tanto localizarse en la envoltura celular o ser secretados (Lory,1998).
La comparación de las secuencias de varios sistemas de secreción extracelular junto con
ensayos de complementación funcional de los componentes secretorios individuales, permitió
clasificarlos en categorías relacionadas mecanísticamente sugiriendo que los mecanismos
Introducción 15
básicos de secreción dentro de cada categoría particular probablemente sean similares o
idénticos. En base a estas similitudes se han definido cinco categorías de sistemas de secreción
conservados, denominados tipo I, II, III, IV y V (Lory, 1998).
Los sistemas de secreción tipo I se caracterizan porque las proteínas secretadas a través
de ellos carecen del característico péptido señal y no utilizan el camino secretorio general
conocido por sus siglas inglesas GSP (General Secretory Pathway), codificado en los genes sec.
El modelo paradigmático de los sistemas tipo-I lo constituye el sistema de secreción de la αhemolisina de E. coli (Lory, 1998; Hueck, 1998). Otros miembros de este grupo son el sistema
de secreción de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, la secreción de la leucotoxina de
Pasteurella haemolytica y la secreción de proteasa de Pseudomonas aeruginosa y Erwinia
chrysanthemi. En general, los sistemas tipo-I parecen ser bastante sencillos. En todos los casos
estudiados, la maquinaria está formada por tres componentes: (i) una ATPasa de transporte
localizada en la membrana interna homóloga a transportadores ABC (por las siglas inglesas
ATP-Binding-Cassette) que media el proceso de translocación dependiente de energía; (ii) una
proteína de la membrana externa relacionada a TolC de E. coli, que es exportada vía el camino
sec y (iii) una proteína dimérica que se extiende desde la membrana interna hasta la membrana
externa y forma el canal por el que pasan las proteínas a ser secretadas (Fath y Kolter, 1993).
En general, los genes codificantes de los componentes del aparato, junto a las correspondientes
proteínas de secreción, forman parte del mismo “cluster” u operón. Estas proteínas son
secretadas directamente desde el citoplasma hacia el exterior sin entrar en contacto con el
periplasma, aunque pequeños péptidos que utilizan este camino pueden ser escogidos desde un
pool periplásmico. La señal de secreción parece ser específica para cada subfamilia: por
ejemplo las proteasas no suelen ser secretadas vía el sistema para hemolisina y viceversa. La
naturaleza de la señal de secreción para la familia de las proteasas parece ser conformacional,
mientras que para la α-hemolisina de E.coli son varios residuos aminoacídicos clave dispersos
en la secuencia, irrespectivamente de la estructura secundaria que adquieren.
Introducción 16
Exterior
ME
EP
MI
Citoplasma
Esquema de los principales sistemas de secreción bacterianos. En el gráfico se esquematiza el arquetipo del
sistema de secreción tipo-1, el sistema Hly de E.coli, el sistema tipo-II de secreción de pululanasa de K. oxitoca y
el sistema tipo-III de Yersinia spp. ME. Membrana externa, MI, membrana interna, EP, espacio periplásmico.
Los sistemas de secreción tipo-II son parte de un camino de secreción en dos etapas: la
primera comprende la exportación de proteínas al periplasma por medio del sistema sec,
conocido también como GSP, seguido por la translocación a través de la membrana externa en
la que interviene una maquinaria secretoria compuesta al menos por 12 proteínas diferentes
(Nunn, 1999). Estos sistemas también son conocidos como la “rama terminal del camino
secretorio general”. El arquetipo de los sistemas tipo-II lo constituye el sistema de secreción de
la pululanasa de Klebsiella oxitoca. La característica principal de la exportación vía el camino
sec es la presencia de un péptido señal en el N-terminal de la proteína de exportación. Esta
secuencia es clivada por la peptidasa del péptido señal presente en la membrana interna cuando
la proteína alcanza el periplasma. En E. coli el GSP comprende un número de proteínas de
membrana interna (SecD a SecF y SecY), una ATPasa asociada a la membrana citoplasmática
(SecA) que aporta la energía para la exportación, una chaperona (SecB) que se une a las
proteínas presecretorias y la peptidasa del péptido señal, más un cierto número de proteínas
accesorias (Hueck, 1998). En el caso de la secreción de pululanasa, el transporte a través de la
membrana externa requiere la acción de 14 factores de secreción adicionales, codificados en un
mismo “cluster” genético que son necesarios y suficientes para el proceso. Al menos siete de
estas proteínas se localizan en la membrana interna mientras que PulS y PulD se ubican en la
membrana externa (Pugsley, 1993). Otros ejemplos de secreción tipo-II, en los que los genes y
Introducción 17
el orden de los mismos están conservados, incluyen el locus out para la secreción de enzimas
pécticas y celulasas de Erwinia spp., la secreción de elastasa, exotoxina A, fosfolipasa C y otras
proteínas por medio del sistema xcp de P.aeruginosa, el operón exe para la secreción de
amilasa y proteasa de Aeromonas hydrophila y el sistema xps de Xanthomonas campestris para
la secreción de poligalacturonasa. En general, los sistemas tipo-II son el camino principal
utilizado por las Gram(-) para la secreción de enzimas extracelulares degradativas (Hueck,
1998). Sin embargo la característica más llamativa de estos sistemas es que gran parte de sus
componentes son homólogos a los requeridos para la biogénesis de los pili tipo-IV, conocidos
también como N-metil-fenilalanil pili (Martinez et al., 1998; Nunn, 1999), por lo que se postula
que ambos sistemas tienen un origen evolutivo común. Las evidencias más fuertes que soportan
esta noción, fueron aportadas por los estudios sobre la biogénesis del pili de P. aeruginosa.
Durante este proceso, la modificación post-traduccional de la pilina (clivaje del péptido señal y
metilación del N-terminal) y el sistema GSP utilizan una misma enzima bifuncional, producto
del gen pilD. Es más, incluso la síntesis de las subunidades de la pilina es necesaria para la
secreción eficiente de exoenzimas vía el sistema tipo-II (Lory, 1998; Nunn, 1999).
El sistema de secreción tipo-III, como el sistema de secreción tipo-I, es independiente
del sistema sec. Está presente en un gran número de bacterias patógenas de animales y
vegetales, en las cuales constituye un factor de virulencia clave dado que su función es la
secreción de una gran diversidad de proteínas patogénicas hacia el citoplasma de las células
eucarióticas (Lee, 1997). Los aparatos tipo-III están compuestos por aproximadamente 20
proteínas, la mayoría de las cuales se ubican en la membrana interna, junto a un componente
localizado en la membrana externa y una ATPasa asociada a la membrana interna (Hueck,
1998). Resulta interesante destacar que la mayoría de las proteínas de la membrana interna son
homólogas a componentes del aparato biosintético del flagelo tanto de Gram(-) como de
Gram(+), mientras que el componente de la membrana externa es homólogo a PulD, la
secretina de membrana externa de los sistemas tipo-II. Como en los sistemas tipo-I y tipo-II, los
genes que codifican el aparato tipo-III están ordenados en “clusters”. Las proteínas secretadas
por este sistema no están sujetas a procesado de péptido señal y si bien se cree que la señal para
el reconocimiento reside en un segmento de 15-20 aa del N-terminal, no se ha observado aún
ninguna similitud estructural ni de secuencia entre distintas proteínas secretadas por el sistema
tipo-III. Estas evidencias han llevado a postular que la señal para la secreción esta dada por el
reconocimiento de pequeñas proteínas citoplasmáticas, tipo-chaperonas, que protegerían a los
Introducción 18
factores secretados de la interacción prematura con otros componentes citoplásmicos y los
guiarían hacia el aparato secretor (Hueck, 1998; Galán y Collmer, 1999). De acuerdo con la
similitud que comparte con el sistema de biosíntesis del flagelo, los aparatos tipo-III se
ensamblan formando una estructura supramolecular que se expande entre la membrana interna
y externa y protruye hacia el exterior. Esta organela recibió el nombre de “complejo aguja” o
inyectosoma (Galán y Zhou, 2000; Hoiczyk et al., 2001). Los ejemplos más estudiados de
sistemas de secreción tipo-III son los islotes de patogenia SPI-1 y SP-2 de Salmonella spp., el
sistema Ysc de Yersinia spp. y el sistema Hrp de Pseudomonas syringae.
Los sistemas de secreción tipo-IV serán tratados en detalle en la sección siguiente.
Recientemente se ha descripto una familia de proteínas de secreción que presentan
características únicas y que han recibido el nombre de sistemas de secreción tipo-V o
autotransportadores (Henderson et al., 1998). Estos sistemas son los más sencillos de todos los
descriptos, dado que los requerimientos para la secreción están contenidos en la estructura
proteica y el proceso es independiente de energía. Todas las proteínas que son secretadas por
este mecanismo poseen tres dominios: (i) un péptido señal para dirigir la translocación al
periplasma, (ii) la proteína de secreción madura o dominio pasajero y (iii) una región Cterminal o dominio β-amfipático que forma un poro en la membrana externa a través del cual el
dominio pasajero pasa a la superficie celular. Como ejemplos de sistemas autotransportadores
se pueden mencionar la proteasa IgA1 de Neisseria y Haemophilus (Poulsen et al., 1989), los
miembros de la familia serin-proteasas de Enterobacteriaceae SPATEs (Henderson et al.,
1998), la adhesina AIDA-I de E. coli y la toxina vacuolizante de Helicobacter pylori VacA
(Cover, 1996).
Los sistemas de secreción tipo-IV
Los sistemas de secreción tipo-IV fueron definidos originalmente en base a las
homologías existentes entre tres complejos multimoleculares diferentes: el sistema de
exportación del complejo-T de Agrobacterium tumefaciens (VirB), necesario para la
transformación tumoral de plantas susceptibles; el sistema de transferencia conjugativa (Tra)
del plásmido del grupo IncN, pKM101 y el sistema de transporte (Ptl) de la toxina pertussis de
Bordetella pertusiss (Pohlman et al., 1994; Christie y Vogel, 2000). El miembro arquetípico de
la familia lo constituye el sistema virB de A. tumefaciens. Esta maquinaria está dedicada al
transporte de una larga hebra de DNA simple cadena, conocida como T-DNA, a través de las
Introducción 19
membranas bacterianas y de la célula vegetal, en la cual el T-DNA se integra al genoma de la
planta. Una vez integrado, la expresión de oncogenes portados por el T-DNA resulta en la
división celular incontrolada y la formación de tumores o agallas (Zambrisky, 1992).
Varios sistemas tipo-IV están compuestos por un conjunto completo de proteínas
homólogas a las VirB de Agrobacterium, incluso en muchos casos el orden de los genes dentro
de los operones correspondientes es el mismo, lo que es altamente sugerente de un ancestro
común a todos. Los sistemas de transferencia de los plásmidos RP4 y Tra del plásmido Ti de A.
tumefaciens parecen ser quimeras entre homólogos del sistema VirB y proteínas Tra de un
ancestro no relacionado. El sistema Dot/Icm de Legionella pneumophila, que juega un rol
esencial en la virulencia del patógeno, fue en principio agrupado junto al sistema VirB de
Agrobacterium, sin embargo estudios posteriores demostraron que este sistema está relacionado
al sistema de Tra de los plásmidos IncI ColIb-P9 de Shigella flexneri. Por cierto al menos 16
genes dot/icm codifican proteínas relacionadas al sistema de transferencia del plásmido de
Shigella, incluso conservan la misma organización genética (Segal y Shuman, 1999).
Recientemente se ha descripto en L. pneumophila la presencia de un sistema adicional tipo-IV.
Este sistema, denominado lvh, que no participa en la virulencia aunque es capaz de transferir
plásmidos mobilizables del grupo IncQ, contiene un set completo de genes homólogos al virB
de Agrobacterium (Segal et al., 1999).
El sistema Ptl de Bordetella pertussis está compuesto por nueve genes homólogos y
organizados del mismo modo que los genes virB de Agrobacterium, con la excepción de los
homólogos a virB1 y virB5 que están ausentes (Weiss et al., 1993). Dentro del islote de
patogenia cag de Helicobacter pylori se ha identificado la presencia de seis genes homólogos a
los virB, que están implicados en la secreción hacia la célula epitelial de una proteína
denominada CagA. Esta proteína media el proceso de reorganización del citoesqueleto de
actina y de la superficie celular para la formación de la estructura de pedestal a la que se une
Helicobacter, pero además promueve la secreción, por parte de la célula gastrica, de citoquinas
proinflamatorias (Covacci et al, 1999; Stein et al., 2000). Se han descripto homólogos a
sistemas de secreción tipo-IV en varios patógenos como Rickettsia prowazekii, Bordetella
bronchiseptica y Bartonella henselae, pero aún no se ha demostrado la funcionalidad de los
mismos.
Introducción 20
Comparación de los sistemas de secreción tipo-IV. En el gráfico se agrupan los distintos sistemas en, a) sistemas
dedicados a la secreción de complejos DNA-proteinas como los sistemas conjugativos, b) los dedicados a la
secrecíon de proteinas como el sistema ptl de B. pertussis y c) sistemas relacionados al sistema Tra de los
plásmidos IncI de S. flexneri.
Actualmente hay tres tipos de sustratos conocidos que son transportados por los
sistemas tipo-IV: intermediarios de la conjugación del DNA, la multimérica toxina pertussis
(PT) y proteínas monoméricas como la primasa, RecA, VirE2 y VirF de Agrobacterium y
CagA de Helicobacter. Es importante destacar que en el caso de la transferencia de DNA, el
intermediario de la conjugación no es el DNA desnudo sino DNA simple cadena asociado a
una o más proteínas que son co-transportadas. Hay varias evidencias experimentales que
soportan la noción de que los sistemas tipo-IV son sistemas de secreción de proteínas en los
cuales la señal de reconocimiento para la translocación del sustrato y la función “piloto” para el
pasaje por el conducto de secreción son aportadas por la fracción proteica del complejo
nucleoproteína y no por el DNA (Christie P.,1997). En el caso de la transferencia del T-DNA
por A. tumefaciens, estas funciones las cumplen la proteína VirE2 que se une al DNA simple
cadena y VirD2 que es la que cliva el T-DNA en el origen de transferencia y permanece unida
covalentemente al 5’ fosfato. Además se ha demostrado recientemente que el sistema de
Introducción 21
conjugación RP4 es capaz de transferir la proteína RecA a E. coli aceptoras,
independientemente del DNA (Heinemann, 1999).
La diferencia entre los sistemas tipo-IV dedicados a la secreción de proteínas y aquellos
involucrados en la transferencia de DNA parece radicar en que estos últimos poseen una
proteína adicional homóloga a VirD4 de A. tumefaciens. La familia de proteínas VirD4 posee
motivos de unión a nucleótidos del tipo Walker A que son necesarios para que el proceso de
transferencia de DNA sea posible. Estas proteínas se localizan en la cara citoplasmática de la
membrana interna y podrían interactuar con los componentes del aparto de secreción. Se cree
que VirD4 y sus homólogas TraG del sistema RP4, TrwB del plásmido R388 y TraD del
plásmido F acoplan tanto espacial como temporalmente el procesamiento del DNA y la
reacción de transferencia. Estudios de sistemas de transferencia quiméricos compuestos por un
aparato de translocación y proteínas de acople heterólogas sugieren que estas proteínas aportan
las bases para el reconocimiento y la exportación de sustratos plasmídicos específicos (Cabezon
et al., 1994). Sin embargo un estudio reciente demostró que un homólogo a VirD4 presente en
Helicobacter pylori es necesario para la secreción de CagA por el sistema tipo-IV (Stein et al.,
2000). Por lo tanto las funciones de estas proteínas no se limitan a las reacciones de
transferencia de DNA sino que jugarían un rol más general en el tráfico del sustrato a través de
las maquinarias tipo-IV.
Exterior
ME
EP
MI
Citoplasma
Grupos Funcionales de los Sistemas de Secreción tipo IV. Los componentes externos del aparato de secreción
tipo IVcomoVirB2, VirB1* y VirB5 son traslocados al periplasma vía el sistema sec. La transglicosidasa lítica
periplásmica VirB1 sufre un segundo procesamiento en el C-terminal para dar VirB1* que se encuentra como
componente menor del T-pilus. Los componentes del canal de secreción están formados por las proteinas VirB3
y VirB6-10. Las ATPasa de membrana son VirB4, VirB11 y VirD4. ME, membrana externa. MI, membrana
interna. EP, espacio periplásmico.
Introducción 22
Las proteínas que componen los aparatos tipo-IV pueden agruparse en tres grupos
funcionales tal como se muestra en el esquema superior: (1) proteínas localizadas en la
superficie celular que forman estructuras adhesivas como el pilus-T o el pilus de conjugación,
(2) componentes del canal de secreción o el canal de apareamiento y (3) ATPasas de
membrana. Probablemente todas estas proteínas se ensamblen formando una estructura
supramolecular, sin embargo aún no hay evidencias de que exista una interacción física entre el
pilus y el canal de secreción.
VirB2 es la subunidad principal del pilus-T de Agrobacterium. Es un polipéptido corto
que se sintetiza como una preproteína de 12.5 kDa y sufre un procesamiento del péptido señal
para dar una proteína madura de 7 kDa que se cicla por la formación de un enlace peptídico
covalente entre el N y C terminal. Este mismo fenómeno fue descripto también en la homóloga
TrbC del sistema RP4 (Eisembrandt et al., 1999). Durante el proceso de maduración de la pilina
TrbC intervienen al menos tres enzimas: la peptidasa LepB remueve el péptido señal, una
peptidasa aún no identificada remueve 27 aa del C-terminal y por último, la enzima TraF,
codificada en el plásmido IncP, remueve 4 aa adicionales del C-terminal (los aa AEIA) y
cataliza el enlace entre el N-terminal truncado y el C-terminal, formando el péptido cíclico por
medio de un mecanismo que semeja al de la díada catalítica de las peptidasas del péptido señal.
Los péptidos cíclicos de este tamaño no son comunes entre los procariotas. El único ejemplo
adicional conocido hasta la fecha es la bacteriocina cíclica de Enterococcus faecalis (Samyn et
al., 1994). La pilina VirB2 se polimeriza para formar el pilus-T, un filamento de 10 nm de
ancho con un espacio luminal de 2nm de diametro, que protruye de la envoltura celular y suele
localizarse en uno de los polos de la bacteria (Lai y Kado, 2000). La biogénesis del pilus-T es
dependiente de la expresión de todos los genes virB, por lo que se considera que el aparato de
transporte tipo-IV es el que media el proceso de ensamble del pilus. El pilus-T es esencial para
la transferencia del T-DNA a la célula vegetal y la virulencia de Agrobacterium, pero la
función precisa que cumple es desconocida. Se ha postulado que podría servir como un
instrumento para percibir al huésped luego de la adhesión o que funciona como un conducto
para “inyectar” el complejo T-DNA y las proteinas efectoras a la célula blanco.
Introducción 23
Esquema de ciclado de la Pilina-T y ensamble del Pilus-T. VirB2 es traslocada al periplasma vía el sistema sec.
Durante este proceso el péptido señal es removido por la peptidasa leader. VirB2 sufre un segundo procesado
proteolítico del C-terminal y luego es ciclada. Se postula que la forma cíclica de VirB2 se asocia a VirB5 en el
periplasma y este complejo se ensambla y protruye de la superficie bacteriana para formar el pilus-T. El proceso
de ensamble es dependiente de la expresión de todos los componentes del aparto VirB.
Estudios de fraccionamiento subcelular demostraron que VirB5 co-purifica en bajas
cantidades con el pilus-T, por lo que puede considerárselo como un componente menor del
pilus (Schmidt-Eisenlohr et al., 1999). Resultados similares fueron reportados para el homólogo
de VirB5, TraC del plásmido pKM101 (Schmidt-Eisenlohr et al., 1999).
VirB1 tiene motivos que están conservados entre las lisozimas eucarióticas y las
transglicosilasas líticas bacterianas, por lo que se postula que participa en la degradación
localizada de la pared de peptidoglicano para permitir el ensamble del aparato tipo-IV. VirB1
es procesada para dar una proteína madura de 73 aa. La forma procesada es detectada en los
sobrenadantes de cultivos de Agrobacterium por lo que se considera que forma parte de los
componentes externos del aparato tipo-IV (Christie, 1997). Estas evidencias condujeron a
postular que la proteína virB1 de A. tumefaciens cumpliría dos funciones: la forma madura
periplásmica después del procesamiento del péptido señal prepararía el sitio en la envoltura
celular para el ensamble del aparato por medio de la lisis localizada de la pared de
peptidoglicano. Luego ocurre el procesamiento de la forma periplásmica para dar un producto
Introducción 24
correspondiente a los 73 aa del C-terminal asociado a estructuras de alto peso molecular en la
membrana externa junto a VirB9, cuya función sería la de estabilizar el pilus o los
intermediarios durante el ensamble del mismo (Zupan et al., 1998).
Varios estudios estructurales y genéticos indican que las proteínas VirB6 a VirB10
forman las subunidades del canal de secreción (Christie, 1997). VirB6 es una proteína
altamente hidrofóbica. Posee seis dominios transmembrana y se la encuentra firmemente
asociada a la membrana interna, por lo que se la considera la candidata principal para la
formación del poro en la membrana interna (Zupan et al., 1998).
VirB7 es una lipoproteína de membrana externa que interacciona consigo misma y con
VirB9, por formación de puentes disulfuro entre cisteínas únicas presentes en cada proteína.
Los heterodímeros VirB7-VirB9 se localizan en la membrana externa y pueden iniciar el
ensamble del transportador. Deleciones en virB7 reducen los niveles celulares de VirB4, 5, 8, 9
y 10, por lo que se considera que es esencial para la síntesis o la estabilidad de estos productos
durante el ensamble del complejo (Zupan et al., 1998). VirB9 es necesaria también para la
formación de oligómeros junto a VirB10: una proteína transmembrana con un pequeño dominio
N-terminal citoplásmico y un gran dominio C-terminal periplásmico, cuya función
probablemente sea la de unir los componentes citoplasmáticos y de membrana externa del canal
de secreción (Christie y Vogel, 2000).
VirB4 y VirB11 poseen motivos conservados de unión a nucleótidos del tipo Walker A
que son esenciales para su función. Ambas proteínas se ensamblan como homodímeros in vivo.
Un estudio reciente determinó que en solución, VirB11 y sus homólogas TrbB del plásmido
RP4, TrwD del plásmido R388 y RP0525 del islote de patogenia cag de Helicobacter pylori, se
ensamblan como anillos hexaméricos y este ensamble es dependiente del motivo Walker A, por
lo que se deduce que el cambio conformacional inducido por ATP contribuye a la morfogénesis
del transportador o a la translocación del sustrato a través del canal (Krause et al, 2000 a, b).
La familia de transportadores tipo-IV se ha vuelto en los últimos años un área muy
activa de estudio. Estos sistemas no sólo están bastante dispersos entre las eubacterias sino que
son muy versátiles, como queda evidenciado por los distintos usos que hacen de ellos varios
patógenos de mamíferos y vegetales. El sistema virB de A. tumefaciens es sin duda el más
promiscuo de estos sistemas, dado que es capaz de transferir DNA y proteínas a una gran
variedad de tipos celulares como plantas, bacterias, levaduras, hongos y células humanas
(Christie y Vogel, 2000).
Introducción 25
En cuanto a la funcionalidad, los sistemas tipo-IV mantienen ciertas semejanzas a los
sistemas tipo-III. Ambos sistemas secretan sustratos por medio de un proceso que requiere el
contacto físico con la célula blanco. Ambos sistemas requieren el acoplamiento o la acción de
proteínas del tipo chaperonas para dirigir la secreción del sustrato a través de la maquinaria.
Ambos sistemas elaboran estructuras supramoleculares como pili o filamentos que de alguna
forma contribuyen al proceso de secreción. Sin embargo sólo los sistemas tipo-IV parecen ser
capaces de exportar largas cadenas de DNA. Mecanísticamente los sistemas tipo-IV también
guardan semejanzas con los sistemas tipo-II. En particular, el sistema Ptl de B. pertussis es
bastante similar al sistema de exportación tipo-II de la toxina colérica, que a su vez guarda
relaciones estructurales con la toxina pertusis. Ambos sistemas son capaces de permitir la
transmisión de DNA a través de la envoltura celular: prueba de ello es la capacidad del sistema
tipo-II de Vibrio cholerae (Eps) para transferir no sólo la toxina colérica sino el fago
filamentoso CTXφ (Davis et al., 2000).
A pesar de los enormes esfuerzos realizados, los sistemas tipo-IV continúan siendo las
maquinarias de transporte menos caracterizadas y varios aspectos de la biología del proceso
implicado permanecen oscuros. En particular aún no se conocen cuales son las señales celulares
que inducen la expresión de estos genes en patógenos intracelulares como Legionella o
Rickettsia, ni la naturaleza y función de la proteínas efectoras secretadas por los mismos.
La búsqueda de factores de virulencia de Brucella
Durante la pasada década, la investigación sobre los aspectos moleculares de la
patogenia de Brucella se incrementó notablemente, en particular los referentes a la búsqueda de
los factores de virulencia del patógeno. Las líneas de trabajo principales abordaron el problema
tomando como modelo las investigaciones llevadas a cabo en patógenos intracelulares
facultativos como Salmonella tiphymurium y Listeria monocytogenes. Dado que los miembros
del género no producen cápsulas ni fimbrias, no son móviles ni producen exotoxinas, se razonó
que la virulencia debía residir en factores estructurales como el LPS y las proteínas de
membrana externa (OMPs) y/o en los genes que le confieren al patógeno la capacidad de
resistir los mecanismos bactericidas del macrófago (Sangari y Aguero, 1996). Con este marco
conceptual se encaró la búsqueda de los factores de virulencia de la bacteria.
La adaptación de las técnicas de clonado y reemplazo genético para su aplicación en
Brucella permitió la identificación de genes como catalasa (kat) (Sha et al, 1994), superóxido
Introducción 26
dismutasa (sod) (Sriranganathan et al, 1991; Tatum et al, 1992), RecA (Tatum et al, 1993), la
serin proteasa inducida por heat-shock HtrA (Tatum et al, 1994; Roop et al, 1994; Elzer et al.
1994), bacterioferritina y ureasa (Denoel et al., 1997). La disrupción de estos genes y el análisis
de las mutantes en el modelo de virulencia murino demostraron que las cepas no son atenuadas.
Por lo tanto el rol que cumplen estos genes en la virulencia es marginal o nulo.
A principio de los años 50, un poliol de cuatro carbonos, el eritritol, fue implicado en la
virulencia de Brucella. Los argumentos que soportaban la hipótesis de que los genes necesarios
para el catabolismo del eritritol celular son esenciales para la virulencia eran los siguientes: (i)
todas las cepas patógenas del género pueden metabolizar eritritol, (ii) el eritritol está presente
en la placenta de los ungulados, en donde Brucella se encuentra en grandes concentraciones y
(iii) la cepa vacunal atenuada naturalmente B. abortus S19, es inhibida por la presencia del
azúcar en el medio de cultivo (Sangari y Aguero, 1996). Sin embargo esta hipótesis tampoco
resultó exitosa. El análisis del locus eri demostró que la cepa vacunal S-19 posee una deleción
del gen que codifica para la D-eritrulosa-1-P dehidrogenasa, lo que resulta en la acumulación
de un metabolito intermediario tóxico para la cepa (Sangari et al., 1994). La posterior
construcción de mutantes en el locus eri que retenían la patogenia demostró que estos genes no
son determinantes de la virulencia.
La identificación y el clonado de proteínas inducidas bajo heat-shock también fue
explorado. La inactivación insercional de las chaperonas DnaK y DnaJ condujo a la conclusión
de que DnaK, pero no DnaJ, es requerida para el crecimiento in vitro de Brucella a 37°C. Los
experimentos de infección realizados con ambas mutantes indicaron que la mutante dnaK de B.
suis es capaz de sobrevivir en fagocitos profesionales pero no de replicar, mientras que la cepa
parental salvaje y la mutante dnaJ multiplican normalmente (Köhler et al., 1996). En forma
similar, la generación de brucelas auxótrofas para purinas por deleción del gen purE atenúa el
crecimiento de B. melitensis en macrófagos (Crawford et al., 1996). Sin embargo, tanto la
mutante purE como la dnaK son cepas metabólicamente defectivas que presentan un
crecimiento anómalo in vitro y requieren medios suplementados y condiciones de cultivo
particulares. Por lo tanto estos defectos genéticos generales, aunque importantes e interesantes
para un posible desarrollo de nuevas cepas vacunales atenuadas, no pueden ser considerados
como factores de virulencia.
