“EFECTO DEL ESTRADIOL EN LA PRODUCCIÓN DE VITELOGENINA Y SU IMPACTO EN LA CALIDAD DEL OOCITO EN TILAPIA NILOTICA, Oreochromis niloticus” Juan Cristóbal Ortiz Tirado jcortiz@espe.edu.ec Introducción Introducción (FAO, 2013) Introducción • • • • • • Crecimiento rápido Omnívoro Cultivo de alta densidad tiene buena supervivencia. Pez resistente a la manipulación y a malas condiciones ambientales Alta fertilidad y posibilidad de reproducción natural Buena aceptación por parte del consumidor Reproducción a temprana edad y numerosa Resultado: sobre población y peces pequeños (enanismo) = endogamia Factores ambientales, sociales y nutricionales •Fecundidad variable •Tasa de Postura •Ausencia de desoves •Calidad del oocito Melatonina GnRHs ~ ~ CP ~ LHa hCG •Propuestas de control: •Manejo de la Luz ->Fotoperiodos •Inducción Hormonal -> CP, hCG, GnrHs Control de luz y reproducción en O. niloticus. Justificación Justificación Tabla N°3. Uso de hormonas en O. niloticus. Pullin, 1987 Shelton, 1999 Ortiz**, 2000 Herbs, 2002 Aizen, 2006 Levavi, 2006 Levavi, 2010 P. Carpa hCG + + + - - - - ­­- LHa (comercial) - + - - - - ­­- P. Tilapia - - + - - - - Sin hormonas - - - + - - - H. R. Tilapia - - - - + + + sGnRHa Desove manual + + + + - - - Estradiol 11 KT DHP - - - - + + + Fecundidad absoluta - - +carp 7300 - - - Ovas /día /hembra - - - 20 - - - Eclosión/puesta - - - 608 - - - Nado libre (%) - 9 - - - - - Autor ** Pruebas en carpa espejo, H.R..-hormonas recombinantes, P.- pituitaria Justificación Pez de maduración asincrónica Frecuencia de desoves entre 15 – 20 días Carrillo et al., 2009 •En tilapia -> no hay estacionalidad FSH y LH, •Afecta el E2 circulante -> Vtg -> oocito •La concentración de Vtg circulante ->biomarcador esteroidogénico -> parámetro de crecimiento ovárico -> calidad para la reproducción de especies acuáticas Calidad del Oocito •Parámetros morfométricos -> diámetro, peso, número oocitos •Actividad enzimática y transformación de AA -> prostaglandina E2 PROBLEMA Hipófisis Gonodotrofinas 17 β estradiol circulante Hígado OVARIO Actividad COX2/ PGE2 Vitelogenina Calidad del oocito HIPOTESIS “En un modelo de producción acuícola, la estimulación del estradiol circulante en hembras adultas de Oreochromis niloticus, y su acción en las concentraciones de vitelogenina, afecta la calidad de los ovocitos en su morfometría y concentración de prostaglandina E2”. OBJETIVO GENERAL Evaluar las concentraciones de estradiol circulante por acción de estímulos externos e internos y su efecto en la producción de vitelogenina y calidad de los ovocitos, durante el período reproductivo de Oreochromis niloticus en un modelo de producción acuícola. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Determinar las variaciones de 17β- estradiol y vitelogenina circulantes, durante el período reproductivo en tilapia, bajo condiciones normales de cultivo. 2. Evaluar el efecto del estradiol puro y pituitaria homóloga de tilapia como estimulantes externos e internos en las concentraciones de estradiol y vitelogenina circulante, durante el período reproductivo de tilapia. 