Extracción de aceite esencial de Myrtus communis L. y estudio de

Extracción de aceite esencial de Myrtus communis L. y estudio
de su actividad antimicrobiana
Gonzales Bocángel, Patrick1; Mansilla Tafur, Adriana2; Rengifo Urbietta, Liliana3;
Arévalo Ortiz, Fermín MSc. 4
1
20101390@lamolina.edu.pe, 220100094@lamolina.edu.pe, 320100101@lamolina.edu.pe,
4
fharevalo@lamolina.edu.pe
RESUMEN
Se extrajo el aceite esencial de Myrtus communis L. “Arrayán”, utilizando: Destilación por
arrastre de vapor para muestra fresca; e Hidrodestilación con el equipo Clevenger para
muestra seca, obteniéndose que este último proceso es más eficiente. La actividad
antimicrobiana fue evaluada contra 3 tipos de bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram
+), Escherichia coli y Pseudomonas poae (Gram -); y 2 tipos de hongos: Aspergillus niger
y Penicillum variabile. Siendo B. amyloliquefaciens el único que mostró sensibilidad al
aceite, con un diámetro de inhibición entre 13-23 mm. Estos resultados difieren de otros
estudios donde se señala que M. communis es un efectivo agente antimicrobiano, lo cual
pudiera deberse a que las muestras son de diferentes regiones geográficas, variando la
composición del aceite.
ABSTRACT
Essential oil of Myrtus communis L. "Arrayan" was extracted by two methods: Steam
distillation for fresh samples; and Hydrodistillation with the Clevenger´s equipment for dry
samples, resulting in the latter process more efficiency. The antimicrobial activity was
evaluated against three types of bacteria: Bacillus amyloliquefaciens (gram +), Escherichia
coli and Pseudomonas poae (Gram -); and 2 types of fungi: Aspergillus niger and
Penicillium variabile. B. amyloliquefaciens was the only strain that was susceptible to the
oil, with an inhibition halos of 13-23 mm. These results differ from other studies which
states that M. communis is an effective antimicrobial agent, mainly because the samples
were taken from different geographical regions with other oil´s composition.
1
INTRODUCCIÓN
En general, los Aceites Esenciales se definen como mezclas de componentes volátiles,
productos del metabolismo secundario de las plantas. Se encuentran muy difundidos en el
reino vegetal, de las 295 familias de plantas, de 60 a 80 producen aceites esenciales. Las
principales plantas que contienen aceites esenciales, se encuentran en familias como:
compuestas, labiadas, lauráceas, mirtáceas, rosáceas, rutáceas, umbelíferas, pináceas. Los
aceites esenciales son de aspecto oleoso, altamente volátiles, solubles en aceites, alcohol,
éter de petróleo, tetracloruro de carbono y demás solventes orgánicos; insolubles en agua
aunque le transmiten su perfume; son inflamables, responsables del aroma de las plantas,
colores y sabores, a veces dulces o amargos, con densidad generalmente inferior a la del
agua. Están compuestos en su mayor parte por hidrocarburos de la serie polimetilénica del
grupo de los terpenos que se encuentran con otros compuestos, casi siempre oxigenados.
Están contenidos en semillas, glándulas, pelos glandulares, sacos, o venas de diversas
piezas de la planta. La mayoría de plantas contienen de 0,01 a 10% de contenido de aceite
esencial. La cantidad media que se encuentra en la mayoría de las plantas aromáticas es
alrededor de 1 a 2%. En la naturaleza los aceites esenciales desempeñan un papel
importante en la defensa y protección de las plantas (1). Se evaporan por exposición al aire a
temperatura y presión ambiente. No deben utilizarse puros o por aplicación directa en ojos,
nariz, conducto auditivo, zonas genitales. Suelen tener un precio elevado (1, 2).
Los aceites esenciales tienen un gran impacto en las industrias de alimentos, cosméticas,
farmacéuticas y agrícolas. Actualmente es una industria en constante desarrollo y
crecimiento en diferentes países (1).
Dada las múltiples cualidades del aceite esencial del arrayán como lo son: balsámico,
antimicrobiano y antiséptico, con propiedades sedativas, es excelente para combatir el acné,
la piel untuosa, para prevenir y combatir estrías y la caída de cabello
(3)
. Se plantearon dos
objetivos para este presente estudio. Primero, extraer el aceite esencial de hojas frescas y
secas de Myrtus communis “Arrayán” mediante equipo de arrastre por vapor y equipo
Clevenger.
2
Segundo, determinar la actividad antimicrobiana del aceite extraído frente a 3 tipos de
bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram +), Escherichia coli y Pseudomonas poae
(Gram -); y 2 tipos de hongos: Aspergillus niger y Penicillum variabile.
MARCO TEÓRICO
I.
Myrtus communis L.
 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
Myrtus L. es un pequeño género perteneciente a la familia Myrtaceae, que incluye
alrededor de 100 géneros y 3.000 especies que crecen en las regiones templadas, tropicales
y subtropicales. M. communis es la única especie Myrtaceae nativas de Europa (Fig. 1). Es
un arbusto de hoja perenne que crece hasta una altura de
aproximadamente 5,1 m. El mirto común tiene un tallo
erguido, 2,4-3 m de altura, sus ramas forman una cabeza
llena cerrada, densamente cubierta por hojas perennes. El
tallo de la planta es ramificado y las hojas verde oscuro
dispuestas de forma opuestas son ovadas lanceoladas, 2-5
cm de largo, coriáceas, glabras, puntual-glandular y
enteras. Cuando son aplastadas, tienen un delicado olor
aromático; glándulas ausentes en la lámina. Las flores
blancas en forma de estrella que tienen cinco pétalos,
Figura 1. Flor de M. communis
cinco sépalos y una masa de estambres insertados,
aparecen de Junio a septiembre. Después del verano, bayas, de globosas a elipsoidales, que
son de color negro azulado (o raramente blanco amarillento) en la maduración, aparecen
alrededor de noviembre (4). Tienen un diámetro menor a 1.2 cm.