La observación de que las cepas rugosas, que carecen del antígeno-O del LPS, son
generalmente atenuadas o avirulentas condujo a hipotetizar que el LPS de Brucella sería
Introducción 27
esencial para la supervivencia intracelular y por lo tanto un factor de virulencia relevante (Riley
y Robertson, 1984; Schurig et al., 1991). Sin embargo estos estudios fueron realizados con
cepas rugosas obtenidas por pasajes sucesivos en medios selectivos o generadas
espontáneamente por medio de un mecanismo, cuyas bases genéticas aún se desconocen,
denominado “variación de fase”, mediante el cual las variantes rugosas aparecen en el cultivo
(Henry, 1933). La posterior generación de mutantes rugosas genéticamente definidas permitió
determinar que el LPS no juega un rol esencial en la invasión ni en la replicación intracelular,
aunque en el modelo murino de infección las mutantes rugosas son atenuadas o avirulentas
(Godfroid et al., 1998; Allen et al., 1998; Ugalde et al., 2000). Si bien estos trabajos
demuestran que la atenuación que presentan las cepas rugosas genéticamente definidas no se
debe a la incapacidad de replicar intracelularmente, las causas de la atenuación no están claras.
Es probable que la mayor susceptibilidad de estas cepas a la lisis mediada por complemento y/o
la inestabilidad de su membrana sean factores más relevantes para la virulencia que la simple
ausencia o presencia del LPS (Sangari y Aguero, 1996). De hecho, B. ovis y B. canis, los dos
únicos miembros con fenotipo rugoso del género Brucella, son completamente virulentas en
sus respectivos huéspedes mientras que B. neotomae, que naturalmente se presenta en fase lisa,
es no patogénica.
Otros candidatos explorados como posibles factores de virulencia fueron las proteínas
de membrana externa (OMPs). El rol hipotético que jugarían las OMPs en la virulencia fue
inferido a partir de la observación de que la respuesta inmune protectiva es generada en parte
contra estas proteínas. Sin embargo, si bien la respuesta inmune protectiva estimulada por las
OMPs está bien documentada para varios patógenos Gram(-) (Kuusi et al.,1979; Gilleland et
al., 1984), el rol que cumplen los anticuerpos anti-OMPs en la inmunidad de la brucelosis no es
claro. Los genes que codifican para varias proteínas de superficie y OMPs de Brucella han sido
clonados (Mayfield et al., 1988; Ficht et al., 1988; Tibor et al., 1994; Wergifosse et al., 1995).
Los estudios de disrupción genética demostraron que estos genes no tienen efecto sobre la
virulencia del patógeno.
Todos los esfuerzos conducentes a la identificación de los genes de virulencia descriptos
previamente no arrojaron resultados alentadores. El concepto “enterobacteria como modelo de
patógeno intracelular facultativo” y la hipótesis de que la bacteria encuentra un ambiente hostil
dentro de la célula huésped, han demostrado que no son aplicables a Brucella.
Introducción 28
La descripción reciente de los eventos intracelulares en la biogénesis de la vacuola que
contiene a Brucella junto a la de otros patógenos reveló que la estrategia seguida por Brucella
es más cercana a la de L. pneumophila y Chlamidiae que a la que despliegan enterobacterias
como Salmonella o Gram(+) como Listeria.
Un programa de búsqueda sistemática de genes por secuenciación de bibliotecas
genómicas llevado a cabo en nuestro laboratorio permitió identificar 925 nuevos genes que
representan aproximadamente el 20 % del genoma de B. abortus. El hallazgo más sorprendente
de este proyecto fue la cantidad de genes con alta identidad (superior al 55%) a genes
involucrados en la interacción entre patógenos y endosimbiontes del grupo α-2 de las
Proteobacterias con sus huéspedes vegetales (Ugalde, 1999; Sanchez et al., 2001).
Por
ejemplo, B. abortus posee genes idénticos a nodN, fixO, fixN, nodG, phaA, ndvB y bacA de
Rhizobium meliloti, los cuales participan en distintos procesos de la simbiosis con alfalfa como
la fijación de nitrógeno en el nódulo, la diferenciación del bacteroide o la síntesis de los
factores nod (Ugalde, 1999). Posee además genes idénticos a los que participan en el
catabolismo de octopinas y manopinas en los tumores formados por Agrobacterium
tumefaciens y genes con alta identidad a los responsables de la síntesis del flagelo. Cabe
destacar que Brucella es un patógeno que no forma flagelo ni fimbrias, por lo que puede
postularse que estos genes podrían ser parte de un sistema de secreción tipo-III presente en
Brucella.
Recientemente, Sola-Landa et al. identificaron en B. abortus los genes bvrS-bvrR, los
cuales codifican un sistema de dos componentes con una gran similitud a los sistemas ChvIExoS de R. meliloti y ChvI-ChvG de A. tumefaciens necesarios para la regulación de los
procesos que conducen a la endosimbiosis y la tumorigénesis respectivamente (Sola-Landa et
al., 1998). Las mutantes bvrR-bvrS de B. abortus muestran mayor sensibilidad a defensinas,
poseen una capacidad de invasión reducida tanto en células fagocíticas como no-fagocíticas,
son incapaces de replicar intracelularmente y de generar un proceso infectivo crónico en
ratones. En forma similar, Le Vier et al. aislaron un fragmento genómico de B. abortus que
codifica un gen idéntico a bacA de R. meliloti, necesario para la exitosa diferenciación de
Rhizobium y el establecimiento de la endosimbiosis en el nódulo. Las mutantes bacA de
Brucella son incapaces de replicar y sobrevivir dentro del macrófago y de establecer un proceso
de infección crónica en ratón (Le Vier et al, 2000). En nuestro laboratorio se identificó el gen
responsable de la síntesis de glucanos cíclicos de B. abortus (Iñon de Iannino et al, 1998; Iñon
Introducción 29
de Iannino et al., 2000). Los glucanos cíclicos han sido descriptos exclusivamente en miembros
del grupo α-2 de Proteobacterias, como Agrobacterium y Rhizobium, en los cuales cumplen
funciones esenciales para la interacción con las plantas huéspedes (Puvanesarajah et al., 1985;
Geremia et al., 1987). Las mutantes de B. abortus incapaces de sintetizar glucanos cíclicos
muestran una reducción significativa de la virulencia en el modelo murino.
Estos hallazgos, junto a la noción de que Brucella es un patógeno refinado que modula
la respuesta de la célula infectada para evitar la exposición a condiciones hostiles o de estrés,
ha permitido generar un nuevo marco conceptual más acertado que el precedente para encarar
el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad.
Aspectos inmunológicos de la brucelosis
La inmunidad protectiva contra la infección por Brucella ha sido estudiada
principalmente en el modelo murino. El criterio usado para estimar el grado de protección es el
recuento de unidades formadoras de colonias (ufc) recuperadas del bazo o hígado a
determinados intervalos de tiempo después del desafío con una cepa virulenta. Los
experimentos de inmunización pasiva y activa demostraron que la respuesta inmune protectiva
en ratón es tanto del tipo humoral como celular (Joint WHO/FAO/OIE report, 1997).
El primer antígeno brucélico que demostró ser protectivo fue el lipopolisacárido liso (SLPS). Estos experimentos se llevaron a cabo mediante transferencia pasiva de anticuerpos
monoclonales (Mabs) dirigidos contra la cadena-O del S-LPS. En cambio, anticuerpos
monoclonales contra el lipopolisacarido rugoso (R-LPS) reconocen débilmente a las bacterias
en fase lisa y por consiguiente no muestran un grado de protección significativa ante el desafío
con cepas lisas (Joint WHO/FAO/OIE report, 1997). El efecto protectivo del S-LPS también ha
sido demostrado por medio de experimentos de inmunización activa utilizando como
inmunógeno distintas preparaciones de S-LPS acoplado a seroalbúmina o a porinas de Brucella
(Jacques et al.,1991; Winter et al., 1988). En resumen, estos datos indican que el S-LPS y más
precisamente el antígeno-O, juegan un rol importante en la inmunidad protectiva contra la
brucelosis. Sin embargo otros antígenos, probablemente proteicos, deben estar involucrados en
la protección, dado que los experimentos de inmunización pasiva o activa mediada por
anticuerpos basados en el S-LPS, si bien reducen significativamente el nivel de infección, no la
eliminan por completo. Además está documentado que la vacunación con cepas rugosas que
Introducción 30
carecen del antígeno-O, es un medio eficaz para proteger ratones contra el desafío con cepas
lisas virulentas de B. abortus, B. suis y B. melitensis (Winter et al.,1996).
La inmunidad protectiva mediada por células contra B. abortus, ha sido demostrada por
medio de experimentos de transferencia pasiva de esplenocitos enriquecidos en células T. La
transferencia de células combinadas con suero inmune ha dado mejores niveles de protección
que la transferencia individual de ambas fracciones. Los experimentos de transferencia pasiva
después de la depleción in vivo usando Mabs anti-CD4 o anti-CD8 o con subpoblaciones
purificadas de células CD4 y CD8 sugieren que ambas subpoblaciones T están involucradas en
la protección mediada por células. Por lo tanto, la resistencia adquirida a la infección por B.
abortus en ratón, es resultado de los efectos combinados, y probablemente interactivos, de los
anticuerpos y células T efectoras de ambos linajes (Araya et al, 1989).
Estudios posteriores utilizando como modelo la infección de ratones knock-out para los
complejos mayores de histocompatibilidad I y II (MHC-I y MHC-II), demostraron que las
células T-CD8 juegan un rol importante durante la eliminación de brucelas después del pico de
infección, tal vez porque lisan macrófagos infectados (Oliveira y Splitter, 1995).
Las citoquinas involucradas en la respuesta inmune celular contra la infección primaria
por B. abortus han sido estudiadas también en el modelo murino. Citoquinas proinflamatorias
como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleuquina 1 (IL-1), IL-6 y factor
estimulante de colonia-granulocito-macrófago (GM-CSF) así como citoquinas derivadas de
células T como interferón gama (IFN-γ), IL-12 e IL-10 pero no IL-4 han sido detectadas en los
sobrenadantes de esplenocitos de animales infectados reestimulados con antígenos brucélicos
(Liautard et al., 1996; Jiang y Baldwin, 1993). El rol de estas citoquinas en el control de la
infección ha sido investigado por inyección de citoquinas recombinantes o por inhibición de la
actividad usando Mabs específicos. Las citoquinas derivadas de macrófagos, como IL-1, IL-12
y TNF-α, contribuyen al control de la infección temprana por Brucella: IL-12 estimulando a las
células NK y T para producir IFN-γ y TNF-α por la vía independiente de IFN-γ, probablemente
para reclutar fagocitos en el sitio de la infección, activar macrófagos y promover la formación
de granulomas (Zhan y Cheers, 1995; Fernandez-Lago et al., 1996).
El IFN-γ es una de las citoquinas más importantes en la resistencia a la infección por B.
abortus. Es un potente activador de macrófagos y monocitos, su actividad metabólica es
producir intermediarios oxidativos y otras moléculas microbicidas. De hecho se ha reportado
que el IFN-γ es capaz de reducir el crecimiento de Brucella en macrófagos, aunque no es
Introducción 31
suficiente para lograr la eliminación total de las bacterias intracelulares. Para el control efectivo
de las bacterias intracelulares se necesita la acción adicional de hierro y TNF-α, la producción
de oxido nítrico (NO), IL-2, IL-1, IL-6 y GM-CSF. En cambio, IL-10 e IL-4 contribuyen
negativamente a la resistencia contra la infección por B. abortus, porque inhiben las funciones
efectoras del macrófago y la producción de IFN-γ. En suma, estos datos indican que para la
resistencia óptima contra brucela, las vacunas deben estimular preferentemente la subpoblación
Th-1 (IFN-γ e IL-2) y no la subpoblación Th-2 (IL-4 e IL-10). Además, la respuesta Th-1 con
producción de IFN-γ promueve la secreción de anticuerpos del isotipo protectivo IgG2a e IgG3
contra el LPS. La inmunización de ratones con B. abortus muertas, a diferencia de las vivas,
resulta en la producción de citoquinas del tipo Th-1 y Th-2 sin estimular la secreción de TNF-α
(Zhan y Cheers, 1995; Zhan et al., 1996). También se ha demostrado que la inmunización de
ratones con extractos proteicos solubles de B. abortus resulta en una alta frecuencia de células
T-CD4 productoras de IL-4, lo que indica que la respuesta se orientó hacia el tipo Th-2.
Además, estas células CD4 productoras de IL-4, son incapaces de mediar la resistencia contra
la infección en los ratones receptores, mientras que los que recibieron células CD4 productoras
de IFN-γ pueden controlarla efectivamente (Zhan et al., 1995).
En conclusión, los datos actuales indican que tanto los anticuerpos contra el antígeno-O,
como la respuesta celular del tipo Th-1 inducida por proteínas, son necesarias para conferir un
grado de protección óptima contra B. abortus.
Requerimientos de una vacuna ideal contra la brucelosis
Por lo que se desprende de lo mencionado anteriormente, las vacunas vivas han
demostrado ser superiores a los productos inactivados o fracciones subcelulares para la
prevención de la brucelosis animal (Nicoletti, 1990). Las vacunas vivas son efectivas, baratas y
la inmunidad que generan es más persistente. Una vacuna viva ideal debería no producir
enfermedad en los animales vacunados, debería evitar la infección en ambos sexos en cualquier
edad, evitar el aborto y la esterilidad, proveer protección a largo plazo contra la infección y el
aborto con una única dosis, no estimular la generación de anticuerpos persistentes que
interfieran con la precisión de los serodiagnósticos durante la vigilancia epidemiológica, no ser
transmitida a otros animales si la cepa vacunal establece una infección latente de largo plazo,
ser biológicamente estable, no revertir a virulencia tanto in vitro como in vivo, no ser patógena
para el hombre, no contaminar carne ni leche y ser cultivable en condiciones de producción a
Introducción 32
gran escala (Adams, 1990). Además, una vacuna viva ideal debería contener marcadores
genéticos o fenotípicos que permitan diferenciarla fácilmente de las cepas virulentas de campo.
Vacunas corrientes contra la brucelosis bovina
El control de la infección en bovinos, especialmente en países con grandes poblaciones
ganaderas cuya producción es del tipo extensiva, se ha llevado a cabo con éxito por medio de la
vacunación con la cepa atenuada B. abortus S-19 (Nicoletti, 1990). Está ampliamente
documentado que la inmunización con B. abortus S-19 confiere un alto nivel de protección
contra la infección y el aborto producido por cepas patógenas de campo (Nicoletti, 1990).
Las características principales de la cepa 19 son la baja patogenicidad, la capacidad de
establecer una infección limitada en los bovinos que imita el proceso de infección natural por
cepas salvajes confiriendo protección y su sensibilidad a bajas concentraciones de eritritol en el
medio de cultivo. Sin embargo la causa de su atenuación aún permanece desconocida. Cabe
destacar que la cepa 19 fue obtenida por pasajes sucesivos en medios de cultivo a partir de una
cepa virulenta de B. abortus aislada de una vaca infectada.
A pesar del buen nivel de protección que confiere y de la marcada atenuación, la cepa
19 dista de ser una cepa vacunal ideal. Se han reportado casos de infección humana provocados
por inoculación accidental con la cepa 19 y en muchos casos, si se suministra a bovinos
preñados es capaz de inducir aborto.
Sin embargo estas no son las principales desventajas de esta cepa vacunal. Debido a la
similitud antigénica que comparte con las cepas lisas virulentas, en particular respecto de la
estructura de S-LPS, la cepa B. abortus S-19 genera anticuerpos anti-LPS que son persistentes e
indistinguibles de los generados por infecciones naturales provocadas por cepas salvajes
(Nicoletti, 1990; Sutherland y Searson, 1990). Esta característica indeseable complica la
interpretación de los test serodiagnósticos utilizados corrientemente durante las campañas de
vigilancia epidemiológica y vacunación masiva para el control de la enfermedad, dado que
todos ellos se basan en la detección del antígeno inmunodominante de Brucella, el S-LPS.
Debido a este inconveniente se han propuesto y diseñado varias alternativas con el
objeto de solucionarlo. Entre las más importantes se pueden destacar las siguientes:
(1) La generación de nuevas cepas vacunales vivas rugosas que carezcan del antígeno-O
y por consiguiente que no estimulen la generación de anticuerpos anti-S-LPS.
Introducción 33
(2) La generación de cepas vacunales vivas en fase lisa que sean defectivas para la
expresión de una proteína inmunodominante. Esta estrategia permitiría discriminar
entre animales infectados de vacunados por la ausencia de anticuerpos contra el
marcador en los animales vacunados.
(3) La generación de nuevos test diagnósticos que permitan diferenciar los anticuerpos
generados por la vacunación con S-19 de los generados por una infección natural.
Las tres primeras alternativas han sido exploradas por varios grupos de trabajo en el área.
La generación de nuevas cepas vacunales rugosas ha arrojado resultados alentadores. La
cepa rugosa B. abortus RB51 fue obtenida por medio de pasajes sucesivos de la cepa virulenta
B. abortus S-2308 en medios de cultivo suplementados con el antibiótico rifampicina (Schurig
et al., 1991). Esta cepa carece del antígeno-O del LPS lo que confiere el fenotipo rugoso. En
consecuencia es incapaz de estimular la generación de anticuerpos anti-cadena-O, que son los
inmunodominantes durante la infección y los que generan problemas cuando se realiza el
serodiagnóstico. En el ganado, su efecto protectivo es similar al producido por la cepa 19, es
rápidamente eliminada del animal y su efecto abortivo es muy reducido o nulo. Puede ser
fácilmente diferenciada de otras cepas de B. abortus por electroforesis en campos pulseados o
por PCR. Sin embargo, los animales vacunados con RB51 no reaccionan ante los
serodiagnósticos convencionales para brucelosis. Este hecho puede ser más perjudicial que
benéfico ya que invalida los test corrientes para la detección del mal. Por lo tanto la utilización
de una cepa rugosa en una campaña de vacunación masiva requiere la implementación de un
serodiagnóstico que discrimine en forma sencilla a los animales vacunados de los infectados.
Recientemente esta cepa ha sido condicionalmente licenciada en los Estados Unidos para su
uso en bovinos. Desde ese momento se han denunciado 32 casos de exposición accidental a la
cepa RB51. Tres de estas 32 personas desarrollaron signos de inflamación en el sitio de la
inoculación seguido por fiebre intermitente, cefaleas, mialgias y niveles elevados de
transaminasas y lactato deshidrogenasa en suero (MMWR, 1998). El hecho de carecer de un
diagnóstico específico para la detección de los animales vacunados con RB51 resulta una seria
desventaja para su uso en grandes poblaciones animales. Mutantes rugosas de B. abortus en el
gen rfbU que codifica para la fosfomanomutasa y para el gen pgm, que codifica para la
fosfoglucomutasa, están siendo probadas como nuevas cepas vacunales rugosas (Winter et al.,
1996; Ugalde et al., 2000).
Introducción 34
La segunda alternativa es la generación de cepas vacunales con deleciones en algún gen
que codifique para un antígeno inmunodominante. Tales mutantes no deberían inducir
respuesta de anticuerpos contra el antígeno escogido. Este antígeno podría servir para
desarrollar un test de detección inmunológica que permita identificar a los animales infectados
de los vacunados. Pero esta estrategia implicaría que bajo el hipotético test diagnóstico, los
animales cuyo resultado sea positivo serían con certeza considerados como “infectados”
mientras que los que obtengan un resultado negativo caerían dentro de la categoría “probables
vacunados/no vacunados”. Por consiguiente los animales con resultado negativo en el primer
test deberían ser sometidos a un segundo test diagnóstico que confirme su status inmunológico.
Si bien esta alternativa es factible, para países como la Argentina es inviable por el alto costo
que implica la implementación de dos serodiagnósticos distintos en una campaña de control de
la brucelosis.
En los últimos años se han desarrollado nuevos test diagnósticos que permiten superar
los problemas generados por la vacunación con S-19. Entre ellos se puede destacar el método
de Elisa competitivo desarrollado por K. Nielsen (Nielsen et al.,1995). Este método se basa en
la detección de anticuerpos contra la cadena-O del S-LPS. Los animales vacunados pueden ser
facilmente discriminados de los infectados ya que a los tres meses post-vacunación con S-19,
los títulos de inmunoglobulinas contra la cadena-O caen por debajo de un valor de cut-off
determinado experimentalmente, mientras que los títulos anti-cadena-O de los animales en un
proceso de infección activa permanecen por encima de ese valor.
Un alternativa aún no explorada es la generación de una cepa vacunal que exprese un
antígeno heterólogo. Esto resultaría en una vacuna etiquetada con una marca antigénica
distintiva que permitiría la rápida y sencilla diferenciación entre animales vacunados de
infectados. Además, el desarrollo de la tecnología para la expresión de antígenos heterólogos
en Brucella permitiría explorar su uso como posible “carrier” de antígenos heterólogos
protectivos contra otros patógenos del ganado. Esto resultaría en una vacuna viva bi o
polivalente. La segunda parte de esta tesis trata este tema.
Resultados 35
PARTE I
Identificación de un fragmento genómico de B.abortus con alta similitud a sistemas de
secreción tipo-IV
Como parte de un esfuerzo para identificar secuencias genómicas de B. abortus llevado
a cabo en nuestro laboratorio (Ugalde, 1999; Sanchez et al, 2001), se aisló un fragmento
genómico que mostraba una homología significativa con la región C-terminal del gen virB9 y
con la región N-terminal del gen virB10 de Agrobacterium tumefaciens y ptlG y ptlH de
Bordetella pertussis. En A. tumefaciens, estos genes pertenecen al operón virB que codifica una
maquinaria multimolecular responsable de la transferencia del T-DNA de la bacteria al núcleo
de la célula vegetal. Los genes homólogos en B. pertussis son miembros del operón ptl que
codifica el sistema de secreción de la toxina pertussis.
El clon identificado, denominado B2A3, fue secuenciado completamente y utilizado
como sonda en un experimento de hibridación contra una genoteca de cósmidos de B. abortus
2308 con el objeto de aislar la secuencia completa de los mismos. Este procedimiento condujo
a la identificación de los cósmidos reactivos pVK8.3, pVK8.25 y pVK8.38. Se purificó el ADN
de los tres cósmidos y se los digirió con diferentes enzimas de restricción para analizar el
tamaño de los insertos por Southern blot usando como sonda el clon B2A3. El análisis reveló
que el cósmido pVK8.3 contenía el inserto más pequeño (20 kb).
En forma simultanea e independiente a nuestro trabajo, el grupo de O’Callaghan en
Nîmes, Francia, analizando un banco de mutantes por transposición de B. suis incapaces de
replicar en células HeLa, identificó un clon que contenía una secuencia genómica con alta
similitud al gen virB10 de A.tumefaciens. Posteriormente los investigadores identificaron la
secuencia completa de una región genómica de 11.860 pb que contiene 11 ORFs homólogos al
operón virB de A. tumefaciens (O’Callaghan et al., 1999). Para la misma época, el grupo de
Ficht en Texas, USA, identificó por medio de STM (Signature-Tagged Mutagenesis) dos
mutantes por transposición en B. abortus idénticas a las recién publicadas de B. suis (virB1 y
virB10) que eran incapaces de establecer un proceso de infección crónica en ratón (Hong et al.,
2000).
Con el objeto de acelerar el proceso de clonado y secuenciación del locus virB de B.
abortus, se decidió entonces encarar el secuenciado tomando como base la secuencia
correspondiente al locus virB de B. suis dado el alto grado de identidad de secuencia entre
ambas especies. Para ello se diseñaron un set de 44 primers para obtener 22 amplicones
solapados de tamaño promedio 530 pb que sumados a los 1.500 pb del clon B2A3 ya
Resultados 36
secuenciados cubren el locus virB completo. Ocho clones independientes de cada amplicón
fueron sometidos a secuenciación automática y las secuencias fueron ensambladas y editadas
(para detalles ver la sección correspondientes Procedimientos Experimentales).
Análisis de secuencia del locus virB
El análisis de la secuencia del locus virB de B. abortus reveló la presencia de 13 ORFs
colineales en la misma orientación, contenidos en un locus de 11.767 pb según se esquematiza
en la Fig. 1. Cabe destacar que el arreglo de todos los ORFs conserva la misma distribución y
orientación que el operón virB de A.tumefaciens y el operón ptl de Bordetella pertusiss, un
fenómeno denominado sintenia. En consecuencia, denominamos virB a los 11 primeros ORFs
con identidad a los correspondientes virB1-virB11 de A. tumefaciens. Los dos ORFs localizados
río abajo de virB11,
que no están presentes en A.tumefaciens ni en B. pertusiss, se
denominaron ORF13 y ORF12 respectivamente.
Los 13 ORFs están precedidos por potenciales sitios de unión a ribosomas con
homología a las secuencias consenso Shine-Dalgarno de E. coli. La mayoría de los sitios de
unión a ribosomas y/o los codones de iniciación se solapan con las secuencias terminales de los
ORFs que los preceden, lo que sugiere que los mismos están transcripcionalmente acoplados.
Este fenómeno también se observa en A. tumefaciens y B. pertussis.
Fig. 1. Representación esquemática del operón virB de B. abortus
Hay dos regiones intergénicas cortas entre virB5-virB6 (184 pb) y virB6-virB7 (164 pb).
Entre virB1 y virB2 hay una gran región intergénica de 436 pb que contiene una secuencia
repetitiva palindrómica degenerada de 121 pb, similar a las secuencias repetitivas BruRS1 que
son características de regiones intergénicas de Brucella y que probablemente funcionen como
sitios de inserción de IS711. Una segunda secuencia repetitiva palindrómica degenerada de 138
pb está presente río abajo del ORF12, en este caso la secuencia es similar a las BruRS2
previamente descriptas (Halling and Bricker, 1994). La presencia de ambas secuencias
repetitivas en los extremos del locus virB sugiere que el mismo podría haberse adquirido por
Resultados 37
transferencia horizontal. Sin embargo la región tiene un contenido de GC que no diverge
significativamente al del resto de genoma (55.5% versus 57%). Estas secuencias repetitivas
están organizadas en forma similar a las descriptas en el locus virB de B. suis excepto por una
inversión de 18 pb de la región flanqueada por la repetición invertida al final del locus de B.
abortus.
El análisis comparativo entre el locus virB de B. abortus y B. suis indicó que ambos son
99,7% idénticos. Sin embargo se pudieron observar dos diferencias significativas: 1) B. abortus
2308 posee una deleción de 9 pb “en fase” en la posición 8.897 correspondiente al gen virB10
respecto de la homóloga en B. suis; 2) en la posición 10.739 correspondiente a la región 3’ del
gen virB11, B. abortus posee una inserción de 1 base lo que resultaría en una proteína de 363 aa
de longitud que difiere del tamaño predicho para la equivalente en B. suis, cuya longitud es de
397 aa. Las homólogas VirB11 de B. abortus y B. suis son 99% idénticas en los primeros 309
aa, pero las secuencias divergen significativamente en la porción C-terminal debido a la
inserción de 1 base presente en B. abortus. Para discernir si esta diferencia refleja una
divergencia real entre ambas proteínas o es debida a un error del proceso de secuenciación, se
amplificaron, clonaron y secuenciaron las regiones correspondientes al 3’ del gen virB11 de B.
abortus S-19, B. suis 1330 y el miembro más divergente del grupo, B. ovis REO198.
Encontramos que todas las secuencias analizadas codifican para un producto predicho de 363
aa idéntico al de B. abortus 2308. Por lo tanto la diferencia fue debida a un error en la
secuencia publicada del locus virB de B. suis 1330.
Proteínas codificadas por el locus virB de Brucella abortus
Con el objeto de buscar similitudes de secuencia que proporcionen algunas claves sobre
las funciones bioquímicas de las proteinas VirB de Brucella abortus, se compararon las
secuencias codificadas en el locus virB con proteinas depositadas en bases de datos. Este
análisis mostró que las proteínas codificadas por la región virB son similares a los componentes
descriptos en otros sistemas de secreción tipo-IV como el operón ptl de B. pertussis, el operón
virB de A. tumefaciens y los sistemas de transferencia de los plásmidos IncN e IncP entre otros.
VirB1 posee una secuencia consenso para clivaje del péptido señal y contiene motivos
aminoacídicos conservados que estan presentes en lisozimas eucarióticas y transglicosidasas
líticas solubles de fagos y bacterias, por lo que pertenece a esta familia de proteinas. Las
transglicosidasas líticas solubles (SLT) de bacterias degradan la mureína clivando el enlace
Resultados 38
β1,4-glicosídico entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina con la formación
concomitante de una unión 1,6 anhidro en el residuo del ácido murámico. Un dominio de
alrededor de 90 aa localizado en la porción C-terminal de las SLT está presente en VirB1 así
como en un gran número de proteínas procarióticas y de fagos (Mushegian et al., 1996). Este
dominio SLT está involucrado en la actividad catalítica.
