TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 1. Introducción El término biorremediación o biorrecuperación se utiliza para denominar una variedad de sistemas de recuperación que degradan, transforman o eliminan o disminuyen la toxicidad de contaminantes orgánicos o inorgánicos a través de la actividad biológica natural de organismos vivos (plantas, hongos, bacterias, etc.), principalmente microorganismos. También se emplean los términos biocorrección y biorrestauración. En contraste con esta definición amplia, es frecuente que por biorremediación sólo se entiendan los procesos llevados a cabo por microorganismos, y que si hay participación de plantas en el proceso se hable de fitorremediación. Esta estrategia de recuperación depende de las actividades catabólicas de los organismos y, por tanto, de su capacidad para usar los contaminantes como alimento (fuente de C y energía). El proceso de biorremediación incluye, además de biodegradación de los contaminantes, reacciones de oxido-reducción, procesos de sorción e intercambio iónico, e incluso reacciones de quelación que provocan la inmovilización de metales. La variedad de procesos de biorremediación ofrece gran versatilidad y flexibilidad: puede realizarse de manera espontánea o dirigida, puede ejecutarse en condiciones aerobias o anaerobias, pueden emplearse organismos autóctonos del sitio contaminado o incorporar otros foráneos, puede realizarse in situ o ex situ (on site y off site), etc. Se aduce como ventaja de los tratamientos ex situ la posibilidad de homogeneizar el suelo, lo que facilita el control de condiciones de proceso y puede permitir unos mejores resultados. Aunque no cualquier contaminante es susceptible de ser biodegradado, se ha usado con éxito biorremediación para tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos de petróleo, disolventes (benceno y tolueno), explosivos (TNT), clorofenoles, pesticidas (2,4-D), creosota e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). La biorremediación, como otras tecnologías de recuperación de suelos y aguas, es un campo de trabajo claramente interdisciplinar, en parte por su complejidad que hace necesarios enfoques diferentes y complementarios: ingenieros de diversas ramas, biólogos (microbiólogos, ecólogos, etc.), químicos, geólogos y otros profesionales tienen su papel en un adecuado diseño y desarrollo de las operaciones de remediación. Como ventajas de la biorremediación se citan: son más respetuosas con el medio ambiente ya que la intrusión y modificación ambiental es reducida (para algunos la principal ventaja radica en que la calidad del suelo no se ve alterada durante el proceso, no se perjudican ni la estructura ni las características biológicas); son efectivos (los contaminantes son destruidos eficazmente) y eficientes (el coste es comparativamente bajo, salvo para los sistemas más complejos); permiten tratar la zona saturada del suelo y la insaturada; pueden aplicarse in situ y también a suelo Prof. Rafael Mulas Fernández 1 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN excavado y al agua subterránea bombeada a la superficie; no requiere en general componentes estructurales o mecánicos complejos; pueden combinarse con otras tecnologías en un tren de tratamientos. Las técnicas de biorremediación han conseguido por estas ventajas una muy buena imagen, resultando bien aceptadas por la opinión pública, en contraste con otros procedimientos físico-químicos, lo que se cita también como una ventaja más. Inconvenientes de la biorremediación son la dificultad o imposibilidad de degradar contaminantes inorgánicos (y algunos orgánicos); la imposibilidad de emplearla si las condiciones no son suficientemente favorables para el crecimiento microbiano; las dificultades para aplicarla en materiales geológicos impermeables; la lentitud, mayor para procesos anaerobios, que lleva a requerir, en ocasiones, lapsos de tiempo muy largos y difíciles de predecir; las dificultades para asegurar un aporte suficiente y homogéneo del oxígeno necesario para tratamiento aerobio; y la necesidad de evaluar la toxicidad de intermediarios y/o productos. Además, las estrategias de biorrecuperación que funcionan en un lugar no tienen por qué funcionar en otro, y procesos que sí funcionan en el laboratorio puede que no tengan éxito cuando se llevan a nivel de campo. Un factor limitante para la extensión de la biorrecuperación es que todavía no se conocen en su totalidad los mecanismos que controlan el crecimiento y la actividad de los microorganismos en ambientes contaminados. En la actualidad, hay un interés creciente por las tecnologías biológicas de recuperación porque las ventajas parecen superar a los inconvenientes. A pesar de las limitaciones mencionadas, el futuro es prometedor ya que la microbiología ambiental es un campo en el que se investiga y se progresa notablemente: los avances en el desarrollo de modelos del metabolismo microbiano, además de los adelantos en los métodos de secuenciación de ADN y de análisis de expresión y función génica, están revolucionando este ámbito de estudio. La efectividad futura de estas tecnologías se verá apreciablemente incrementada al aumentar la comprensión de los mecanismos implicados en el proceso, tanto microbiológicos como biogeoquímicos y de transporte en el medio. En resumen, la biorremediación es una herramienta útil y eficaz cuando, como todas las herramientas, se emplea adecuadamente. Como ha dicho R. Schaffner, coordinador del Bioremediation Discussion Group (Biogroup)1, “la biorremediación, que una vez fue una tecnología humilde y que generaba demasiadas dudas, se ha convertido en una verdadera industria”. 2. Aspectos relevantes y factores que influyen en la biorremediación Para la descripción de los aspectos más relevantes de los procesos de biorremediación se ha optado por sistematizarlos según se refieran a las sustancias contaminantes (2.1), a los microorganismos que van a desarrollar la remediación (2.2) o al medio (suelo, agua) en que el proceso se desarrolla (2.3). No obstante, hay un conjunto de aspectos que se refieren a la denominada biodisponibilidad que se refieren a la interacción de los microorganismos con los contaminantes, interacción condicionada por factores ambientales. Algunos aspectos de la biodisponibilidad se han incluido en alguno de los tres apartados mencionados, pero finalmente se ha añadido un apartado 2.4 para incluir lo que parecía no encajar del todo en ninguno de los anteriores. 1 http://www.bioremediationgroup.org/ Esta página web contiene gran cantidad de información sobre este tema. Prof. Rafael Mulas Fernández 2 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 2.1. Relativos a los contaminantes Vamos a considerar tanto los relativos a la constitución química del contaminante, como los relativos a su disponibilidad para los organismos (estado físico, solubilidad, volatilidad) y los que tienen que ver con su facilidad de transformación (biodegradabilidad). Constitución química. No cualquier contaminante puede ser objeto de biorremediación, aunque sí un amplio abanico de tipos. Se han aplicado procedimientos de biorrecuperación, con distintos grados de éxito y rapidez en alcanzarlo a: • Hidrocarburos. De diverso tipo: alifáticos, aromáticos (como BTEX), aromáticos policíclicos (PAH) y también sus mezclas como el petróleo y sus derivados (gasolinas, gasóleos, fueles…). Es el grupo de compuestos sobre el que más se ha trabajado en biorremediación. • Organoclorados. Tanto pesticidas de diversos tipos, como disolventes clorados o PCB. • Nitroaromáticos, como explosivos (TNT y otros). • Metales pesados. • Otros: organofosforados, fenoles, dioxinas, etc. Estado físico. Para que los microorganismos puedan actuar sobre los contaminantes, estos deben ser accesibles a aquellos (biodisponibilidad) y uno de los factores que primero influye en esa disponibilidad es el estado de agregación. Los contaminantes pueden encontrarse en fase vapor, líquida y sólida. Los gases tienden a escapar a la atmósfera. Los sólidos presentan movilidad y superficie de contacto escasas. Desde el punto de vista de la biorremediación, en ocasiones se considera que están en fase sólida contaminantes asociados a las partículas de suelo, típicamente adsorbidos