Las flores son polinizadas por insectos y tienen una estrategia especializada de dispersión
de semillas por aves, mamíferos y hormigas. Las semillas de M. communis no tienen
aparente latencia. Como consecuencia de ello, la germinación puede ocurrir poco después
de la dispersión y su estrategia de establecimiento rápido podría permitir a las plántulas
3
aprovechar el otoño y las lluvias de invierno durante los cruciales primeros estadios de
crecimiento. Estas características se pueden considerar ventajoso con el fin de maximizar el
éxito reproductivo, con el establecimiento de plántulas y la supervivencia en los ambientes
Mediterráneos (5,6).
 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Es nativa del sur de Europa, norte de África y Asia occidental. Se distribuye en América del
Sur, del Norte Himalaya occidental y Australia y muy extendida en la región mediterránea
donde crece de modo silvestre y también de forma cultivada. Es la única especie del género
que se encuentra en el hemisferio norte
(5)
. Crece sobre cualquier suelo desde rocoso hasta
tepetatoso. A cualquier altitud, pero se distribuye más frecuentemente sobre los 700 y 1500
msnm.
 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Rosidae
Orden: Myrtales
Familia: Myrtaceae
Subfamilia: Myrtoideae
Tribu: Myrteae
Género: Myrtus
Especie: Myrtus communis L.
 NOMBRE COMÚN
Arraigán, arraiján, arrayán, arrayán blanco, harrajian, mata gallinas, mirta, mirtilo, mirto
común, mortera, murta, murtal, murtera, murtiñera, murto, murtrón, myrta.
4
 USOS Y ANTECEDENTES
El Mirto o Arrayán, por su composición y propiedades, es similar al Eucalipto, pues ambas
especies pertenecen a la misma familia botánica, Myrtaceae. Se utiliza popularmente para
infecciones pulmonares y bronquiales, urinarias (cistitis) e intestinales (diarreas,
disenterías).También contiene taninos que le confieren un carácter astringente.
Además, las bayas se utilizan como antiséptico, astringente, carminativo, analgésico, tónico
para el cabello, hemostático, antiemético, cardiotónico, diurético, anti-inflamatorio, tónico
para el cerebro, nefroprotector, antidiabético. Diversas acciones farmacológicas de las hojas
son astringente, antiséptico, hipoglucemiante, laxante, analgésico, tónico y estimulante del
cabello. Se ha reportado propiedades antibacterianas de la raíz (3).
Según señala Sumbul et al, 2011
(3)
, la decocción de la fruta se utiliza para bañar a los
recién nacidos con la piel enrojecida, mientras que la decocción de hojas se utiliza todavía
para lavado vaginales, enemas y contra enfermedades respiratorias. El aceite obtenido de
las bayas fortalece y promueve el crecimiento del cabello.
Muchos aceites esenciales y sus componentes han sido recientemente calificados como
antioxidantes naturales, como es el caso del Mirto (3,7-8). Estos compuestos tienen un papel
importante en la prevención de una variedad de enfermedades relacionadas con el estilo de
vida y el envejecimiento debido a que estos están estrechamente relacionados con especies
reactivas del oxígeno (ROS) y la peroxidación lipídica (8).
Mimica-Dukić et al, 2010
(7)
concluyó el aceite esencial de Mirto mostró un potencial
considerable antimutagénico, que fue probablemente debido a la actividad antioxidante de
sus componentes. Se demostró a través del método TLC-DPPH que el 1,8-cineole y metil
eugenol son los compuestos más responsables de la actividad de captación de radicales de
todo el aceite. También indica que los compuestos fenólicos presentes en los extractos de
metanol o etanol de hojas de mirto, contribuyen adicionalmente a la actividad global
antioxidante y anti-mutagénica.
Además, M. communis presentó capacidad para inducir la muerte celular de las diferentes
líneas celulares de cáncer con características de apoptosis. Gracias a la activación de la
5
caspasa-3, -8 y -9, la escisión de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), la liberación de
los nucleosomas en el citosol, y la fragmentación del ADN. Esto causó la pérdida del
potencial de membrana mitocondrial en las células MM6 y llevó a la liberación de
citocromo c de la mitocondria (9).
Por otro lado, varios estudios han comprobado la actividad antimicrobiana del Arrayán.
Mansouri et al, 2001
(10)
, evaluó la actividad antibacteriana del extracto crudo de metanol
de Myrtus communis L. contra 10 cepas de laboratorio de microorganismos, incluyendo 6
Gram positivas (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes) y 4 Gram
negativas (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa y Campylobacter
jejuni).
Así mismo, Al-Saimary et al, 2002 (11), utilizaron dos métodos por para evaluar la actividad
antibacteriana de diversas concentraciones de los extractos acuosos de las hojas contra
Pseudomonas aeruginosa en comparación con 6 antibióticos; estos métodos determinan las
zonas de inhibición de crecimiento y la concentración inhibitoria mínima. Los extractos
acuosos dieron un excelente efecto sobre el crecimiento bacteriano y sus efectos se
encuentran dentro de los límites de los efectos antibióticos.