1
1
D L I I K A A E K Y G I D P S L L A A I A Q Q E S G F N P N A I S G S G A V G L consenso SLT
F L V L A Q Q C A P T V A P Q T M A A I V Q V E S G F N P Y A I G V V G G R L V virB1
41
41
M Q I M P - - - - - S T A K A L G L K G - - - - - - I P G E D - - - - - - - - - consenso SLT
R Q P V S L D E A I T T A Q S L E A K G W N F S L G I A Q V N R Y N L P K Y G S virB1
61
81
- - - D L L D P C D N I S A G A K Y L K H L Y K R F - - - - - - - - G G N L W L consenso SLT
T Y A Q A F D P C K N L K M G S K I L E D C Y R R A I V K M P G Q E Q G A L R A virB1
90 A L A A Y N A G
121 A F S C Y Y A G
consenso SLT
virB1
Decoration 'Decoration #1': Shade (with solid deep red) residues that match consenso
VirB2 posee una secuencia para el procesado del péptido señal por lo que
probablemente sea secretada. Contiene también dos regiones con alta probabilidad de formar
hélices transmembranas hidrofóbicas, estas regiones están conservadas en todas sus homólogas.
Los dos residuos alanina que preceden el sitio de clivaje del péptido señal en TrbC se
encuentran conservados en una posición comparable en VirB2 de B. abortus y PtlA de B.
pertussis (ver recuadro en la figura inferior). Además, se encuentra también presente, en una
posición relativa similar, la secuencia AEIA requerida para el clivaje del tetrapéptido Cterminal y el proceso de ciclado, por lo que es probable que VirB2 sea también una pilina
cíclica (ver recuadro en la figura inferior).
La homóloga a VirB2 de A.tumefaciens es la subunidad principal del pilus-T. Si bien
estructuras tipo pili no han sido observadas en Brucella, los estudios de microscopía electrónica
de los estadios intracelulares de la bacteria son escasos, por lo que no puede descartarse que
Resultados 39
este tipo de apéndices estén presentes durante el proceso de maduración del nicho replicativo
intracelular.
VirB4 y VirB11 poseen motivos de unión a nucleótidos trifosfato del tipo Walker-A
(GQSGAGKT, residuos 544-551 en virB4 y GETGSGKTT, residuos 184-192 en virB11).
Ambos motivos son esenciales para la funcionalidad del complejo virB de Agrobacterium.
VirB4 y VirB11 no presentan consensos para clivado del péptido señal ni dominios
transmembranas por lo que su probable localización es en el citoplasma o asociadas a la
membrana interna como se ha reportado para todas las homólogas.
VirB4 presenta en la porción C-terminal de su secuencia un motivo conservado de
alrededor de 200 aa que está presente en todos los miembros de la familia de ATPasas de
transporte tipo IV.
VirB11 presenta motivos conservados con la superfamilia de ATPasas presentes en los
sistemas de secreción tipo II y Tipo IV, que a su vez se subdividen en las familias PilB
(sistemas Tipo II) y virB11 (sistemas Tipo IV) (Planet et al., 2001). En el recuadro se muestra
el motivo Walker A de unión a NTP.
Resultados 40
VirB6 tiene seis probables dominios transmembrana y no posee consenso para
procesado del péptido líder por lo que probablemente sea una proteína integral de la membrana
interna. Por analogía con el modelo de A. tumefaciens, VirB6 podría formar el poro del canal
de secreción y por consiguiente interactuaría con los sustratos secretados. Por cierto, virB6
muestra un menor grado de identidad de secuencia con PtlD de B. pertusis respecto del resto de
las proteínas virB. Esta diferencia podría reflejar diferencias en los sustratos secretados por los
distintos sistemas.
VirB7 posee consenso para clivaje de péptido señal tipo II característicos de
lipoproteínas procarióticas (LA↓GCTTT, residuos 14-20) por lo que probablemente sea una
lipoproteína anclada a la envoltura externa como en el sistema de Agrobacterium y Bordetella.
En estos sistemas, VirB7 forma un complejo covalente con VirB9 a través de un puente
disulfuro que es esencial para la síntesis o la estabilidad de VirB4, 5, 8, 9, 10 y 11 (Zupan et al,
1998). VirB9 de B. abortus posee sólo un residuo cisteína que se encuentra dentro del péptido
señal. Por lo tanto la posible interacción con VirB7 en el sistema de Brucella no sería por
medio de la formación de un puente disulfuro. De hecho se ha demostrado en A. tumefaciens
que ambas proteinas pueden dimerizarse aún en ausencia de cisteínas (Baron et al, 1997; Das et
al, 1997). Además la homólogas TraF del pKM101 y TrwF del R388 carecen de residuos
cisteínas.
VirB10 carece de consensos de secreción pero presenta un probable dominio
transmembrana en la porción N-terminal (aa 33-52), por lo que podría tratarse de una proteína
integral de la membrana interna como se ha observado en el sistema de Agrobacterium.
ORF 13 codifica para una proteína hipotética de 83 aa de probable localización
citoplásmica que no posee similitudes con ninguna proteína depositada en las bases de datos.
Resultados 41
En cambio el ORF12 codifica para una proteína de 172 aa que posee consenso para clivaje por
peptidasa tipo II característicos de lipoproteínas (LAA↓CSSP, residuos 13-19) y muestra
similitudes con la proteína, Upf30.5, codificada en el sistema de conjugación del plásmido
R751 de Enterobacter aerogenes (Thorsted, et al., 1998), pero no posee homologías evidentes
con el resto de los sistemas tipo-IV descriptos. La porción C-terminal de ORF12 presenta un
dominio conservado presente en la familia de proteínas OmpA. Esta familia está compuesta por
proteinas de membrana externa, en su mayoría porinas y lipoproteínas.
A continuación se muestran las similitudes entre las proteínas VirB de B. abortus con
las presentes en los sistemas de secreción tipo IVde B. pertussis y A. tumefaciens.
B. abortus VirB
% de Identidad (I) y Similitud (S) con otros sistemas
Tipo IV
Ptl
VirB C58
Tra pKM101
Probable Localización/Función
ORF
MW (kD)
I
S
I
S
I
S
1
25.3
23
--
--
33
46
41
54
Periplasma/ME, Transglicosidasa
2
11.1
7.4
45
57
19
50
20
52
ME, Pilina/contacto celular
3
13
35
52
27
42
26
42
MI, desconocida
4
94.5
51
67
30
49
30
49
Citoplasma, ATPasa de transporte
5
26.8 24.6
--
--
24
45
31
51
ME, componente del pilus
6
36.1
19
41
20
36
20
42
7
5.9
39
56
27
52
25
56
8
26.5
41
65
29
42
36
55
Transmembrana, formación del poro
ME, Lipoproteína, complejo con
VirB9?
MI periférica, desconocida
9
31.9
45
58
27
42
28
45
ME, complejo con VirB7?
10
41.2
35
52
39
59
35
53
Integral de MI, desconocida
11
40.9
46
59
36
54
31
48
Citoplasma, ATPasa de transporte
13
9.2
--
--
--
--
--
--
Citoplasma? , desconocida
12
19
--
--
--
--
--
--
Lipoproteína, desconocida
4.3
30
17.5
Resultados 42
Los genes virB constituyen un operón que se transcribe al comienzo de la fase estacionaria
Si bien la mayoría de los genes del locus virB se solapan, lo que indicaría que están
transcripcionalmente acoplados, la presencia de una gran región intergénica conteniendo una
secuencia repetitiva palindrómica entre los genes virB1 y virB2 podría indicar que virB1 no
forma parte del mismo policistrón. Con el objeto de estudiar como estos genes son expresados
en brucela, se construyeron dos tipos de fusiones transcripcionales. En primer lugar, un cassette
lacZ-accI sin secuencias promotoras, fue insertado en el sitio NruI de la secuencia codificante
del gen virB10, generándose la cepa mutante B. abortus 2308 virB10::lacZ-accI. En segundo
lugar, para determinar si los genes virB funcionan como un operón comenzando desde virB1, se
insertó un cassette polar que confiere resistencia a kanamicina en el sitio BamHI de la secuencia
codificante del gen virB1. Este constructo fue insertado en el genoma de la cepa B. abortus
virB10::lacZ-accI para generar la doble mutante B. abortus virB1::Km virB10::lacZ-accI (Fig.
2).
Fig. 2 Esquema de las fusiones transcripcionales en virB10. En el gráfico se representan las fusiones
transcripcionales utilizadas en los ensayos de actividad β-galactosidasa
Ambas mutantes fueron usadas en ensayos de medición de la actividad β-galactosidasa
durante el crecimiento vegetativo. Como se grafica en la Fig. 3, la actividad β-galactosidasa
comienza a incrementarse a partir de la 20 hs de crecimiento en la mutante virB10::lacZ-accI a
medida que se reduce la pendiente de la curva de crecimiento, alcanzando un valor de inducción
30 veces mayor a las 36 h (DO600 2.6). Sin embargo la actividad β-galactosidasa no se
incrementa cuando una mutación polar es introducida en virB1. Estos resultados indican que el
Resultados 43
locus virB es un operón transcripto desde virB1 al comienzo de la fase estacionaria de
crecimiento.
Fig. 3 Ensayo de actividad β-galactosidasa. En A) se muestran los valores de actividad β-galactosidasa para las
mutantes virB10::lacZ-accI (z) y virB1::Km, virB10::lacZ-accI ({). En B) se muestran los valores de DO600
correspondientes a los puntos indicados en el gráfico superior. Los valores de actividad se expresan como A420×
Vol/A600
Los genes virB son esenciales para la replicación intracelular
Uno de los aspectos más enigmáticos de la presencia del operón virB en B. abortus es el
rol que juega en la biología de esta bacteria. A pesar de los enormes esfuerzos llevados a cabo
en varios laboratorios durante la pasada década, muy pocos determinantes de la virulencia han
sido descriptos hasta la fecha. La ausencia de plásmidos en el género Brucella, así como la
ausencia de exotoxinas, indicarían en principio que el operón virB cumple una función distinta a
la descripta en A.tumefaciens y B. pertussis.
La función del operón virB de Brucella fue estudiada en células HeLa, por medio del
análisis del comportamiento intracelular de distintas mutantes en ensayos de protección a la
gentamicina. Este ensayo permite cuantificar la tasa de crecimiento intracelular dado que la
gentamicina/estreptomicina elimina diferencialmente a las bacterias extracelulares sin afectar a
Resultados 44
las intracelulares. Las monocapas (1×105 células por pocillo) fueron inoculadas con B. abortus
2308 (cepa virulenta) o las distintas mutantes, a una multiplicidad de infección (MOI) de 500 en
medio MEM completo e incubadas por una hora. Finalizado el período de infección, los pocillos
fueron lavados extensivamente para eliminar las bacterias no adherentes y se agregó medio
fresco conteniendo gentamicina y estreptomicina. A diferentes tiempos postinfección (p.i.) los
pocillos fueron lavados, las células lisadas y se determinó el número de bacterias viables
intracelulares.
Para determinar el comportamiento de una mutación que afecta al operón virB en
conjunto, se construyó una mutante polar en virB1 por inserción de un cassette que confiere
resistencia a kanamicina y que posee secuencias terminadoras (Oka et al., 1981). En la Figura 4
se observa que a las 4 h p.i., las UFC intracelulares de la cepa parental y mutante polar virB1 son
similares. Sin embargo a tiempos mayores (24 y 48 h p.i.) las UFC de la mutante comienzan a
decrecer, no pudiéndosela aislar a las 48 h p.i., mientras que la cepa parental crece
exponencialmente alcanzando 7.4×107 UFC/ml en el mismo período. Los ensayos de exclusión
de Tripan Blue indicaron que no había diferencias en la viabilidad celular entre las células
infectadas con la cepa parental y la mutante. El fenotipo de la mutante polar virB1::Km pudo ser
revertido al introducir en la misma el cósmido pVK8.3 que contiene el operón virB completo,
mientras que el plásmido pBBR4virB1, que contiene sólo al gen virB1 bajo el promotor lac, fue
incapaz de reestablecer el fenotipo replicativo parental, lo que confirma la naturaleza polar de la
mutación introducida en virB1.
Fig. 4 Replicación intracelular de la cepa parental y de la mutante polar virB1 en HeLa. Las monocapas de
células fueron inoculadas como se indica en Proc. Experimentales. Las UFC intracelulares de cada cepa fueron
determinadas para cada punto indicado. Cada valor es el promedio de tres experimentos independientes realizados
por duplicado. En todos los casos el error estándar es menor al 5 %.
Resultados 45
Con el objeto de extender el análisis a otros genes del locus virB se construyeron las
siguientes mutantes: una mutante por inserción de un cassette no polar en el gen virB9, una
mutante por remplazo del gen virB11 y una mutante por inserción de un cassette polar en el
ORF13. El comportamiento de las mismas fue analizado en células HeLa.
Fig.5 Replicación intracelular de las mutantes virB9 y virB11. En el panel de la izquierda se muestra el
comportamiento intracelular de la mutante no polar virB9::Gm (F) y de la misma mutante complementada (J). El
panel de la derecha muestra el comportamiento intracelular seguido por la mutante ΔvirB11 (F) y el de su
correspondiente complementada (J) Cada valor representa el promedio y el desv. std. de tres experimentos
independientes hechos por duplicado.
Como se muestra en la Fig. 5, las mutantes virB9 y virB11 fueron incapaces de
sobrevivir y replicar intracelularmente en forma similar a lo observado con la mutante polar
virB1. El defecto provocado por estas mutaciones pudo ser revertido al sobreexpresar virB9 y
virB11 respectivamente y no se observaron diferencias en la viabilidad celular entre las células
infectadas con la cepa parental o las distintas mutantes.
En cambio, como puede observarse en la Figura 6, la mutación introducida en el ORF13
no afectó la capacidad de B. abortus para sobrevivir y replicar intracelularemente en HeLa, dado
que no se observaron diferencias significativas entre esta mutante y la cepa parental virulenta.
Fig. 6 Replicación intracelular de la mutante polar ORF13::Km.
El gráfico muestra el patrón de replicación intracelular en HeLa de la
mutante polar ORF13::Km. Cada valor representa la media más el
desv. std. de tres experimentos independientes realizados por
duplicado.
Resultados 46
El análisis de todos estos resultados en conjunto indica que el operón virB de Brucella
es esencial no sólo para la replicación intracelular sino para la sobrevida de la bacteria después
de su entrada a la célula huésped, y aparentemente no está involucrado en el proceso de
invasión, dado que no se observaron diferencias en las UFC durante las primeras horas p.i.. No
se observó daño celular en los cultivos inoculados con las cepas mutantes o parental, por lo tanto
la falta de recuperación de mutantes viables no fue resultado de la muerte celular sino del
control efectivo de la supervivencia intracelular del patógeno. A pesar de que las mutaciones
introducidas en el operón virB son de distinta naturaleza (inserciones polares, no-polares,
reemplazo génico), los correspondientes fenotipos son similares. Esto sugiere, como fue
observado en otros sistemas tipo–IV descriptos previamente, que la presencia de todos los
componentes del aparato de secreción son necesarios para el correcto ensamblaje y función del
mismo.
Los resultados obtenidos con la mutante polar en el ORF13 sugieren que los dos ORF
adicionales presentes en el locus virB de Brucella probablemete no participen en la formación
del complejo VirB. Datos similares fueron obtenidos en el laboratorio de O’Callaghan con una
mutante por inserción en el ORF12 de B. suis. Esta mutante es capaz de replicar en forma
similar a la cepa parental en monocitos humanos, de lo que se concluye que también es
dispensable para la replicación en líneas macrofágicas (O’Callaghan et al, 1999).
Efecto de distintas mutaciones en virB10 sobre la replicación intracelular
La proteína VirB10 es uno de los componentes más representados en todos los
transportadores tipo IV descriptos, incluso hay homólogos presentes en los sistemas de Mating
Pair Formation (Mpf) de los plásmidos IncP RK2 y el sistema Trb del plásmido Ti de
A.tumefaciens. VirB10 es una proteína integral de la membrana interna con un pequeño dominio
citoplasmático, una región transmembrana y un gran dominio periplasmático, pero la función
que cumple dentro de la maquinaria virB no está del todo clara, aunque se sabe que es un
miembro importante del canal de transporte conformado por las proteínas VirB 6, 7, 8, 9.
Para analizar el rol que cumple virB10 en B. abortus, se construyeron dos tipos de
mutantes por inserción: la mutante virB10::Km tiene insertado en el sitio NruI, un cassette polar
que confiere resistencia a kanamicina; la mutante virB10::accI tiene insertado en el mismo sitio
un cassette no-polar que confiere resistencia a gentamicina (ver Fig. 7). En ambas mutantes la
secuencia codificante de virB10 fue interrumpida en el aa 201.
Resultados 47
Fig. 7 Representación esquemática de las mutaciones introducidas en virB10.
El comportamiento intracelular de ambas mutantes fue analizado en células HeLa en
ensayos de protección a la gentamicina. Como se muestra en la Fig. 8, durante las primeras 8 h
p.i. el número de bacterias intracelulares de ambas mutantes no mostró diferencias significativas
respecto de la cepa parental. Sin embargo, a partir de las 8 h p.i., la cepa salvaje comienza a
replicar exponencialmente mientras que ambas mutantes se ven severamente afectadas en la
capacidad de sobrevivir en HeLa, siendo completamente eliminadas a las 48h p.i. cuando la cepa
salvaje ha alcanzado 1.38×107 UFC/ml. En ningún caso se observó daño celular, por lo tanto la
falta de recuperación de mutantes viables se considera resultado del control efectivo de la
supervivencia y multiplicación intracelular de la bacteria. La mutante no-polar virB10
conteniendo el plásmido pBBR2virB10 y la mutante polar virB10 conteniendo el cósmido
pVK8.3 revierten el fenotipo mutante a niveles similares a los de la cepa parental, lo que
demuestra el rol esencial que juega este gen en la funcionalidad de la maquinaria virB necesaria
para la vida intracelular de Brucella.
Fig 8. (A) Replicación intracelular de las mutantes virB10 en HeLa. (Ο) Cepa parental B. abortus 2308.(Q)
Mutante no-polar virB10::Gm. (▲) Mutante polar virB10::Km. (B) Replicación intracelular de las mutantes
complementadas. Los símbolos indican las correspondientes mutantes complementadas como en (A). Cada valor
es la media más el Des. Std. de tres experimentos por duplicado. *, P<0.05; **, P<0.01. El análisis estadístico se
realizo con t test.
Resultados 48
Para determinar si la maquinaria virB es necesaria para la supervivencia intracelular en
células fagocíticas profesionales, se realizaron ensayos de protección a la gentamicina
infectando la línea macrofágica murina J774.A1 con las mutantes virB10 polar y no-polar y con
la cepa parental virulenta. En la Figura 9 se observa que, en forma similar a lo que ocurre en
células Hela, las mutantes virB10 son incapaces de sobrevivir y replicar intracelularmente en la
línea macrofágica murina, a diferencia de lo que ocurre con la cepa parental. Por lo tanto, los
resultados anteriores indican que VirB10 es un componente esencial de la maquinaria VirB
necesaria no sólo para la efectiva colonización de células epiteliales sino también de fagocitos
profesionales.
Fig 9. (A) Replicación intracelular de las mutantes virB10 en J774 A.1.
virB10 es esencial para la virulencia en ratón
El efecto de virB10 en la virulencia de Brucella fue evaluado en el modelo murino.
Números iguales de UFC (5×104) de la cepa parental y mutantes virB10 polar y no-polar fueron
inoculadas intraperitonealmente a ratones hembra BalB/C de 90 días de edad. A los 15 días p.i.
los ratones fueron sacrificados y se realizo recuento de viables en bazo. Como se muestra en la
Figura 10, los ratones que recibieron la mutante polar virB10 controlaron completamente la
infección, recuperándose menos de 10 UFC por bazo, mientras que los ratones que recibieron la
cepa parental presentaron una típica infección aguda por Brucella (4×105 UFC/bazo). En el caso
de la mutante no-polar virB10, si bien no es completamente eliminada, sufre una reducción de
1000 veces en los recuentos de viables respecto de la cepa parental, confirmando el rol esencial
de virB10 en la virulencia. Tanto la mutante polar como la no-polar recuperan el fenotipo
virulento cuando se las complementa con los plásmidos pVK8.3 y pBBRvirB10
Resultados 49
respectivamente. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el sistema virB es uno de
los determinantes principales en la patogénesis de Brucella.
7
log ufc/bazo
6
5
4
3
2
1
Wild type
virB10
polar
virB10
no-polar
virB10
polar
pVK-virB
virB10
no-polar
pBBR4-virB10
Fig 10 Persistencia de las mutantes virB10 en bazo de ratones infectados. El número de bacterias viables en
bazo fue determinado a los 15 dias p.i. según se describe en Proc. Exp. Los valores representan las medias más los
Des. Std. (n=5).
Análisis del tráfico intracelular de las mutantes virB10
Como se puede observar en los ensayos de replicación intracelular en células HeLa, B.
abortus S2308 sigue un proceso de dos pasos acoplados: un período lag que dura entre 10 y 12
horas, durante el cual las bacterias se hallan dentro de las células pero no replican; seguido de un
período de crecimiento exponencial.
El requerimiento de un operón virB activo para la supervivencia intracelular de Brucella
puede tener dos posibles explicaciones: (1) el operón virB es esencial para el establecimiento de
un nicho de replicación intracelular competente o (2) el operón virB es necesario para la
replicación intracelular una vez que el nicho replicativo se ha formado.
Con el objeto de determinar qué paso del proceso de formación de la vacuola replicativa
de Brucella está afectado en las mutantes virB10, se realizaron estudios del tráfico intracelular
en células HeLa por medio de inmunofluorescencia doble y de colocalización con marcadores
endocíticos por medio de microscopía confocal con laser de barrido.
Las mutantes virB10 interaccionan con endosomas tempranos
Resultados 50
En un trabajo reciente, Pizarro-Cerdá et al. describieron que el primer paso del tráfico
intracelular seguido por B. abortus 2308 en células HeLa es la interacción transitoria con
endosomas tempranos (Pizarro-Cerdá et al., 1998b). Evaluamos entonces la capacidad de las
mutantes polar y no-polar virB10 de interactuar con estos compartimentos subcelulares en
comparación con la cepa parental.
En forma similar a lo que ocurre con la cepa salvaje, entre los 5 y 10 min p.i. ambas
mutantes se localizaron en vacuolas tempranas caracterizadas por la presencia de la proteína
periférica de membrana específica de endosomas tempranos EEA1 (Mu et al., 1995) (Figura 11
a y b). A los 10 min p.i., entre el 10-15 % de las vacuolas que contienen a la cepa salvaje o a las
mutantes virB10 poseen el marcador de endosomas tempranos en cantidad similar a las vacuolas
conteniendo partículas de látex. La interacción es transitoria dado que a los 40 min p.i., menos
del 2 % de las partículas de látex, cepa salvaje o mutantes virB10 colocalizan con EEA1. El bajo
nivel de colocalización observado en las vacuolas que contienen tanto a las partículas inertes
como a las bacterias sugiere que la entrada en HeLa no es sincrónica y que, una vez dentro de la
célula, la interacción con compartimentos endosomales tempranos es rápida y transitoria. No se
observaron diferencias en la tasa de adherencia e internalización entre mutantes y cepa salvaje,
confirmando las observaciones realizadas en los ensayos de replicación intracelular. Estos
resultados indican que los eventos tempranos en la biogénesis de la vacuola que contiene a
Brucella no se ven afectados por mutaciones que alteran la integridad del complejo virB.
La mutante polar virB10 es incapaz de evadir la vía endocítica y sufre un proceso degradativo
Se ha propuesto que las cepas patógenas de Brucella inhiben la fusión entre la vacuola
bacteriana y los lisosomas (Frenchick et al., 1985; Pizarro-Cerdá et al., 1998a). Comparamos
entonces la capacidad de las vacuolas que contienen Brucella de adquirir proteínas asociadas a
lisosomas.
Tanto las vacuolas que contienen a las mutantes polares y no-polares virB10 acumulan
gradualmente la glicoproteína de membrana marcadora de endosomas tardíos/lisosomas,
LAMP1. A las 4 h p.i., el 80-90% de la vacuolas son positivas para LAMP1 en forma similar a
la cepa salvaje (ver Fig. 12 y 16). Durante las primeras 4 h p.i. ambas mutantes parecen seguir la
misma cinética de adquisición de LAMP1. Sin embargo entre las 4h p.i. y las 12 h p.i., LAMP1
Resultados 51
bacteria
EEA1
Superpuesto
B.
B.
% de vacuolas conteniendo EEA1
virB10 no-polar
virB10 polar
S 2308
A.
15
bolas de latex
S 2308
10
virB10 polar
virB10 no-polar
5
0
5
10
40
Tiempo p.i. (min)
Fig. 11. A. Distribuci—n de EEA1 y bacterias a los 10 min de la internalizaci—n en HeLa. Las vacuolas
conteniendo bacterias internalizadas fueron marcadas con anticuerpo anti-EEA1 (flechas). La barra representa 10 m.
B. Distribuci—n de EEA1 en vacuolas conteniendo bolas de latex o distintas cepas de Brucella a los 5, 10 y
40 min p.i. Los valores fueron calculados como se describe en Procedimientos Experimentales. Los datos representan
la media mas el D.S. de dos experimentos independientes
Resultados 52
4 h p.i.
LAMP1
Superpuesto
LAMP1
Superpuesto
virB10 no-polar
virB10 polar
S 2308
bacteria
24 h p.i.
virB10 no-polar
virB10 polar
S 2308
bacteria
Fig. 12. Distribuci—n de LAMP1 y bacterias a las 4 y 24 h p.i. . CŽlulas HeLa fueron infectadas con las cepas
indicadas por 1 h. A las 4 o 24 h p.i. las cŽlulas fueron procesadas para doble inmunofluorescencia como se indica.
Las flechas indican vacuolas que contienen bacterias internalizadas marcadas con LAMP1. A las 24 h p.i la cepa
virulenta ha establecido el nicho de replicaci—n intracelular (delimitado por lineas punteadas)
mientras que las mutantes virB10 polar y no-polar aœn retienen el marcador. ObsŽrvese que la mutante no-polar
se distribuye en la superficie de la cŽlula huesped (delimitado por linea punteada). La barra representa 10 m.
Resultados 53
comienza a ser excluído de las vacuolas que contienen a S2308 mientras que las mutantes
virB10 lo retienen en sus vacuolas (Fig. 16).
Fig. 16. Cinética de adquisición de LAMP1,
β en las vacuolas que
Catepsina D y Sec61β
contienen Brucella.
Células HeLa fueron infectadas con la cepa
salvaje virulenta S2308 (A), mutante polar
virB10::Km (B) o mutante no-polar virB10::Gm
(C) y procesadas para microscopía de
fluorescencia doble indirecta para los tiempos
indicados, como se describe en Proc. Exp. Para
determinar el porcentaje de bacterias que
colocalizan con el marcador indicado, un mínimo
de 100 bacterias fueron contadas por cada
muestra. Los datos indican las medias de dos
experimentos independientes. En cada caso, el
Desv. Estd. no excedió la escala ploteada.
Analizamos entonces la distribución en los compartimentos vacuolares de la hidrolasa
ácida lisosomal Catepsina D, que se acumula dentro de lisosomas. Catepsina D comienza a ser
reclutada gradualmente en las vacuolas que contienen a la mutante polar virB10 siguiendo la
misma cinética de incorporación de LAMP1 (94% de vacuolas positivas a las 4 h p.i.). Como se
observa en la Figura 13, tanto las bacterias intactas como los productos de degradación
bacterianos, detectados con anticuerpos anti-LPS, colocalizan con catepsina D a las 12h p.i. y 24
h p.i., sugiriendo que la vacuola que contiene a la mutante polar avirulenta ha interactuado con
lisosomas. En cambio la mayoría de las vacuolas que contienen tanto a la cepa salvaje como a
Resultados 54
catepsina D
superpuesto
virB10 no-polar
virB10 polar
S 2308
bacteria
Fig. 13. Distribuci—n de catepsina D en las vacuolas que contienen bacterias internalizadas a las 24 h p.i. CŽlulas
HeLa fueron infectadas con S2308, virB10 polar o no-polar por 1 h. Despues de 24 h de incubaci—n las cŽlulas fueron
procesadas para doble inmunofluorescencia indirecta como se describe en Proc. Exp. A las 24 h p.i., la mutante virB10
polar sufre un proceso de degradaci—n por el cual tanto las bacterias intactas (flecha) como probables productos de
degradaci—n (puntas de flecha) colocalizan con el marcador lisosomal. En cambio la cepa parental virulenta ha establecido
su nicho de replicaci—n intracelular y la mutante virB10 no-polar muestra una baja o nula colocalizaci—n con catepsina D
(puntas de flecha) mientras que la mayoria de las bacterias se distribuyen en la superficie celular (delimitada por linea
punteada). La barra representa 10 m.
Resultados 55
la mutante no-polar virB10 excluyen catepsina D. A las 12 h p.i. la enzima lisosomal fue
detectada en menos del 10% de la vacuolas que contienen tanto a la cepa S2308 como a la
mutante virB10 no-polar (ver Figura 16).