sobre su superficie. Son los líquidos los que mayores posibilidades tienen para desplazarse y disolverse en la fase acuosa. Respecto a los líquidos, hay que distinguir lo que esté disuelto en agua y las fases no acuosas que forman las sustancias orgánicas no miscibles con el agua (NAPL: NonAqueous Phase Liquid), que pueden ser ligeras (LANPL: Light NAPL, como muchos hidrocarburos) o pesadas (DNAPL: dense NAPL, como disolventes clorados). Solubilidad en agua. Para estar disponible para los organismos la sustancia ha de ser soluble en agua o, al menos, poderse dispersar en ella (emulsionar) con auxilio de surfactantes. Recordemos que la solubilidad viene condicionada por la estructura molecular de la sustancia: → Es menor cuanto mayores son las cadenas hidrocarbonadas de la molécula. → Es menor cuanto menos grupos funcionales polares (con oxígeno o nitrógeno) tenga la molécula. → En el caso de organoclorados, es menor cuanto mayor sea el grado de sustitución de hidrógenos por cloros. → En el caso de PAH, es menor cuanto mayor sea el número de anillos aromáticos. → Es mayor para aromáticos que para alifáticos de análogo peso molecular. Muchas sustancias orgánicas son hidrófobas por su carácter apolar y así ocurre con muchos contaminantes: hidrocarburos, pesticidas, disolventes, PCBs... Estas sustancias, además de ser relativamente poco solubles en agua, tienen una mayor afinidad por los medios apolares, como es la materia orgánica del suelo (MOS), por lo que suelen adsorberse o absorberse sobre dicha fracción orgánica. Muchas veces se emplea el término “sorción” para referirse a esta asociación con la materia orgánica edáfica, dado que en muchos casos se comprueba que no sólo hay una unión superficial sino que la sustancia contaminante se mezcla con la MOS, pudiendo describirse matemáticamente mejor con un modelo de disolución que con uno de adsorción. Para modelizar el grado de hidrofobicidad de una sustancia suele emplearse el coeficiente de reparto octanol-agua Prof. Rafael Mulas Fernández 3 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN (KOW)2 y a partir de este se deducen otros parámetros relativos a la solubilidad en agua y a la distribución entre la fase acuosa y la MOS. Volatilidad. La presión de vapor de muchas sustancias orgánicas es apreciable, sobre todo las de bajo peso molecular. Por ello, en la evolución natural de una mezcla de contaminantes orgánicos interviene la pérdida por volatilización de las fracciones más ligeras. También la volatilidad viene dada por la estructura molecular, siendo mayor para moléculas de bajo PM y para aquellas que presentan menos grupos funcionales polares, y que aumenta notablemente con la temperatura. También hay que recordar que los líquidos confinados en pequeños recintos, como los poros del suelo, presentan una presión de vapor menor que el líquido libre. Efectivamente, en un capilar, como los mencionados poros, la superficie del líquido forma un menisco por efecto de la tensión superficial, que conlleva una diferencia de presiones a ambos lados de la superficie, lo que se traduce en un descenso de presión de vapor. Biodegradabilidad. Aunque, como veremos, la biodegradación será más o menos fácil y rápida según qué microorganismos se hallen presentes y de una serie de factores (temperatura, pH, concentración de nutrientes, etc.) y, por tanto, la biodegradabilidad no sólo depende de la sustancia, sí que algunas características de composición y estructura molecular facilitan un mayor grado de degradabilidad. En principio, serán más biodegradables las sustancias con moléculas que: → sean de menor peso molecular (o tamaño de molécula) → tengan cadenas poco ramificadas (las ramificaciones ocasionan impedimentos estéricos) → sean poco insaturadas (pocos enlaces múltiples) → incluyan pocos anillos aromáticos. A pesar de lo mencionado en relación con el peso molecular, se comprueba que los hidrocarburos de menos de 9-10 C son poco degradables, en parte por su mayor volatilidad que les hace escapar del medio, en parte por resultar tóxicos para bastantes microorganismos. El número óptimo de átomos de C para la biodegradación se puede considerar que está entre 10 y 20. Además, favorecen la biodegradabilidad grupos funcionales como: alcohol, amino, carbonilo o carboxilo, mientras que disminuyen la biodegradabilidad grupos funcionales como: halógenos, ácido sulfónico (que aporta mayor resistencia que los halógenos), éter, nitro o nitrilo, así como los C cuaternarios y los N trisustituidos. La degradación de compuestos con N o S habitualmente está ligada a su utilización como fuente de dichos nutrientes. La experiencia muestra que, aunque es frecuente hablar de sustancias persistentes, refractarias o recalcitrantes, la gran mayoría de las sustancias orgánicas pueden ser biodegradadas por algunos microorganismos, en condiciones adecuadas y plazos de tiempo suficientes. Polímeros de larga cadena que no pueden entrar en la célula sólo se degradarán si existen enzimas exocelulares apropiados. Polietileno o cloruro de polivinilo son ejemplos en los que no existen esos enzimas y son compuestos típicamente no degradables. La experiencia indica que la degradación en condiciones naturales difiere notablemente de la que se produce en laboratorio en condiciones optimizadas y controladas. Esto ha ocasionado fracasos en práctica de la biorremediación. Existen demasiados factores ambientales con influencia sobre el grado de degradabilidad como para asegurar que sea posible pronosticar con detalle el nivel de eficacia del proceso de biodegradación. Hay que recordar, además, que los suelos son medios de gran heterogeneidad, de forma que las condiciones ambientales pueden variar en muy pequeñas distancias. Dicho todo esto, hay que recomendar vivamente la realización de ensayos de tratabilidad previos a la implementación de una técnica de biorremediación, sobre todo con suelos, 2 También denominado “constante octanol-agua” o “coeficiente de partición octanol-agua”, transcribiendo incorrectamente del inglés “partition coefficient”. Prof. Rafael Mulas Fernández 4 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN ambientes y/o contaminaciones que tengan alguna particularidad. Lo que es importante es que los ensayos de tratabilidad se extiendan a escala piloto, en las condiciones lo más similares a las que se aplicarían en el tratamiento. Eso permite detectar influencias no contempladas a escala de laboratorio: efecto de las oscilaciones térmicas (diurnas y estacionales), de los vientos, de la insolación, posibles excesos de humectación por las precipitaciones, estrés hídrico, etc. Concentración de contaminantes. Es habitual que la tasa de biodegradación sea condicionada por la concentración de contaminante en el medio. En unos casos, la elevada concentración de contaminante genera efectos tóxicos o de inhibición; p. ej. se suele considerar que en el caso de hidrocarburos una concentración en suelo por encima del 10-15% disminuirá la actividad biológica. En otros casos, existe un límite inferior de concentración por debajo del que no se produce la biodegradación de forma apreciable; parece ser que a bajas concentraciones no se activa la expresión de los enzimas necesarios para la degradación, ya que no le resultará rentable energéticamente a la célula, frente a otras fuentes alternativas de energía y/o C. De la concentración de contaminante también depende su velocidad de degradación. Las sustancias solubles en agua tienen, generalmente, cinéticas de degradación tipo Michaelis-Menten, con lo que la velocidad de degradación resulta proporcional a su concentración para rango de concentraciones bajas (cuando se puede aproximar a una cinética de primer orden). De todas formas, la aproximación a primer orden es sólo una de las posibles y hay que ser cuidadosos a la hora de modelizar el consumo de contaminante por los microorganismos y elegir una ecuación que se adapte a las condiciones del caso y no la más habitual o la más sencilla. Otros factores. Por ejemplo, la viscosidad que influye en el grado de infiltración de mezclas líquidas como el petróleo o sus derivados. El tiempo transcurrido desde la contaminación también puede influir: se ha comprobado en casos de vertidos antiguos de petróleo o derivados una baja velocidad de degradación atribuida a una disminución de la biodisponibilidad con el tiempo, por un efecto de envejecimiento. Este puede ser atribuible, aparte de la pérdida de toda la fracción volátil o semivolátil, a difusión lenta en microporos y adsorción en sus paredes, a la formación de películas semirrígidas en la superficie de las fases no acuosas y/o reacciones químicas de oxidación que van integrando el contaminante con la materia húmica. 