Feisst et al, 2013
(12)
, identificó Myrtucommulone (MC) y semimyrtucommulone (S-MC)
en las hojas de mirto, los cuales mostraron poseer actividad anti-inflamatoria al suprimir
potentemente la biosíntesis de eicosanoides por la inhibición directa de la ciclooxigenasa-1
y 5-lipoxigenasa in vitro e in vivo. Lo que sugiere su uso terapéutico para el tratamiento de
enfermedades relacionadas con la inflamación y alergia.
 COMPOSICIÓN DEL ACEITE ESENCIAL
Hasta hace poco, los aceites esenciales se han estudiado en su mayoría por su sabor y
fragancia para dar sabor a los alimentos, bebidas y otros bienes. Sin embargo, los aceites
esenciales y sus componentes están ganando mayor interés debido a su potencial uso multifuncional. Muchos autores han informado de las propiedades antimicrobianas, antifúngicas,
antioxidantes y de captura de radicales de los mismos
(13)
. Así es importante conocer la
composición del aceite esencial de Myrtus communis L.
6
Bajalan et al, 2013
(14)
, extrajo el aceite esencial utilizando el equipo de Clevenger;
posteriormente se analizó por GC y GC/MS. De acuerdo con este estudio, se identificaron
25 componentes diferentes que representaron el 92.21% del total del aceite; siendo los
principales: el α-Pinene (27.87%), 1,8-cineole (20.15%), ambos monoterpenos oxigenados,
y Linalool (10.26%). Mientras tanto Yadegarinia et al, 2006 (13), obtuvo por análisis de GC
y GC/MS un total de 32 compuestos en el aceite de M. communis, entre los cuales la mayor
cantidad correspondía a: α-Pinene (29.1%), Limonene (21.5%), 1,8-cineole (17.9%) y
Linalool (10.4%). Tabla 1.
Tabla 1 Composición química de aceite esencial de Myrtus communis.
Fuente: Yadegarinia et al, 2006 (13)
7
La diferencia entre los porcentajes de cada componente entre ambas investigaciones se
puede deber a diversas razones. Primero, los nutrientes de diferentes suelos y su
acumulación en las hojas podría resultar en diferente metabolismo y la producción de
diferentes productos biológicos y aceites volátiles. Segundo, el cambio en los genes a través
de las generaciones e hibridaciones, puede resultar en la producción de una variedad de
aceites volátiles. Tercero, la aclimatación de especies al medio ambiente en el que se
cultiva, así como a los diferentes ecotipos de la especie (15).
 ANÁLISIS DE MERCADO
El comercio internacional de aceites esenciales está controlado por dos grandes sectores
económicos que acopian la mayor parte de la producción mundial: las grandes empresas de
sabores y fragancias y los grandes acopiadores de materias primas para estas industrias. La
mayoría de estas empresas están establecidas en EEUU, Europa y Japón. De esta forma, se
puede decir que nueve grupos manejan el 80% del mercado de sabores y fragancias a nivel
mundial: IFF (empresa norteamericana que vende unos 1,700 millones de US$), Givaudan
–Roure (grupo Hoffman La Roche, vende unos 1.100 millones), Quest (grupo ICI, unos
800 millones), Haarmann & Reimer (grupo Bayer, unos 850 millones), Firmenich (unos
500 millones), Tastemaker, Takasago, Bush Boak Allen y Dragocco. El resto del mercado
está dividido entre grandes empresas nacionales de mucha menor envergadura que las
citadas y un sin número de pequeñas y medianas empresas (16).
Estados Unidos es el principal mercado de las exportaciones de aceites esenciales de la
región sudamericana, el registro de compras en el año 2007 fue por US$ 463,69 millones,
de los cuales el 24% es decir US$ 111,29 millones provenían de Sudamérica (17).
Aunque cabe resaltar que las importaciones son poco representativas en comparación con el
volumen total de las importaciones mundiales, no obstante se ajustan al comportamiento
creciente de éste mercado (18).
Los principales orígenes de las importaciones de Estados Unidos son India, Argentina,
Francia, Brasil, México y China.
8
Como lo muestra la Tabla 2, en el año 2007 Perú exportó una cantidad total de 483 451,98
kg netos de aceites esenciales por el valor de 12 218 392,46 US$ FOB total, teniendo como
principales destinos a los Estados Unidos, al Reino Unido y a Los Países Bajos (19).
También se puede apreciar, que el tercer lugar en exportaciones peruanas de esencias, lo
ocupa el aceite esencial de arrayan, con un valor de US$ 11 545,33 FOB total registrado
por cada 44,03 kg netos de aceite esencial, para el año 2007 (19).
Tabla 2: Ranking de aceites esenciales exportados por el Perú - año 2007.
Fuente: Veritrade L.T.D. (2007)
9
En el Perú normalmente encuentra aplicación en la fabricación de aguas de colonia y en
aguas de baño. El Arrayán contiene tanto en sus hojas como en sus frutos una esencia
aromática fuertemente antiséptica, el Mirtol.
Entre las empresas que comercializan aceite esencial de Arrayan están:
 Inkanatural
Botella de 10 ml a 25 soles
 Essential oils Perú- EOP
Botella de 10 ml a 44 soles
 Aroma y sabores del mundo
Por 0.20 ml a 10.60 soles
II.