3. Evaluar la calidad del ovocito por parámetros morfométricos y bioquímico-celulares como la prostaglandina E2, bajo condiciones normales de cultivo, acción del estradiol exógeno y pituitaria homóloga. METODOLOGIA Actividad Biológica de Pituitaria Homóloga de tilapia Detección de grupo de reproductores en proceso de trabajo Material Biológico: • Grupo de reproductores en condiciones normales de producción Signos: • Saludables • Consumo normal de alimento • Pápila genital dilatada • Embriones en la boca Factores ambientales: • Verificación de estacionalidad y ambiente ideal para reproducción en la región (Temperatura, Luz, pluviosidad Oxígeno, salinidad) 3. Material Biológico Oreochromis niloticus ( Línea Chitralada) – Peso: 319 g/unidad – CV < 10% Tamaño de la muestra: • Nivel de significación α =0,05 • Potencia del 90 %, β =0,10 – Grupo 1: 12 hembras – Grupo 2: 12 hembras – Grupo 3: 12 hembras – (1 ♀:1♂) • Sangre: – • 250 uL cada 5 días Ovocitos : – – 500 mg tejido ovárico ~ 40 ovocitos invididuo Pruebas experimentales -17 β estradiol y vitelogenina Verificación y marcaje de Reproductores Aclimatación Pruebas (25 días) Control Estradiol exógeno Pituitaria homologa (1 ♀:1♂) (1 ♀:1♂) (1 ♀:1♂) 300 µl SF 5μg/g (300 µl) 5μg/g (300 µl ) Técnicas usadas: • Estradiol , Testosterona y Prostaglandina E2 – ELISA – Curvas de calibración de la prueba. – Detección de variación intra e inter –ensayo • Vitelogenina – – – – Cromatografía de intercambio iónico Perfil de proteína SDS -PAGE Western Blot (anti vtg de dorada ) Análisis por densitometría optica ( Image J) • Actividad COX • Morfometría oocito – diámetro de los oocito-estereomicroscópio – Peso del ovario/oocitos – balanza analítica – Simetría del oocito en vitelogénesis y post vitelogénesis – histología clásica Análisis Estadístico: ANOVA de 1 vía *Shapiro Wilk *Levene *Tukey Cuando los datos no cumplieron estas normas * Kruskall – Wallis * Test de Dunn /Mann – Whitney Paquete estadístico – InfoStat – Graph Pad Prism 5 • diferencias significativas -> si p<0,05. Instalaciones de la Empresa Productora Tilapia, Provincia del Guayas – Ecuador. Empresa Santa Priscila Taura II Piscinas de Reproducción O niloticus Área de Reproducción Instalación de unidades experimentales Estanquería de 7 ton de capacidad • Manejo de reproductores para el experimento RESULTADOS • • • • CONDICIONES AMBIENTALES VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES DETECCIÓN VTG ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA Parámetros ambientales: Temperatura 31,95 ± 1,57 °C. 29,78 ± 1,04 °C. Pluviosidad Luminosidad RESULTADOS • • • • CONDICIONES AMBIENTALES VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES DETECCIÓN DE VTG ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA a) Grupo de Reproductores : Diciembre 2012-Marzo 2013 Relación Longitud gónada vs masa gonadal Relación ovocitos vs masa gonadal RESULTADOS • • • • CONDICIONES AMBIENTALES VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES DETECCIÓN DE VTG ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA Detección de vitelogenina circulante en tilapia Aumento de las concentraciones de Vtg circulante en machos SDS –PAGE al 8%. Muestras: 1.- marcador de proteína 10-250 kDa; 2,3,4,5.- plasma de hembras 311 y 316; 6.- plasma humano; 7 plasma de macho; 8.- plasma de macho tratado con pituitaria; 9.- plasma de macho tratado con estradiol puro. Detección de vitelogenina circulante en tilapia Validación del anticuerpo para Vtg de tilapia Western Blot en muestras no purificadas, con anticuerpos primarios de conejo anti – vtg de dorada y marcador de proteína (10-250 kDa). Muestras: A, B, C. D: plasma de hembras maduras, E: Control (plasma humano), F: plasma macho O. niloticus. H: plasma de macho O. niloticus con estradiol. Detección de vitelogenina de tilapia Detección de Vtg por western blot, con anticuerpo primarios de anti – Vtg de dorada y marcador de proteína (10-250 kDa), en plasma pre - purificado de O. niloticus. Muestra 312. A: día 1. B: día 5. C: día 10. D: día 15. E: día 20. F: día 25, H: macho normal RESULTADOS • • • • CONDICIONES AMBIENTALES VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES DETECCIÓN DE VTG ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA Actividad Biológica de pituitaria de tilapia y carpa en células de Leydig de cobayo *** 2000 Testosterona (pg/mL) ** 1500 1000 500 0 Control Tilapia Carpa Pituitaria (2,5 mg/mL) *muestra una diferencia significativa Actividad biológica de pituitaria de tilapia y carpa en células foliculares de trucha arco iris. 17β estradiol (pg/mL) 5000 * 4000 3000 2000 1000 0 Control Tilapia Carpa Pituitaria (2,5 mg/mL) *muestra una diferencia significativa Actividad Biológica de pituitaria de tilapia y carpa en células foliculares de tilapia 17β estradiol (pg/mL) 4000 * *** 3000 2000 1000 0 Plas. Macho Ovario Tilapia Carpa Pituitaria (2,5 mg/mL) *muestra una diferencia significativa RESULTADOS • DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • INTERACCIONES Comportamiento del E2 circulante en el ciclo reproductivo de O. niloticus c E2 (ng/mL) 25,00 ab bc bc bc 20,00 15,00 a 10,00 5,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Días Control Estradiol Hipófisis 25,00 RESULTADOS • DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • INTERACCIONES Comportamiento de la Vtg en el ciclo reproductivo de O. niloticus 6,00 Vtg (mg/mL) 5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Días Control Estradiol Hipófisis 25,00 RESULTADOS • DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA • INTERACCIONES Comportamiento de Estradiol y vitelogenina circulante en plasma, bajo condiciones normales de cultivo. 8 6 20 4 10 2 0 0 1 5 10 Días 15 20 25 Estradiol Vitelogenina Vitelogenina (mg/mL) 17 β estradiol (ng/mL) 30 Comportamiento de E2y Vtg circulante en plasma, bajo acción del estradiol exógeno. 8 6 20 4 10 2 0 0 1 5 10 15 20 25 Días Estradiol Vitelogenina Vitelogenina (mg/mL) 17 β estradiol (ng/mL) 30 Comportamiento de E2y Vtg circulante en plasma, bajo la acción de pituitaria homóloga. 8 6 20 4 10 2 0 Vitelogenina (mg/mL) 17 β estradiol (ng/mL) 30 0 1 5 10 15 Días 20 25 Estradiol Vitelogenina RESULTADOS • PARAMETROS MORFOMÉTRICOS • ACTIVIDAD COX Y PG´S Parámetros morfométricos de hembras adultas de Oreochromis niloticus. Control Estradiol Hipófisis ♀=12 ♀=12 ♀=12 319,±38ª 316±41a 313±44ª 27±1ª 26 ± 1a 26 ± 1ª Longitud cefálica (cm) 6,7±0,5 6,7±0,5 6,8±0,5 Ancho total (cm) 7,7±0,6 7,7±0,6 7,9±0,6 Índice de Condición (cm) 1,7±0,3a 1,6±0,08a 1,6±0,1a Tratamientos Peso (g) Longitud Total (cm) Parámetros reproductivos de hembras adultas de Oreochromis niloticus Tratamientos Parámetros IGS (%) Control (♀=12) Estradiol (♀=12) Hipófisis (♀=12) Media±SD CV (%) Media±SD CV (%) Media±SD CV (%) 2,4±1,2 51,5 2,8±1,3 46,4 3,5±1,6 46,4 3,0±1 33,0 2,8±1,4 52,5 2,7±1,4 52,8 Ovocitos /g hembra 8,1±3,3ª 36,5 12,5±6,6ab 52,8 15,7±5,8b 36,8 Ovocito (mm3) 19±12,0 62,9 20,5±10,1 49,4 22,8±12,2 53,4 Ovocito (mg) Diámetro ovocito- eje mayor (mm) Estadios de desarrollo y simetría de los ovocitos en O. niloticus 2.0 ** * 1.5 1.0 0.5 0.0 Estradiol Control Hipófisis 100 > 2 mm < 1,6 - 1,9 > < 0,7 - 0,9 > 80 % 60 40 20 0 Estradiol Control Hipófisis Ovocito mm (eje mayor) RESULTADOS • PARAMETROS MORFOMÉTRICOS • ACTIVIDAD COX Y PG´S Actividad COX y Prostaglandina E2 0,60 1,20 0,50 0,50 0,80 0,60 0,40 0,34 0,78 0,29 0,701 0,40 0,20 0,40 0,37 0,30 0,319 0,305 0,20 0,10 0,00 0,00 CONTROL Actividad total ESTRADIOL Actividad COX1 Actividad COX2 PITUITARIA prostaglandinas PGE2 (ng/mg) COX uM /min / mL 1,00 CONCLUSIONES • Bajo condiciones normales de cultivo, la dinámica de secreción de E2 y Vtg circulante, generan una interacción inversa con un índice