2.2. Relativos a los microorganismos Los organismos descomponedores, los que en la naturaleza van degradando los materiales orgánicos, son bacterias y hongos, principalmente. Las bacterias son organismos procariotas, de menor tamaño que los eucariotas (como los hongos), por lo que tienen mayor superficie de contacto con el medio, lo que las hace más fáciles de desarrollar en medios pobres en nutrientes ya que ofrece mayor contacto con los sustratos, pero también más sensibles a las variaciones del medio y a los tóxicos presentes. Igualmente, las bacterias son más rápidas en detectar una nueva sustancia que puede resultar nutritiva porque esa capacidad reside en sus membranas y no ha de procesarse información en el interior de la célula, cual es el caso de los eucariotas. La mayor parte de los suelos contienen gran número de microorganismos naturales o indígenas: típicamente entre 107 y 109 células por gramo de suelo. Aunque sólo una parte de ellos tenga capacidad de degradar los contaminantes, esos valores suponen millones de microorganismos activos en cada gramo de suelo. Existen gran cantidad de microorganismos que pueden emplear contaminantes orgánicos en su metabolismo como fuente de energía y/o carbono. No obstante, no son todos y la presencia en los distintos ecosistemas de los que sí son capaces es muy variable: en los suelos puede haber entre Prof. Rafael Mulas Fernández 5 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN un 0,1 y un 50 % de las bacterias con la capacidad de degradar hidrocarburos y entre un 6 y un 80 % de los hongos. La capacidad para degradar una determinada sustancia depende de los biocatalizadores (enzimas) de que disponga el microorganismo. Recordemos que toda la capacidad enzimática potencial de una célula se encuentra codificada en su DNA, pero sólo está activa la parte que ha activado el entorno. Habitualmente, un microorganismo es capaz de metabolizar un contaminante o un pequeño grupo de ellos. Para la degradación completa en caso de mezclas complejas (como muchos casos de contaminación por hidrocarburos), resulta necesaria la participación de diversos tipos de microorganismos, lo que se suele denominar “consorcio”, para entre todos disponer de enzimas útiles para la degradación. Para elegir un sistema de biorremediación y conducirlo exitosamente conviene estudiar diferentes aspectos microbiológicos de las poblaciones implicadas: → su bioquímica, para ver si las rutas metabólicas pueden mejorarse; → las características fisiológicas; → la ecología de las especies, para determinar las condiciones óptimas; → su genética; → sus asociaciones o consorcios. Contacto microorganismo-sustrato. El contacto es necesario para que se produzca la degradación. En función de diferentes factores, el contacto puede generar el paso a través de la membrana de las moléculas del sustrato (ver a continuación) o bien, en el caso de sustancias que por su tamaño u otras características no puedan entrar en la célula, la liberación de enzimas exocelulares que degradarán en mayor o menor medida el sustrato, generando metabolitos intermedios que sí puedan penetrar en el organismo. Paso a través de la membrana. Las paredes celulares son rígidas con una membrana lipídica y las sustancias han de estar en disolución para que sea posible su entrada a la célula (“las bacterias no tienen boca”3). Las moléculas de grandes dimensiones han de ser degradadas, al menos parcialmente, por la acción de enzimas exocelulares para poder penetrar al interior y ser asimiladas. Aquellas moléculas que permanezcan sin solubilizarse serán altamente persistentes. La membrana es hidrófoba, con lo que resulta bastante poco permeable a compuestos polares. Existen dos mecanismos generales de paso de sustancias por la membrana: → Difusión simple o transporte pasivo: moléculas no polares y de tamaño relativamente pequeño podrán atravesar la membrana a favor del gradiente de concentración hasta alcanzar un equilibrio entre las concentraciones externa e interna. → Transporte facilitado o activo: las moléculas pasan la membrana en un proceso mediado por portadores, que son proteínas especializadas. Existe transporte sin consumo energético, que como mucho puede igualar las concentraciones de los dos lados de la membrana, y transporte con consumo de energía, que puede introducir moléculas contra el gradiente de concentración, es decir, concentrar la sustancia en el interior. Este caso, dada la especificidad de los portadores, presenta una cinética análoga a las cinéticas enzimáticas, con una velocidad máxima de transporte, lo que puede condicionar la cinética global de la degradación. Rutas metabólicas. El metabolismo consiste en series complejas de reacciones bioquímicas acopladas que llevan por un lado a la síntesis de biomasa o nuevo material celular (anabolismo) y por otro a la mineralización (conversión en CO2 y agua) del sustrato, con producción de la energía (ATP) y el poder reductor (NAPDH) que son necesarios para la síntesis mencionada (catabolismo). 3 Aunque se trabaja en conseguir por ingeniería genética bacterias con capacidad de invaginación de membrana análoga a la de algunos protozoos. Prof. Rafael Mulas Fernández 6 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Por tanto, una parte del sustrato se mineraliza y otra se biotransforma (lo que a veces incluye la transformación en materias húmicas persistentes en el tiempo). En ocasiones se han propuesto coeficientes de rendimiento (biomasa celular producida por unidad de masa de sustrato consumido) de hasta 0,5 (para bacterias aerobias), pero en realidad el rendimiento depende del sustrato, de qué microorganismos participen y de las condiciones ambientales. Frecuentemente es menor de 0,1 y, además, interesa que la mineralización sea máxima una vez que se alcanza un nivel de biomasa celular suficiente para el proceso de biorremediación. No siempre el catabolismo produce la mineralización, sino que se detiene la degradación en algún metabolito intermedio. Es posible que estos metabolitos, que se acumularán en el medio si no hay otro organismo con la capacidad de degradarlos, resulten tóxicos o nocivos, incluso más que el contaminante original, por lo que será necesario evaluar este aspecto. Las rutas metabólicas son diferentes según las estructuras químicas de los sustratos y según los enzimas de que disponga cada célula. Crecimiento de la población microbiana. Dado que, en principio, la velocidad de la descontaminación es función del número de microorganismos, aunque es algo a matizar, es necesario estudiar el crecimiento de las poblaciones. Los microorganismos se reproducen asexualmente en cuanto existen condiciones adecuadas. El tiempo necesario para la duplicación (que una célula dé lugar a dos) es muy variable: desde minutos (15 o 20 en condiciones óptimas) a semanas. Se suelen considerar cuatro fases en el crecimiento: una fase de latencia, de duración variable según lo extraño que resulte el medio para los microorganismos; una fase de crecimiento exponencial; otra fase estacionaria, en la que los factores limitantes han estabilizado el crecimiento y, finalmente, una fase de senescencia, en la que los factores limitantes son más fuertes que la propia capacidad de crecimiento y hacen que la población disminuya. Los factores limitantes pueden ser abióticos (pH, temperatura, humedad… y se ven en otro apartado) y bióticos. Entre estos podemos mencionar la predación por otras especies o la competencia: p. ej., al percibir una abundancia de organismos algunos liberan toxinas. La fase de latencia es el tiempo necesario para que cada célula sintetice los enzimas capaces de degradar el sustrato con el que se encuentra, para lo que antes ha de buscar en su base de datos genética el gen necesario. Efectivamente, un conjunto de enzimas