Aceites Esenciales
 DEFINICIÓN
Los aceites esenciales son las fracciones líquidas volátiles, que contienen las sustancias
responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica
(saborizantes). Generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes que
pueden ser: Compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos,
cetonas, ésteres y ácidos), Monoterpenos, Sesquiterpenos y Fenilpropanos (20).
 CLASIFICACIÓN (21)
Los aceites esenciales se clasifican con base en los siguientes criterios: Consistencia, origen
o naturaleza química de los componentes mayoritarios.
Por su consistencia
o Las Esencias Fluidas. Son líquidos muy volátiles a temperatura ambiente (esencias
de albahaca, caléndula, citronela, pronto alivio, romero, tomillo, menta, salvia,
limón).
10
o Los Bálsamos: Son de consistencia más espesa, poco volátiles, contienen
principalmente sesquiterpenoides y son propensos a polimerizarse (bálsamos de
Copaiba, bálsamo de Perú, bálsamo de Tolú).
o Oleorresinas: Tienen el aroma de las plantas en forma concentrada, son típicamente
líquidos muy viscosos o sustancias semisólidas (caucho, gutapercha, chicle,
oleorresinas de páprika, de pimienta negra, de clavero). Contienen los aceites
esenciales, los aceites fijos, los colorantes y los principios activos de la planta.
o Los Concretos: Se obtienen de plantas aromáticas frescas por extracción con
solventes apolares (hidrocarburos). Tienen forma de semisólidos coloreados, libres
del solvente original. Estos componentes no son muy solubles en las bases para
perfumes siendo así necesaria su conversión en absolutos.
o Los Absolutos: Son productos de conversión de concretos por la extracción con
etanol absoluto. Una vez completa la disolución, los absolutos se refrigeran a
temperaturas de -5 °C a -1°C. A estas temperaturas las ceras se precipitan y se
pueden remover por filtración. El rendimiento de absolutos a partir de concretos
varía de 10% a 65 %.
Por su origen
o Aceites Esenciales Naturales: Se obtienen directamente de la planta y no se someten
posteriormente a ninguna modificación fisicoquímica o química, son costosos y de
composición variada.
o Artificiales: Se obtienen por enriquecimiento de esencias naturales con uno de sus
componentes; también se preparan por mezclas de varias esencias naturales
extraídas de distintas plantas.
o Sintéticos: Son mezclas de diversos productos obtenidos por procesos químicos, son
más económicos y por lo tanto se utilizan mucho en la preparación de sustancias
aromatizantes y saborizantes.
Por la naturaleza química
Según la estructura química de los componentes mayoritarios que determinan el olor
particular de los aceites, estos se dividen en tres grupos principales:
11
o Monoterpenoides (Iinalool, nerol, 1-8 cineol, geraniol)
o Sesquiterpenoides (farnesol, nerolidol)
o Fenil propanos oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas)
Los monoterpenoides se encuentran principalmente en plantas de los órdenes Ranunculales,
Violales y Primulales, mientras que son escasos en Rutales, Cornales, Lamiales y Asterales.
Por el contrario, los sesquiterpenoides abundan en Magnoliales, Rutales, Cornales y
Asterales. Aunque en los aceites esenciales tanto los monoterpenos, los sesquiterpenos y los
fenilpropanos se les encuentran en forma libre, más recientemente se han investigado los
que están ligados a carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos
del aceite como tal.
 BIOSÍNTESIS DE LOS ACEITES ESENCIALES
Los compuestos terpenoides naturales son sintetizados de la ruta de la acetil-coenzima por
medio de intermediario común que es el ácido mevalónico.
Estudios recientes muestran que muchos terpenoides no se originan de esta ruta, por lo que
se muestra una ruta alterna que implica al piruvato, gliceraldehido- 3-fosfato y un
intermedio 1-desoxi-xilulosa-5fosfato (20).
1. Biosíntesis del Ácido Mevalónico
Comienza con dos moléculas acetilCoA que se condensan. Seguido otra unidad de
acetilCoA que ha perdido un H-α. La hidrólisis de una de las dos funciones tioéster da lugar
a la β-hidroxi-β-metilglutarilCoA. Se da una segunda hidrólisis del otro grupo de tioéster
seguido de dos reducciones sucesivas con una reductasa NADPH-dependiente se logra
obtener el Ácido Mevalónico (20). (Figura 2)
12
Figura 2: Biosíntesis del ácido mevalónico
2. Biosíntesis de IPP y DMAPP
Dos unidades básicas que originan los terpenoides provienen del ácido mevalónico, son:
Isopentenilpirofosfato (IPP) y gama, gamadimetilalilpirofosfato (DMAPP). Una molécula
de ácido mevalónico es pirofosfatada por dos unidades de ATP para originar mevalonilpirofosfato.
Se produce una descarbonatación por medio de ATP, generando Isopentenilpirofosfato
(IPP). Un doble enlace en IPP da la unidad DMAPP (20). (Figura 3)
13
Figura 3: Biogénesis de las unidades isoprénicas básicas: Isopentenilpirofosfato (IPP) y γ,γDimetilalilpirofosfato (DMAPP)
3. Condensación cabeza-cola de IPP y DMAPP
Un IPP se puede condensar con varias unidades de DMAPP por una condensacion “cabezacola”, donde la cabeza es la funcion pirofosfato y la cola el extremo donde estan los
metilos. En la Figura 4 se ve el origen del Geralnilpirofosfato, precursora de monoterpenos
naturales. La condensacion de geranilpirofosfato con una nueva unidad IPP da origen al
farnesilpirofosfato, el cual es el precursor de todos los sesquiterpenos naturales
(20)
. (Figura
4).