de correlación bajo entre las dos variables y afectando los parámetros reproductivos (fecundidad y morfometría de los ovocitos) durante el ciclo reproductivo de tilapia. • La administración de E2 y pituitaria homóloga generan una tasa diferente de metabolización del estradiol circulante, permitiendo un cambio en la dinámica de secreción de la vitelogenina circulante durante los primeros días del ciclo reproductivo de tilapia, afectando positivamente parámetros reproductivos (fecundidad, morfometría de los ovocitos y peso de los ovarios). • La acción de pituitaria homóloga de tilapia origina respuestas diferentes en cultivos celulares de tres modelos animales, produciendo información relevante para su aplicación en pruebas in vivo y haciéndola competitiva con hormonas comerciales. • La concentración de prostaglandina E2, actividad COX-1, COX2, se ven afectados por la acción de E2 y pituitaria homóloga. En este sentido la PGE es componente funcional para la ovulación, desove y su interacción con receptores de membrana en la embriogénesis. Agradecimientos • Al Laboratorio de hormonas y receptores de la Universidad de Chile y Programa de Doctorado en Acuacultura : Universidad de Chile, Católica del Norte y Católica de Valparaíso. • A la SENESCYT • A la Universidad de la Fuerzas Armadas - ESPE Gracias Interacción E2 y Vtg bajo condiciones normales de cultivo. Estradiol Vitelogenina Rango (unidades) 40 30 20 10 30 20 10 0 0 1 10 5 15 Días Días 30 Rango (unidades) Rango (unidades) 40 25 20 15 20 25 Días Interacción E2 y Vtg bajo acción de estradiol exógeno. Estradiol 45 Rango (unidades) Vitelogenina 40 30 20 10 40 35 30 25 20 0 10 5 1 15 Días Días 50 Rango (unidades) Rango (unidades) 50 45 40 35 30 25 20 25 Días Interacción E2 y Vtg bajo la acción de pituitaria homóloga. Estradiol 50 Rango (unidades) Vitelogenina 40 20 0 1 40 30 20 10 0 5 10 Días 15 Días 50 Rango (unidades) Rango (unidades) 60 45 40 35 30 20 25 Días Comportamiento de 11 keto - testosterona durante el período reproductivo de machos de tilapia. Comportamiento del estradiol y testosterona (ng/mL) (Biswas et al .,2005) Índice Gonodosomático Volumen del oviducto (mm3) Resumen Strain GMT (O. niloticus and O. mossambicus) Evaluations Produced by FishGen using limited materials of GIFT as its base, the YY males technique is available worldwide through efficient partnership with hatcheries selling GMT (Genetically Male Tilapia), a chromosome manipulation technique, not a GMO fish. Very poor field performance so far. Red tilapias (Oreochromis spp.) Result of a mutation of one single dominant red O. mossambicus, the initial dominant red color was spread in several tilapia species, so today there are no pure red materials available. It is salinity tolerant due to mossambicus blood, and some countries like Jamaica, Colombia and Thailand prefer this color. Poor breeding and grow-out performances when compared to niloticus. Several hybrids (tri and tetra-hybrids, too) of Nile, Aureus, Hornorum, and Mossambicus are used especially to yield monosex population or cold/brackish water resistance/survival. Hybrids (several crosses) Strain Chitralada (O. niloticus) GIFT (O. niloticus) (Ponzoni et al; 2010) GST (O. niloticus) Introducción (Zimmerman, 2007) Evaluations Developed in Thailand, this strain of O. niloticus is the most successful Nile in Latin America due to proper adaptation and successful breeding programs, but it has also some significant role in South East Asia where it also has very good field performance results when compared to other Niles. Originally developed in Philippines by