están siempre presentes en la célula para su funcionamiento elemental, pero otros sólo se sintetizan en presencia del respectivo sustrato. No es extraño que un mismo organismo pueda utilizar varios sustratos, pero lo habitual es que no los emplee a la vez, sino de forma secuencial, empezando por los más rentables energéticamente hablando y acabando por los menos. Cambios genéticos. Como capacidad adaptativa a las condiciones del entorno, además de poder producir enzimas específicos en función de los sustratos presentes, existe la posibilidad de que se produzcan cambios genéticos que proporcionen a la célula alguna capacidad metabólica nueva. Estos cambios se pueden producir por transmisión de información genética entre células, para lo que existen varios mecanismos, pero el más efectivo es el de la conjugación. En el caso de las bacterias, el material genético que se trasmite es el que reside en los plásmidos. Una de las ventajas de inocular poblaciones microbianas alóctonas, pero adaptadas a los contaminantes a tratar, consiste en que, en ocasiones, ocurre la transmisión de la capacidad de degradar esos contaminantes a la población autóctona, por otro lado más adaptada al resto de condiciones ambientales. Según algunos autores, la transferencia de plásmidos entre especies es muy frecuente en condiciones naturales. Prof. Rafael Mulas Fernández 7 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Grupos de microorganismos. Los organismos que más pueden contribuir a la degradación de contaminantes orgánicos son los quimioheterótrofos: los que emplean estos compuestos orgánicos como fuente de energía y como fuente de carbono. Aunque las bacterias son los microorganismos responsables de la mayor parte de la degradación en el caso de aguas, en cuanto a los suelos, tanto hongos como bacterias tienen un papel similar, al menos en cuanto a la degradación de hidrocarburos. Los hongos son especialistas en descomponer materia vegetal y muchos hidrocarburos tienen un cierto parecido estructural con componentes de la materia orgánica de origen vegetal. Por ello su contribución a la descontaminación es preponderante en algunos casos. Los hongos tienen además la propiedad de trabajar de forma extensa: desarrollan hifas de longitud variable que les permiten aprovechar el sustrato en un punto mientras que toman agua en otro separado. Como ya se ha mencionado, lo habitual es la cooperación de un número amplio de especies asociadas en lo que se denomina un consorcio. En ocasiones, incluso se establece relación física entre los componentes del consorcio para facilitar la cooperación metabólica. Hay que señalar que la capacidad degradativa de un consorcio resulta superior a lo que sería previsible a partir de los perfiles enzimáticos individuales de sus componentes. A ello contribuyen diversos factores: unos organismos pueden suministrar factores de crecimiento específicos a otros, pueden consumir productos que les resulten tóxicos a los otros, puede darse cometabolismo, etc. En cualquier caso, en el ecosistema de forma natural proliferarán los organismos que mejor puedan obtener nutrientes y energía y desplazarán a las especies menos adaptadas a las condiciones del emplazamiento contaminado. Cometabolismo y sintrofia. Son interesantes ejemplos de cooperación microbiana. Se dice que existe cometabolismo4 cuando se produce la transformación metabólica innecesaria de una sustancia que un organismo no utiliza ni como fuente de energía ni de carbono. Normalmente, enzimas que degradan un sustrato primario transforman además otro sustrato secundario del que los microorganismos no obtienen provecho. Es decir, los enzimas que inician la ruta metabólica son enzimas de baja especificidad, pero los que la continúan son de mayor especificidad y no reconocen a los metabolitos que habrían de ser sus sustratos. En remediación tienen interés cuando un contaminante resulta ser sustrato secundario. Conviene llamar la atención sobre el hecho de que en la bibliografía relativa a biorremediación se emplea el término cometabolismo con significados diferentes, en parte porque es de hecho un proceso o conjunto de procesos complejo y que todavía ha de ser investigado para su comprensión y manejo. Hay casos en que el sustrato secundario sólo se degrada si existe el primario en el medio y otros casos en los que se degrada el sustrato secundario aunque no exista el primario y, por tanto, los microorganismos no obtengan beneficio de esta actividad metabólica. Unas veces, otros microorganismos sí pueden aprovechar los productos de la degradación como sustratos, pero en otras ocasiones el metabolito se acumula por no existir quien lo aproveche. Se denomina sintrofia la actividad concertada de diferentes microorganismos sobre un mismo sustrato, de forma que combinando sus actividades metabólicas consiguen la degradación. Esta acción concertada puede implicar el intercambio o puesta en común de requerimientos nutritivos, de factores de crecimiento o de enzimas relacionados con la utilización de sustratos. Un requisito para esta cooperación es la proximidad física de las distintas especies participantes. 4 A veces se escribe co-metabolismo. Prof. Rafael Mulas Fernández 8 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 2.3. Relativos al medio Aunque la degradabilidad de los contaminantes fuera suficiente y existiesen organismos con las capacidades apropiadas para la biodegradación, resulta indispensable siempre la existencia de condiciones ambientales apropiadas para la actividad microbiana. Vamos a contemplar aquí, tanto lo que se puede considerar que son características fisicoquímicas del medio, como lo que serán condiciones ambientales (temperatura, pH, humedad, etc.). Ambos tipos de factores influyen tanto sobre el estado y distribución de los contaminantes como sobre los microorganismos, modificando, por tanto, la interacción entre ambos. Cabe afirmar que cada emplazamiento contaminado supone un problema diferente que ha de ser resuelto específicamente. Composición y propiedades del suelo. Tanto la composición química (contenidos de materia orgánica, silicatos, óxidos, etc.), como la granulometría (textura) de la fracción mineral y la estructura del suelo, condicionan muchas propiedades con influencia en el proceso de biorremediación: la permeabilidad, que facilita o dificulta el establecimiento de gradientes y el transporte de agua y sustancias, la capacidad de retención de agua, las cinéticas y el equilibrio de sorción de los contaminantes, etc. Características hidrogeológicas. Profundidades de la zona no saturada y de la saturada, sentido y velocidad de flujo del agua subterránea, porosidad y permeabilidad de suelo y subsuelo, proporción entre infiltración y escorrentía superficial, etc. Temperatura. Con el aumento de temperatura se incrementa la tasa metabólica (se multiplica por un factor de 2-3 por cada incremento de 10ºC) hasta un máximo que dependerá del tipo de organismo. Existen microorganismos adaptados a diferentes rangos térmicos: psicrófilos, mesófilos y termófilos. Los más frecuentes son los mesófilos para los que va decreciendo la tasa metabólica por encima de una temperatura próxima a los 40ºC. Para ellos, las temperaturas óptimas se hallarían en torno a los 30ºC. Pero si las temperaturas son claramente inferiores o superiores, este factor modifica la composición de la comunidad microbiana predominando alguno de los otros tipos. Habrá que considerar este aspecto en relación con los datos climáticos del emplazamiento y su estacionalidad, así como de las oscilaciones diurnas que se puedan producir. Se ha desarrollado biorremediación con éxito en muchos climas, desde Alaska al Sahara, lo que indica que las poblaciones microbianas se adecuan a las condiciones ambientales que se dan en cada caso. La temperatura también influye en los contaminantes: su incremento aumenta su solubilidad en agua, lo que facilita la biodegradación, pero también la de los que resultan tóxicos, lo que afecta negativamente a los microorganismos. Al aumentar la temperatura, aumenta la volatilidad de los contaminantes, lo que elimina parte de los mismos, y disminuye su viscosidad. pH. Los suelos presentan una variabilidad mayor de pH que los sistemas acuáticos (2,5 a 11). En general, lo