14
Figura 4: Formación de terpenoides a partir de IPP y DMAPP
 CAVIDADES SECRETORAS (22)
Los espacios secretores pueden encontrarse en cualquier lugar de la planta y las secreciones
son variadas: Terpenos volátiles en Mirtaceae, Umbelliferae; bálsamos y resinas en
Coniferae; gomas o mucílagos en Sterculiaceae y Malvaceae.
Pueden presentarse como cavidades más o menos esféricas o como canales o conductos. Su
origen es esquizógeno o lisígeno, a veces mixto.
15
Los espacios lisígenos se forman por lisis de células enteras (holocrina), y quedan rodeados
de células más o menos desintegradas. Las secreciones se originan en las células antes de
que éstas se desintegren. La lisis comienza en unas cuantas células y luego se extiende a las
vecinas.
Estos
espacios
pueden
formarse
como
respuesta
a
lesiones.
En el exocarpo de Citrus hay cavidades lisígenas (Figura 5), se pueden ver a simple vista
como pequeñas masas translúcidas.
Figura 5. Corte transversal del exocarpo de Citrus (Rutaceae) con cavidades lisígenas
Por otro lado, en los espacios o cavidades esquizógenos la cavidad se forma gracias a que
las células se separan por disolución de la laminilla media y por dilatación de los espacios
intercelulares. Las células que limitan los espacios se diferencian formando el epitelio
secretor (figura 6.). La secreción es merocrina (22).
Figura 6. Ontogenia de una cavidad esquizógena
Para Myrtus communis las hojas aromáticas presentan canales o cavidades esquizógenas
secretoras que parecen puntos hialinos, rellenas de aceites esenciales, fundamentalmente de
compuestos terpénicos, y frecuentemente con células secretoras taníferas dispersas (23).
16
MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO:
Se trabajaron dos métodos distintos de extracción de los aceites por lo que el material tuvo
diferentes tratamientos. De esta forma, 379.2 gramos de la especie botánica Myrthus
communis “Arrayan” se mantuvo en fresco y 401.4 gramos fue llevado a secado en estufa.
La planta provino del Centro mayorista de verdura, “La Parada”.
 METODOLOGÍA
1. RECOLECCIÓN:
Las ramas con las flores de las especie M. communis fueron recolectadas de la sierra de
Junín. Se hizo una selección de las mismas, para luego proceder a su secado en la estufa.
2. TRITURACIÓN, DESECACIÓN Y ALMACENAMIENTO:
Secado en estufa: Se pesaron 401.4 g de muestra, se colocó en una fuente hecha de
cartulina y se colocó en estufa a una temperatura de 47° C y se realizó determinaciones de
peso con la mayor frecuencia posible hasta alcanzar un valor constante. El material seco, se
almacenó a temperatura ambiente en la misma fuente de papel acondicionándola para que
no haya un intercambio de humedad.
3. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ACEITES ESENCIALES
Según la variedad del material vegetal, parte de la planta a emplear y estabilidad del aceite
esencial que se pretenda obtener, se emplean diversos procedimientos físicos y químicos de
extracción, donde su correcta aplicación será lo que determine la calidad del producto final.
Sin embargo, en materia de rendimiento es importante establecer que ninguna cantidad de
mejoras en los aspectos tecnológicos compensará la mala calidad del material vegetal (24).
3.1 Destilación Por Arrastre Con Vapor De Agua
La destilación por arrastre con vapor es una técnica usada para separar sustancias orgánicas
insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no volátiles que se encuentran en la
mezcla, como resinas o sales inorgánicas. Con esta técnica se pueden separar sustancias
inmiscibles en agua y que se descomponen a su temperatura de ebullición o cerca de ella,
17
por lo que se emplea con frecuencia para separar aceites esenciales naturales que se
encuentran en hojas, cáscaras o semillas de algunas plantas (mitecnológico). El material
vegetal generalmente fresco y cortado en trozos pequeños (troceado), se coloca en un
recipiente cerrado y somete corrientes de vapor de agua sobrecalentado. Los compuestos
volátiles que están presentes en la muestra son arrastrados por el vapor de agua, este
posteriormente condensa y se recolecta sobre un recipiente que contiene agua, lo cual
permite que se lleve a cabo una separación de dos fases (Figura 7). Los aceites esenciales
son generalmente insolubles en agua y menos densos que ésta, lo que facilita la separación
de la fase orgánica, que se obtienen en un embudo de decantación. Esta técnica es muy
empleada y reconocida, se usa generalmente para extraer esencias fluidas, utilizadas para
perfumería y cosmética. Se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza
del aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada (20).