Akvaforsk, GIFT strain is now available in most tilapia countries with very good field performance. This is why it is the main O. niloticus cultured in South East Asia (also hybridized with Aureus in China). Several breeding programs of this successful strain have developed worldwide by Akvaforsk and others. Produced by GenoMar ASA using GIFT population as its base, is being sold today in limited parts of the world (China, Indonesia, Thailand, Brazil, and the Philippines) where partners and GenoMar integrations are located. Fully owned genetic material, limited sales. Very good field performance. Introducción Reproducción a temprana edad y numerosa • Desarrollo gonadal: 20-25g. • Desoves : 3- 10 veces/año (max. 11 veces) • Pez asincrónico de incubación bucal Resultado: sobre población y peces pequeños (enanismo) = endogamia •Tasa de postura – hembras •Fecundidad •Ciclo reproductivo /ambiente •Relaciones sociales El Sayed, 2003; 2005 1. Relación: Postura de hembras adultas/masa corporal Suárez et al; 2013 2. Relación: Fecundidad/masa corporal Suárez et al; 2013 Estévez, 1995; Córdova, 2004 Ortiz et al., 2000 Fecundidad Peso ♀ (g) Fecundidad Ovocitos ♀ O. mossambicus 25 ... 1200 O. aureus Especie 100 ... 2500 Diámetro ovocitos (mm) 1.8 ... 2.5 Peso ovocitos (mg) 2.3 ... 6.4 Privisencev, 1991 70 ... 850 250 ... 2200 2.0 ... 2.5 2.5 ... 6.9 Privisencev, 1991 O. niloticus 117 - 177 678 2.5 2.3 -4 Ridha & Cruz ,2000 O.niloticus 296.82 523 - - Fessehaye et al., 2006 O.niloticus 180 500 - 3000 - - Ponzonni et al., 2010 Tilapia de la Florida 90 ... 420 380 ... 1400 2.1 ... 2.6 2.1 ... 6.5 Privisencev, 1991 T. macrocephala 80 ... 350 200 ... 600 2.5 ... 3.0 6.0 ... 7.5 Privisencev, 1991 T. mariae 70 ... 280 1200 ... 5000 1.0 ... 1.4 1.1 Privisencev, 1991 T. zilli 29…419 5000 1. 1…3 Coward & Bromage ,2000 1.8 Autor 3. Relación Ciclo reproductivo: temperatura Suárez et al; 2013 Boroiller et al., 1987 Síntesis de esteroides sexuales Carrillo et al., 2009 Nagahama et al., 1995 Reproducción a temprana edad y numerosa • Jerarquización social – Poligamia – Poliándrismo Resultado: sobre población y peces pequeños (enanismo) = endogamia Efecto endogámico del 3% por generación (Fessehaye et al., 2006) Espermiación – Paternidad múltiple PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENETICO Neira, 2010 PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENETICO Problemas en cruzas individuales y grupales 1. 2. 3. 4. Ausencia marcada de desoves Falta de Sincronización de puestas Baja fecundidad relativa Bajo stock de alevines viables para la evaluación de líneas. Neira, 2010; Ponzoni, 2010; Powell,2010; Muñoz Cueto, 2010; Reyes; 2011 Justificación Control de la Reproducción – Luz – Hormonas C/subunidad α /FSH β /LH β es codificada por un gen diferente y difiere en sus secuencia de aminoácidos y conservación filogenética . En Salmónidos y Perciformes la estructura primaria es diferente en FSH β. •Ausencia 3era Cys conservada y presencia de una cisteína adicional en la terminal N. •Modificaciones de carbohidratos en sitios específicos de N – terminal y ausencia de un segundo sitio de N –glicosidación. Ulloa - Aguirre., 2001 Aizen et al., 2007 Factores próximos: • Temperatura • Salinidad • Oxígeno • Estructura social • Alimentación Silva, 2010 Factores últimos: • Temperatura + alimento • Estructura social Discusión Control Programa de Mejoramiento * 1400 Control Estradiol Hipófisis 20 1000 * 800 40 * 30 10 20 10 m ) g) (m ito vo c O O vo c ito he m /g ito s vo c O (m br a ) (% S IG /g vo s H ue vo s H ue he m he m br a br a ur a st 3 0 0 Po Rango (unidades) 1200