Analizados en conjunto, estos resultados demuestran que la mutante polar virB10 es
incapaz de evadir la vía endocítica y es dirigida a los lisosomas en donde sufre un proceso
degradativo. Este resultado es consistente con la rápida eliminación de la mutante observada en
los ensayos de replicación intracelular y en el modelo de infección murino. Se puede concluir
que el sistema de secreción virB es esencial para que Brucella evada en forma eficiente la vía
endocítica y la posterior degradación en lisosomas. En contraste a lo anterior, las vacuolas que
contienen a la mutante no-polar virB10 permanecen positivas para LAMP1 pero nunca
adquieren el marcador lisosomal catepsina D, lo que sugiere que la maquinaria virB defectiva
sólo en virB10 es aún competente para evitar interacciones con lisosomas.
La mutante no-polar virB10 es incapaz de formar el nicho replicativo en el RE
El siguiente paso del análisis consistió en determinar si las vacuolas que contienen a las
mutantes son capaces de adquirir los marcadores reticulares sec61β y calreticulina con la
formación concomitante del nicho replicativo.
El translocador reticular sec61β fue reclutado en las vacuolas que contienen a la cepa
salvaje S2308 a partir de las 4 h p.i. con una cinética similar a la descripta previamente (PizarroCerdá et al, 1998b). A las 24 h p.i., calreticulina está presente en las vacuolas que contienen a la
cepa salvaje S2308 en plena fase replicativa. En cambio, tanto la mutante polar como la no-polar
en virB10 fueron incapaces de reclutar sec61β y calreticulina en sus vacuolas (Fig. 14 y 16).
Como control, la mutante no-polar complementada con el plásmido pBBRvirB10, que permite la
expresión de virB10 bajo el control del promotor lac, muestra el mismo comportamiento que la
cepa parental alcanzando y replicando en el compartimento tipo-RE. El mismo resultado se
observa con la mutante polar complementada con el cósmido pVK8.3 (Fig. 15).
El análisis comparativo de la cinética de adquisición de los distintos marcadores
utilizados sugiere que la maquinaria VirB cumple un rol esencial en el tráfico intracelular de
Brucella, posibilitando la exclusión de LAMP1 y adquisición de sec61β. La mutante no-polar
virB10
es
capaz
de
evitar
la
interacción
con
los
compartimentos
endosomales
tardios/lisosomales en forma análoga a la cepa salvaje. Sin embargo es incapaz de completar el
proceso de maduración de la vacuola que la contiene, caracterizado por la exclusión gradual de
Resultados 56
calreticulina
superpuesto
virB10 no-polar
virB10 polar
S 2308
bacteria
Fig. 14. Distribuci—n de calreticulina y bacterias a las 24 h p.i. CŽlulas HeLa fueron inoculadas con las cepas
indicadas por 1 h y procesadas para inmunofluorescencia doble despues de 24 h de incubaci—n. Las punta de flecha
indican bacterias que no colocalizan con el marcador reticular. Calreticulina no est‡ presente en las vacuolas que
contienen a las mutantes virB10 polar y no-polar, mientras que la cepa parental ha establecido su nicho de replicaci—n
y colocaliza con el marcador reticular (delimitados por linea punteada). La barra representa 10 m.
virB10 polar
virB10 no-polar
Fig. 15. Las mutantes virB10 polar y no-polar
complementadas recuperan la capacidad de formar el
nicho replicativo. CŽlulas HeLa fueron infectadas por 1 h
con las correspondientes mutantes complementadas. A las
24 h de incubaci—n las cŽlulas fueron procesadas para
inmunofluorescencia. A la izquierda, B. abortus virB10
polar (pVK-virB). Derecha, B. abortus virB10 no-polar
(pBBR-virB10). Ambas cepas establecieron su nicho de
replicaci—n intracelular (lineas punteadas). La barra
representa 10 m.
Resultados 57
LAMP1 y la adquisición de marcadores reticulares y en consecuencia es incapaz de establecer el
nicho replicativo. Esto indica que el sistema de secreción virB defectivo en virB10 retiene la
capacidad de evitar la fusión de la vacuola con el lisosoma pero ha perdido la capacidad de
establecer el nicho replicativo.
La mutante no-polar virB10 es reciclada a la superficie celular
Durante la realización de los estudios de tráfico intracelular se observó que a partir de
las 12 h p.i. un número creciente de mutantes no-polares se localizaban en las proximidades de
la superficie celular (ver figuras 12, 13 y 14), un fenómeno nunca observado en las primeras
etapas de la infección. Para determinar si las bacterias se localizaban extracelularmente
estrechamente asociadas a la membrana celular o se hallaban dentro de las células, se realizaron
marcaciones diferenciales antes y luego de la permeabilización con saponina para discriminar
bacterias intracelulares de extracelulares (ver Procedimientos Experimentales). El número de
bacterias intracelulares y extracelulares por célula infectada fue estimado a las 24 h p.i.
Como se muestra en la Figura 17, la cepa salvaje se encuentra predominantemente en el
interior de la célula huésped y sólo se detecta un bajo número de bacterias extracelulares (44
bact. intra./cel. infect. versus 7 bact. extra./cel. infect.). En cambio, la mutante virB10 no-polar
se encuentra casi exclusivamente en forma extracelular (20 bact. extra./cel.infect. versus 0.4
bact. intra./cel.infect). En el caso de la mutante polar los números de bacterias intracelulares y
extracelulares fueron 1 y 0 respectivamente, debido a que a las 24 h p.i., la mayoría de las
mutantes polares fueron degradadas después de la interacción con lisosomas.
Fig. 17. Distribución de bacterias intra y
extracelulares por célula infectada.
Células HeLa fueron infectadas con la cepa
virulenta parental S2308, la mutante polar
virB10::Km o mutante no-polar virB10::Gm.
A las 24 h p.i. los cultivos fueron lavados
fijados
y
procesados
para
inmunofluorescencia doble indirecta como se
describe en Proc. Exp. El número de
bacterias extracelulares (barras blancas) e
intracelulares (barras negras) por célula
infectada, fue estimado por microscopía
confocal con laser de barrido. Los datos
representan las medias más el Desv. Std. de
dos determinaciones hechas por duplicado
Resultados 58
Una explicación trivial para este fenómeno es que un número reducido de bacterias
pudo haber permanecido en el medio de cultivo y subsecuentemente proliferaron. Esta
explicación se descartó debido a que todos los experimentos se realizaron en presencia de
gentamicina y estreptomicina en cantidades equivalentes a 40 veces la concentración mínima
inhibitoria. Un explicación alternativa es que las bacterias extracelulares pudieron ser liberadas
al medio de cultivo por citólisis o apoptosis de las células infectadas.
Para excluir esta posibilidad se examinó la capacidad de las células de excluir el
colorante trypan blue a las 15, 24 y 48 h p.i.. En todas las muestras estudiadas, la morfología de
las células fue normal y la capacidad de exclusión de trypan blue fue similar a la de la cepa
parental (≈ 90% ) indicando que las bacterias no fueron liberadas por muerte celular.
El proceso de reciclado al espacio extracelular fue evaluado infectando células HeLa
con la mutante no-polar, la mutante complementada y la cepa parental. Se permitió el contacto
entre célula y bacteria por una hora, al cabo de ese período se removieron las bacterias no
adherentes y se agregó medio fresco conteniendo gentamicina y estreptomicina para eliminar
toda bacteria no internalizada. Luego de tres horas, se reemplazó el medio conteniendo los
antibióticos por medio fresco sin antibióticos para permitir la supervivencia extracelular y se
estimó el número de viables a los tiempos indicados. En un experimento paralelo se evaluó la
capacidad de replicación intracelular permitiendo que los antibióticos estuvieran presentes en el
medio de cultivo durante todo el ensayo.
Fig. 18. Cinética de exclusión de la célula
huésped.
Células HeLa fueron infectadas con la cepa
parental virulenta S2308 (panel superior),
mutante no-polar virB10::Gm (panel medio) o
mutante no-polar virB10::Gm complementada
(panel inferior) por el lapso de una hora. Al final
del período el medio de cultivo fue removido,
lavado y reeplazado por medio fresco con
antibióticos. Al cabo de 4 h p.i., a la mitad de las
muestras se les reemplazó el medio de cultivo por
medio fresco sin antibióticos (fig. blancas), la otra
mitad permaneció con antibióticos durante todo el
experimento (fig. negras). A los tiempos
indicados las células fueron lisadas y se
determinó el número de bacterias viables. Los
datos representan el promedio de dos
determinaciones independientes realizadas por
triplicado. En todos los casos los valores
correspondientes al Desv. Std. no superaron el
área ploteada
Resultados 59
Como se puede observar en la Fig. 18, los resultados muestran que cuando los
antibióticos estuvieron ausentes, las UFC de la mutante no-polar comienzan a aumentar a partir
de las 8 h p.i. alcanzando 2×106 a las 42 h p.i., en contraste con el comportamiento de la mutante
cuando los antibióticos están presentes en el medio de cultivo, indicando que la mutante nopolar es incapaz de proliferar intracelularmente. En cambio, el comportamiento de la cepa
salvaje y de la mutante complementada fue el mismo bajo ambas condiciones de cultivo,
indicando que ambas cepas replican intracelularmente.
El fenómeno del reciclado a la superficie celular puede observarse en la Fig. 19. En la
misma se muestra una marcación para inmunofluorescencia triple. Los límites de la membrana
plasmática fueron marcados con anticuerpos anti-MHC-I; las bacterias intra y extracelulares
fueron marcadas con anticuerpos anti-LPS. Puede apreciarse una mutante virB10 no-polar que
se encuentra por fuera de la célula estrechamente asociada a la membrana plasmática, mientras
que otra mutante, aún intracelular, comienza el proceso de fusión de su vacuola con la
membrana plasmática en un evento similar a la exocitosis.
Estos resultados estan en acuerdo con los ensayos de inmunofluorescencia y confirman
que la mutante no-polar virB10 presenta un fenotipo “bizarro”, caracterizado por la progresiva
exclusión de la célula huésped a partir de las 8 h p.i..
Superpuesto
MHC-I en Membrana
LPS Extracelular
LPS Intra y Extracelular
Resultados 60
Fig. 19. La mutante B. abortus virB10 no-polar es reciclada a la superficie celular. CŽlulas HeLa fueron
infectadas con la mutante no-polar virB10 por 1 h y procesadas para triple inmunofluorescencia 15 h despues de la
incubaci—n como se describe en Proc. Exp. Para diferenciar entre bacterias intra y extracelulares, las mismas se
marcaron con anticuerpo de conejo anti-LPS previo a la permeabilizaci—n con saponina, luego de la
permeabilizaci—n se utiliz— anticuerpo de vaca anti-LPS. Los limites de la membrana celular se marcaron con
anticuerpo anti- MHC-I previo a la permeabilizaci—n. La flecha indica una bacteria internalizada en los momentos
previos a la exclusi—n de la cŽlulas huesped. La punta de flecha indica una bacteria que ya ha sido excluida de la
cŽlula. La barra representa 10 m.
Resultados 61
Parte II
Diseño y construcción de vectores de expresión para Brucella abortus
Con el objeto de explorar el posible uso de la cepa vacunal B. abortus S-19 como
“carrier” vivo de antígenos heterólogos para su posible aplicación en el etiquetado antigénico de
la cepa vacunal o para la generación de vacunas vivas polivalentes, se procedió a desarrollar un
vector de expresión para Brucella.
El plásmido escogido para la construccion del cassette de expresión fue el vector de
amplio rango de huésped pBBR1mcs. Este vector es replicativo en el contexto de Brucella,
mantiene un número de copias intermedio (entre 20-50 copias/célula) y se mantiene en forma
estable aún sin presión de selección (Kovach et al., 1995; Elzer et al., 1995).
Para permitir la producción del antígeno recombinante en cantidades compatibles con el
desarrollo de una respuesta inmune, se escogió la secuencia promotora del gen bcsp31 de
Brucella. La proteína BCSP31 es expresada constitutivamente por Brucella tanto bajo
condiciones de cultivo en el laboratorio como durante el proceso de infección. Además los
anticuerpos anti-BCSP31 son detectados tanto en sueros de animales vacunados con S-19 como
en animales infectados por cepas salvajes, lo que indica que el promotor es activo durante el
proceso de infección (Bricker et al., 1988; Halling et al., 1991). El hecho de que este promotor
sea funcional en E. coli facilita la construcción del vector de expresión (Mayfield et al., 1988).
Fig. 21. Representación
esquemática del vector
de
expresión
para
Brucella.
En A. se esquematiza la
región promotora y el
péptido señal junto a la
secuencia “linker” para el
clonado en fase del gen
reportero.
En B. se esquematiza el
vector conteniendo el gen
reportero SAPA. En el
mismo se muestra la
secuencia aminoacídica
de una de las 14
repeticiones en tandem.
Resultados 62
En segundo lugar se eligió la secuencia codificante correspondiente al péptido señal de
la proteína BCSP31. Su utilidad sería la de direccionar la expresión del antígeno recombinante
hacia el periplasma de la bacteria. Esto podría ser conveniente para evitar posibles efectos
tóxicos o la formación de cuerpos de inclusión que suelen generarse cuando una proteína
recombinante es expresada constitutivamente o en altas cantidades por un promotor fuerte.
Río abajo del codón que codifica para la Pro-31 se agregó una secuencia “linker” que contiene
sitios para las enzimas de restricción KpnI, SacI y EcoRI. Estos sitios permiten la fusíon en fase
del gen que se desea expresar. El vector resultante fue denominado pBEV (Fig. 21).
Expresión de un gen reportero en pBEV
Se escogió como gen reportero del vector de expresión para Brucella, la secuencia que
codifica para un antígeno repetitivo de Trypanosoma cruzi denominado SAPA (Pollevick et al.,
1991). El fragmento escogido consta de una región 5’ y 3’ no-repetitiva más una región central
compuesta por 14 unidades repetidas en tandem, cada una de 36 pb de longitud. El gen reportero
fue insertado en el sitio EcoRI del pBEV quedando en fase con el codón de iniciación y el
péptido señal como lo confirmó el análisis de secuencia.
La expresión del antígeno repetitivo en B. abortus S-19 conteniendo pBEV-SAPA fue
analizada por medio de Western blot. Como se observa en la Fig. 22, dos bandas reactivas con
un tamaño molecular aparente de 45 y 55 kDa fueron detectadas en el extracto total de las
bacterias tranformadas con pBEV-SAPA. Se observan además bandas de menor tamaño que
probablemente sean productos de degradación de la unidades repetitivas, a juzgar por el patrón
regular que presentan. El producto recombinante también es expresado en E.coli S17.1 λpir
utilizada como cepa donora durante la conjugación de pBEV-SAPA a Brucella, confirmando
que el promotor escogido también es funcional en E. coli como fue reportado previamente. El
antígeno recombinante es traslocado eficientemente al periplasma de Brucella y es
prácticamente indetectable en la fracción citoplásmica. Como control, el suero no reacciona con
el extracto total de B. abortus S-19 transformada con el vector pBEV que carece del inserto de
DNA que codifica la proteína reportera.
No se observó ninguna diferencia en las características de crecimiento en cultivo entre
la cepa recombinante y la cepa parental control.
Resultados 63
Fig. 22. Expresión del antígeno
recombinante en el periplasma de B.
abortus S-19.Western-blot de extractos
proteicos de B. abortus o E. coli revelados
contra suero de conejo anti-SAPA. Las
cuatro calles de la izquierda corresponden
a extractos proteicos de B. abortus S-19 tal
como se indica en la figura. La calle de la
derecha corresponde a extracto proteico
total de E. coli transformada con pBEVSAPA. Se indican las posiciones de los
marcadores de peso molecular.
El antígeno recombinante es inmunogénico en ratones
El paso siguiente fue evaluar si el antígeno recombinante era capaz de generar una
respuesta inmune durante la vacunación con B. abortus S-19 pBEV-SAPA en ratones BALB/c.
A distintos tiempos post-vacunación, la presencia de anticuerpos específicos anti-SAPA
fue analizada en el suero de los ratones inoculados. El análisis de western blot (Fig. 23) mostró
que los sueros de los ratones vacunados con la cepa vacunal recombinante son reactivos contra
el antígeno repetitivo purificado como proteína de fusión a GST a partir de los 18 días postvacunación y se incrementa hasta los 30 días p.v. a juzgar por la intensidad de las bandas
reactivas. No se detectaron anticuerpos específicos contra el antígeno recombinante en el suero
de los ratones vacunados con la cepa parental control en ninguno de los intervalos de tiempo
testeados.
Fig. 23.El antígeno recombinate es inmunogénico en ratones. Western blot de GST-SAPA purificada y revelada
con una mezcla de sueros de ratónes inoculados con, (A) B. abortus S-19 pBEV (control) a los 10 y 30 días p.i. y
(B) sueros de ratones inoculados con B. abortus S-19 pBEV-SAPA a los 10, 18, 23 y 30 días p.i.
Resultados 64
Los títulos de anticuerpos contra el antígeno recombinante y contra el antígeno
inmunodominante de Brucella, el LPS, se determinaron por medio de un ensayo de ELISA
cinético a distintos tiempos p.v. Los títulos de anticuerpos anti-LPS alcanzaron valores cinéticos
equivalentes durante el tiempo de muestreo, tanto en los ratones que recibieron la cepa vacunal
recombinante como en los que recibieron la cepa parental control (Fig. 24). Los anticuerpos
específicos contra el antígeno recombinante SAPA fueron detectables tan pronto como a los 10
días p.v. y a partir de ese momento se incrementaron hasta el fin del período de muestreo (Fig.
24). Por lo tanto, la expresión del antígeno recombinante repetitivo en el periplasma de B.
abortus S-19 es compatible con la generación de una respuesta inmune humoral específica
contra el antígeno y no altera la respuesta serológica contra el antígeno inmunodominante de la
bacteria.
Fig. 24. Títulos de anticuerpos anti-SAPA y anti-LPS en ratones inoculados con B. abortus S-19 pBEVSAPA. Enzimoinmunoensayo cinético de sueros agrupados de ratones inoculados con B. abortus S-19 (pBEVSAPA) o B. abortus S-19 pBEV (control) recogidos a los 10, 18, 23 y 30 días p.i. En todos los casos los sueros
fueron testeados contra LPS de B. abortus y GST-SAPA. Los valores del eje y representan los valores medios de las
pendientes (×103) para cada suero. Las barras de error indican el Desv. Std.
Subtipos de inmunoglobulinas específicas contra el antígeno recombinante
Los subisotipos de las inmunoglobulinas específicas inducidas contra el antígeno
recombinante fueron analizados por ELISA. Estos ensayos mostraron que el subisotipo
predominante de las inmunoglobulinas específicas contra el antígeno recombinante fue IgG2a
con bajo titulo de IgG1 (Fig. 25). Este resultado es consistente con el tipo de respuesta Th1
generada por la vacunación con B. abortus S-19.
Resultados 65
Fig. 25. Subclases de IgG
inducidas contra el antígeno
recombinante.
Enzimoinmunoensayo de sueros
agrupados de ratones inoculados
con B. abortus S-19 pBEVSAPA contra GST-SAPA. Como
anticuerpos
secundarios
se
utilizaron anti-IgG1 y anti-IgG2a
de ratón acoplados a HRP. Para
determinar el título se utilizó la
inversa de la dilución mayor
cuyo valor de ABS 405nm fuera
superior a la media + 3Desv. Std
de 5 sueros normales.
Para determinar si la respuesta humoral generada contra SAPA depende de la capacidad
del “carrier” bacteriano para establecer un proceso de infección limitada o de la cantidad de
antígeno recombinante presente en el inóculo, se inocularon ratones con el mismo número de B.
abortus S-19 pBEV-SAPA vivas o inactivadas por calor. A los 30 días p.i. la presencia de
anticuerpos anti-SAPA en el suero de los animales inoculados fue analizada por ELISA. En la
Fig. 26 se observa que la cantidad de antígeno recombinante presente en el inóculo inactivado
por calor no es suficiente para generar anticuerpos específicos anti-SAPA, por lo tanto la
capacidad de generar una respuesta inmune humoral contra el antígeno heterólogo depende de la
capacidad de Brucella de establecer una infección limitada en el huésped.
Fig. 26. La inmunogenicidad del
antígeno recombinante depende de la
viabilidad de Brucella.
Enzimoinmunoensayo cinético de sueros
agrupados de ratones a los 30 días de la
inoculación con B. abortus S-19 pBEVSAPA contra GST-SAPA. Cada valor de
pendientes (×!03) corresponde a un pool
de 5 sueros.
Resultados 66
Expresión de otros antígenos heterólogos en pBEV
Con el objeto de analizar la capacidad del vector desarrollado para la expresión de otros
antígenos heterólogos de utilidad en medicina veterinaria, se procedió a clonar en el mismo el
gen vp1 que codifica para la proteína de cápside VP1 del virus de la fiebre aftosa (FMDV)
O1Caseros y el gen etx*, modificado por ingeniería genética, que codifica el toxoide epsilon de
Clostridium perfringens D.
El gen etx*, porta un cambio aminoacídico generado por mutagénesis dirigida, que
resulta en el cambio de la His136 por Pro136. Este cambio aminoacídico en la secuencia del
toxoide anula por completo su toxigenicidad sin alterar la inmunogenicidad y en consecuencia,
el antígeno modificado es adecuado para la inmunización y protección contra la enterotoxemia
generada por C. perfringens D (J. Ugalde y D. Comerci, resultados no publicados).
La expresión del toxoide recombinante fue analizada por medio de western blot. Como
se muestra en la Figura 27, una banda reactiva de aprox. 32 kD, correspondiente al toxoide
recombinante, junto a una banda de menor tamaño correspondiente al procesado del péptido
señal aportado por el pBEV, más una banda de aprox. 26 kD presumiblemente producto del
clivaje proteolítico del toxoide, están presentes en los extractos totales de B. abortus S-19
transformadas con el pBEV-etx* (Fig. 27 calle 3). Estos productos no se observan en la calle 1
correspondiente al extracto total de B. abortus S-19 pBEV. Como control positivo de la reacción
de western blot, la calle 2 muestra el perfil de expresión de etx* en E. coli como proteína de
fusión a un tag de histidinas en el vector pTrcHis. La banda de ≈35 kD corresponde a la
proteína fusionada y la banda menor a productos del procesado proteolítico. Las bandas
superiores corresponden a probables agregados proteicos.
Fig 27. Expresión de etx* en pBEV.
Western-blot de extractos totales proteicos de B.
abortus S-19 pBEV-etx* revelados contra suero de
conejo anti-etx.
Calle 1. B. abortus S-19 pBEV (control).
Calle 2. E. coli pTrcHis-etx*
Calle 3. B. abortus S-19 pBEV-etx*
Se indican las posiciones de los marcadores de peso
molecular.
Resultados 67
Para determinar si el toxoide recombinante se acumula como cuerpo de inclusión en
Brucella o permanece en la fase soluble, se separaron luego de la ruptura por sonicación, las
fracciones solubles e insolubles de un cultivo de B. abortus S-19 pBEV-etx* y se realizó el
western blot. En la Figura 28 se observa que el toxoide recombinante está presente tanto en el
pellet como en la fase soluble. En forma análoga a lo observado con el sistema de expresión del
antígeno repetitivo SAPA, la expresión del toxoide epsilon no alteró las características de
cultivo la cepa B. abortus S-19.
Fig. 28. Distribución de etx* en fase soluble y cuerpos de inclusión. Western-blot de fracción total, fracción
soluble e insoluble de B. abortus S-19 pBEV-etx* reveladas contra suero de conejo anti-etx*. De izq. a der.: fracción
total, pellet y sobrenadante de B. abortus S-19 pBEV-etx*, fracción total de B. abortus S-19 pBEV (control
negativo). Se indican las posiciones correspondientes a los marcadores de peso molecular.
A pesar de haberse intentado numerosas veces, variando relaciones molares entre
inserto y vector o probando distintas estrategias de fusión, el clonado del gen codificante de la
VP1 del FMDV en el vector de expresión de Brucella pBEV resultó infructuoso. La ausencia de
clones que expresaran la VP1 recombinante luego de la transformación de las mezclas de
ligación en E. coli, junto a la detección de clones que portaban el gen insertado en el pBEV,
pero que presentaban rearreglos y deleciones de las secuencias nucleotídicas de vp1, nos
indicaban que la expresión constitutiva de este antígeno particular generaba efectos letales o
deletereos para la bacteria.
Expresión de VP1 en pBEVσ32
Resultados 68
Para superar el inconveniente surgido durante los intentos de expresión de VP1 en
pBEV, se decidió desarrollar un segundo tipo de vector de expresión cuyo promotor fuera
inducible y menos potente.
El promotor escogido fue el correspondiente al gen dnaK de B. abortus. Las
características principales de este promotor es que es inducible bajo condiciones de heat-shock
durante el cultivo vegetativo de Brucella bajo condiciones de laboratorio, pero también se
induce luego de que la bacteria es internalizada por células fagocíticas profesionales, según lo
indicaban los trabajos previos (Cellier et al., 1992). El hecho de que los anticuerpos anti-DnaK
sean detectables en los sueros de animales inoculados experimentalmente con Brucella, indican
que el promotor también es activo durante el proceso de infección.
En consecuencia se construyó el vector de expresión inducible pBEVσ32 tomando
como base el pBEV, según se muestra en el esquema de la Figura 29.
Fig.29. Representación esquemática de la región de clonado del vector pBEVσ
σ32.
El vector pBEVσ32 porta la secuencia correspondiente al promotor dnaK más
secuencias de unión a ribosomas, codón de iniciación y secuencias “linker” del pBEV.
La funcionalidad del pBEVσ32 fue analizada usando el gen reportero SAPA. Como se
muestra en la figura 30 panel A, la expresión del antígeno repetitivo puede observarse en las
calles 2 y 3 correspondientes al extracto total de B. abortus S-19 pBEVσ32 -SAPA cultivadas a
30°C y al extracto inducido a 42°C durante 120 min respectivamente, pero no se observa en la
calle 1 correspondiente al extracto total de B. abortus S-19 pBEVσ32 (ctrl. negativo). Como
control positivo se utilizó un extracto total de B. abortus S-19 pBEV-SAPA. Puede apreciarse
que tanto a 30°C como a 42°C hay un nivel similar de expresión del antígeno recombinante. La
intensidad de las bandas correspondientes al antígeno recombinante expresado bajo el promotor
dnaK son considerablemente menores que las obtenidas para el mismo antígeno bajo el
promotor constitutivo del pBEV. Si se tiene en cuenta que las cantidades de bacterias sembradas
Resultados 69
en las distintas calles son equivalentes, se puede concluir que el promotor dnaK es menos
potente.
En la Figura 30 panel B, se observa que al incubar las bacterias a 37°C y 42°C durante
30 min., se incrementa progresivamente la cantidad del producto recombinante. Luego de 120
min. de tratamiento a las temperaturas de inducción, los niveles de expresión del antígeno
recombinante vuelven a los niveles basales observados al comienzo del ensayo. Por lo tanto el
nivel máximo de inducción de pBEVσ32 se logra a los 30 min del incremento de la temperatura
de cultivo de 30°C a 42°C. Como se muestra en la Fig. 30 panel C, gran parte del antígeno
recombinante SAPA expresado en pBEVσ32 permanece en fase soluble en forma similar a lo
observado cuando se lo expresa en pBEV. Sólo la banda de 55 kD, correspondiente a probables
agregados proteicos, fracciona en cuerpos de inclusión insolubles.
A
B
C
Fig. 30. Expresión de SAPA en el vector inducible pBEVσ
σ32. Western-blot de extractos proteicos de B.
abortus pBEVσ32-SAPA revelados contra suero de conejo anti-SAPA. Panel A, calle 1: extracto total de B.
abortus pBEVσ32, calle 2: extracto total de B. abortus pBEVσ32-SAPA a 30°C, calle 3: extracto total de B.
abortus pBEVσ32-SAPA a 42°C por 120 min., calle 3: extracto total de B. abortus pBEV-SAPA. Panel B,
perfil de expresión de SAPA a distintos tiempos y temperaturas de inducción. Panel C, distribución de SAPA
en fracción soluble o cuerpos de inclusión. Se indica la posición de los marcadores de peso molecular.
Se procedió entonces a analizar la expresión de VP1 en pBEVσ32. El vector pBEVσ32VP1 fue introducido en B.abortus S-19 por conjugación, los clones exconjugantes fueron
seleccionados en placas TSB suplementadas con carbenicilina 50 μg/ml y ácido nalidíxico 5
μg/ml, repicados y sometidos a la temperatura permisiva para la inducción. La Figura 31 panel
A muestra que la expresión del antígeno viral en Brucella se induce al desplazar la temperatura
de cultivo de 30°C a 42°C, mientras que no se detecta expresión del producto recombinante en
la calle correspondiente a las bacterias transformadas con pBEVσ32 (control negativo). El
antígeno viral recombinante, luego de 2 h de inducción, se agrega en cuerpos de inclusión que se
particionan en el pellet luego del fraccionamiento celular (Fig. 31, panel B).