Figura 7. Destilación por arrastre de vapor
3.2 Hidrodestilación (Equipo Clevenger)
La hidrodestilación es una técnica de destilación directa. En este
tipo de extracción el material vegetal que puede estar molido,
cortado, entero o la combinación de éstos, se dispone en un
recipiente cerrado y se adiciona agua hasta ¾ de la capacidad del
recipiente. Posteriormente éste se somete a calentamiento durante
Figura 8. Destilador tipo
Clevenger
18
el proceso de extracción. El agua al llegar al punto de ebullición genera vapor. La
generación del vapor debe ser interna (base del recipiente), produciendo la presión
suficiente para vencer la resistencia hidráulica del material vegetal. Conforme el vapor
entra en contacto con la planta, éste extrae los componentes volátiles. La mezcla de vapor
saturado y aceite esencial, fluye hacia un condensador, en donde se condensa y enfría hasta
la temperatura ambiente (Figura 8). A la salida del condensador, se obtiene una emulsión
líquida inestable, la cual es separada en la trampa de Clevenger o en un tubo separador
(Figura 8), en donde se va acumulando el aceite esencial debido a su inmiscibilidad en el
agua. La trampa posee un ramal lateral por la cual el agua es desplazada para favorecer la
acumulación del aceite. Esta técnica es utilizada comúnmente para extraer aceite esencial
de diferentes tipos de vegetales (24).
4. ANÁLISIS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Se realizó en el Laboratorio de Ecologia Microbiana y Biotecnologia Marino Tabusso
(LMT) de la UNALM. Se utilizó el método de difusión en agar reportado en el estudio de
Sánchez et al, 2012 (25) con ciertas modificaciones. Los microorganismos fueron incubados
en caldo LB hasta obtener una densidad óptica de 0.05 (106 ufc/ml). Se inocularon 100 µl
de cada microorganismo en placas petri con agar Mueller-Hinton (25). Finalmente, se añadió
el aceite esencial (desde 5-10µl) en diversos puntos, y se dejaron incubar a 28 ºC por 24h.
Los microorganismos empleados fueron: un gram positivo (Bacillus amyloliquefaciens) y
dos gram negativo (Escherichia coli, Pseudomonas poae).
5. ANÁLISIS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA
La prueba antifungica se realizó en el Laboratorio de Micologia y Biotecnologia (LMB) de
la UNALM. Se trabajó en condiciones asépticas, se ejecutó el método disco agar difusión
con Aspergillus niger y Penicillium variabile según el estudio reportado por Akli Ouelhadj
et al, 2011(26). Los hongos fueron sembrados en tubos de agar PDA por 5 días, transcurrido
ese tiempo se le agregó a cada tubo Tween 80 al 0.1 % para cosechar las esporas y preparar
los inóculos a 107 spores/ml. Este se inoculó en agar PDA por incorporación en placas
Petri, luego se añadió el aceite esencial a un volumen de 30 µl, encima del papel Whatman
19
de 6mm de diámetro, en el centro de la placa. Se incubó a 28ºC por 72 h, pero también se
evaluó el transcurso del experimento a 48 h.
RESULTADOS
Rendimientos obtenidos por Arrastre de vapor e hidrodestilación
Tabla 3. Cuadro comparativo entre los dos método utilizados en la extracción.
Material vegetal
Aceite esencial
extraído
Rendimiento
Arrastre de vapor
270g fresco
0.1 ml
0.037ml/100g material fresco
Hidrodestilación
(Clevenger)
400g fresco
(174.3g seco)
0.9 ml
0.2ml/100g material fresco
(0.5ml/100g material seco)
Actividad antibacteriana
Luego de 24 horas se determinó que había actividad antibacteriana contra la bacteria B.
amyloliquefaciens, gram positiva (Fig. 7), mientras que para la muestra de Pseudomonas
poae no se evidenció inhibición puesto que los microrganismos crecieron uniformemente
en toda la placa (Fig.8). En el caso de E. coli se observó un retraso en el crecimiento del
microorganismo (Fig.9) en las zonas donde se inoculó el aceite. Sin embargo, no se puede
hablar de un efecto bactericida, como se vio en B. amyloliquefaciens.
20
Contra Bacillus amyloliquefaciens (gram positiva)
Figura 9: Actividad antimicrobiana del arrayan contra Bacillus
amyloliquefaciens. Inóculo del aceite de 5ul y 7ul. Diámetro de inhibición de
13 y 23mm, respectivamente
Contra Pseudomonas poae (gram negativa)
Figura 10: Actividad antimicrobiana del arrayan contra Pseudomonas poae. Inóculo del
aceite de 5ul y 7ul. No se reportó inhibición.
21
Contra Escherichia coli (gram negativa)
10
7
5
Figura 11: Actividad antimicrobiana del arrayan contra E.coli. Inóculo del aceite de 5ul, 7ul
y 10µl. Se observó un retraso en el crecimiento (zonas resaltadas), más no efecto bactericida.
Tabla 4: Diámetro de los halos de inhibición
DIÁMETRO
ESPECIE
A 5 ul
A 7 ul
Bacillus amyloliquefaciens
13 mm
23 mm
Pseudomonas poae
-
-
Escherichia coli
0.9mm (10ul)
0.7mm
(-) No presencia de halos de inhibición
Actividad antifúngica
Luego de 72 horas se determinó que no había actividad antifungica del arrayan contra los
dos microorganismos (Figura 11, 12)
22
Contra Penicillium variabile
A.
Figura 12: Actividad antimicrobiana sobre Penicillium variabile con 30uL de aceite de arrayan a
las A. 48h y B. 72h. El aceite se agregó sobre papeles estériles. Se nota una demora en la
esporulación, mas sí hubo crecimiento.
B.
23
Contra Aspergillus niger
A.
B.
DISCUSIÓN
Figura 13. Actividad antifúngica sobre Aspergillus niger con 30 uL de aceite de arrayán a A. 48h y
a B. 72h. El aceite se agregó sobre papales estériles. Se nota una demora en la esporulación, mas sí
hubo crecimiento miceliar.
