INFORME TÉCNICO FINAL "Desarrollo de un producto biorremediador para ser aplicado en los fondos acuícolas de las etapas productivas del salmón" CÓDIGO PROYECTO: 206-5467 BENEFICIARIO: LABORA TOR/OS RECALC/HE S.A. FECHA DE PREPARACiÓN: Enero 2010 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 /ND/CE A. RESUMEN EJECUTIVO •••••••••••••••••••••••••••••••..•.•••.•••••••••••.••.••.•••••••••••••••.••••••••••••••..••••••••••••••••.••. 6 B. EXPOSICIÓN DEL PROBLEMA ••••••••••••••••••••••••••••••.•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.• 8 B.1. PROBLEMA A RESOLVER QUE JUSTIFICÓ LA EJECUCiÓN DEL PROYECTO ...•......... 8 B.2. OBJETIVOS TÉCNICOS DEL PROYECTO Y LOS RESULTADOS PERSEGUIDOS 12 OBJETIVO GENERAL 12 OBJETIVOS ESPECIFICOS 13 B.3. PRODUCTO DESARROLLADO C. METODOLOGíA, .......................•..•••.•.•........................................................... 15 PLAN DE TRABAJO Y RESULTADOS OBTENIDOS •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18 ACTIVIDAD 1.1: AISLAMIENTO, IDENTIFICACiÓN Y CULTIVO DE BACTERIAS NITRIFICANTES Y DENITRIFICANTES DESDE SEDIMENTOS MARINOS Y LACUSTRES .••19 1.1.1. MUESTREO PARA AISLAMIENTO DE CONSORCIOS 19 1.1.2. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CULTIVO DE BACTERIAS NlTRIFICANTES y DENITRIFICANTES 20 1.1.3. RESULTADOS DEL AISLAMIENTO 1.2.1. MATERIALES 1.2.2. PROCEDIMIENTO Y CULTIVO DE BACTERIAS 22 26 I Etapa: Adaptación Cepas 27 27 II Etapa: Biorremediación 28 1.2.3. RESULTADOS 1.2.3.1.- Concentración celular 1.2.3.2.- Temperatura 1.2.3.3.- Evolución pH de los ensayos 1.2.3.4.- Oxígeno disuelto 1.2.3.5.- Potencial Redox 1.2.3.6.- Evolución concentración especies contaminantes • AMONIO • NITRITO NITRATO 1.2.4. CONSTRASTACION 31 31 33 34 36 37 38 38 39 • MEDICIONES LABORATORIO EXTERNO 40 .41 ACTIVIDAD 1.3. FORMULACiÓN DEL PRODUCTO ....•..........•..•.•......•.•.............................•...... 42 1.3.1. DEFINICIÓN DE CRITERIOS GENERALES DE DISEÑO 43 1.3.2. DETERMINACIÓN DE LAS CONDICIONES FISICO-QUIMICAS DEL PRINCIPIO ACTIVO .43 1.3.3. SELECCIÓN PRELIMINAR DE EXCIPIENTES 44 1.3.4. FORMULACIÓN PRELIMINAR DE LOS COMPRIMIDOS 45 1.3.5. CONFECCIÓN DE PROTOTIPOS 46 -Página 2 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.3.6. PRUEBAS Y ENSAYOS Fls/COS REALIZADOS A LOS PROTOTlPOS .49 1.3.7. RESUL TADOS 50 ACTIVIDAD 1.4. DEFINICiÓN DE LA DOSIS DEL PRODUCTO .........•............•.•.....•.••.•.....•.•.... 51 ACTIVIDAD 1.5. CARACTERIZACiÓN DE SEDIMENTOS •...•...............•.•.................................. 52 1.5.1. MUESTREO EN TERRENO 52 1.5.2. ANALIS/S EN LABORATORIO 54 1.5.3. RESULTADOS 54 C.2. ETAPA 2, DISEÑO DEL PROCESO PRODUCTIVO, PRODUCCiÓN PROTOTIPO Y EVALUACiÓN EN CONDICIONES REALES ...••.•.................................•...••............................•.•.. ACTIVIDAD 2.1: DISEÑO DEL PROCESO, DEFINICiÓN DE EQUIPOS Y ADQUISICiÓN 2.1.1. CALCULOS DE DISEÑO 2.1.1.1. Volumen y dimensiones del equipo 2.1.1.2. Aireación 2.2.2.3. Potencias de agitación 2.1.1.4. Transferencia de calor 2.1.1.5. Esterilización 2.1.2. LA Y-OUT DE PROCESOS 58 .•.•.. 59 60 60 61 62 63 64 65 2.1.3. SISTEMAS AUXILIARES 65 Sistemas de refrigeración 65 Sistema de esterilización 65 Sistema de control del Ph 66 Sistema de aireación 66 2.1.4. PLANOS CONSTRUCTIVOS 2.1.5. INSTRUMENTACIÓN Y CONTROL 67 2.1.6. ADQUIS/CION 69 ACTIVIDAD 68 DE EQUIPOS PARA LA PLANTA 2.2. PRODUCCION PILOTO .......•..•..•.....•.•...•.•..•...•.•.....••........................................ 2.2.1. PUESTA EN FUNCIONAMIENTO DE LA PLANTA PILOTO 72 2.2.2. OPERACIÓN DE LA PLANTA BIOMASA 2.2.3. PRODUCCIÓN 75 PROTOTIPO 2.2.3.1. PRODUCCiÓN 77 DE UNIDADES BIORREMEDIADORAS PARA SEDIMENTOS LACUSTRES ............................................................................................................................................................................. 2.2.3.2. PRODUCCiÓN DE UNIDADES BIORREMEDIADORAS 2.2.4. OBTENCiÓN DE PERMISOS DE LA SUBSECRETARIA ACTIVIDAD 2.3: EVALUACiÓN 72 PARA SEDIMENTOS DE PESCA IN SITU DEL PRODUCTO BIORREMEDIADOR 2.3.1. PRUEBAS DE EFICACIA EN AGUA DE MAR 2.3.1.1. Método de estudio Área de Estudio 77 MARINOS ..78 79 80 80 80 81 -Página 3 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Diseño del muestreo 82 Muestreo de sedimento 84 2.3.1.2. Resultados 87 Contenido de Materia Orgánica 87 Cambios en el ORP del sedimento 89 Cambios en el pH del sedimento 9O Cambios en la macrofauna bentónica 91 Cambios en parámetros fisico-quimicos 91 AMONIO, NH4 .....................................................