ideal para la mayoría de organismos es casi la neutralidad, algo por encima de 7. Es bastante bueno el intervalo de 6,5 a 8 u 8,5. Fuera de este intervalo se pueden desnaturalizar proteínas. Los hongos están mejor adaptados a un entorno algo más ácido que las bacterias. Además, el pH puede afectar a la forma química de algunos contaminantes con propiedades ácidobase y, muy principalmente, afecta a la disponibilidad de los nutrientes: buena parte de ellos resultan más disponibles para los organismos en medio ácido. Modificar el pH del suelo no siempre es fácil, ya que muchos suelos presentan una notable capacidad tampón. No obstante, añadir enmiendas y acondicionadores de pH, aunque los cambios en el pH no sean drásticos, suele provocar mejoras apreciables en el proceso de biorremediación. Prof. Rafael Mulas Fernández 9 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Humedad. Todos los organismos necesitan agua. Se discute bastante en la bibliografía cuál es la cantidad de agua necesaria. Se comprueba que ocurre biorremediación en un amplio margen de niveles de humectación. La humedad óptima en un suelo depende fundamentalmente del tipo de suelo y puede ser estimada usando como criterio una proporción respecto a la capacidad de campo: se suele estimar que correspondiente al 50-70 % de la capacidad de campo, aunque no existe unanimidad entre los autores. En parte, porque al hablar de agua en el suelo, más que la cantidad de agua total interesa la cantidad de agua disponible. Por ello se analizan en ocasiones el potencial hídrico o la actividad del agua, dos formas de conocer en qué grado el agua esta libre o retenida por las superficies (orgánicas o minerales) y/o los solutos5. El exceso de humedad también supone inconveniente, ya que el contenido líquido desplaza el aire de los poros y enseguida limita la disponibilidad de oxígeno, creando condiciones anóxicas. El aporte de agua (riego) se aprovecha con frecuencia para incorporar otras sustancias (nutrientes, acondicionadores de pH, sustancias oxigenantes, microorganismos adicionales, etc. [ver el apartado 3.3 Bioestimulación]). Nutrientes. Además de carbono, hidrógeno y oxígeno (que constituyen casi el 80% de la materia seca celular) son necesarios otros nutrientes: N y P los principales, pero también K, Ca, S, Mg y oligoelementos. Estos nutrientes habrán de existir en el medio si se quiere desarrollar una población microbiana para la remediación, pero, además, habrán de encontrarse en proporción adecuada. En caso contrario, alguno de ellos actuará como limitante, impidiendo un mayor crecimiento de la masa microbiana. Al ocurrir contaminación por sustancias orgánicas se incrementa de forma notable la cantidad de C en el medio. Habitualmente, este incremento no se acompaña de otro paralelo en N y P, con lo que el desequilibrio nutricional limita el desarrollo microbiano. De ahí la idea de estimular el desarrollo microbiano por adición de nutrientes. Las cantidades de N y P necesarios para estimular la biodegradación son menores que los requerimientos teóricos debido a que no todo el C del contaminante es incorporado a la biomasa, sino que una fracción notable se transforma en CO2. Se han propuesto muchas relaciones idóneas entre los principales nutrientes (C:N:P)6: 100:15:1, 100:10:1, 100:20:1, 120:10:1, 100:5:1, 100:10:0,1, 20:5:1, etc. Podemos comprobar que existe mayor acuerdo en la proporción C/P que en las de ambos con el N7. Es cierto que estas relaciones varían algo entre sistemas terrestres y acuáticos y según la predominancia de bacterias y hongos sea diferente. Por ello el enfoque que proponen algunos autores es efectuar el análisis químico de la población de microorganismos del emplazamiento y así conocer el equilibrio nutricional adecuado a ese medio. En todo caso, interesa que la relación entre los nutrientes sea mantenida a partir de controles periódicos. Oxidantes: Los contaminantes orgánicos que se van a degradar se emplean, en buena medida, como fuente de energía metabólica en reacciones redox en las que se actúan como reductores (dadores de electrones). La mayor parte de los procesos metabólicos que dan lugar a la degradación de dichos contaminantes son aerobios, es decir, emplean el O2 como aceptor de electrones (oxidante) en las reacciones de obtención de energía. La disponibilidad de O2 en los suelos viene limitada por el espacio poroso del suelo, por el contenido de agua y por su consumo (en la degradación y en otros procesos, por los microorganismos y por otros seres vivos). 5 Recordemos que una elevada concentración de sales puede provocar la deshidratación por efecto osmótico aunque la cantidad de agua sea notable. 6 Relaciones entre las masas de los distintos elementos. En ocasiones se citan relaciones en número de átomos (o molares), necesariamente diferentes a estas. 7 Hay que tener cuidado al buscar datos en la bibliografía ya que unas veces se da la relación de nutrientes ideal a alcanzar y otras la que se ha adicionado en la práctica. Prof. Rafael Mulas Fernández 10 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Las necesidades de O2 son notables: se determina estequiométricamente que para la oxidación de hidrocarburos a CO2 y agua son necesarios unos 3,3 g de oxígeno por g de hidrocarburo. Cuando no hay suficiente O2 pueden emplearse otros aceptores de electrones exógenos y desarrollarse procesos anaerobios de degradación. Existen evidencias de que pueden degradarse por vía anaerobia hidrocarburos diversos (saturados y no saturados y aromáticos, como los BTEX). Las vías anaerobias de degradación suelen ser las principales para los compuestos fuertemente halogenados. En caso de respiración anaerobia, los principales oxidantes que participan en los procesos son SO42-, NO3- y Fe3+. También existe la posibilidad de que se produzca fermentación: transformación del sustrato sin aceptor de electrones inorgánico exógeno, empleando el propio sustrato del que una parte de los C se oxidan y otra se reducen8. En cualquier caso, los procesos aerobios son mucho más rentables energéticamente, por lo que son los elegidos si existe suficiente O2. Los procesos anaerobios, para obtener la misma cantidad de energía requieren mucho mayor consumo de sustrato. Por ello, desde el punto de vista de algunos autores, serían los más recomendables en procesos de degradación, en los que interesa el máximo consumo de sustrato. Es frecuente que el oxígeno resulte ser un factor limitante en procesos de biorremediación de suelos: frente a las necesidades antes mencionadas, las concentraciones máximas en aguas son del orden de los 10 mg/L. Se comenta más adelante que la lenta velocidad de transferencia de oxígeno al agua (de donde lo toman los microorganismos) es uno de los tres principales limitantes de la velocidad de la biodegradación. Para asegurar las condiciones aerobias no habrá que bajar de los 2 mg/L. Por esta razón, los suelos arcillosos no son adecuados para una biorremediación in situ, dada la dificultad de aireación que presentan en sus finos poros. También presentan dificultad de aireación los suelos compactados. La adición de enmiendas como paja, compost, etc. mejora la estructura e incrementa el volumen de poros en el suelo, facilitando la aireación. Estas adiciones son factibles, tanto en procesos in situ como en algunos ex situ. Otros factores: Se pueden mencionar la salinidad (natural en el medio o como consecuencia de la contaminación), la presión (caso de trabajar a gran profundidad de columna de agua) o la presencia de sustancias diversas. En todos los casos, es preferible potenciar las capacidades de degradación de los microorganismos preexistentes, adaptados a dichas condiciones. Respecto a la existencia de tóxicos e inhibidores metabólicos hay que señalar que disminuirán el desarrollo microbiano y la degradación, haciendo inviable, en ocasiones, la biorremediación. 