Resultados 70
De los resultados anteriores se concluye que el uso de un promotor más débil e
inducible en el vector de expresión fue suficiente para permitir la expresión del antígeno viral
VP1 en forma de cuerpos de inclusión. Sin embargo, a pesar de intentarlo varias veces por
técnicas diferentes, fue imposible detectar la presencia de anticuerpos anti-VP1 luego de la
inmunización de ratones con la cepa recombinante B. abortus S-19 pBEVσ32-VP1.
A
B
Fig 31. Expresión de VP1 en el vector inducible pBEVσ
σ32. Western-blot de extractos proteicos de B. abortus S19 pBEVσ32-VP1 revelados contra suero de conejo anti-VP1 01-Caseros. Panel A, perfil de expresión de VP1 a
distintos tiempos de inducción a 42°C. De izq. a der.: B. abortus S-19 pBEVσ32, B. abortus S-19 pBEVσ32-VP1 a
30°C (tiempo 0), B. abortus S-19 pBEVσ32-VP1 a 42°C por 30 y 120 min., GST-VP1 (ctrl. positivo). Panel B,
distribución de VP1 en fase soluble y cuerpos de inclusión. Extractos proteicos de B. abortus S-19 pBEVσ32-VP1
inducidas a 42°C por 120 min. De izq. a der.: extracto soluble, cuerpos de inclusión, extractos totales inducidos,
extractos totales sin inducir, extracto total inducido de B. abortus S-19 pBEVσ32 (ctrl. negativo).
Resultados 71
Atenuación y eficacia protectiva de la cepa S-19 recombinante
Los parámetros básicos de la infección por B. abortus S-19 fueron analizados para
determinar si la expresión del antígeno recombinante repetitivo afecta la atenuación de la cepa
S-19. Ratones BALB/c fueron inoculados por vía intraperitoneal con 107 UFC de B. abortus S19 pBEV-SAPA o B. abortus S-19. A distintos tiempos p.v. los bazos fueron removidos,
pesados y se estimó el número de UFC recuperadas.
Tiempo
postinfección
B. abortus S-19
B. abortus S-19
pBEV-SAPA
Días
log10 UFC/bazo
(media±DS)
log10 UFC/bazo
(media±DS)
0
7±0.3
7±0.3
10
7.7±0.5
7.5±0.4
20
5.96±0.72
5.38±0.34
30
3.43±0.27
Cada punto de muestreo corresponde a 5 animales.
2.24±0.38
Como se observa en la tabla superior, ambos grupos de animales lograron controlar la
infección en forma similar. El número de UFC recuperadas fue levemente superior en los
animales que recibieron la cepa parental en cada intervalo analizado, lo que indica que la cepa
recombinante es eliminada más rápidamente, tal vez por el estrés que genera en la bacteria la
expresión del antígeno heterólogo. La esplenomegalia, una consecuencia característica de la
infección por Brucella, fue similar en ambos grupos de animales.
Por lo tanto se estimó la capacidad protectiva de la cepa vacunal recombinante. Los
animales se dividieron en tres grupos de 5 cada uno. Los dos primeros grupos recibieron 1×107
UFC intraperitoneales de B. abortus S-19 y B. abortus S-19 pBEV-SAPA respectivamente. El
tercer grupo recibió solamente solución salina fisiológica. Ocho semanas posteriores a la
vacunación, los tres grupos de animales fueron desafiados con 5×104 UFC i.p. de la cepa
virulenta B. abortus S2308. A las dos semanas p.d. los bazos fueron removidos y se determinó el
número de UFC de la cepa patógena. Como se observa en la tabla siguiente, los animales
vacunados con la cepa S-19 o con la cepa S-19 portando el vector recombinante no presentan
diferencias significativas respecto del nivel de protección conferido contra el desafío con la cepa
patógena, mientras que el grupo control sin vacunar presenta un proceso de infección activa. Por
Resultados 72
lo tanto, la expresión de un antígeno recombinante en la cepa vacunal B. abortus S-19 no altera
sus propiedades protectivas en el modelo murino.
Vacuna
Log10 UFC de B. abortus 2308 en
bazo
(media ± DS)
log10 unidades de
protección
Salina
6.2±0.53
0
S-19
2.95±0.48
3.25
S-19 pBEV-SAPA
3.03±0.56
3.17
Los tres lotes (n=5) fueron desafiados con 5×104 UFC de B. abortus S2308 a las 8
semanas de la vacunación. Las unidades de protección se calculan como la diferencia
entre logUFC del grupo vacunado respecto del grupo control sin vacunar.
Inoculación experimental en bovinos
La capacidad de la cepa vacunal recombinante de generar anticuerpos específicos contra
la etiqueta molecular fue evaluada en bovinos. Un lote de 5 terneras Angus de seis meses de
edad fueron inoculadas por vía subcutanea con 5×109 u.f.c. de B. abortus S-19 pBEV-SAPA.
Como control se utilizó un lote de 5 terneras Angus de la misma edad que recibieron 5×109 UFC
de B. abortus S-19 por la misma vía. Los sueros correspondientes a distintos tiempos p.v. se
analizaron por ELISA para determinar la concentración de anticuerpos específicos contra el LPS
bacteriano y el antígeno recombinante repetitivo.
Fig.32.
Presencia
de
anticuerpos anti-SAPA y
anti-LPS
en terneras
inoculadas.
Enzimoinmunoensayo
de
sueros bovinos a los 60 días
de la inoculación con B.
abortus S-19 o B. abortus S19 pBEV-SAPA contra
LPS brucélico o GSTSAPA.
Resultados 73
Los resultados que se muestran en la Fig. 32 indican que los animales inoculados con B.
abortus S-19 pBEV-SAPA presentan una alta concentración de anticuerpos específicos contra
el antígeno heterólogo. En cambio, el lote inoculado con B. abortus S-19 presenta un muy bajo
nivel de anticuerpos anti-SAPA. Si bien el número de animales es bajo como para definir un
valor de corte significativo, todos los sueros del lote control muestran valores de Abs 405 nm
menores a 0.3 por lo que puede asumirse este valor como corte. La generación de anticuerpos
anti-SAPA no altera la respuesta contra el antígeno inmunodominante de Brucella , el LPS, a
juzgar por los valores similares de anticuerpos anti-LPS en los dos lotes. Este comportamiento
es similar al observado en las inoculaciones experimentales en el modelo murino e indica que
el antígeno heterólogo se expresa en el contexto de B. abortus en cantidad y forma suficiente
como para generar respuesta humoral específica.
Discusión 74
PARTE I
El sistema virB de Brucella abortus
Las bacterias del género Brucella son parásitos intracelulares facultativos que han
desarrollado la capacidad de evadir los mecanismos de defensa de la célula huésped
remodelando las vacuolas endocíticas en organelas especializadas que son permisivas para su
crecimiento.
Un gran número de patógenos bacterianos que replican dentro de células eucarióticas
comparten esta estrategia aunque, en la mayoría de los casos, los factores codificados por los
patógenos que conducen la biogénesis de este tipo de organelas son desconocidos (Sinai y
Joiner, 1997; Meresse et al., 1999).
En este trabajo se describen algunos de los determinantes genéticos requeridos para la
biogénesis de una organela que permite la replicación intracelular del patógeno B. abortus.
A pesar de los esfuerzos llevados a cabo en la última década, muy poco es lo que se
conoce sobre los mecanismos genéticos y moleculares que subyacen al proceso infectivo. La
hipótesis de que Brucella encuentra un ambiente hostil dentro de la célula huésped ha permitido
identificar varias proteínas de respuesta al estrés aunque el rol que juegan en la virulencia es
sólo marginal o accesorio. Por cierto resulta llamativo que varios estudios tendientes a
individualizar genes de virulencia por medio de técnicas de avanzada como STM (SignatureTagged Mutagenesis) o Inducción Diferencial de Fluorescencia (IDF) hayan identificado tan
pocos genes de respuesta a estrés (Boschiroli et al, 2001). Haciendo un análisis crítico de lo
anterior, resulta evidente que la hipótesis conductora no fue la apropiada. Una hipótesis más
ajustada a los datos aportados por este y otros trabajos es que la bacteria modula la respuesta de
la célula infectada para evitar la exposición a tales condiciones de estrés.
El trabajo pionero que demostró que un gen necesario para la virulencia de
Agrobacterium tumefaciens y para el establecimiento del proceso simbiótico entre Rhizobium
meliloti y leguminosas está presente también en Brucella, en la cual cumple un rol accesorio en
la virulencia (Iñon de Iannino et al., 1998), abrió un nuevo panorama en la investigación sobre
los mecanismos moleculares de la patogénesis de la brucelosis. La aplicación posterior de las
técnicas de mutagénesis por transposición permitieron identificar un sistema de dos
componentes, BvrRS, que participa en el proceso de internalización en células HeLa y en la
modulación del camino endocítico (Sola-Landa et al.,1998). Este sistema es similar a los
sistemas chvG-chvI de A. tumefaciens y exoS-chvI de R. meliloti en los que regulan el proceso
Discusión 75
infectivo o la invasión del nódulo, respectivamente (Charles y Nester, 1993; Cheng y Walker,
1998).
A partir de estos trabajos, fue evidente que Brucella comparte más estructuras y
mecanismos moleculares con patógenos vegetales y endosimbiontes del grupo α-2 que lo que
se había pensado anteriormente y el sistema virB, cgs y bvrRS son claros ejemplos de esto. Esta
idea fue reforzada con la aplicación de programas sistemáticos de búsqueda de genes por
secuenciación al azar de genotecas, que permitió encarar la búsqueda “racional” de probables
genes involucrados en el proceso infectivo. El estudio de Sanchez y col. permitió identificar en
B. abortus la presencia de 1.199 nuevos genes entre los cuales sorprende la cantidad de
secuencias con alta identidad a genes que participan en la síntesis de factores nod y fijación
simbiótica de nitrógeno por R. meliloti como fixO, fixN, fixR, nodN, nodG y bacA o genes
similares a los involucrados en el establecimiento del proceso patogénico de A. tumefaciens,
como los genes virB9 y virB10 o en el catabolismo de manopinas como mocB (Ugalde, 1999).
Por cierto a partir de este descubrimiento comenzó este trabajo de tesis. El objetivo original fue
identificar si B. abortus poseía un sistema de secreción tipo-IV equivalente al de A. tumefaciens
y analizar el probable rol que cumpliría en la virulencia.
El análisis de secuencias obtenidas al azar condujo a la identificación el locus virB de B.
abortus. La organización genética y la identidad de secuencia permiten agruparlo a la familia
de transportadores tipo-IV presentes en varios géneros de bacterias tanto patógenas como de
vida libre (Christie y Vogel, 2000). Dentro de esta familia se puede establecer una clara
división funcional entre los transportadores. Siguiendo la clasificación propuesta por Christie y
Vogel, los sistemas tipo IV se dividen en el subgrupo A, conformado por los sistemas
dedicados a la translocación de ADN o complejos nucleoproteínas como los sistemas de
transferencia conjugativa de plásmidos de los grupos IncN, IncW, IncP, IncRh1 e IncF, a los
que pueden sumarse el sistema virB de A. tumefaciens y el sistema lvh de L. pneumophila; y
aquellos involucrados en la secreción de proteínas que conforman el subgrupo B, representados
por el sistema Ptl de B. pertussis y el sistema Cag de H. pylori, junto con el sistema dot/icm de
L. pneumophila, el locus virB de R. prowazekii y el locus homólogo a virB de Bartonella
henselae. Estos dos últimos ejemplos se los considera como dedicados a la exportación de
proteínas aunque aún no se han demostrado las funciones que cumplen ni los productos
secretados. El operón virB de B. abortus probablemente pertenezca al subgrupo B dado que es
muy improbable que esté involucrado en la transferencia de ADN por las siguientes razones:
Discusión 76
1) a pesar de la intensa búsqueda llevada a cabo en varios laboratorios, no se ha
detectado jamas la presencia de plásmidos naturales en el género Brucella.
2) no se ha podido demostrar el intercambio genético natural entre miembros del
género.
3) ensayos preliminares llevados a cabo en nuestro laboratorio demostraron que el
operon virB es incompetente para la transferencia conjugativa del plásmido del grupo
IncQ, RSF1010, a diferencia de los operones homólogos virB de A.tumefaciens y
dot/icm y lvh de L. pneumophila que si son competentes para su transferencia (R. Sieira,
resultados no publicados).
4) los estudios del tráfico intracelular de las mutantes virB llevados a cabo en este
trabajo que demuestran que la capacidad de la bacteria para modular la vía endocítica se
encuentra afectada.
Todas estas observaciones están más acordes con un modelo en el que el aparato virB
actúa directa o indirectamente alterando las propiedades fusogénicas de la vacuola que
transfiriendo ADN a la célula huésped.
La incapacidad que muestran distintas mutantes virB para replicar y sobrevivir en
células en cultivo, ya sean fagocitos profesionales o no, sumadas a la imposibilidad de
establecer un proceso infectivo, como muestran los ensayos de inoculación en ratones, indican
que el sistema virB constituye uno de los principales determinantes de la virulencia de
Brucella. Como ya ha sido reportado en varios estudios precedentes, la capacidad de
replicación intracelular correlaciona con la virulencia. Los estudios realizados con las mutantes
virB confirman que el proceso clave para el posterior desarrollo y manifestación de la
brucelosis es la colonización de la célula huésped y esto sólo se logra si la integridad del
operón virB no está afectada. Distintos estudios llevados a cabo por otros laboratorios en forma
simultánea con el presente trabajo confirman nuestros hallazgos. Un análisis de mutantes por
transposición de B. suis incapaces de replicar en células HeLa permitió a los investigadores del
grupo de Nimes, Francia, identificar el locus virB (O’Callaghan et al., 1999). Este grupo
analizó además la capacidad de replicación intracelular en macrófagos humanos de cuatro
mutantes independientes en los genes virB2, virB5, virB9 y virB10, llegando a la conclusión
que todos son esenciales para la virulencia. Sin embargo una mutante en el orf12 es capaz de
replicar en los macrófagos en forma similar a la cepa parental virulenta, lo que sugiere que esta
proteína no es necesaria para la multiplicación en macrófagos. En forma similar, nuestros
estudios de infección en HeLa de la mutante polar en el orf13, muestran que este orf y el orf 12
Discusión 77
son dispensables para el proceso de replicación intracelular. Ambos resultados sugieren que los
productos codificados por el ORF13 y el ORF12 no participan en la formación del complejo
virB. El producto codificado por el ORF13 es una proteína hipotética de 83 aminoácidos que no
tiene similitudes con ninguna secuencia depositada en los bancos de datos ni está presente en
ninguno de los sistemas tipo-IV descriptos. El producto del ORF12 presenta una secuencia
consenso de lipoproteínas (LAAC, residuos 13-16) y un probable sitio de clivaje de péptido
señal que generaría una proteína de 17.5 kDa con homología a Upf30.5, una proteína también
hipotética, que probablemente este involucrada en la formación del puente de conjugación del
plásmido R751 de Enterobacter aerogenes (Thornsted et al., 1998) y a la adhesina F de los
patógenos vegetales Pseudomonas fluorescens y P. syringae implicada en la unión a los pelos
radiculares de la planta (De Mot et al., 1994). En base a estas similitudes, O’Callaghan
especula que este producto probablemente participa en la interacción de Brucella con células
no-fagocíticas actuando como una adhesina. Sin embargo nuestros estudios de infección en
HeLa con la mutante polar en ORF13 no muestran una reducción en la internalización de la
mutante respecto de la cepa parental virulenta y por lo tanto, el rol exacto que cumplen el
ORF13 y 12 debe ser estudiado con mayor profundidad.
Dos trabajos de publicación reciente, en los que se describe el uso de la técnica STM
para el aislamiento de factores de virulencia en B. suis y B. abortus, identificaron inserciones
en los genes virB2, virB4, virB6 y virB8 que afectan la capacidad replicación en macrófagos
humanos (Foulongne et al., 2000), mientras que el análisis de las mutantes incapaces de iniciar
el proceso de infección crónica en ratones permitió aislar a los genes virB1 y virB10 (Hong et
al., 2000). Estos resultados confirman nuestras observaciones sobre el comportamiento
avirulento de las mutantes virB10 en ratones BALB/c y remarcan la importancia del sistema
tipo-IV como factor necesario para el establecimiento de la infección.
Los estudios de fusión a lacZ permitieron determinar que el locus virB es un operón que
se activa al comienzo de la fase estacionaria del crecimiento vegetativo. Si bien en este trabajo
no se ha explorado el patrón de expresión del operón virB durante los estadios intracelulares de
Brucella, es dable postular que el mismo es activo en la fase lag intracelular, esto es, durante
las primeras 12 h p.i. en las cuales Brucella permanece intracelular pero no replica, ya que en
este lapso se está produciendo la maduración de la vacuola en un nicho replicativo y este
proceso se logra con éxito sólo si el operón virB es activo. Una vez formada la vacuola
replicativa , comienza la fase de replicación intracelular exponencial y la actividad del operón
virB sería innecesaria. Estudios de inducción intracelular del operón virB en la línea J774.A1
Discusión 78
llevados a cabo en nuestro laboratorio, sugieren que el mismo sufre una importante inducción
en las primeras 12 h p.i., previo al estadio de replicación intracelular (Sieira, resultados no
publicados). Recientemente O’Callaghan y colaboradores observaron, por medio de inducción
diferencial de fluorescencia, que el promotor virB se induce específicamente dentro del
macrófago y que la acidificación de la vacuola es una de las señales percibidas por la bacteria
para activar el sistema. (D. O’Callaghan, comunicación personal).
El requerimiento de un operón virB activo para la supervivencia intracelular de Brucella
puede tener dos explicaciones posibles: 1) el operón virB es esencial para la formación de un
nicho de replicación intracelular competente, o 2) el operón virB es necesario para la
replicación una vez que el nicho de replicación intracelular se ha establecido. Los análisis a
nivel subcelular del tráfico seguido por las mutantes polares y no-polares en virB10 permitieron
discriminar entre estas dos alternativas. El sistema tipo-IV codificado por el operón virB es
esencial para la biogénesis del nicho replicativo.
Los estudios de colocalización con marcadores endocíticos tempranos durante los
primeros minutos de la internalización de la bacteria junto al comportamiento observado en los
estudios de infección en células en cultivo sugieren que el complejo virB no está involucrado ni
en el proceso de invasión ni en los primeros pasos de la internalización en fagocitos noprofesionales. Las vacuolas que contienen tanto a la cepa salvaje como a las mutantes virB10
interactúan en forma rápida y transitoria con endosomas tempranos caracterizados por la
presencia del marcador EEA1. La fusión de la vacuola que contiene a Brucella con endosomas
tempranos ha sido descripta también en macrófagos murinos (Pizarro-Cerdá et al., 1998b) y
más recientemente en macrófagos humanos (Rittig et al., 2001). La interacción de parásitos
intracelulares con compartimentos endosomales tempranos no es un fenómeno extraño, ha sido
demostrada en la infección de macrófagos derivados de monocitos humanos por
Mycobacterium avium y M. tuberculosis (de Chastelier et al., 1995; Clemens y Horwitz, 1996)
y datos recientes mostraron que Salmonella typhimurium adquiere EEA1 antes de localizarse en
vesículas conteniendo glicoproteínas lisosomales como LAMP-1 (Meresse et al., 1999; SteeleMortimer et al., 1999).
El defecto en la biogénesis de la vacuola permisiva para la replicación intracelular de
Brucella es ilustrado por el trafico alterado que muestran las mutantes virB10. A diferencia del
proceso de maduración que sufre la vacuola que contiene a la cepa virulenta B. abortus 2308, la
vacuola que contiene a la mutante polar virB10 muestra una rápida cinética de adquisición de
los marcadores lisosomales LAMP-1 y catepsina-D, alcanzando un estado estable de
Discusión 79
acumulación de ambos alrededor de las 4 h p.i. (94% de vacuolas positivas para los dos
marcadores) sin adquirir marcadores reticulares. Este resultado indica que la vacuola que
contiene a la mutante polar virB10 interacciona con lisosomas en donde la bacteria sufre un
proceso degradativo, lo que explica el fenotipo avirulento que muestra la mutante en los
ensayos de infección en células en cultivo y en ratones. El resultado sugiere además que una
mutación que interrumpe a VirB10 y afecta la transcripción de los genes río abajo afecta el
proceso por el cual Brucella escapa de la vía endocítica. Este proceso de escape está
caracterizado por la progresiva exclusión de LAMP-1 de la membrana vacuolar y la
adquisición del marcador de retículo endoplásmico Sec61β, dos fenómenos no observados en la
vacuola que contiene a la mutante polar.
Homólogos a VirB10 y VirB11 están presentes en todos los sistemas tipo-IV descriptos.
VirB11 tiene homólogos también en los sistemas tipo-II y en las maquinarias de ensamblaje de
las pilinas tipo-IV. La función precisa de VirB10 es desconocida en todos los sistemas tipo-IV,
sin embargo varios estudios topológicos llevados a cabo en A. tumefaciens sugieren que esta
proteína transmembrana se ensambla formando complejos de alto peso molecular que dependen
de la presencia del complejo VirB7-VirB9, aunque no se ha demostrado que exista interacción
física entre ellos (Zupan et al., 1998; Burns, 1999). Probablemente, como postula Kado, los
componentes VirB6-10 formen en conjunto una estructura tubular que se expande entre ambas
membranas formando el canal de translocación (Kado, 2000). VirB11 posee motivos de unión a
nucleótidos trifosfato y actividad ATPasa. En A. tumefaciens, H. pylori y en el operón Trb de
los plásmidos RP4, estas proteinas se ensamblan formando homomultímeros hexaméricos
(Rashkova et al., 2000; Krause et al., 2000a). Recientemente se ha logrado determinar la
estructura cristalina de la ATPasa HP0525 de H. pylori (Yeo et al., 2001). Este estudio reveló
que en el hexámero, los dominios N- y C-terminales de cada monómero forman dos anillos los
cuales en conjunto forman una cámara abierta hacia un lado y cerrada hacia el otro. El
ADP/ATP se une a la interfase presente entre ambos anillos y esta unión concertada de ATP y
posterior liberación de ADP regularía la apertura y cierre del poro. En base a estas evidencias
los investigadores postulan que HP0525 funcionaría como un poro o portal en la membrana
interna involucrado en la translocación de proteínas, ya sea la proteína efectora CagA o
componentes de la maquinaria de secreción tipo IV como lo postulaban varios estudios previos
(Christie, 1997; Zupan et al., 1998; Burns, 1999; Kado, 2000).
Discusión 80
Si bien no se dispone de pruebas formales sobre el funcionamiento o la topología del
sistema virB de Brucella, haciendo una analogía con los estudios arriba descriptos, es lícito
postular que el severo defecto observado en el tráfico intracelular de la mutante polar virB10
sea consecuencia de la ausencia de un complejo virB funcional. Más allá de la función
mecanística del complejo virB de Brucella, la descripción del tráfico intracelular de la mutante
polar virB10 implica que el sistema virB per se, o probables moléculas efectoras secretadas por
el mismo, están implicados en evitar la fusión de la vacuola con los lisosomas.
Esquema del trafico intracelular en HeLa seguido por las mutantes virB10
Los estudios realizados sobre la mutante no-polar virB10 muestran que esta cepa es
competente para evadir el camino endocítico pero es incapaz de alcanzar el RE para establecer
el nicho de replicación intracelular. Este hallazgo implica que la evasión de la vía endocítica no
es un proceso suficiente para permitir la multiplicación intracelular de Brucella, se requiere
además un proceso de maduración caracterizado por la exclusión progresiva de LAMP-1 de la
membrana de la vacuola y la adquisición de marcadores reticulares como Sec61β, aunque no se
descarta que en el proceso intervengan otros factores aún desconocidos. El proceso de
formación de la vacuola replicativa también es dependiente de la integridad del complejo virB.
Es probable que esta mutante posea un complejo virB defectuoso pero parcialmente funcional.
Un sistema de transporte defectuoso podría ser competente para evitar las interacciones entre la
vacuola y los lisosomas pero incapaz de completar el proceso de maduración de la vacuola para
Discusión 81
el establecimiento del nicho replicativo. Sorprendentemente, a partir de las 12 h p.i., la mutante
sufre un proceso de exclusión de la célula siendo reciclada a la superficie celular. Este
transporte retrógrado no ha sido observado previamente y probablemente indique una posible
interacción de Brucella con el camino exocítico. Una caracterización más profunda del proceso
de reciclado podría aclarar el mecanismo que subyace a este fenómeno.
Otro patógeno intracelular, Legionella pneumophila ha desarrollado una estrategia
similar para modular el destino de su vacuola. Luego de ser internalizada, las vacuolas que
contienen a L. pneumophila se asocian secuencialmente con vesículas lisas, mitocondrias y RE
(Horwitz, 1983a,b). La vacuola replicativa es incapaz de adquirir marcadores de endosomas
tardíos-lisosomas y se cubre de ribosomas en una posición perinuclear en forma similar a lo
observado en Brucella. En forma similar a lo que ocurre durante el tráfico intracelular de
Brucella, la vacuola que contiene a L. pneumophila es completamente segregada de la vía
endocítica. L. pneumophila controla el proceso de formación de su vacuola replicativa a través
de la acción específica de los genes dot/icm, un grupo de 24 genes que codifican una
maquinaria de secreción tipo-IV como es el caso del operón virB de Brucella. A pesar ser un
área de intensa investigación, la identificación de las moléculas efectoras que gobiernan el
crecimiento intracelular y el destino de la vacuola de Legionella ha mostrado ser dificultosa y
poco fructífera. Sin embargo hay un consenso generalizado entre los investigadores del área
quienes postulan que los probables efectores son los responsables de la biogénesis de la
organela replicativa (Segal et al., 1998; Vogel et al., 1998; Coers et al.,1999; Coers et al.,2000).
Las similitudes entre el comportamiento intracelular de Brucella y Legionella sugieren
que ambos microorganismos podrían utilizar mecanismos moleculares comunes para el
establecimiento de sus respectivos nichos replicativos. La pronta publicación de las secuencias
genómicas completas de Brucella y Legionella permitirán realizar búsquedas comparadas de
los probables factores bacterianos involucrados en estos procesos.
Discusión 82
PARTE II
La expresión de proteínas recombinantes en B. abortus S-19
La cepa vacunal B. abortus S-19 es una cepa naturalmente atenuada cuya característica
principal es el alto nivel de protección que confiere ante la infección con cepas virulentas de B.
abortus. Esta característica, sumada al bajo costo y la facilidad de su
producción la
convirtieron en una de las cepas vacunales vivas más utilizadas en medicina veterinaria. Sin
embargo, la similitud antigénica entre la cepa 19 y las cepas virulentas de campo respecto del
antígeno inmunodominante, el LPS, dificulta la discriminación serológica entre los animales
vacunados de los infectados, debido a la persistencia en el suero de los anticuerpos anti-LPS
(Brooks-Worrel y Splitter, 1992; Sutherland y Searson, 1990).
Debido a este inconveniente se han propuesto y diseñado varias alternativas para
solucionarlo, como el desarrollo de nuevas cepas vacunales que carecen del antígeno-O del
LPS (cepas rugosas), generación de cepas en fase lisa defectivas para la expresión de una
proteína inmunodominante y la generación de nuevos test diagnósticos que permiten
diferenciar los anticuerpos generados por la vacunación con S-19 de los generados por una
infección natural.
Una alternativa no testeada es la expresión de un antígeno heterólogo en S-19 que
resulte en una cepa vacunal portando una etiqueta antigénica distintiva que permita una rápida
discriminación entre animales vacunados de infectados.
Con el fin de analizar esta última alternativa, fue necesario desarrollar un vector de
expresión para Brucella. Para ello tomamos en consideración ciertas características que debía
poseer este vector:
1- Teniendo en cuenta la imposibilidad de controlar la expresión del antígeno
recombinante una vez que la cepa vacunal se encuentra en el animal, el promotor
elegido debería permitir la expresión en forma constitutiva del producto a niveles
compatibles con la generación de una respuesta serológica específica
2- El vector debe mantenerse en forma estable en la bacteria aún sin la presencia de
una presión selectiva
3- Con el objeto de minimizar los probables efectos tóxicos o la generación de cuerpos
de inclusión que suelen formarse cuando una proteína recombinante es expresada
constitutivamente o en grandes cantidades, se decidió dirigir la expresión del antígeno
heterólogo al periplasma de Brucella
Discusión 83
En consecuencia se eligió la secuencia promotora y las señales secretorias del gen
bcsp31 de B. abortus, una proteína periplásmica inmunodominante que es detectable en
infecciones naturales así como en animales vacunados (Bricker et al., 1988; Mayfield et al.,
1988). El vector escogido para realizar la construcción fue el pBBR1MCS4. Si bien en el
momento del desarrollo el pBBR era el único vector replicativo conocido para Brucella, su uso
era apropiado ya que se había reportado su estabilidad aún sin presión selectiva (Kovach et al.,
1995).