24
DISCUSIÓN
Extracción de los aceites esenciales
Se realizaron dos metodologías para la extracción de aceites esenciales. La metodología
más conocida es el equipo Clevenger
(27)
usado en muchos laboratorios y considerado en
varios estándares internacionales como el más adecuado para la determinación del
contenido total del aceite esencial de una planta aromática
(28)
. Los resultados corroboran
este hecho, pues tenemos que la extracción por el método de hidrodestilación, equipo
Clevenger, fue más efectivo con 0.2ml/100g material fresco en comparación a los
0.035ml/100g material fresco (no fue suficiente para llevar a cabo las pruebas necesarias
para el valor agregado). Esto se debe a múltiples razones: el flujo de vapor producido en el
generador no fue adecuado (demasiado bajo) para la cantidad de materia prima utilizada; el
montaje de laboratorio es de vidrio y no está aislado, las pérdidas de calor a los alrededores
son muy altas, lo que hace que el vapor se condense con demasiada facilidad
(29);
si el
material queda muy apretado, el vapor se acanala disminuyendo el rendimiento del aceite
(30).
Por otro lado, el rendimiento logrado para el arrayán en hidrodestilación fue de 0.5%
(v/p-muestra seca); por lo que se puede decir que el rendimiento de extracción obtenido es
bajo, pero dentro del rango reportado por Farrell (1985) (31), quien menciona que la mayoría
de los aceites esenciales tienen rendimientos de extracción de 0.5-2%. Sin embargo, es
importante recordar que el rendimiento puede variar dependiendo de la región y época de
cosecha del arrayán, así como del modo de proceso y preparación de la muestra utilizada
(32);
subvalorando la producción de aceites esenciales por la planta. Eso se refleja en los
resultados de otras investigaciones, los cuales reportan rendimientos similares al nuestro:
0.29, 0.54 y 0.36% (33). Los resultados que se vienen mencionando fueron obtenidos por el
equipo Clevenger, el cual tuvo la característica de ser utilizado con material seco. Si bien el
secado reduce la cantidad de aceite en cada planta, puede incrementar enormemente el
rendimiento por tanda porque se puede colocar más material en cada tanda. De esta forma
se asegura que mayor área de muestra esté expuesta a los vapores.
25
Actividad Antibacteriana
El aumento de la prevalencia de microorganismos resistentes a los fármacos
antimicrobianos es una preocupación importante en todo el mundo. Así, con tantos agentes
antibacterianos disponibles para el tratamiento de infecciones sistémicas, este no es ningún
problema en la actualidad, pero la capacidad de los microorganismos para adquirir
resistencia a múltiples fármacos puede negar el efecto terapéutico de una familia entera de
agentes antibacterianos. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos,
seguros y eficaces es necesario. Las plantas podrían ser una buena fuente para este
propósito, y muchos extractos de plantas presentan actividades anti-microbianas (34).
En el presente estudio se evaluó cualitativamente la actividad antibacteriana in vitro del
aceite esencial de M. communis según la presencia o ausencia de zonas de inhibición. Las
pruebas se realizaron utilizando diferentes bacterias: Bacillus amyloliquefaciens (Gram +),
Escherichia coli, y Pseudomonas poae (Gram -). Los resultados que se muestran en la
Tabla 4 difieren de lo señalado en otros trabajos. Por ejemplo, Akin et al, 2010
(34)
,
realizaron el test de disco difusión, reportando inhibición del crecimiento en E. coli, S
aureus y P. Aeruginosa; siendo los diámetros (en mm) 15, 15 y 7, respectivamente.
Yadegarinia et al, 2006 (13), también señaló efecto inhibitorio del aceite esencial de Arrayán
a una concentración de 8µl/ml en E. coli (13mm), S aureus (10mm) y C. albicans
(21.33mm). Así mismo, Nabavizadeh et al, 2014 (35), llevó a cabo el test de disco-difusión,
dando zonas de inhibición para E. faecalis (21mm), S aureus (48mm) y C. albicans
(26mm).
Sin embargo, es difícil comparar directamente los datos con la literatura señalada porque
varias variables influyen en los resultados, como la diferente composición química del
aceite esencial debido a factores ambientales (como la geografía, la temperatura, la
duración del día, nutrientes, etc) a los que se encuentra expuesta la planta. Estos factores
intervienen en las vías biosintéticas y en consecuencia, la proporción relativa de los
principales compuestos característicos (13,15,34 ). Entonces, como la mayoría de los trabajos
citados son provenientes de una región completamente distinta a la nuestra, Europa
occidental y medio oriente, es muy probable que esta sea una de las razones de las
discordancias encontradas.
26
Por otro lado, se notó que Pseudomonas poae no se vio afectada y E. coli sufrió un retraso
en su crecimiento (Fig. 10 y 11), mientras que B. amyloliquefaciens (Gram +) sí es inhibido
por el aceite esencial. Fig. 9. Coincidiendo con otros estudios donde se informó que las
bacterias Gram-negativas son más resistentes a los extractos a base de plantas y aceites
esenciales
(36)
. La causa de este comportamiento recae en que la estructura hidrofílica de la
membrana externa de las bacterias Gram-negativas está constituida esencialmente del lipopolisacárido (LPS), lo cual bloquea la penetración del aceite hidrófobo y evita la
acumulación del aceite esencial en la membrana de la célula diana (37).