2.4. Relativos al acceso de los microorganismos al contaminante Ya se ha mencionado y resulta obvio que el contaminante ha de estar disponible para los microorganismos para que sea biodegradado. En principio los sustratos que están mas disponibles son los disueltos en la fase acuosa, pero también se considera que son accesibles los contaminantes dispersos o emulsionados en el agua. Para incrementar la dispersión de sustancias adsorbidas/sorbidas sobre las partículas sólidas del suelo o en forma de fase libre (NAPL), en los suelos y aguas subterráneas no contamos con la acción mecánica de agitación por el viento, las corrientes y las olas que ocurre en el mar y otras masas de agua. Para ese fin sólo se puede contar con la acción de surfactantes, bien de origen 8 Por eso la fermentación no puede tener lugar sobre compuestos muy reducidos, como son los hidrocarburos. Prof. Rafael Mulas Fernández 11 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN natural o bien añadidos. Fundamentalmente se ha estudiado su efecto en los casos de contaminación por hidrocarburos (petróleo, gasolinas, fueles…). Se ha establecido para el caso de hidrocarburos que la velocidad de proceso de biorremediación viene regulada por las velocidades de estos tres subprocesos: • el de biodegradación propiamente dicho: es en realidad el menos determinante; • el de transferencia de O2 al agua, proceso que en los suelos puede ser bastante lento; • el de disolución/dispersión en la fase acuosa de los hidrocarburos. Parece pues de gran interés poder incrementar la velocidad de este último proceso. Los biosurfactantes son sustancias de origen natural (segregadas por microorganismos y también por plantas u otros seres vivos) y propiedades tensioactivas, es decir, que alteran las condiciones de las interfases disminuyendo la tensión superficial. Tienen la característica de facilitar la emulsión de líquidos no miscibles y por ello se llaman también bioemulsionantes. Como es sabido, estas propiedades son debidas a una estructura mixta en su molécula, con grupos polares hidrófilos y grupos apolares hidrófobos. Los microorganismos presentan la capacidad de segregar este tipo de compuestos (asociados a su membrana o de forma extracelular) puesto que su hábitat típico, en muchos casos, son las interfases. A la diversidad de organismos productores de biosurfactantes se corresponde una amplia diversidad de tipos de sustancias: rhamnolípidos y otros glicolípidos, trehalolípidos, lipopéptidos, lípidos polihidroxílicos, lipopolisacáridos, etc., lo que conlleva diferencias en cuanto a su capacidad tensioactiva y emulsionante. La producción de biosurfactantes parece que hay que contemplarla a nivel de población y no de célula individual: su producción se da en poblaciones que han llegado a un estado estacionario de crecimiento, siendo inducida por mecanismos de percepción de quorum y comprobándose que habrá mayor producción de biosurfactante cuanto mayor sea la densidad poblacional. Según parece, la actuación de estos biosurfactantes no sería a nivel macroscópico, sino a nivel local: entre el contaminante y la membrana. Las utilidades de estas sustancias para los microorganismos productores pueden ser varias: se piensa que les ayudan a desprenderse de las gotas de líquido contaminante una vez agotado el componente que utilizan9, para así ir en busca de nuevas fuentes de carbono; también se cree que el biosurfactante deja una “cápsula” alrededor de la gota que la señala como usada, favoreciendo así a toda la población. También se han empleado surfactantes sintéticos, incluso simples detergentes, al objeto de provocar la separación de los contaminantes orgánicos de las partículas del suelo, pero los biosurfactantes presentas ventajas sobre ellos (aunque no todos en igual extensión): • menor toxicidad (mayor biocompatibilidad) • mayor biodegradabilidad (por lo que persisten menos tiempo en el medio) • mejor selectividad • buena capacidad espumante • eficacia, incluso a baja concentración • actividad sostenida en amplio abanico de condiciones (pH, temperatura, salinidad…). Respecto a los surfactantes sintéticos hay que indicar que en muchas ocasiones presentan acción bactericida por su acción sobre las membranas. A esto hay que añadir que algunos son relativamente fáciles de producir industrialmente. Por ello se está desarrollando la biotecnología necesaria para su uso en otros campos, como el alimentario, y la biorremediación podría aprovecharse de ello. 9 Recordemos que, en el caso de mezclas, aunque muchos microorganismos presentan capacidad metabólica múltiple, frecuentemente un microorganismo sólo puede utilizar en cada momento una sustancia o poco más. Prof. Rafael Mulas Fernández 12 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 3. Estrategias de biorrecuperación Los procesos que tienen lugar durante la biorremediación ocurren naturalmente sin que intervención tecnológica alguna: es lo que se denomina biorremediación pasiva, intrínseca o atenuación natural. Pero cuando se aborda un proyecto de biorrecuperación interesa alcanzar los objetivos de limpieza (más o menos exigentes) en plazos lo más breves que sea posible. Para ello se interviene aplicando soluciones tecnológicas diversas para activar el proceso: biorremediación activa. En lo que sigue, se desarrolla la biorremediación activa en dos grandes estrategias, no excluyentes, sino más bien complementarias: bioaumento y bioestimulación. 3.1. Atenuación natural Todos los ecosistemas presentan un cierto grado de resiliencia: la capacidad para retornar a las condiciones previas a una perturbación. Es decir, es la capacidad de los ecosistemas de absorber perturbaciones sin alterar significativamente sus características de estructura y funcionalidad, es decir, pudiendo regresar a un estado similar al original una vez que la perturbación ha terminado. Los suelos, como ecosistemas, también presentan, en mayor o menor grado, esta capacidad y ante la perturbación que supone una contaminación reaccionan en el sentido de recuperar un estado parecido al original. Esta reacción espontánea implica una variedad de procesos naturales, físicos, químicos y biológicos, que bajo condiciones favorables y actuando sin intervención humana, van eliminando y/o transformando los contaminantes. Estos procesos incluyen dispersión, dilución, sorción, volatilización y la destrucción, estabilización o transformación química o biológica de contaminantes. Con ello se consigue reducir la masa, la toxicidad, la movilidad, el volumen y/o la concentración de los contaminantes en el suelo o el agua subterránea. De hecho, se ha venido confiando en esta capacidad, directa o indirectamente, al utilizar tecnologías de confinamiento o aislamiento: por un lado impiden la migración de los contaminantes y por otro dejan tiempo a que estos procesos puedan ir actuando. Tras la contaminación, la naturaleza puede trabajar a través de cuatro vías principales en el proceso de recuperación: 1. Las sustancias contaminantes pueden adherirse o sorberse sobre la matriz sólida del suelo. Esto no limpia, pero puede impedir que los contaminantes alcancen el agua subterránea. 2. Algunos contaminantes pueden evaporarse. Estos gases se escapan al aire dejando el suelo. Al alcanzar la superficie, la luz del sol puede provocar su fotodegradación. 3. Según la contaminación se mueve a través de suelo y del agua subterránea, puede mezclarse con ésta, lo que reduce la contaminación por dilución. 