La decisión de dirigir la expresión del antígeno heterólogo al periplasma de Brucella fue
tomada basándose en un principio empírico propio del laboratorio y teniendo en cuenta lo
reportado en la literatura: si bien no hay forma de predecir el estado que adquirirá una proteína
recombinante en su nuevo “ambiente” celular (degradación, agregación o plegamiento
correcto), en muchos casos los problemas encontrados por la formación de cuerpos de inclusión
o por degradación de productos recombinantes en el citoplasma no suelen encontrarse cuando
la expresión se redirige hacia el periplasma, aunque esta afirmación no entraña un principio
general (Barth et al., 2000; Halfmann et al., 1993; Bowden et al., 1991).
En este trabajo se muestra que con el vector diseñado, un antígeno repetitivo heterólogo
puede ser expresado en el periplasma de Brucella en forma estable. La mayoría de la proteína
recombinante fue detectada en la fracción periplásmica de la bacteria, presumiblemente en
forma soluble ya que permanece en el sobrenadante de la fracción luego del tratamiento suave
utilizado para liberar el contenido periplásmico.
La expresión del antígeno repetitivo no altera las características de cultivo de la cepa 19
ni modifica la característica atenuación de la cepa vacunal a juzgar por los ensayos de
persistencia en ratones.
La capa vacunal recombinante induce una fuerte respuesta serológica específica contra
SAPA como puede apreciarse en los ensayos de ELISA, sin afectar la respuesta serológica
contra el LPS. Esto indica que el vector de expresión es mantenido en forma estable sin presión
selectiva y que la secuencia promotora escogida es activa durante la infección limitada
provocada por la cepa 19 recombinante.
Las subclases de IgG inducidas contra SAPA son predominantemente del tipo IgG2a
con muy bajos títulos de IgG1, lo que sugiere un desarrollo predominante de respuesta inmune
Th1 (Stevens et al.,1988) que es el tipo de respuesta estimulada por Brucella (Agranovich et
al.,1999; Scott et al., 1997). La respuesta serológica contra el antígeno recombinante no
Discusión 84
depende de la cantidad del mismo presente en el inóculo, sino de la competencia de la cepa
recombinante para generar una infección limitada en el huésped a juzgar por la ausencia de
anticuerpos anti-SAPA cuando los animales se inmunizaron con la cepa recombinante
inactivada por calor.
La expresión de SAPA en la cepa 19 no afecta la eficacia protectiva de la misma frente
a la infección de los ratones con la cepa virulenta S-2308. Los estudios de inoculación en
bovinos se correlacionan con lo observado en los ensayos en ratón: los anticuerpos anti-SAPA
son detectables a los 60 días p.v., sin observarse una alteración de los títulos anti-LPS
brucélicos. Por lo tanto el vector es estable también en bovinos y la expresión de SAPA es
compatible con la generación de una respuesta humoral específica. La eficacia protectiva de la
cepa recombinante no ha podido ser evaluada en bovinos debido principalmente a una
imposibilidad práctica.
Aunque en este trabajo se describe la expresión de un antígeno repetitivo en la cepa
vacunal S-19 para demostrar la factibilidad de la estrategia, es posible expresar en este vector
epitopes protectivos contra otros patógenos de importancia en la ganadería.
El vector
desarrollado fue de utilidad para la expresión del toxoide recombinante epsilon de C.
perfringens D.
Con respecto a la expresión del antígeno VP1 del virus de la aftosa, fue necesario
modificar el vector de expresión intercambiando el promotor constitutivo por un promotor más
débil e inducible, con el objeto de reducir los efectos deletereos que generaba la expresión del
antígeno viral en pBEV. Como muestran los análisis por western blot, la expresión de VP1 se
indujo al incubar las bacterias a 42°C, sin embargo esto no fue suficiente para estimular la
generación de anticuerpos específicos contra el antígeno aftoso, ya sea porque el nivel de
expresión no fue lo suficientemente elevado como para estimular la respuesta humoral o por el
stress que genera en el “carrier” la expresión del antígeno recombinante. Esto confirma que la
expresión de proteínas recombinantes en sistemas heterólogos son más una cuestión de arte que
de ciencia exacta, los sistemas de expresión no son universalmente explotables ni
generalizables, cada producto particular y el sistema de expresión escogido deben ser
analizados en detalle para determinar su factibilidad y eficacia.
Esta tecnología ha sido usada recientemente para expresar proteínas recombinantes
modelo en la cepa vacunal B. abortus RB51 bajo el promotor lac (Vemulapalli et al., 2000) y
en otras cepas bacterianas atenuadas como Bacillus anthracis (Brossier et al., 1999), bacilo de
Discusión 85
Calmette-Guerin (Cirillo et al., 1995), Vibrio cholerae (Killeen et al., 1999), Listeria
monocytogenes (Weiskirch y Paterson, 1995) y Lactobacilus casei (Zegers et al., 1999). La
ventaja de usar una potencial vacuna viva multivalente basada en la cepa vacunal B. abortus S19 es su aplicabilidad a poblaciones de animales domésticos y salvajes que requieren
vacunación contra la brucelosis.
En el modelo que se analizó en este trabajo se utilizó un vector de expresión autónomo
que porta un marcador de resistencia a antibióticos. En el diseño de una cepa vacunal
multivalente, sin embargo, es conveniente generar una inserción genómica estable del cassette
de expresión con el objeto de evitar su pérdida durante las divisiones sucesivas de la cepa
portadora en la ausencia de la presión selectiva. Para eso debe escogerse una región genómica
que sea blanco para la integración del cassette que no interrumpa una secuencia genética
importante para la capacidad protectiva de la cepa vacunal. Una probable región genómica para
generar integraciones podría ser el gen cgs que codifica para la sintetasa de glucanos cíclicos de
Brucella (Iñon de Iannino et al., 1998). Está documentado que la disrupción de esta secuencia
en la cepa vacunal S-19 no sólo no afecta su capacidad protectiva sino que reduce
significativamente su virulencia residual (Briones et al., 2001). Alternativamente se puede
utilizar un vector de replicación autónoma que porte resistencia a sales mercuriales o arseniales
en lugar de resistencias antibióticas como se ha utilizado en V. cholerae (Killen et al., 1999).
Otra posible aplicación de la tecnología desarrollada es el etiquetado antigénico de la
vacuna brucélica. El principal problema de los países que implementan campañas de
vacunación contra la brucelosis es la discriminación de los animales vacunados de los
infectados. Los resultados aquí presentados indican que el uso de una cepa vacunal portando
una etiqueta antigénica distintiva como SAPA, permite diferenciar en forma rápida y específica
a los animales vacunados por medio de un ensayo de ELISA. Incluso es posible implementar
un diagnóstico rápido basado en el uso de tiras reactivas como los utilizados frecuentemente
para la detección de embarazos.
El antígeno repetitivo SAPA es un excelente candidato para su uso como etiqueta
antigénica dado que es relativamente fácil de expresar en forma recombinante, probablemente
porque su estructura tridimensional es sencilla . Además es un excelente inmunógeno, cada una
de las 14 repeticiones en tandem porta al menos tres epitopes B (C. Buscaglia, comunicación
personal).
Discusión 86
El uso de una vacuna brucélica etiquetada no sólo puede ser útil para la discriminación
de los animales vacunados: puede incluso ser una herramienta de utilidad en política sanitaria
para la implementación de una campaña de vacunación a gran escala. La inclusión de distintas
repeticiones antigénicas sintéticas pueden servir para diferenciar animales vacunados de
distintas zonas geográficas, en distintos períodos de vacunación o para etiquetar productos de
diferentes empresas.
Conclusiones 87
•
El locus virB de Brucella abortus está contenido en un fragmento de 12 Kpb y está
compuesto por 13 ORFs colineales en la misma orientación. Todos los ORFs están precedidos
por potenciales sitios de unión a ribosomas.
•
El locus virB codifica para una probable maquinaria de secreción tipo-IV.
•
El locus virB es un operón transcripto desde virB1 al comienzo de la fase estacionaria
de crecimiento vegetativo.
•
Distintas mutaciones que afectan la integridad de los componentes del operón virB
anulan la capacidad de supervivencia y replicación intracelular de B. abortus tanto en fagocitos
profesionales como no-profesionales. Este defecto además anula la capacidad de la bacteria de
establecer un proceso infectivo en ratones. Por lo tanto el sistema VirB constituye uno de los
principales determinantes de la virulencia de Brucella.
• Si bien los primeros eventos del tráfico intracelular de Brucella no se encuentran
afectados por mutaciones polares y no-polares sobre el gen virB10, los eventos tardíos se
encuentran alterados.
• Mutantes polares en virB10 pierden la capacidad de aislar la vacuola que las contiene de
la via endocítica y en consecuencia sufren un proceso degradativo debido a la formación del
fagolisosoma.
• En cambio mutantes no-polares isogénicas retienen la capacidad de evadir la via
endocítica degradativa en forma similar a la cepa parental virulenta, sin embargo son incapaces
de modular el proceso de maduración de las vacuolas que las contienen y establecer un nicho
intracelular competente para su replicación.
• Por lo tanto el sistema VirB cumple una función esencial en el proceso de aislamiento de
la via endocítica y formación de la vacuola replicativa de Brucella. Los resultados sugieren que
la función de mismo es secretar moléculas efectoras que alteran el trafico de la bacteria.
Conclusiones 88
• Los resultados confirman que la formación del nicho de replicación intracelular es un
proceso en varios pasos que involucran la evasión de la via endocítica degradativa y la
interacción con la via biosintética para el establecimiento del nicho de replicación en el RER.
• La expresión de antígenos recombinantes heterólogos en B. abortus usando los vectores
de expresión desarrollados demuestra que esta tecnología es aplicable al género Brucella.
• Los vectores desarrollados permiten la expresión constitutiva o termoinducible de
antígenos recombinantes. Los mismos son competentes tambien para redirigir la expresión del
antígeno al periplasma de la bacteria.
• La expresión constitutiva de un antígeno repetitivo como SAPA en el periplasma de B.
abortus S-19 es compatible con la generación de una respuesta inmune humoral contra el
mismo sin alterar las propiedades culturales, de atenuación, ni la eficacia protectiva de la cepa
vacunal, sugiriendo que el desarrollo de nuevas cepas vacunales de Brucella recombinantes y
polivalentes es una tecnología factible.
Procedimientos experimentales 89
Cepas o Plásmidos
Brucella abortus
2308
S-19
virB1::Kan
virB9::Gm
virB10::Kan
virB10::Gm
ΔvirB11
virB1::Kan virB10::lacZ-Gm
virB10::lacZ-Gm
ORF13::Kan
Características
Fuente o Referencia
Salvaje, lisa, virulenta, Nalr
cepa vacunal, lisa, Nalr
r
2308 Nal Kanr, inserción de cassette Kanr
polar en virB1
2308 Nalr Gmr, inserción de cassette nopolar en virB9
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette polar
en virB10
2308 Nalr Gmr, inserción de cassette nopolar en virB10
2308 Nalr Gmr, deleción de virB11 y
reemplazo por cassette no-polar
virB1::Kan con fusión transcripcional
virB10::lacZ-Gm
2308 Nalr Gmr, fusión transcripcional
lacZ-Gm en virB10
2308 Nalr Kanr, inserción de cassette polar
en ORF13
Stock del laboratorio
Stock del laboratorio
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Escherichia coli
DH5αF’Iq
F’ φ80dlacZΔM15(lacZYA-argF)U169
deoR recA1 endA1 hsdR17 (rk- mk+) phoA
supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1/F’proAB+
lacIq ZΔM15 zzf::Tn5(Kmr)
Stock del laboratorio
S17.1 λpir
Nals
Herrero et al, 1990
Vector de amplio rango de huésped, Kanr
Vector de amplio rango de huésped, Ampr
Fragmento EcoRI de 0.88 kb conteniendo
el gen virB1 clonado en pBBR1MCS-4
Fragmento EcoRI de 1.2 kb conteniendo
el gen virB10 clonado en pBBR1MCS-2
Fragmento HindIII-HincII de 1.6 kb
conteniendo el gen virB9 clonado en
pBBR1MCS-4
FragmentoEcoRI de 1,4 kb conteniendo el
gen virB11 clonado en pBBR1MCS-4
Cósmido
Fragmento HindIII de 20 kb conteniendo
el operón virB clonado en pVK 102
Vector de clonado
Fragmento BamHI-EcoRI de 250 pb
conteniendo promotor y péptido señal del
gen bcsp31 de B. abortus clonado en
pBBR1MCS-4
Fragmento EcoRI de 850 pb conteniendo
la secuencia codificante del antígeno
SAPA de T. cruzi clonado en pBEV
Fragmento genómico Sau3A de 1.5 kb
conteniendo los genes virB9-virB10 de B.
abortus clonado en pBluescript SK
Cassette no-polar accI (Gmr) en pSportI
Cassette polar Kanr en pUC4
Cassette lacZ-Gm para fusión
transcripcional, clonado en pUC9
Kovach et al.,1995
Kovach et al.,1995
Plásmidos
pBBR1MCS-2
pBBR1MCS-4
pBBR4-virB1
pBBR2-virB10
pBBR4-virB9
pBBR4-virB11
pVK102
pVK8.3
pGEM-T easy
pBEV
pBEV-SAPA
pB2A3
pSPG1
pUC4K
pAB2001
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Este trabajo
Stock del laboratorio
Este trabajo
Promega Corp.
Este trabajo
Este trabajo
Ugalde R. A., 1999
Ugalde et al, 2000
Pharmacia Corp
Becker et al, 1995
Procedimientos experimentales 90
Medios y condiciones de cultivo
Las cepas de Brucellae fueron cultivadas a 37°C en agitador rotatorio (200 rpm) o en
placas de petri por 24-48 hs en medio tripticasa de soja (TSB) con el agregado de antibióticos
según el requerimiento de cada cepa. Los antibióticos utilizados a la concentración final
indicada fueron: kanamicina (50 μg/ml), gentamicina (2,5 μg/ml), tetraciclina (2,5 μg/ml),
ampicilina (50 μg/ml), carbenicilina (50 μg/ml) y ácido nalidíxico (5 μg/ml).
Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas a 37°C en agitador rotatorio (200 rpm)
o en placas de petri por 12-18 hs en medio Luria-Bertani (LB) con el agregado de antibióticos
según el requerimiento de cada cepa. Los antibióticos utilizados a la concentración final
indicada fueron: ampicilina (100 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (20 μg/ml),
gentamicina (20 μg/ml) y trimetoprima (20 μg/ml).
Purificación de ADN genómico
Para la extracción y purificación de ADN genómico de B. abortus se siguió la técnica
del CTAB (Meade et al, 1982) con algunas modificaciones. Las bacterias fueron cosechadas
por centrifugación a 4000×g (aproximadamente 1 g de peso húmedo), lavadas dos veces y
resuspendidas en una solución 10mM Tris pH 7,6, 10mM EDTA. Luego fueron sometidas a
lisis por el agregado de SDS 0.5% final y proteinasa K, 100μg/ml. Se incubo 1 h a 37°C. Luego
de la incubación, se agregó NaCl hasta llevar la concentración a 0.8 M y se agregó una solución
de CTAB/NaCl para acomplejar y remover la pared celular, polisacáridos y proteinas. Se
incubó a 65°C por 30 min y se procedió a la extracción con cloroformo/alcohol isoamílico. La
fase acuosa conteniendo el ADN genómico se extrajo con un volumen igual de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y la fase acuosa fue precipitada con 0.6 volúmenes de
isopropanol. El ADN genómico precipitado fue secado y resuspendido en buffer TE y
congelado a -20°C para su posterior uso.
Southern blots
El ADN purificado fue digerido en forma completa con las enzimas de restricción
indicadas en cada caso y 5 μg de cada digesto fueron resueltos por electroforesis en geles de
agarosa 0,8-1% en 0,5× Tris-borato-EDTA (45mM Tris-borato, 1mM EDTA, pH 8,0) a 0,5
volts/cm en presencia de 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. Para la transferencia a membranas de
nitrocelulosa se siguió la técnica de transferencia por capilaridad descripta en Molecular
Procedimientos experimentales 91
Cloning (Sambrook et al, 1989). Las membranas de nitrocelulosa fueron prehibridadas en 3×
SSC, 5× reactivo de Denhardt, 0,5% SDS, 100 μg/ml ADN esperma de salmón por 2 h a 50°C.
Las hibridaciones se llevaron cabo por 18-20 h con las sondas y en las condiciones requeridas
por cada experimento. Luego de los lavados, las membranas fueron expuestas sobre películas
radiográficas con pantallas intensificadoras a -70°C.
Clonado de la región virB
En un esfuerzo por identificar en forma sistemática secuencias genéticas de B. abortus
llevado a cabo en nuestro laboratorio (Ugalde R. A., 1999; Sanchez et al., 2001) se identificó
un fragmento de ADN de 1.5 kb con alta identidad a los genes virB9-virB10 de A. tumefaciens
y ptlF-ptlG de B. pertussis (GeneBank, número de acceso AQ752936). Este clon, denominado
pB2A3, fue usado como sonda en un experimento de hibridación de colonias sobre una
genoteca de B. abortus en cósmido pVK102 (Iñon de Iannino et al, 1998), con el objeto de
aislar el locus virB completo. La técnica de hibridación de colonias se realizó en la forma
clásica tal como se describe en Molecular Cloning (Sambrook et al, 1989). Los cósmidos
purificados de tres colonias reactivas fueron sometidos a digestión completa con las restrictasas
HindIII, AvaII y EcoRI, los digestos fueron resueltos por electroforesis en geles de agarosa
0,8%, transferidos y sometidos a análisis de Southern blot usando como sonda el clon pB2A3,
para confirmar el resultado de la hibridación sobre colonias. El cósmido pVK8.3 que contiene
el fragmento de ADN mas pequeño (20 kb) fue elegido para los análisis de secuenciación y
complementación genética.
Con el objeto de acelerar el proceso de clonado y secuenciación del locus virB, en lugar
de proceder de la forma clásica, se decidió diseñar un set de 44 oligonucleótidos
complementarios a la secuencia codificante del locus virB de B. suis 1330, de forma tal de
obtener, por medio de PCR sobre el cósmido pVK8.3, 22 amplicones solapantes de tamaño
promedio 530pb que cubren el locus virB entero.
Secuenciación del locus virB
Luego de realizadas las reacciones de PCR, los amplicones fueron clonados en el vector
pGEM-T easy y se purificaron los plásmidos por el método de la lisis alcalina (Sambrook et al.,
1989) seguido de precipitación con polietilenglicol 8000. Los plásmidos obtenidos se
sometieron a análisis de secuenciación automática. Ocho clones independientes de cada
Procedimientos experimentales 92
amplicón fueron secuenciados. Las reacciones de secuencia se realizaron sobre cada molde con
los oligonucleótidos T7 y/o SP6 usando el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction (Applied Biosystem) en ciclador térmico Genius (Techne) con AmpliTaqr DNA
polimerasa (FS enzyme) siguiendo el protocolo provisto por el fabricante. Las reacciones
fueron analizadas en un secuenciador automático ABI Prism 377 (Applied Biosystem). Las
secuencias fueron ensambladas y editadas usando el software Phred-Phrap-Consed System en
un ambiente LINUX. Las secuencias fueron comparadas contra la base de datos de proteínas
no-redundante del National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando los
programas BLASTx y/o BLASTp del servicio en red BLAST del NCBI (Altschul et al., 1990).
La secuencia completa del operón virB de B. abortus se encuentra depositada en el
GenBank bajo el número de acceso AF226278.
Construcción de la mutante polar virB1
Un amplicón de 881 pb conteniendo el gen virB1 fue obtenido a partir de una reacción
de PCR sobre ADN genómico de B. abortus 2308 usando los oligonucleótidos 5’CGCTGATCTATAATTAAGGCTA-3’y 5’-TGCGACTGCCTCCTATCGTC-3. El producto
de PCR fue ligado al vector pGEM-T easy para generar el plásmido pGEM-T-virB1. El
plásmido resultante fue linearizado con BamHI y ligado a un fragmento de 1,3 kb que codifica
para un cassette polar de resistencia a kanamicina, de esta forma se generó el plásmido pGEMT virB1::Kan. Todos los plásmidos de la línea pGEM-T son incapaces de replicar
autónomamente en Brucella por lo que funcionan como vectores suicidas. El pGEM-TvirB1::Kan fue electroporado en B. abortus 2308 y las colonias que sufrieron eventos de doble
recombinación homóloga fueron seleccionadas en placas TSB con el agregado de kanamicina y
repicadas en réplica a placas TSB ampicilina. Las colonias Kanr Amps fueron seleccionadas y
sometidas a análisis de PCR y Southern blot para confirmar que el gen salvaje virB1 había sido
reemplazado por la copia interrumpida por el cassette kanamicina. Este procedimiento generó
la mutante polar B. abortus virB1::Kan.
El fragmento de 881 pb conteniendo el gen virB1 salvaje fue escindido del pGEM-TvirB1 por EcoRI y ligado al sitio EcoRI del vector replicativo para Brucellae, pBBR1MCS-4 de
forma tal que el gen quede bajo la acción del promotor lac presente en el vector. El plásmido
resultante, denominado pBBR4-virB1, fue introducido en la cepa E. coli S17.1 λpir y
posteriormente movilizado a B. abortus virB1::Kan por conjugación biparental.
Procedimientos experimentales 93
Generación de mutantes en virB10
Para obtener mutantes polares y no-polares en el gen virB10 se realizaron dos tipos de
mutagénesis por inserción dirigida. El plásmido pB2A3, que contiene a los genes virB9-virB10
de B. abortus 2308, fue linearizado con NruI y ligado a un fragmento HincII de 1,3 kb que
codifica para un cassette polar de resistencia a kanamicina o a un fragmento SmaI de 0,7 kb que
codifica para un cassette de resistencia a gentamicina que carece de secuencias terminadoras
transcripcionales. Los plásmidos resultantes, denominados pB2A3::Kan y pB2A3::Gm fueron
introducidos en B. abortus 2308 por electroporación. Dado que pB2A3 es un derivado de
pBluescript SK, es incapaz de mantenerse en forma autónoma en Brucella y en consecuencia
funciona como vector suicida. Por lo tanto las colonias que fueron Kanr Amps o Gmr Amps en
las correspondientes placas de selección fueron consideradas como posibles dobles
recombinantes. Los análisis de PCR y Southern blot confirmaron que el gen salvaje virB10
había sido interrumpido por los cassettes polar y no-polar. De esta forma se generó la mutante
polar B. abortus virB10::Kan y no-polar B. abortus virB10::Gm.
Los plásmidos para la complementación de las mutantes virB10 fueron generados de la
siguiente manera. Una PCR preparativa fue llevada a cabo con los oligonucleótidos 5’GGGAATTCGTCAGGCACAATAAAGTCAC-3’y
5’-CCACAGTGCCAGGCGTCAAG-3’
para amplificar un fragmento de 1244pb que contiene el gen virB10 completo. El amplicón fue
clonado en pGEM-T easy para generar el vector pGEM-T-virB10. Este vector fue digerido con
EcoRI, se purifico el inserto de 1,2 kb que contiene a virB10 y posteriormente el fragmento fue
ligado al sitio EcoRI de los vectores pBBR1MCS-2 y pBBR1MCS-4 bajo el promotor lac. Los
plásmidos resultantes, denominados pBBR2-virB10 y pBBR4-virB10 fueron introducidos en E.
coli S17.1λpir por el método de la transformación con Cl2Ca (Inoue et al., 1990) y luego
movilizados por cruce biparental a la mutante no-polar B. abortus virB10::Gm o a la mutante
polar B. abortus virB10::Kan respectivamente.
Generación de fusiones transcripcionales en virB10
El plásmido pAB2001 fue digerido con HindIII para liberar un fragmento de ADN de
4,5 kb que contiene el cassette lacZ-accI carente de secuencias promotoras. Los extremos
cohesivos de este fragmento de ADN fueron rellenados con T4 DNA polimerasa (New England
Biolabs) y ligados al sitio NruI del vector pB2A3. El plásmido resultante, denominados
Procedimientos experimentales 94
pB2A3::lacZ-Gm fue introducido en B. abortus 2308 por electroporación. Se seleccionaron las
colonias Gmr Amps como posibles dobles recombinantes y los eventos correctos de doble
recombinación homóloga fueron confirmados por análisis de PCR y Southern blot. Este
procedimiento generó la cepa B. abortus virB10::lacZ-Gm que posee una fusión transcripcional
del cassette lacZ en el gen virB10.
Generación de la doble mutante B. abortus virB1::Kan virB10::lacZ-Gm
El vector pGEM-T-virB1::Kan fue introducido en la cepa B. abortus virB10::lacZ-Gm
por electroporación. Las bacterias fueron sembradas en placas TSB conteniendo
gentamicina(2,5 μg/ml) y kanamicina (50 μg/ml). Las colonias resistentes a ambos antibióticos
fueron repicadas en réplica a placas TSB conteniendo ampicilina (50 μg/ml). Las colonias Kanr
Gmr Amps fueron seleccionadas como posibles dobles recombinantes y el evento de reemplazo
génico de virB1 fue confirmado por análisis de PCR.
Generación de la mutante B. abortus virB9::Gm
Un fragmento de ADN de 1651 pb conteniendo el gen virB9 completo fue amplificado a
partir de ADN genómico de B. abortus 2308 con los oligonucleótidos 7086U y FusB9D. El
producto de PCR fue ligado al vector pGEM-T generándose el plásmido pGEM-T-virB9. Este
vector fue linearizado con EcoRI y ligado al fragmento de 0,8 kb del gen accI que codifica para
resistencia a gentamicina, generándose el vector pGEM-T-virB9::Gm. Esta construcción fue
introducida en B. abortus 2308 por electroporación y las colonias Gmr Amps seleccionadas para
confirmar el evento de doble recombinación homóloga por PCR. El gen virB9 fue escindido del
vector pGEM-T-virB9 por corte con las enzimas HincII-HindIII y ligado al vector
pBBR1MCS-4 bajo el promotor lac para generar el vector complementante pBBR4-virB9.
Generación de la mutante polar B. abortus ORF13::Kan
Un fragmento de 2,2 kb conteniendo la porción C-terminal del gen virB11 y el ORF13
completo fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico de B. abortus . El producto de
PCR fue digerido por EcoRI y clonado en el vector pBBR1MCS-4 para generar el vector
pBBR4-ORF13. Este vector fue linearizado con NdeI, los extremos cohesivos fueron rellenados
con DNA Polimerase Klenow Fragment (New England Biolabs) y ligados a un fragmento
HincII de 1,3 kb que contiene al cassette polar Kanr del vector pUC4K (Pharmacia),
Procedimientos experimentales 95
generándose el vector pBBR4-ORF13::Kan. Este vector fue digerido con EcoRI, el fragmento
de 2,5 kb correspondiente al ORF13 interrumpido con el cassette Kanr fue purificado y ligado
al sitio EcoRI del pBluescript KS II que funciona como vector suicida en el contexto de
Brucella. El vector generado, denominado pBlue-ORF13::Kan fue introducido en B. abortus
2308 por electroporación y las colonias Kanr Amps seleccionadas y posteriormente analizadas
por PCR para comprobar que el evento de reemplazo genético del ORF13 por la copia
interrumpida había ocurrido correctamente.
Deleción del gen virB11
El fragmento EcoRI de 1,2 kb del vector pGEMT-virB10, que contiene el gen virB10
completo fue ligado al sitio EcoRI del pBluescript KS II, generándose el vector pBlue-virB10.
Un fragmento BamHI de 0.8 kb que contiene al gen accI del vector pSPG1 fue ligado al sitio
BamHI del vector pBlue-virB10 de forma tal que el cassette Gmr quede río abajo y en el mismo
sentido que el gen virB10. Este procedimiento generó el vector pBlue-virB10-Gm. Un producto
de amplificación por PCR de 850 pb que contienen al ORF13-ORF12 fue ligado al vector
pGEM-Teasy y luego liberado por restricción con NotI. El fragmento NotI fue ligado al pBluevirB10-Gm en el sitio NotI río abajo y en el mismo sentido de transcripción de la construcción
virB10-Gm, generándose así el vector pBlue-virB10::Gm-ORF13-ORF12. Esta construcción
fue introducida en B. abortus 2308 por electroporación para generar la deleción del gen virB11
y su reemplazo por el marcador accI que confiere resistencia a gentamicina. Las colonias
resistentes a gentamicina y sensibles a ampicilina fueron seleccionadas y posteriormente
analizadas por PCR para confirmar que el reemplazo de virB11 por accI había ocurrido.
Cultivo de células
Las células Hela fueron cultivadas en botellas de 75 cm2 (Falcon; Becton-Dickinson) a
37°C en atmósfera de CO2 al 5% con Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (MDMEM; Gibco
BRL) suplementado con suero feral bovino (Gibco BRL) al 10% y 2mM glutamina sin el
agregado de antibióticos (medio de cultivo celular). Las células fueron usadas entre los pasajes
1 y 15 y fueron divididas 1:10 o 1:4 dos veces por semana. Para las inoculaciones de la
monocapas, las placas de cultivo de 24 pocillos (Falcon; Becton-Dickinson) fueron sembradas
con 500μl de 1×104 o 1×105 células por pocillo (para el análisis por microscopía confocal, las
Procedimientos experimentales 96
células fueron sembradas en placas de 24 pocillos conteniendo cubreobjetos de vidrio de 12mm
de diámetro).