En los últimos años, como se ha mencionado, varias publicaciones han documentado la
actividad antimicrobiana de los aceites esenciales y de los extractos de plantas. Los
componentes mayoritarios en el aceite de M. communis son α-Pinene (29.1%), Limonene
(21.5%), 1,8-cineole (17.9%) y Linalool (10.4%), siendo los dos últimos los principales
responsables de su efecto antimicrobiano
(13,34)
. Ambos son compuestos terpenoides y uno
de los principales mecanismos de acción propuestos consiste en la disrupción de la
membrana celular bacteriana mediante 3 posibles vías: aumentando la permeabilidad de la
membrana a iones pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y
desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos 3 efectos
produce la muerte en la célula bacteriana (38).
Actividad antifúngica
Los productos químicos sintéticos son conocidos por sus propiedades cancerígenas. La
aplicación excesiva de fungicidas sintéticos fue advertido después de su toxicidad y
contaminación residual que resulta. Del mismo modo, muchos patógenos pueden
desarrollar resistencia a estos fungicidas. Para ello, la lucha contra los microorganismos se
dirige al uso de métodos orgánicos. Actualmente, además de lo ya mencionado, los aceites
esenciales son una herramienta muy útil para aumentar la vida útil de los productos
alimenticios.
Estas
sustancias
naturales
ricos
en
antioxidantes
y
compuestos
antimicrobianos se consideran alternativa importante para resolver los problemas de
27
deterioro post cosecha relacionadas con molde y para evitar la pérdida de la calidad y
cantidad de fruta durante el almacenamiento (39).
Por lo anterior, se evaluó la actividad antifúngica in vitro del aceite esencial de M.
communis contra dos cepas de hongos pertenecientes a los principales hongos que causan el
deterioro de los alimentos incluidos frutas: Aspegillus niger y Penicillium variabile.
En la figura 12a, muestra que a las 48 horas, el aceite esencial de arrayan (30ul) mostró una
aparente actividad fungicida contra P. variabile
manifestando un posible halo de
inhibición. Sin embargo, esto fue distinto a las 72 horas (figura 12b) en donde se observó
un crecimiento dentro de la zona de inhibición, lo cual sugiere una actividad fungistática
mas no fungicida ya que el crecimiento del hongo se vio retrasada en comparación al resto
de la placa, esto por una posible alteración morfológica de las hifas de todo el hongo
(40)
.
Este resultado difiere de Akli Ouelhadj et al 2011 (24), quienes afirman que a un volumen de
aceite superior a los 20 ul, Penicillium. sp es extremadamente sensible y genera halos de
(para 30 ul) de 46 mm. En cambio,
Martinetz et al 1998
(41)
reportó que el extracto de
aceite esencial de M. communis fue inefectivo en Penicillium sp resultado que apoya lo
reportado en este trabajo.
Situación similar se dio para Aspergillus niger. En la figura 13a, muestra que a las 48 horas,
existe una aparente inhibición alrededor del papel Whatman de unos 0.5 mm y más allá de
esa distancia un crecimiento miceliar sin esporulación en comparación de toda la placa. A
pesar de ello a las 72 horas (figura 13b) el crecimiento se dio dentro de la posible zona de
inhibición y la esporulación se hizo cada vez más evidente dentro de la zona de crecimiento
sin esporulación que se observó en la figura 13a. Con lo anterior, se sugiere lo mismo que
para P. variabile, una actividad fungistática mas no fungicida. Resultado contradictorio a lo
dicho por Akli Ouelhadj et al 2011
(24)
de quienes se siguió la metodología para evidenciar
la actividad antifungica, si para un volumen de 20 ul A. niger no mostraba extrema
sensibilidad en comparación a Penicillium. sp, entonces con 30 ul se esperó halos de
inhibición más, iguales o cercanos a 59.5 mm y una extrema sensibilidad al aceite de M.
communis. Sin embargo, no fue así y más bien se podría apoyar los resultados en el trabajo
de Sadeghi Nejad B et al (2014)(42) quienes mencionan que a una alta concentración del
aceite se observó un muy bajo efecto inhibitorio contra A. niger.
28
Según la literatura consultada, la actividad antifúngica del aceite esencial de M. communis
es debido a sus componentes principales: cineol (éter), α-pineno y limoneno
(monoterpenos), y también a sus constituyentes minoritarios: mirtenol, linalol, geraniol
(alcoholes terpénicos) y eugenol (fenol)(24) .
Si monoterpenos tales como α-pineno y limoneno se encuentran entre los principales
componentes que contribuyen a la alta actividad antimicrobiana de Myrtus communis(43) y
según Derwich et al 2010
(44)
, esta actividad de los monoterpenos se explica por la
presencia de grupos hidroxilo fenólicos capaces de formar enlaces de hidrógeno con los
sitios activos de las enzimas de la célula diana. Entonces, se puede sugerir que el aceite
esencial extraído del arrayan presentaba esos compuestos (puesto que la composición de
una aceite no cambia) no obstante, estos estaban en una baja concentración lo que podía
influir en una baja actividad antifungica. Para tal caso a través de GC y GC-MS, se hubiera
tenido la composición real del aceite extraído (45).
CONCLUSIONES
Por lo tanto, la extracción del aceite de Myrtus communis es más efectiva y con un mayor
rendimiento usando el equipo de Clevenger con muestra estabilizada.
Presenta una actividad antibacteriana contra Gram positiva (Bacillus amyloliquefaciens)
mas no, para Gram negativas (Escherichia coli, y Pseudomonas poae) y no se evidenció
actividad antifúngica contra Aspergillus niger y Penicillium variabile sino más bien una
actividad fungistatica.
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