4. Los organismos utilizan algunas sustancias químicas contaminantes como alimento, lo que las transforma en materiales inocuos, en general. Esta evolución natural y espontánea del suelo (y agua subterránea) se denomina de varias formas: biorremediación pasiva, intrínseca o natural, reducción natural o atenuación natural. La atenuación natural ocurre en la mayoría de sitios contaminados y con la mayoría de los contaminantes. No obstante, deben existir condiciones apropiadas para que los sitios se vayan depurando. Si no se dan dichas condiciones, esta “autolimpieza” no avanzará a suficiente velocidad ni alcanzará unos niveles de concentración que supongan riesgo aceptable. Prof. Rafael Mulas Fernández 13 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Este proceso se incluye dentro de los de biorremediación porque la principal contribución a la recuperación es la degradación por la actividad de los microorganismos autóctonos, en general, por el concurso de poblaciones microbianas mixtas, que operan bajo complejas regulaciones simbióticas. La velocidad de la transformación de moléculas complejas en moléculas sencillas está en función de la masa microbiana activa. Ya se ha mencionado varias veces en este apartado la velocidad o el factor tiempo. Esta es la principal limitación: los procesos de atenuación natural son excesivamente lentos para lo que la mayoría de ocasiones interesa. Hablamos de años y, más bien, decenios. Sólo en los casos en que el terreno no va a tener uso y por su ubicación u otras circunstancias puede restringirse el acceso de personas (lo cual evita todo riesgo para la salud humana), se puede emplear la atenuación natural como única alternativa de recuperación. Es más frecuente, utilizar la atenuación natural como una segunda etapa de recuperación, tras una primera fase en la que se aplica alguna otra tecnología y se elimina con ella la mayor parte de la contaminación. En general, funciona mejor en los casos en que es posible eliminar la fuente de contaminación (p. ej., residuos enterrados que pueden desenterrarse) y, por tanto, dejan de incorporarse contaminantes al terreno. No obstante lo dicho, es posible que la atenuación natural que dé los mismos resultados y con casi la misma rapidez que otros métodos, al menos, que otros métodos de biorremediación. Cuando pueda esperarse que la atenuación natural consiga los objetivos de recuperación en un tiempo razonable comparado con el de otros métodos más activos, podrá ser considerada una alternativa aceptable. Si las condiciones resultan ser óptimas para la acción de los microorganismos, esta estrategia sería la más apropiada, y no habría necesidad de acudir a ninguna de las estrategias mejoradas que veremos a continuación. Los procesos involucrados en la atenuación natural operan siempre en todos los suelos contaminados, aunque se aplique otro tipo de tecnologías de tratamiento, pero su contribución a la consecución de los objetivos de remediación varía en las diferentes situaciones. Mientras que en algunos casos la atenuación natural podría satisfacer del todo los objetivos de recuperación, en otros casos su contribución será escasa o nula. Por tanto, antes de escoger una alternativa de recuperación, es necesario evaluar cuidadosamente el emplazamiento contaminado para determinar qué grado de atenuación natural es esperable. En ocasiones se emplea la terminología de la EPA que la denomina atenuación natural monitorizada (MNA)10 o supervisada. El término monitorizada pone énfasis en la necesidad de control o supervisión por parte de los técnicos responsables para verificar periódicamente que la atenuación natural está funcionando. Como ventajas cabe citar que no es necesario excavar ni construir (sólo lo necesario para el aislamiento adecuado de la zona y la eliminación de la fuente, cuando es posible), no genera residuos que haya que eliminar a continuación como otros métodos, disminuye mucho el contacto de los trabajadores con la contaminación, afecta menos a la población y al medio ambiente, requiere menos equipamiento y trabajo que la mayoría de los otros métodos y, por tanto, resulta más económica. Es evidente que la supervisión y control durante años tiene un coste, pero en conjunto sigue siendo menor que el de otros métodos. No obstante, estas ventajas pueden ser compartidas con las estrategias de biorremediación mejorada que vamos a comentar y el incremento de coste que pueda suponer la aportación de nutrientes, oxígeno y otros acondicionadores puede ser compensado con creces por la disminución de plazos para alcanzar los objetivos de la remediación, y el consiguiente ahorro de años de control del emplazamiento. 10 Monitored Natural Attenuation. Ver, p. ej., en http://www.clu-in.org/techfocus/ . Prof. Rafael Mulas Fernández 14 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 3.2. Bioaumento El bioaumento (o bioaumentación11) consiste en la adición al medio (suelo, agua) al objeto de optimizar la biodegradación de microorganismos alóctonos vivos especializados, cuya eficiencia en la degradación del contaminante esté probada. Se incrementa la población nativa de microorganismos del sistema incorporando un inóculo de otros adaptados selectivamente, desarrollados para que tengan la capacidad para degradar los contaminantes en cuestión, compuestos previamente considerados como no o difícilmente biodegradables. Estos microorganismos pueden ser naturales o modificados genéticamente, aunque esta última opción no está libre de crítica y controversia. La inoculación adicional de cultivos específicos pretende colaborar con la actual biomasa o restituirla en casos de mortandad. El bioaumento no sustituye la población de organismos existentes, pero incrementa su habilidad de degradar compuestos o responder en ciertas situaciones, dando como resultado una mejora del tratamiento. Recordemos lo ya mencionado sobre la relativa facilidad de transferencia de plásmidos, incluso entre especies diferentes. Esta tecnología se utiliza cuando la microflora autóctona es insuficiente en número o capacidad degradadora o cuando se requiere el tratamiento inmediato de un sitio contaminado sin tiempo para esperar a que la población autóctona desarrolle una capacidad apropiada para degradar la contaminación. La bioaumentación modifica es el tiempo de aclimatación, es decir, el que tardan los microorganismos nativos a adaptarse al contaminante, que se reduce, haciendo que la biodegradación comience antes y se evite el riesgo tóxico hacia plantas, animales y humanos. El tamaño del inóculo a utilizar depende de la extensión de la zona a recuperar, de la dispersión de los contaminantes y de la velocidad de crecimiento de los microorganismos degradadores. Hay que reconocer que es un enfoque discutido. Por un lado, hay que recordar que la introducción de microorganismos (bacterias y hongos) específicos es una práctica agrícola que se realiza desde hace décadas con propósitos diversos: suministrar nutrientes, estimular el crecimiento de los vegetales, p. ej., mediante la producción de hormonas vegetales, controlar patógenos, mejorar la estructura del suelo, etc. Además, las características de los inóculos anunciadas por quienes los comercializan, parecen impresionantes: → → → → → → → Mezclas microbianas concentradas (200 millones/g) de más de 50 especies, aclimatadas específicamente de microbios de los que se encuentran naturalmente, no patógenos de rápida multiplicación: espontáneamente en minutos al ponerlos en condiciones adecuadas efectivos en amplios rangos de temperatura (50-100ºF) y de pH (4-10) capaces de degradar un amplio número de contaminantes dejando como subproductos únicamente CO2, agua y trazas de sales. Sin embargo, hay investigadores como Lee y Merlin (1999)12 o Van Hamme et al. (2003)13 que concluyen que ”varias investigaciones, de laboratorio y de campo, han indicado que la adición de cultivos microbianos comerciales no aumenta significativamente las velocidades de degradación de petróleo respecto a lo que se consigue por enriquecimiento con nutrientes de la población microbiana natural (bioestimulación)”. 11 En inglés, bioaugmentation. También se usa en alguna ocasión el término biomagnificación. Lee, K. & Merlin, F.X. (1999) Bioremediation of oil on shoreline environments: development of techniques and guidelines, Pure Appl. Chem. 71 (1) 161–171 13 Van Hamme, J. D., Singh, A. and Ward, O. P. (2003) Recent Advances in Petroleum Microbiology, Microbiology and Molecular Biology Reviews 67 (4) 503-549. 