Los mismos procedimientos se utilizaron para cultivar la línea celular murina J774.A1.
En este caso el medio de cultivo utilizado fue RPMI (Gibco BRL) suplementado con suero fetal
bovino 10% (Gibco BRL) y 2mM glutamina.
Ensayos de infección en células
Stocks de B. abortus congelados a -70°C fueron utilizados para sembrar 10 ml de TSB,
con el agregado de antibióticos según el requerimiento de cada cepa. Después de 18-20 hs de
cultivo a 37°C y 200 rpm (fase logarítmica), las bacterias fueron cosechadas por centrifugación,
lavadas dos veces en solución tampón fosfato salina (PBS) pH 7.4 y resuspendidas en medio de
cultivo celular a una concentración de 5×107 UFC/ml sin el agregado de antibióticos. Los
números bacterianos fueron estimados por comparación de la densidad óptica del cultivo a 600
nm contra una curva standard y determinados por conteo retrospectivo. Después que las células
HeLa fueron sembradas en placas de 24 pocillos (105 células/pocillo), el medio fue removido y
las células inoculadas con las bacterias resuspendidas en medio de cultivo celular o con una
dilución 1:20 000 de una solución 10% de bolas de látex teñidas cuando fue necesario. Para
asegurar un contacto estrecho entre las células y las bacterias, las placas fueron centrifugadas
por 10 min a 141×g a temperatura ambiente e inmediatamente incubadas a 37°C en atmósfera
de CO2 al 5% (tiempo 0). Después de 1 h, los pocillos fueron lavados 5 veces con PBS (pH 7.4)
y se agregó medio de cultivo celular conteniendo 100μg/ml de gentamicina y 50μg/ml de
estreptomicina para eliminar todas las brucelas no internalizadas. En los experimentos de
infección a tiempos cortos (5, 10 y 40 min) no se agregaron antibióticos. En los experimentos
de infección a largo plazo, el medio de cultivo celular fue reemplazado a las 24 h por medio
fresco con el agregado de gentamicina y estreptomicina.
A los tiempos indicados, el número de brucelas intracelulares viables fue determinado
de la siguiente forma: las células fueron lavadas 5 veces con PBS estéril (pH 7.4) y tratadas con
una solución de Triton X-100 al 0,1% final en agua bidestilada estéril, los lisados fueron
diluidos en forma serial en solución fisiológica estéril y plaqueados en medio TSB con el
agregado de los antibióticos necesarios.
Procedimientos experimentales 97
Ensayos de infección en ratones
Ratones hembra de la línea BALB/c de 60 días de edad fueron inoculados
intraperitonealmente con 104 UFC de B. abortus 2308, las mutantes B. abortus virB10::Kan, B.
abortus virB10::Gm o las respectivas mutantes complementadas. A los 15 días postinfección
(p.i.), los ratones fueron sacrificados, los bazos removidos, pesados y homogeneizados en 1ml
de solución fisiológica estéril. Los homogenatos de tejidos fueron diluidos en forma seriada y
plaqueados en TSB por duplicado con el agregado de los antibióticos apropiados. Las UFC
fueron determinadas después de 3-4 días de incubación a 37°C.
Anticuerpos y sondas fluorescentes
El anticuerpo policlonal de conejo anti-antígeno endosomal temprano 1 (EEA1) fue
obsequio del Dr. H. Stenmark, The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Noruega; el anticuerpo
policlonal anti- LAMP1 humano fue obtenido del Dr. M. Fukuda, The Burnham Institute, La
Jolla, CA, USA; el anticuerpo policlonal de conejo anti-catepsinaD fue un obsequio del Dr. S.
Kornfeld, Washington University School of Medicine, St Louis, MO, USA; los anticuerpos
policlonales de conejo anti-calreticulina y anti-calnexina fueron obtenidos de Affinity
Bioreagents. El anticuerpo policlonal de conejo anti-sec61β fue un obsequio de Bernhard
Dobberstein, ZMBH, Heidelberg, Alemania. Los anticuerpos policlonales de vaca y conejo
anti-B. abortus 2308 fueron obtenidos mediante procedimientos standard (Pizarro-Cerdá et al.,
1998). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron : anticuerpo policlonal de burro anti-IgG
de conejo acoplado a FITC; anticuerpo de burro anti-IgG de ratón conjugado a FITC;
anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de vaca conjugado a Texas Red (TxR) y anticuerpo de
burro anti-IgG de ratón conjugado a Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories).
Inmunofluorescencia analítica y cuantitativa
A diferentes tiempos post-inoculación, los cubreobjetos fueron lavados 5 veces en PBS
(pH 7.4) para remover las bacterias no adherentes y fijados por 15 min en paraformaldehido
3%, pH 7.4 a temperatura ambiente. Luego las células fueron lavadas tres veces en PBS
seguido por una incubación de 10 min en PBS con NH4Cl 50 mM para extinguir la
fluorescencia debida a los grupos aldehido libres. Posteriormente los cubreobjetos fueron
incubados con diluciones apropiadas de los anticuerpos primarios dirigidos contra los distintos
marcadores intracelulares en PBS-5% suero de caballo-0,1% saponina por 20 min en cámara
Procedimientos experimentales 98
húmeda a temperatura ambiente. Después de este período, los cubreobjetos fueron lavados
serialmente en lavados en PBS-5% suero de caballo-0,1% saponina, PBS y agua bidestilada e
incubados con la dilución apropiada de los anticuerpos secundarios en la solución arriba
descripta y siguiendo el mismo procedimiento. Luego, los cubreobjetos fueron montados en
portaobjetos sobre gotas de Mowiol (Aldrich) y dejados 1 h en oscuridad para permitir el
secado. Los preparados que no fueron analizados inmediatamente fueron guardados a –20
grados.
Los análisis de inmunofluorescencia indirecta y confocal fueron realizados en un
microscopio Leica LaserTechnik TCS 4DA usando objetivo 100× de inmersión en aceite. Las
líneas de láser utilizadas fueron: 488 nm para FITC; 568 nm para TxR y 647 nm para Cy5. Las
proyecciones fueron salvadas en formato TIFF e importadas a ADOBE POTHOSHOP para
editar y superponer las imágenes usando el formato RGB.
Para determinar el porcentaje de bacterias o bolas de látex que colocalizaban con el
marcador intracelular estudiado, se contaron un mínimo de 80-100 bacterias intracelulares
(reveladas por inmunofluorescencia indirecta) o bolas de látex (reveladas por emisión de
autofluorescencia roja) en el canal rojo y luego las muestras fueron observadas bajo el canal
verde o azul, según correspondiera. Los ensayos fueron realizados en duplicado. Para analizar
el porcentaje de bacterias intracelulares y extracelulares, las bacterias extracelulares fueron
marcadas por incubación con anticuerpo de conejo anti-LPS seguido de la marcación con
anticuerpo de burro anti IgG de conejo conjugado a FITC previo a la permeabilización con
saponina. Luego las células fueron permeabilizadas para permitir la marcación de las bacterias
intracelulares con suero de vaca anti-LPS seguido de la marcación con suero de cabra anti-IgG
bovina conjugado a TxR. Los límites de las células o las vacuolas replicativas pueden ser vistos
aumentando el contraste de las imágenes confocales lo que permitió graficarlas con líneas
punteadas usando las herramientas apropiadas del software PHOTOSHOP.
Construcción del vector de expresión pBEV
Un fragmento de ADN de 250 pb que codifica parala región promotora, el codón de
iniciación y los los primeros 31 codones correspondientes al péptido señal del gen bcsp31 de B.
abortus S19 (Mayfield et al.,1988) fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos 5’GACTGGATCCGCGGCCGCCTGCAA-3’ y 5’-ACTGGTACCGGGGCCTGTGCAAC-3’.
Estos oligonucleótidos contienen sitios de restricción para BamHI y KpnI, respectivamente para
Procedimientos experimentales 99
facilitar los procedimientos de clonado. Como ADN molde, se utilizó un vector derivado de
pUC19 conteniendo la secuencia completa del gen bcsp31 previamente clonado en nuestro
laboratorio. El fragmento de 250 pb fue ligado a los sitios BamHI y KpnI del vector pUC19 y la
construcción resultante fue introducida en E. coli DH5αF’Iq según el procedimiento clásico de
transformación por Cl2Ca (Inoue et al., 1990). La construcción fue analizada por mapeo de
restricción y secuenciación. Esta construcción fue designada pUC-PROM.
Dado que pUC-PROM posee un origen de replicación basado en ColE1, es incapaz de
mantenerse en forma autónoma en el contexto de Brucella. Por lo tanto, un fragmento BamHIEcoRI de 250 pb fue escindido de pUC-PROM y ligado a los sitios correspondientes del vector
de amplio rango de huesped (replicativo en el género Brucellae) pBBR1MCS-4. Este vector,
que contiene la región promotora, el codon iniciación y el péptido señal de bcsp31 mas tres
sitios de restricción en tandem y en fase (KpnI-SacI-EcoRI) fue denominado pBEV.
Como gen “reporter”de esta construcción se utilizó la secuencia codificante del antígeno
repetitivo de Trypanosoma cruzi, SAPA. Este antígeno esta formado por 14 unidades
repetitivas en tandem, cada una conformada por 12 aminoácidos de longitud (Pollevick et al.,
1991). Un fragmento de ADN de 850 pb codificantes del antígeno repetititvo fue introducido
en fase en el sitio EcoRI de pBEV. El vector recombinante resultante, denominado pBEVSAPA, fue introducido en E. coli DH5αF’Iq competentes y la formación del nuevo gen híbrido
fue analizado por secuenciación. Posteriormente, pBEV y pBEV-SAPA fueron introducidos en
E. coli S17.1 λpir para ser transferidos por conjugación a B. abortus S19.
Shock osmótico de Brucella
Para la preparación del contenido periplásmico de Brucella se siguió el protocolo
desarrollado por T. Stabel con menores modificaciones (Stabel et al., 1994). Un cultivo de B.
abortus fue cosechado por centrifugación, lavado y resuspendido en solución fisiológica a una
concentración final de 1-5×1010 bacterias /ml. Las bacterias fueron centrifugadas a temperatura
ambiente por 10 min a 6000×g y resuspendidas en 1ml de Tris 0,2M pH 8,0. Se agregó luego
un 1 ml de solución Tris 0,2M pH 8,0, Sacarosa 1M y Zwittergent 3-16 0,5%. Se incubó 10
min a temperatura ambiente y se agregó lisozima hasta una concentración final de 100μg/ml.
Se procedió a incubar el preparado hasta notar un cambio en la turbidez de la muestra. Luego se
agregaron 2 ml de agua bidestilada y se incubó con agitación suave por 2 h a 25 °C. Despues de
este período se centrifugó la muestra por 30 min a 25 °C y 8000×g. La fracción periplásmica (
Procedimientos experimentales 100
4ml del sobrenadante) fue extraída para su posterior análisis y el pellet (fracción
protoplástica)fue lavado dos veces con solución fisiológica y separado para su posterior uso.
Western blots
Los lisados bacterianos totales, las fracciones protoplásticas y periplásmicas fueron
solubilizadas en solución amortiguada de Laemmli en presencia de ditiotreitol como agente
reductor a 100°C por 5 min (Laemmli, 1970).Los extracto protéicos fueron resueltos por
electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida-SDS 10% (SDS-PAGE) y
transferidos a filtros de nitrocelulosa tal como se describe en Molecular Cloning (Sambrook et
al., 1989). La expresión de la proteína recombinante fue detectada en los filtros por incubación
con suero hiperinmune de conejo contra SAPA en dilución 1:500 (Pastini et al., 1994) seguido
de la incubación con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa
de rábano (HRPO) (Dako Immunoglobulins) diluído 1:2000 y revelado con 4-cloro-1-naftol
como cromógeno (Sigma Chemical Corp.).
Para estudiar la respuesta inmune generada contra la proteína recombinante expresada
en Brucella, 50 ng de proteína híbrida SAPA-glutatión-S-transferasa (GST-SAPA) purificada
de E. coli fueron solubilizadas en solución amortiguada de Laemmli, resueltas por SDS-PAGE,
transferidas a membranas de nitrocelulosa e incubadas con los sueros de los animales
inmunizados. Los filtros fueron luego incubados con proteína A-I125 (Dupont NEN Research
Products) y expuestos en placas radiográficas.
Inmunización de ratones y ensayos de protección
Ratones BALB/c hembras de 60 dias de edad fueron inoculados intraperitonealmente
con 1×107 ufc de Brucellae en 0,2 ml de solución fisiológica. Grupos de 8 ratones fueron
inoculados con B. abortus S19 (pBEV), B. abortus S19 (pBEV-SAPA) y B. abortus S19
(pBEV-SAPA) inactivadas por incubación a 65°C por 1 h, respectivamente. A los 10, 18, 23 y
30 dias p.i., dos animales por grupo fueron sangrados y sacrificados, el suero fue recogido y
guardado a -20°C hasta su uso; los bazos fueron extraídos, pesados y homogeneizados en 1ml
de solución fisiológica esteril para realizar recuento de viables por dilución y plaquéo en medio
TSB suplementado con los antibióticos necesarios.
Para los ensayos de protección, dos grupos de 10 ratones fueron inoculados
intraperitonealmente con 1×107 UFC de B. abortus S19 y B. abortus S-19 (pBEV-SAPA)
Procedimientos experimentales 101
respectivamente. Sesenta dias post-inoculación los ratones fueron desafiados con 5×104 UFC
intraperitoneales de la cepa virulenta B. abortus 2308. A los 7 y 28 dias post-desafío, 5 ratones
de cada grupo fueron sacrificados, los bazos removidos y homogeneizados como ya se
describió para efectuar el recuento de viables.
ELISA
La respuesta de anticuerpos murinos contra el LPS de Brucella y contra el antígeno
recombinante SAPA fueron evaluados por ensayos de ELISA indirecto. Para la detección de
los anticuerpos anti-LPS se siguió la técnica desarrollada por Nielsen con algunas
modificaciones (Nielsen et al., 1995). Placas de poliestireno (Nunc 92620) fueron
sensibilizadas con S-LPS a una concentración de 1 μg/ml en solución amortiguada de
carbonato de sodio 0,006M pH 9,6. Los sueros de los ratones para cada período de muestreo
fueron combinados y dispensados a una dilución 1:25 en solución PBS 10mM, 0,015M EDTA,
0,015M EGTA, 0,05% Tween 20 pH 6.3. La reactividad de los sueros fue detectada incubando
con suero de cabra anti-Ig de ratón conjugado a peroxidasa (HRPO) (Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc.) diluído 1:2500 en PBS 10 mM, 0,05% Tween 20 pH 7,2 y revelada con una
solución de sustrato/cromógeno 1mM de 2,2-azino-bis(3-ethylbenzil-thiazoline-6-sulfonic
acid)diammonium salt (ABTS), 4 mM H2O2 en 0,05 M de solución amortiguada citrato pH 4,5.
Las lecturas fueron tomadas a 405 nm cada minuto, sobre los primeros 15 minutos de reacción
con el programa ELISA 2.20 ADRI (Nielsen et al., 1992) en un lector de ELISA conectado a
una computadora (Titertek Multiscan). Los valores de absorbancia en el rango lineal versus
tiempo fueron utilizados para calcular las pendientes para cada suero por análisis de regresión
lineal. Los valores de las pendientes (multiplicads por 103), que son directamente
proporcionales a la concentración de anticuerpos específicos presentes en la muestra (Winter et
al., 1988), fueron graficados para cada muestra. El mismo procedimiento se siguió para evaluar
la respuesta serológica contra el antígeno recombinante SAPA. En este caso las placas de
poliestireno fueron sensibilizadas con 500ng de SAPA recombinante en solución amortiguada
de carbonato de sodio 0,006M pH 9,6. Para la detección de los distintos isotipos de
inmunoglobulinas, se utilizaron anticuerpos secundarios de cabra conjugados a HRPO antiIgG1 y IgG2a de ratón diluídos 1:500 en PBS 10 mM, 0,05% Tween 20 pH 7,2. En este caso
los títulos de anticuerpos específicos contra SAPA fueron expresados como la máxima dilución
Procedimientos experimentales 102
cuyo valor de absorbancia a 405 nm fue mayor al valor promedio + 3 DS de 5 sueros murinos
normales.
Inoculación experimental de bovinos
Diez terneras de 6 meses de edad fueron divididas en dos lotes. El lote control,
compuesto por 5 terneras, fue inoculado por vía subcutanea con 5×109 UFC de la cepa vacunal
B. abortus S19 resuspendidas en solución fisiológica esteril. El grupo experimental, compuesto
por 5 terneras, recibió la misma dosis y por la misma vía de la cepa vacunal etiquetada B.
abortus S19 (pBEV-SAPA). Previo a la vacunación en manga, los animales fueron sangrados y
los sueros preinmunes guardados a -20°C hasta su uso. A los 60 días post-vacunación los
animales fueron sometidos a sangrados exploratorios y los sueros fueron congelados hasta su
uso.
Bibliografía 103
Abrami, L., M. Fivaz, P-E. Glauser, R. G. Aperton, and F. G. van der Goot. 1998. A poreforming toxin interacts with a GPI-anchored protein and causes vacuolation of the endoplasmic
reticulum. J. Cell. Biol. 140:525-540.
Adams, L. G. 1990. Development of live Brucella vaccines. In: Adams, L. G. (ed.). Advances
in brucellosis Research. Texas A&M University Press. p250-276.
Agranovich, I., D. E. Scott, D. Terle, K. Lee, and B. Golding. 1999. Downregulation of Th2
responses by Brucella abortus, a strong Th1 stimulus, correlates with alterations in the B7.2CD28 pathway. Infect. Immun. 67:4418-4426.
Allen, C., G. Adams, and T. A. Ficht. 1998. Transposon-derived Brucella abortus rought
mutants are attenuated and exhibit reduced intracellular survival. Infect. Immun. 66:1008-1016.
Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W, Myers, and D. J. Lipman. 1990. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Anderson, T. D., and N. F. Cheville. 1986. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella
abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough
endoplasmic reticulum. Am. J. Pathol. 124:226-237.
Andrews, N. W. 1995. Lysosome recruitment during host cell invasion by Trypanosoma cruzi.
Trends Cell. Biol. 5:133-137.
Araya, L.N., P.H. Elzer, G.E. Rowe, F.M. Enright, and A. J. Winter. 1989. Temporal
development of protective cell-mediated and humoral immunity in BALB/c mice infected with
Brucella abortus. J. Immunol.143:3330-3337.
Arenas, G. N., A.S. Staskevich, A. Aballay, and L. S. Mayorga. 2000. Intracellular
trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect. Immun. 68:4255-4263.
Baldwin, C. L. and A. J. Winter. 1994. Macrophages and Brucella. Immunol. Ser. 60:363380.
Baron, C., Y. R. Thorstenson, and P. C. Zambryski. 1997. The lipoprotein VirB7 interacts
with VirB9 in the membrane of Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 179:1211-1218.
Barth, S., M. Huhn, B. Matthey, A. Klimka, E. A.Galinski, and A. Engert. 2000.
Compatible-solute-supported periplasmic expression of functional recombinant proteins under
stress conditions. Appl Environ Microbiol. 2000. 66:1572-1579.
Becker, A., M. Schmidt, W. Jager, and A. Puhler.1995. New gentamicin-resistance and lacZ
promoter-probe cassettes suitable for insertion mutagenesis and generation of transcriptional
fusions. Gene.162:37-39.
Bibliografía 104
Biederbick, A., H. F. Kern, and H. P. Elsässer. 1995. Monodansylcadaverine (MDC) is a
specific in vivo marker for autophagic vacuoles. Eur. J. Cell. Biol. 66:3-14.
Boschiroli, M. L., V. Foulongne, and D. O’Callaghan. 2001. Brucellosis: a worldwide
zoonosis. Curr. Op. Microbiol. 4:58-64.
Bowden, G. A., A. M. Paredes, and G. Georgiou. 1991. Structure and morphology of protein
inclusion bodies in Escherichia coli. Biotechnology (N Y). 9:725-730
Bricker, B. J., L. B. Tabatabai, B. L. Deyoe, and J. E. Mayfield. 1988. Conservation of
antigenicity in a 31-kDa Brucella protein. Vet. Microbiol. 18:313-325.
Briones, G., N. Iñon de Iannino, M. Roset, A. Vigliocco, P. SilvaPaulo, and R. A. Ugalde.
2001. Brucella abortus cyclic β-1,2-glucan mutants have reduced virulence in mice and are
defective in intracellular replication in HeLa cells. Infect. Immun. 69:4528-4535.
Brooks-Worrell, B. M., and G. A. Splitter. 1992. Antigens of Brucella abortus S19
immunodominant for bovine lymphocytes as identified by one- and two-dimensional cellular
immunoblotting. Infect. Immun. 60:2459-2464.
Brossier, F. M. Mock, and J. Sirard. 1999. Antigen delivery by attenuated Bacillus anthracis:
new prospects in veterinary vaccines. J. Appl. Microbiol. 87:298-302.
Burns, D. L. 1999. Biochemistry of type IV secretion. Curr. Op. Microbiol. 2:25-29.
Cabezón, E., E. Lanka, and F. de la Cruz. 1994. Requirements for mobilization of plasmid
R388: trwB and RP4 traG are interchangeable. J. Bacteriol. 176:4455-4458.
Cellier, M. F., J. Teyssier, M. Nicolas, J. P. Liautard, J. Marti, and J. Sriwidada. 1992.
Cloning and characterization of the Brucella ovis heat shock protein DnaK functionally
expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:8036-8042.
CDC/MMWR. 1998. Human exposure to Brucella abortus strain RB51--Kansas, 1997.
MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47:172-175.
Charles, T. C., and E. W. Nester. 1993. A chromosomally encoded two-component sensory
transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol.
175:6614-6625.
Cheng, H. P., and G. C. Walker. 1998. Succinoglycan production by Rhizobium meliloti is
regulated through the ExoS/ChvI two component regulatory system. J. Bacteriol. 180:20-16.
Christie P. J.1997. Agrobacterium tumefaciens T-complex transport apparatus: a paradigm for
a new family of multifunctional transporters in Eubacteria. J. Bacteriol. 179:3085-3094.
Bibliografía 105
Christie, P. J., and J. P. Vogel. 2000. Bacterial type IV secretion: conjugation systems
adapted to deliver effector molecules to host cells. Trends Microbiol. 8:354-360.
Cirillo, J. D., C. K. Stover, B. R. Bloom, W. R. Jacobs Jr., and R. G. Barletta. 1995.
Bacterial vaccine vectors and bacillus Calmette-Guerin. Clin. Infect. Dis. 20:1001-1009.
Clemens, D. L., and M. A. Horwitz. 1996. The Mycobacterium tuberculosis phagosome
interacts with early endosomes and is accessible to exogenously administered transferrin. J.
Exp. Med. 184:1349-1355.
Coers, J., C. Monahan, and C. R. Roy. 1999. Modulation of phagosome biogenesis by
Legionella pneumophila creates an organelle permissive for intracellular growth. Nature Cell.
Biol. 1:451-453.
Coers, J., J. C. Kagan, M. Matthews, H. Nagai, D. M. Zuckman, and C. R. Roy. 2000.
Identification of ICM protein complexes that play distinct roles in the biogenesis of an
organelle permissive for Legionella pneumophila intracellular growth. Mol. Microbiol. 38:719736.
Corbel, J. M. 1997. Brucellosis: an overview. Emerg. Infect. Dis. 2:213-221.
Covacci, A., J. L. Telford, G. Del Giudice, J. Parsonnet, and R. Rappuoli. 1999.
Helicobacter pylori virulence and genetic geography. Science. 284:1328-1333.
Cover, T. L. 1996. The vacuolating cytotoxin of Helicobater pylori. Mol. Microbiol. 20:242246.
Crawford, R. M., L. Van de Verg, L. Yuan, T. L. Hadfield, R. L. Warren, E. S. Drazek,
H.H. Houng, C. Hammack, K. Sasala, T. Polsinelli, J. Thompson, and D. L. Hoover. 1996.
Deletion of purE attenuates Brucella melitensis infection in mice. Infect. Immun. 64:21882192.
Das, A., L. B. Anderson, and Y. H. Xie. 1997. Delineation of the interactions domains of
Agrobacterium tumefaciens VirB7 and VirB9 by use of yeast two-hybrid assay. J. Bacteriol.
179:3404-3409.
Davis, B. M., E. H. Lawson, M. Sandkvist, A. Ali, S. Sozhamannan, and M. K. Waldor.
2000. Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage
CTXφ. Science. 288:333-335.
de Chastelier, C., T. Lang, and L. Thilo. 1995. Phagocytic processing of the macrophage
endoparasite Mycobacterium avium, in comparison to phagosomes which contain Bacillus
subtilis or latex beads. Eur. J. Cell. Biol. 68:167-182.
Bibliografía 106
De Mot, R., G. Schoofs, A. Roelandt, P. Declerck, P. Proost, J. Van Damme, and J.
Vanderleyden. 1994. Molecular characterization of the major outer-membrane protein OprF
from root-colonizing Pseudomonas fluorescens. Microbiology. 140:1377-1387.
Denoel, P. A., R. M. Crawford, M. S. Zygmunt, A. Tibor, V. E. Weynants, F. Godfroid, D.
L. Hoover, and J. J. Letesson. 1997. Survival of bacterioferritin deletion mutant of Brucella
melitensis 16M in human monocyte-derived macrophages. Infect. Immun. 65:4337-4340.
Desjardins, M. 1995. Biogenesis of phagolysosomes: the ‘kiss and run’hypothesis. Trends
Cell. Biol. 5:183-186.
Desjardins, M., L. A. Huber, R. G. Parton, and G. Griffiths. 1994. Biogenesis of
phagolysosomes proceeds through a sequential series of interactions with the endocytic
apparatus. J. Cell. Biol. 124:677-688.
Detilleux, P. G., B. L. Deyoe, and N. F. Cheville. 1990. Entry and intracellular localization of
Brucella spp. en Vero cells: fluorescence and electron microscopy.Vet. Pathol. 27:317-328.
Drevets, D. A., B. P. Canono, P. J. M. Leenen, and P. A. Campbell. 1994. Gentamicin kills
intracellular Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 62:2222-2228.
Duclos, S., and M. Desjardins. 2000. Subversion of a young phagosome: the survival
startegies of intracellular pathogens. Cell. Microbiol. 2:365-377.
Dunn, W. A. 1990ª. Studies on the mechanism of autophagy: formation of the autophagic
vacuole. J. Cell. Biol. 110: 1923-1933.
Dunn, W. A. 1990b. Studies on the mechanism of autophagy: maturation of the autophagic
vacuole. J. Cell. Biol. 110: 1935-1945.
Eisembrandt, R., M. Kalkum, E-M. Lai, R. Lurz, C. I. Kado, and E. Lanka. 1999.
Conjugative pili of IncP plasmid and the Ti plasmid T pilus are composed of cyclic subunits. J.
Biol. Chem. 274:22548-22555.
Elzer, P. H., , M. E. Kovach, R. W. Phillips, G. T. Robertson, K. M. Peterson, and M. R.
Roop II. 1995. In vivo and in vitro stability of the broad-host-range cloning vector
pBBR1MCS in six Brucella species. Plasmid. 33:51-57.
Elzer, P. H., R. W. Phillips, M. E. Kovach, K. M. Peterson, and M. R. Roop II. 1994.
Characterization and genetic complementation of a Brucella abortus high-temperaturerequirement A (htrA) deletion mutant. Infect. Immun. 62:4135-4139.
Enright F. M. 1990. The pathogenesis and pathobiology of Brucella infection in domestic
animals. p.301-320. En K. Nielsen and J. R. Duncan (eds.) Animal brucellosis. CRC Press Inc.,
Boca Raton, Fla.
Bibliografía 107
Fath, M. J., and R. Kolter. 1993. ABC transporters: bacterial exporters. Microb. Rev. 57:9951017.
Fernandez-Lago, L., M. Monte, and A. Chordi. 1996. Endogenous gamma interferon and
interleukin-10 in Brucella abortus 2308 infected mice. FEMS Immunol. Med. Microbiol.
15:109-114.
Ferrari, G., M. Naito, H. Langen, and J. Pieters. 1999. A coat protein on phagosomes
involved in the intracellular survival of mycobacteria. Cell. 97:435-447.
Ficht, T. A., S. W. Bearden, B. A. Sowa, and L. G. Adams. 1988. A 36 kilodalton Brucella
abortus cell envelope protein is encoded by repeated sequences closely linked in the genomic
DNA. Infect. Immun. 56:2036-2046.
Foulongne, V. G. Bourg, C. Cazevieille, S. Michaux-Charachon, and D. O’Callaghan.
2000. Identification of Brucella suis genes affecting intracellular survival in an in vitro human
macrophage infection model by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 68:1297-1303.