12 Prof. Rafael Mulas Fernández 15 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN Parece existir un cierto acuerdo en que esta estrategia tiene mayor aplicabilidad en procesos ex situ. Hay varias razones que avalan la dificultad de aplicarla in situ: • • • La dificultad o imposibilidad de incrementar la población microbiana con capacidad de degradar mediante inóculo externo cuando ésta ya ha crecido en respuesta a la contaminación. La mayor adaptación de la población autóctona a las condiciones ambientales que la lleva a competir con ventaja con la población inoculada. La existencia de depredadores, parásitos y competidores con respuestas tóxicas o de inhibición frente a la población extraña. Con frecuencia se indica que los inóculos microbianos funcionan mejor si se trata de organismos obtenidos en el ambiente en el que se van a aplicar. Para incrementar la eficiencia in situ del bioaumento se propone caracterizar fisicoquímica y biológicamente el emplazamiento de forma completa, al objeto de poder desarrollar un inóculo con las mayores garantías de éxito. Es decir, que los inóculos no se han de desarrollar con vocación universal. Se propone también una aclimatación al medio previa a la inoculación. Hace falta estudiar mejor qué densidad de microorganismos inoculados es conveniente. Una alternativa en estudio es la incorporación de los organismos encapsulados en algún soporte físico que los proteja de actividades microbianas hostiles. El diseño mediante ingeniería genética de microorganismos es, en opinión de algunos, una alternativa de futuro al permitir la incorporación al medio de capacidades de degradación superiores a las que pueden desarrollar los microorganismos naturalmente. La primera patente de un organismo modificado por ingeniería genética que se reconoció en el mundo14 era de una bacteria utilizable para biorremediación. Es decir, esta posibilidad se contempla desde el nacimiento mismo de la ingeniería genética. No obstante, parece recomendable restringir el uso de estos organismos modificados a aplicaciones ex situ por los riesgos asociados a su desarrollo y proliferación no controlados, con la posibilidad de transferir genes modificados a los organismos autóctonos y alterar el pool genético de la comunidad. Aplicaciones. Se ha usado bioaumento para tratar suelos contaminados con herbicidas (2,4-D, clorofam), insecticidas (lindano, clordano, paratión), clorofenoles (PCP) y nitrofenoles, PCBs, petróleo y derivados y HAPs. También se ha aplicado efectivamente para tratar desechos con concentraciones relativamente altas de metales. Limitaciones. Antes de llevar a cabo la bioaumentación en un sitio, deben realizarse cultivos de enriquecimiento, aislar microorganismos capaces de cometabolizar o utilizar el contaminante como fuente de carbono, y cultivarlos hasta obtener grandes cantidades de biomasa (Alexander, 1994) 3.3. Bioestimulación La bioestimulación responde a la idea de “aplicar biorremediación, pero creando condiciones”. Es decir, intentar que se alcancen las condiciones para que la biodegradación transcurra de forma idónea. Se denomina también biorremediación mejorada (enhanced bioremediation) o acelerada. La bioestimulación consiste en estimular a los microorganismos autóctonos de un ambiente natural por medio de la adición de nutrientes y otros aditivos, de humedad y la aireación del sistema para así mejorar la eliminación del los contaminantes. A veces se añade a esta definición la idea de que estos parámetros se deben, además, controlar para ir regulando su adición. Es de destacar que 14 Se trata de una patente concedida en EE.UU. a A. Chakrabarty (de la General Electric) en 1980 (aunque fue solicitada en 1972) por la creación de una bacteria del género Pseudomonas con capacidad de degradar hidrocarburos. Prof. Rafael Mulas Fernández 16 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN esta estrategia de descontaminación utiliza los agentes biológicos propios del suelo, en la idea de que los microorganismos indígenas, una vez adaptados y aclimatados, desarrollarán la capacidad de degradar los contaminantes, acelerando el proceso mediante los aportes mencionados. Vamos a repasar los principales aportes que se emplean en bioestimulación: Oxígeno. Se puede proporcionar inyectando aire al suelo de forma directa, o como peróxido de hidrógeno (líquido) o peróxido de manganeso (sólido) que lo proporcionan al descomponerse en el suelo. La ventaja del peróxido de hidrógeno es que puede incorporarse a las disoluciones nutritivas en los casos en que se usan (de forma continua o discontinua). Se puede aplicar en pozos, tuberías o difusores. En los procesos ex situ, se puede proceder además con aradas, volteos, etc., según la técnica de biorremediación empleada. Humedad. Ya se han comentado las necesidades de humedad. El aporte de agua se puede hacer mediante diversos sistemas de riego, de forma continua o discontinua, y siempre mejor si se va controlando el nivel de humedad. Nutrientes. Se pueden aportar de distintas formas: productos naturales con contenidos apropiados de nutrientes, residuos orgánicos, fertilizantes en gránulos o briquetas, abonos de liberación lenta, fertirrigación, etc. En algunos casos se han empleado fertilizantes específicamente diseñados para la biorremediación. Es conocido el Inipol EAP22, empleado en la biorremediación del petróleo vertido del Exxon Valdez en Alaska: se trata de un fertilizante oleofílico con capacidad de adherirse a la interfase hidrocarburo-agua e incluye, además de los nutrientes, un surfactante. Se han desarrollado otros mejorados, con mayor poder emulsionante y menor toxicidad del surfactante, que son de utilidad en los casos de contaminaciones costeras y similares, en que no son de aplicación fertilizantes solubles o de liberación lenta. Además, también puede incorporarse al suelo para estimular la biorremediación: → otros aceptores de electrones diferentes al O2, → ácidos o bases para ajuste del pH, → los ya citados surfactantes, → cometabolitos para activar ciertos enzimas, → etc. Limitaciones. Esta tecnología no es recomendable para suelos arcillosos, altamente estratificados o demasiado heterogéneos, ya que pueden provocar limitaciones en la transferencia de O2. Otros factores que pueden limitar su aplicación serían: que el tipo del suelo no favorezca el crecimiento microbiano, que se produzca incremento en la movilidad de los contaminantes, o que se puedan obstruir los pozos de inyección a causa del crecimiento microbiano. Prof. Rafael Mulas Fernández 17 / 18 TRATAMIENTO Y RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS FUNDAMENTOS DE BIORREMEDIACIÓN 4. Bibliografía Las principales fuentes consultadas parar la elaboración de este documento son las que se referencian a continuación. • • • • • • • • • • Callaba, A, Miguel, E. y Llamas, J. F. (eds.) 1998 Terceras Jornadas sobre Suelos Contaminados. Ministerio de Medio Ambiente, Madrid. Eweis, J. B., Ergas, S. J., Chang, D. P. Y. y Schroeder, E. D. 1999 Principios de biorrecuperación. Tratamientos para la descontaminación y regeneración de suelos y aguas subterráneas mediante procesos biológicos y físico-químicos. Ed. Mc GrawHill, Madrid. Instituto Geológico y Minero de España, 1995 Contaminación y depuración de suelos. IGME, Madrid. Lagrega, M. D., Buckingham, P. L. y Evans, J. C. 1996 Gestión de residuos tóxicos: Tratamiento, eliminación y recuperación de suelos. Ed. McGraw-Hill, Madrid. Marín, I., Sanz, J. L. y Amils, R. (Eds.) 2005 Biotecnología y Medio Ambiente. Ed. Ephemera, Madrid Milliarium.com. Técnicas de tratamiento de suelos contaminados. Disponible [html] en http://www.miliarium.com/Marcos/Prontuario.htm > Medio Ambiente Ortiz Bernad, I., Sanz García, J., Dorado Valiño, M. y Villar Fernández, S. 2007. Técnicas de recuperación de suelos contaminados. Col. Informes de vigilancia tecnológica nº 6. CITME, CEIM, Universidad de Alcalá, Comunidad de Madrid. Madrid. Disponible [pdf] en http://www.madrimasd.org/informacionidi/biblioteca/publicacion/Vigilanciatecnologica/default.asp U.S. E.P.A. Hazardous Waste Clean-Up Information (CLU-IN) Web Site. Disponible [html] en http://www.clu-in.org/ Van Deuren, J., Lloyd, T., Chhetry, S., Liou, R. & Peck, J. 2002. Remediation Technologies Screening Matrix and Reference Guide. 4ª Ed. Federal Remediation Technology Roundtable (FRTR). Disponible [html] en http://www.frtr.gov/matrix2/ Volke Sepúlveda, T. y Velasco, J.A. 2002. Tecnologías de remediación para suelos contaminados. Instituto Nacional de Ecología (INE-SEMARNAT), México. Disponible [pdf] en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/ Además, se han recogido en las notas al pie algunas referencias puntuales. También se ha consultado documentación de cursos y jornadas, en concreto alguna de los siguientes autores: → Ércoli, Eduardo Carlos. Laboratorio de Bioprocesos. Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza (Argentina) → → García Izquierdo, Carlos. Centro de Biología Aplicada del Segura (CEBAS), CSIC. Murcia Moreno-Ventas Bravo, Xabier Eduardo. Dpto. de Ciencias y Técnicas del Agua y del Medio Ambiente, Área de Ecología. Universidad de Cantabria Prof. Rafael Mulas Fernández 18 / 18