Fratti, R.A., I. Vergne, J. Chua, J. Skidmore, and V. Deretic. 2000. Regulators of
membrane trafficking and Mycobacterium tuberculosis phagosome maturation block.
Electrophoresis. 21:3378-3385.
Frenchick, P. J., R. J. Markham, and A. H. Cochrane. 1985. Inhibition of phagosomelysosome fusion in macrophages by soluble extracts of virulent Brucella abortus. Am J. Vet.
Res. 46:332-335.
Galán, J. E., and A. Collmer. 1999. Type III secretion machines: bacterial devices for protein
delivery into host cells. Science. 284:1322-1328.
Garcia del Portillo, F., M. B. Zwick, K. Y. Leung, and B. B. Finlay. 1993. Salmonella
induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins
in ephitelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22:10544-10548.
Garcia del Portillo, F.,
and B. B. Finlay. 1995. The varied lifestyles of intracellular
pathogens within eukaryotic vacuolar compartments. Trends Microbiol. 3: 373-380.
Geremia, S. Cavaignac, A. Zorreguieta, A. Toro, J. Olivares, and R. A. Ugalde. 1987. A
Rhizobium meliloti mutant that forms ineffective pseudonodules in alfalfa produces normal
exopolysaccharide but fails to form
-(1-2) glucan. J. Bacteriol. 160:880-884.
Gilleland, H. R. Jr., M. Parker, J. M. Matthews, and R. D. Berg. 1984. Use of a purified
outer membrane protein F (porin) preparation of Pseudomonas aeruginosa as a protective
vaccine in mice. Infect. Immun. 44:49-54.
Bibliografía 108
Godfroid, F., B. Taminiau, I. Danese, P. Denoel, A. Tibor, V. Weynants, A. Cloeckaert, J.
Godfroid and J. J. Letesson. 1998. Identification of the perosamine synthetase gene of
Brucella melitensis 16M and involvement of lipopolysaccharide O side chain in Brucella
survival in mice and in macrophages. Infect Immun. 66:5485-5493.
Halfmann, G., H. Brailly, A. Bernadac, F. A. Montero-Julian, C. Lazdunski, and D.
Baty. 1993. Targeting of interleukin-2 to the periplasm of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol.
1993. 139:2465-2473.
Halling, S. M., and B. J. Bricker. 1994. Characterization and occurrence of two repeated
palindromic DNA elements of Brucella spp.: Bru-RS1 and Bru-RS2. Mol. Microbiol. 14:681689.
Halling, S. M., P. G. Detilleux, F. M. Tatum, B. A. Judge, and J. E. Mayfield. 1991.
deletion of the BCSP31 gene of Brucella abortus by replacement. Infect. Immun. 59:38633868.
Heinemann J. 1999. Genetic evidence of protein transfer during bacterial conjugation.
Plasmid. 41:240-247.
Heinzen, R. A., S. S. Grieshaber, L. S. Van Kirk, and C. J. Devin. 1999. Dynamics of actinbased movement by Rickettsia rickettsii in Vero cells. Infect. Immun. 67:4201-4207.
Henderson, I. R., F. Navarro-Garcia, and J. P. Nataro. 1998. The great escape: structure
and function of the autotransporter proteins. Trends Microbiol. 6:370-378.
Henry, B. S. 1933. Dissociation in the genus Brucella. J. Infect. Dis. 52:3085-402.
Herrero, M., V. de Lorenzo, and K. Timmis. 1990. Transposon vectors containing nonantibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign
genes in gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 172:6557-6567.
Hoiczyk, E., and G. Blobel. 2001. Polymerization of a single protein of the pathogen Yersinia
enterocolitica into needles punctures eukaryotic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:46694674.
Hong, P. C., R. M. Tsolis, and T. A. Ficht. 2000. Identification of genes required for chronic
persistence of Brucella abortus in mice. Infect. Immun. 68:4102-4107.
Horwitz, M. A. 1983ª. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease
bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158:1319-1331.
Horwitz, M. A. 1983b. The Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits
phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158:2108-2126.
Bibliografía 109
Hueck, C. J. 1998. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and
plants. Microb. Mol. Biol. Rev. 62:379-343.
Iñon de Iannino, N. G. Briones, F. Iannino, and R. A. Ugalde. 2000. Osmotic regulation of
cyclic 1,2 beta-glucan synthesis. Microbiology. 146:1735-1742.
Iñon de Iannino, N., G. Briones, M. Tolmasky, and R. A. Ugalde. 1998. Molecular cloning
and characterization of cgs, the Brucella abortus cyclic beta (1-2) glucan synthetase gene:
genetic complementation of Rhizobium meliloti ndvB and Agrobacterium tumefaciens chvB
mutants. J. Bacteriol. 180:4392-4400.
Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia
coli with plasmid. Gene.96:23-28.
Jacques, I., V. Olivier-Bernardin and G. Dubray. 1991. Induction of antibody and protective
responses in mice by Brucella O-polysaccharide-BSA conjugate. Vaccine. 9:896-900.
Jahans, K. L., G. Foster, and E. S. Broughton. 1997. The characterisation of Brucella strains
isolated from marine mammals. Vet. Microbiol. 179:3244-3249.
Jiang, X., and C. L. Baldwin. 1993. Effects of citokines on the intracellular growth of
Brucella abortus. Infect. Immun. 61:124-134.
Jumas-Bilak, E., S. Michaux-Charachon, G. Bourg, D. O’Callaghan, and M. Ramuz.
1998. Differences in chromosome number and genome rearrangements in the genus Brucella.
Mol. Microbiol. 27:99-106.
Kado, C. 2000. The role of the T-pilus in horizontal gene transfer and tumorigenesis. Curr. Op.
Microbiol. 3:643-648.
Killeen, K., D. Spriggs, and J. Mekalanos. 1999.Bacterial mucosal vaccines: Vibrio cholerae
as a live attenuated vaccine/vector paradigm. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 236:237-254.
Köhler, S., J. Teyssier, A. Cloeckaert, B. Touot, and J-P. Liautard. 1996. Participation of
molecular chaperone DnaK in intracellular growth of Brucella suis within U937-derived
phagocytes. Mol. Microbiol. 20:701-712.
Köhler, S., M. Layssac, A. Naroeni, I. Gentschev, M. Rittig, and J-P. Liautard. 2001.
Secretion of listeriolysin by Brucella suis inhibits its intramacrophagic replication. Infect
Immun. 69:2753-2756.
Kovach, M. E., P. H. Elzer, D. S. Hill, G. T. Robertson, M. A. Farris, R,. M. Roop II, and
K. M. Peterson. 1995. Four new derivatives of the broad-host-range vector pBBR1MCS,
carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166:175-176.
Bibliografía 110
Krause, S., M. Bárcena, W. Pansegrau, R. Lurz, J. M. Carazo, and E. Lanka. 2000ª.
Sequence related protein export NTPases encoded by the conjugative transfer region of RP4
and by the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori share similar hexameric rings
structures. Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 97:3067-3072.
Krause, S., W. Pansegrau, R. Lurz, F., de la Cruz, and E. Lanka. 2000b. Enzymology of
type IV macromolecule secretion systems: the conjugative transfer region of plasmids RP4 and
R388 and the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori encode structurally and
functionally related nucleoside triphosphate hydrolases. J. Bacteriol. 182:2761-2770.
Kuusi, N., M. Nurimenen, H. Saxen, and P. H. Mäkelä. 1979. Immunizations with major
outer membrane proteins in experimental salmonellosis in mice. Infect. Immun. 25:857-862.
Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of the
bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.
Lai, E-R., and C. I. Kado. 2000. The T-pilus of Agrobacterium tumefaciens. Trends
Microbiol. 8:361-369.
Le Vier, K., R. W. Phillips, V. K. Grippe, R. M. Roop II, and G. C. Walker. 2000. Similar
requirements of a plant symbiont and a mammalian pathogen for prolonged intracellular
survival. Science. 287:2492-2493.
Lee, C. A. 1997. Type III secretion systems: machines to deliver bacterial proteins into
eukaryotic cells? Trends Microbiol. 5:148-156.
Liautard, J-P., A. Gross, J. Dornand, and S. Kölher. 1996. Interactions between
professional phagocytes and Brucella spp. Microbiologia Sem. 12:197-206.
Lory, S. 1998. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared
pathways of extracellular protein targeting. Curr. Op. Microbiol.1:27-35.
Martinez, A., P. Ostrovsky, and D. N. Nunn.1998. Identification of an additional member of
the secretin superfamily of proteins in Pseudomonas aeruginosa that is able to function in type
II protein secretion. Mol Microbiol. 28:1235-46.
Mayfield, J. E., B. J. Bricker, H. Godfrey, R. M. Crosby, D. J. Knight, S. M. Halling, D.
Balinsky, and L. B. Tabatabai. 1988. The cloning, expression and nucleotide sequence of a
gene encoding for an immunogenic Brucella abortus protein. Gene. 63:1-9.
Mayorga, L. S., F. Bertini, and P. D. Stahl. 1991. Fusion of newly formed phagosomes with
endosomes in intact cells and in a cell-free system. J. Biol. Chem. 266:6511-6517.
Bibliografía 111
Meade, H. M., S. R. Long, C. B. Ruvkun, S. E. Brown, and F. M. Ausubel. 1982. Physical
and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti
induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149:114-122.
Meador, V. P., and B. L. Deyoe. 1989. Intracellular localization of Brucella abortus in bovine
placenta. Vet. Pathol. 26:513-515.
Méresse, S., O. Steele-Mortimer, E. Moreno, M. Desjardins, B.B. Finlay, and J-P. Gorvel.
1999. Controlling the maturation of pathogen-containing vacuoles: matter of life or death.
Nature Cell. Biol. 1:E183-E188.
Michaux-Charachon, S., G. Bourg, E. Jumas-Bilak, P. Guigue-Talet, A. Allardet-Servent,
D. O’Callaghan, and M. Ramuz. 1997. Genome structure and phylogeny in the genus
Brucella. J. Bacteriol. 179:3244-3249.
Miller, W. G., L. G. Adams, T. A. Ficht, N. F. Cheville, J. P. Payeur, D. R. Harley, C.
House, and S. H. Ridgway. 1999. Brucella-induced abortions and infection in bottlenose
dolphins (Tursiops truncatus). J. Zoo.Wildl. Med. 30:100-110.
Moreno, E., E. Stackebrandt, M. Dorsch, J. Wolters, M. Busch, and H. Mayer. 1990.
Brucella abortus 16S rRNA and lipid A reveal a phylogenetic relationships with members of
the alpha-2 subdivision of the class Proteobacteria. J. Bacteriol. 172:3569-3576.
Mu, F. T., J. M. Callaghan, O. Steele-Mortimer, H. Stenmark, R. G. Parton, P. L.
Campbell, J. McCluskey, J. P. Yeo, E. P. Tock, B. H. Toh. 1995. EEA1, an early endosomeassociated protein. EEA1 is a conserved apha-helical peripheral membrane protein flanked by
cysteine ‘fingers’and contains a calmodulin-binding IQ motif. J. Biol. Chem. 270:1350313511.
Mushegian, A. R., K, J. Fullner, E. V. Koonin, and E. W. Nester. 1996. A family of
lysozyme-like virulence factors in bacterial pathogens of plants and animals. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 93:7321-7326.
Naroeni, A., N. Jouy, S. Ouahrani-Bettache, J-P. Liautard, and F. Porte. 2001. Brucella
suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane
modifications. Infect. Immun. 69:486-493.
Nicoletti, P. 1989. Relationship between animal and human disease, p.41-51. En E. J. Young
and M. J. Corbel (ed.), Brucellosis: clinical and laboratory aspects. CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla.
Nicoletti, P. 1990. Vaccination. In: Nielsen, K. and J.R. Duncan (eds.). Animal brucellosis.
CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. p283-299.
Bibliografía 112
Nielsen, K. H., D. Gall, D. E. Henning, and M. Garcia. 1992. Enzyme immunoassay:
application to diagnosis of bovine brucellosis. Monograph. ADRI. p199-225,
Nielsen, K. H., L. Kelly, D. Gall, P. Nicoletti, and W. Kelly. 1995. Improved competitive
enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Immunol. Immunopathol.
46:285-291.
Nunn, D. 1999. Bacterial type II protein export and pilus biogenesis: more than just
homologies? Trends Cell. Biol. 9:402-408.
O’Callaghan, D., C. Cazevielle, A. Allardet-Servent, M. L. Boschiroli, G. Bourg, V.
Foulongne, P. Frutos, Y. Kulakov, and M. Ramuz. 1999. A homologue of the
Agrobacterium tumefaciens VirB and Bordetella pertussis Ptl type IV secretion systems is
essential for intracellular survival of Brucella suis. Mol Microbiol. 33:1210-1220.
Oka, A., H. Sigisaki, and M. Takamani. 1981. Nucleotide sequence of the kanamycin
resistance transposon Tn903. J. Mol. Biol. 147:217-226.
Oliveira, S. C., and G. A. Splitter. 1994. Subcloning and expression of the Brucella abortus
L7/L12 ribosomal gene and T-lymphocyte recognition of the recombinant protein. Infect.
Immun. 62:5201-5204.
Pastini, A. C., S. R. Iglesias, V. C. Carricarte, M. E. Guerin, D. O. Sanchez, and A. C. C.
Frasch. 1994. Immunoassay with recombinant Trypanosoma cruzi antigens potentially useful
for screening donated blood and diagnosing Chagas disease. Clin. Chem. 47:1893-1897.
Pizarro-Cerdá, J., E. Moreno, V. Sanguedolce, J-L. Megue, and J-P Gorvel. 1998ª.
Virulent Brucella abortus avoids lysosome fusion and replicate within autophagosome-like
compartments. Infect. Imm. 66:2687-2692.
Pizarro-Cerdá, J., M. Desjardins, E. Moreno, and J-P. Gorvel. 1997. When intracellular
pathogens invade the frontiers of cell biology and immunology. Histol. Histopathol. 12:10271038.
Pizarro-Cerdá, J., S. Méresse, R. G. Parton, F. G. van der Goot, A. Solá-Landa, I. LopezGoñi, E. Moreno, and J-P. Gorvel. 1998b. Brucella abortus transits through the autophagic
pathway and replicates in the endoplasmic reticulum of non-professional phagocytes. Infect.
Immun. 66:5711-5724.
Planet, P. J., S. C. Kachlany, R. DeSalle, and D. H. Figurski. 2001. Phylogeny of genes for
secretion NTPases: identification of the widespread tadA subfamily and development of a
diagnostic key for gene classification. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 98:2503-2508.
Bibliografía 113
Pohlman, R. F., H. D. Genetti, and S. C. Winans. 1994. Common ancestry between IncN
conjugal transfer genes and macromolecular export systems of plant and animal pathogens.
Mol. Microbiol. 14:655-668.
Pollevick, G. D., J. Affranchino, A. C. C. Frasch, and D. O. Sanchez. 1991. The complete
sequence of a shed acute-phase antigen of Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol.
47:247-250.
Porte, F., J-P. Liautard, and S. Köhler. 1999. Early acidification of phagosomes containing
Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect. Immun.
67:4041-4047.
Poulsen, K., J. Brandt, J. P. Hjorth, H. C. Thogersen, and M. Kilian. 1989. Cloning and
sequencing of the immunoglobulin A1 protease gene (iga) of Haemophilus influenzae serotype
b. Infect Immun. 57:3097-3105.
Price, R. E., J. W. Templeton, and L.G. Adams. 1990. Survival of smooth, rough and
transposon mutant strains of Brucella abortus in bovine mammary macrophages. Vet. Immunol.
Immunopathol. 26:353-365.
Pugsley,
A. P.1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria.
Microbiol. Rev. 57:50-108.
Puvanesarajah, V., F. M. Schell, G. Stacey, C. J. Douglas, and E. W. Nester. 1985. Role for
2-linked- -D-glucan in the virulence of Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 164:102106.
Rashkova, S. X. R. Zhou, J. Chen, and P. J. Christie. 2000. Self-assembly of the
Agrobacterium tumefaciens VirB11 traffic ATPase. J. Bacteriol. 182:4137-4145.
Riley, L. K., and D. C. Robertson. 1984. Ingestion and intracellular survival of Brucella
abortus in human and bovine polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 46:224-230.
Rittig, M. G., M. T. Alvarez-Martinez, F. Porte, J-P. Liautard, and B. Rouot. 2001.
Intarcellular survival of Brucella spp. in human monocytes involves conventional uptake but
special phagosomes. Infect. Immun. 69:3995-4006.
Roop, R. M. II, T. W. Fletcher, N. M. Sriranganathan, S. M. Boyle and G. G. Schurig.
1994. Identification of an immunoreactive Brucella abortus HtrA stress response protein
homolog. Infect. Immun. 62:1000-1007.
Roy, C. R., K. H. Berger, and R. R. Isberg. 1998. Legionella pneumophila DotA is required
for early phagosome trafficking decisions that occur within minutes of bacterial uptake. Mol.
Microbiol. 28:663-674.
Bibliografía 114
Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual,
2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y.
Samyn, B., M. Martinez-Bueno, B. Devreese, M. Maqueda, A. Galvez, E. Valdivia, J.
Coyette, and J. Van Beeumen. 1994. The cyclic structure of the enterococcal peptide
antibiotic AS-48. FEBS Lett. 352:87-90.
Sanchez, D. O., R. O. Zandomeni, S. Cravero, R. Verdún, E. Pierrou, P. Faccio, G. Diaz,
S. Lanzavecchia, F. Aguero, A. C. C. Frasch, S. G. E. Andersson, O. L. Rossetti, O. Grau,
and R. A. Ugalde. 2001. Gene discovery through genomic sequencing of Brucella abortus.
Infect. Immun. 69:865-868.
Sangari F. J., and J. Aguero. 1996. Molecular basis of Brucella pathogenicity: an update.
Microbiol. Sem. 12:207-218.
Sangari, F. J., J. M. García-Lobo, and J. Aguero. 1994. The Brucella abortus vaccine strain
B19 carries a deletion in the erytritol catabolic genes. FEMS Microbiol. Lett. 121:337-342.
Schawb, J. C., C. J. M. Beckers, and K. A. Joiner. 1994. The parasitophorous vacuole
membrane sorrounding intracellular Toxoplasma gondii functions as a molecular sieve. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 91:509-513.
Schmidt-Eisenlohr, H., N. Domke, C. Angerer, G. Wanner, P. C. Zambryski, and C.
Baron. 1999. VirB proteins stabilize VirB5 and mediate its association with the T-pilus of
Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 181:7485-7492.
Schurig, G. G., R. M. Roop, T. Bagchi, S. Boyle, D. Buhrman, and N. Sriranganathan.
1991. Biologic properties of RB51, a stable rough strain of Brucella abortus. Vet. Microbiol.
28:171-188.
Scidmore, M. A., E. R. Fischer, and T. Hackstadt. 1996. Sphingolipids and glycoproteins are
differentially trafficked to the Chlamydia trachomatis inclusion. J. Cell. Biol. 134:363-374.
Scidmore-Carlson, M. A., E. I. Shaw, C. A. Dooley, E. R. Fisher, and T. Hackstadt. 1999.
Identification and characterization of a Chlamydia trachomatis early operon encoding four
novel inclusion membrane proteins. Mol Microbiol. 33:753-765.
Scott, D. E., I. Agranovich, J. Inman, M. Gober, and B. Golding. 1997. Inhibition of
primary and recall allergen-specific T helper cell type 2-mediated responses by a T helper cell
type 1 stimulus. J. Immunol. 159:107-116.
Segal G., and H. A. Shuman. 1999. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence
genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol. Microbiol. 33:669-670.
Bibliografía 115
Segal, G., J. J. Russo, and H. A. Shuman. 1999. Relationships between a new type IV
secretion system and the icm/dot virulence system of Legionella pneumophila. Mol. Microbiol.
34:799-809.
Segal, G., M. Purcell, and H. A. Shuman. 1998. Host cell killing and bacterial conjugation
require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:1669-1674.
Sha, Z., T. J. Stabel, and J. E. Mayfield. 1994. Brucella abortus catalase is a periplasmic
protein lacking a standard signal sequence. J. Bacteriol. 176: 7375-7377.
Sinai, A. P., and K. A. Joiner. 1997. Safe haven: the cell biology of nonfusogenic pathogen
vacuoles. Ann. Rev. Microbiol. 51:415-462.
Smith, L. D. and T. A. Ficht. 1990. Pathogenesis of Brucella. Crit. Rev. Microbiol. 17:209230.
Sola-Landa, A., J. Pizarro-Cerdá, M. Grilló, E. Moreno, I. Moriyón, J. M. Blasco, J-P.
Gorvel, and I. Lopez-Goñi. 1998. A two component regulatory system conserved in animal
pathogenic Brucella and plant pathogenic Agrobacterium is required for host cell invasion and
virulence. Mol. Microbiol. 29:125-138.
Sriranganathan, N., S. M. Boyle, G. G. Schurig, and H. Misra. 1991. Superoxide dismutase
of virulent and avirulent strains of Brucella abortus. Vet. Microbiol. 26:359-366.
Stabel, T. J., Z. Sha, and J. E. Mayfield. 1994. Periplasmic location of Brucella abortus
Cu/Zn superoxide dismutase. Vet. Microbiol. 38:307-314.
Steele-Mortimer, O., S. Méresse, J-P. Gorvel, B. H. Toh, and B.B. Finlay. 1999. Biogenesis
of Salmonella typhimurium-containing vacuoles in ephitelial cells involves interactions with
early endocytic pathways. Cell Microbiol. 1:33-49.
Stein, M., R. Rappuoli, and A. Covacci. 2000. Tyrosine phosphorylation of the Helicobacter
pylori CagA antigen after cag-driven host cell translocation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
97:1263-1268.
Stevens, T. L., A. Bossie, V. M. Sanders, R. Fernandez-Botran, R. L. Coffman, T. R.
Mosmann, and E. S. Vitetta. 1988. Regulation of antibody isotype secretion by subsets of
antigen-specific helper T cells. Nature. 334:255-258.
Suss-Toby, E., J. Zimmerberg, and G. E. Ward. 1996. Toxoplasma invasion: the
parasitophorous vacuole is formed from host cell plasma membrane and pinches off via a
fission pore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:8413-8418.
Bibliografía 116
Sutherland, S. S., and J. Searson. 1990. The immune response to Brucella abortus: the
humoral immune response. In K. Nielsen and J. R. Duncan (eds.). Animal brucellosis. CRC
Press, Inc., Boca Raton, Fla. p65-81.
Swanson M. S., and R. R. Isberg. 1995. Association of Legionella pneumophila with the
macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Imm. 63:3609-3620.
Tatum, F. M., D. C. Morfitt and S. M. Halling. 1993. Construction of a Brucella abortus
RecA mutant and its survival in mice. Microb. Pathog. 14:177-185.
Tatum, F. M., N. F. Cheville, and D. C. Morfitt. 1994. Cloning, characterization and
construction of htrA and htrA-like mutants of Brucella abortus and their survival in Balb/C
mice. Microb. Pathog. 17:23-26.
Tatum, F. M., P. G. Detilleux, J. M. Sacks and S. M. Halling. 1992. Construction of Cu/Zn
SOD deletion mutants of Brucella abortus: analysis of survival in vitro in epithelial and
phagocytic cells and in vivo in mice. Infect. Immun. 60:2863-2869.
Theriot J.A. 1995. The cell biology of infection by intracellular pathogens. Ann. Rev Dev.
Biol. 11:213-239.
Thorsted, P. B., D. P. Macartney, P. Akhtar, A. S. Halnes, N. Ali, P. Davidson, T.
Stafford, M. J. Pocklington,
W. Pansegrau, B. M. Wilkins, E. Lanka, and C. M.
Thomas.1998. Complete sequence of the IncP
plasmid R751: implications for the evolution
and organisation of the IncP backbone. J. Mol. Biol. 282:969-990.
Tibor, A., V. Weynants, P. Denoel, B. Lichtfouse, X. De Bolle, E. Saman, J. Limmet, and
J. J. Letesson. 1994. Molecular cloning, nucleotide sequence, and occurence of a 16.5kilodalton outer membrane protein of Brucella abortus with similarity to PAL lipoproteins.
Infect. Immun. 62:3633-3639.
Ugalde, J. E., C. Czibener, M. F. Feldman, and R. A. Ugalde. 2000. Identification and
characterization of the Brucella abortus phosphoglucomutase gene: role of lipopolysaccharide
in virulence and intracellular multiplication. Infect Immun. 68:5716-5723.
Ugalde, R. A. 1999. Intracellular lifestyle of Brucella spp. Common genes with other animal
pathogens, plant pathogens, and endosymbionts. Microbes Infect. 1:1211-1219.
Vemulapalli, R., Y. He, S. Boyle, N. Sriranganathan, and G. G. Schurig. 2000. Brucella
abortus strain RB51 as a vector for heterologous protein expression and induction of specific
Th1 type immune responses. Infect. Immun. 68:3290-3296.
Bibliografía 117
Verger, J. M., F. Grimont, P. A. D. Grimont, and M. Grayon. 1985. Brucella: a
monospecific genus as shown by deoxiribonucleic acid hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol.
35:292-295.
Via, L.E., D. Deretic, R. J. Ulmer, N. S. Hibble, L. A. Huber, and V. Deretic. 1997. Arrest
of mycobacterial phagosome maturation is caused by a block in vesicle fusion between stages
controlled by rab5 and rab7. J. Cell. Biol. 272:13326-13331.
Vogel, J. P., and R. R. Isberg. 1999. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr. Opin.
Microbiol. 2:30-34.
Vogel, J. P., H. L. Andrews, S. K. Wong, and R. R. Isberg. 1998. Conjugative transfer by
the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279:873-876.
Weiskirch, L. M., and Y. Paterson. 1997. Listeria monocytogenes: a potent vaccine vector for
neoplastic and infectious disease. Immunol. Rev. 158:159-169.
Weiss, A. A., F. D. Johnson, and D. L. Burns. 1993. Molecular characterization of an operon
required for pertussis toxin secretion. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90:2970-2974.
Wergifosse, P. de, P. Lintermans, J. N. Limet, and A. Cloeckaert. 1995. Cloning and
nucleotide sequence of the gene coding for the major 2-kilodalton outer membrane protein of
Brucella abortus. J. Bacteriol. 177:1911-1914.
WHO fact sheet N173. 1997. Brucellosis. Geneva. World Health Organization.
WHO. Report of the Joint WHO/FAO/OIE Working Group Meeting on Brucellosis. 1997.
The Development of new/improved brucellosis vaccines.World Health Organization, Geneva,
Switzerland. (unpublished document WHO/EMC/ZDI/98.14).
Winter, A. J., G. E. Rowe, J.R. Duncan, M.J. Eis, J. Widom, B. Ganem, and B. Morein.
1988. Effectiveness of natural and synthetic complexes of porin and O polysaccharide as
vaccines against Brucella abortus in mice. Infect. Immun. 56:2808-2817.
Winter, A. J., G. G. Schurig, S. M. Boyle, N. Sriranganathan, J. S. Bevins, F. M. Enright,
P. H. Elzer, and J. D. Kope. 1996. Protection of BALB/c mice against homologous and
heterologous species of Brucella by rough strain vaccines derived from Brucella melitensis and
Brucella suis biovar 4. Am. J. Vet. Res. 57:677-683.
Yeo, H. J., S. N. Savvides, A. B. Herr, E. Lanka, and G. Waksman. 2001. Crystal structure
of the hexameric traffic ATPase of the Helicobacter pylori Type IV secretion system. Mol.
Cell. 6:1461-1472.
Young, E. J., M. Borchert, F. L. Kreutzer, and D. M. Musher. 1985. Phagocytosis and
killing of Brucella by human polymorphonuclear leukocytes. J. Inf. Dis. 151:682-690.
Bibliografía 118
Zambrisky, P. C.1992. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story.
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-490.
Zegers, N. D., E. Kluter, H. Van Der Stap, E. Van Dura, P. Van Dalen, M. Shaw, and L.
Baillie. 1999. Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis by Lactobacillus casei:
towards the development of an oral vaccine against antrhax. J. Appl. Microbiol. 87:309-314.
Zhan, Y., A. Kelso, and C. Cheers. 1995. Differential activation of Brucella -reactive CD4 + T
cells by Brucella infection or immunizations with antigenic extracts. Infect. Immun. 63:969975.
Zhan, Y., and C. Cheers. 1995. Differential induction of macrophage-derived cytokines by
live and dead intracellular bacteria in vitro. Infect. Immun. 63:720-723.
Zhan, Y., Z. Liu, and C. Cheers. 1996. Tumor necrosis factor alpha and interleukin-12
contribute to resistance to intracellular bacterium Brucella abortus by different mechanism.
Infect. Immun. 64:2782-2786.
Zupan J. R., D. Ward, and P. Zambryski. 1998. Assembly of the VirB transport complex for
DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells. Curr. Op. Microbiol. 1:649-655.
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