••.•.........................•.....................•......•...................•.•. 93 NITRATO, N03 94 .......•...•..............•..........••.•...............••.•...........................••...............•......•..................... SULFUROS, S04 96 2.3.1.3. Conclusiones 97 2.3.2. PRUEBAS DE EFICACIA EN AGUA DULCE 99 2.3.2.1. Método de estudio 99 Área de estudio 100 Diseño Muestreal 100 Muestreo de sedimento y agua 103 2.3.2.2. Resultados Caracterización 107 del sedimento 107 Contenido de Materia Orgánica 108 Caracterización 112 del Oxigeno Disuelto {OD) Macrofauna bentónica 113 2.3.2.3. Conclusiones 114 ACTIVIDAD 2.4: ESTUDIO DE VIDA UTIL DEL PRODUCTO BIORREMEDIADOR 115 2.4.1. PRUEBAS A T" VARIABLE 115 2.4.2. PRUEBAS A HUMEDAD VARIABLE 116 2.4.3. PRUEBAS A TIEMPO VARIABLE 117 C.3. ETAPA 3, ESTUDIO DEL MERCADO, DIFUSiÓN Y PROTECCiÓN INTELECTUAL PRODUCTO ACTIVIDAD.3.1. DESARROLLO ACTIVIDAD 3.2. ESTABLECER DEL 118 DEL PLAN DE NEGOCIO ...............................•..................... 119 INVERSiÓN Y COSTOS DE PRODUCCIÓN .•.•.•..............•.•. 121 ACTIVIDAD 3.3. SEMINARIOS Y PUBLICACIONES ..............................................•.•............... 122 Dentro del plan de difusión del proyecto se realizaron diferentes actividades: 122 ACTIVIDAD 3.4. PROTECCiÓN DEL PRODUCTO ............•.......•..............•......................•........ 124 D. RESUMEN Y CONCLUSIONES •••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••.••.••••••.••••••••••••••••••.•••.••••••••••••• -Página 4 de 130- 125 INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 E. BIBLIOGRAFíA ........................................................................•...............•............................ 127 F. ANEXOS 129 2. INSTRUCTIVO MONTAJE DE EQUIPOS (sólo en OVO) 129 3. PROTOCOLO OPERACiÓN PLANTA BIOMASA (sólo en OVO) •.•..................................... 129 4. OVD 1 129 5. OVO 2- Filmación submarina LAGO ••••...........•.••••••.......•.........•...•.•.•...........•.•.••.•••.••.•.•...•.... 129 6. OVO 3- Filmación submarina MAR 129 7. CARTA GANTT COMPLETA 130 -Página 5 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 A. RESUMEN EJECUTIVO En el marco del proyecto Innova Chile W 206-5467 de Titulo: Desarrollo de un producto Biorremediador para ser aplicado en los Fondos Acuicolas en las etapas productivas del salmón, la Corporación Farmacéutica Recalcine, empresa dedicada a la producción de productos farmacéuticos humanos y veterinarios, mediante el presente informe tiene como objetivo la presentación del proyecto de Innovación empresarial llevado a cabo durante 2 años y 3 meses (Septiembre 2007-Enero 2010). Recalcine, ha sido pionero entre los laboratorios farmacéuticos nacionales, en la creación de un departamento de 1&0 propio y en la introducción de nuevas formas farmacéuticas, cuya formulación garantiza una mejor farmacocinética y una mejor seguridad en el cumplimiento del tratamiento del paciente. Sus especialidades médicas las ha agrupado en divisiones que constituyen la Corporación farmacéutica Recalcine. Asimismo, a través de su linea veterinaria FAV, la Corporación entrega productos veterinarios desde 1.994. En 1.997 da comienzo a la investigación y desarrollo de productos biológicos, que le permitió entregar la primera vacuna contra la pisclrickettsia salmones, una de las principales enfermedades que causa pérdidas en esta industria y la vacuna contra el virus ISA en 2009. Recalcine inició sus exportaciones en el año 1.994 desarrollando mercado en Bolivia, Colombia, Ecuador, Paraguay, Perú, Venezuela y Centro América. Posee una dotación de 1.013 trabajadores. Actualmente, desarrolla en U.S.A. proyectos en el campo de la biotecnologia asociada con prestigiosas compañías norteamericanas. y de la ingeniería genética, En el mercado nacional compite en las lineas farmacéuticas de pediatría, ginecología, dermatología, gástrica, dental, antiinfecciosas, oncología, entre otras, y desarrollamos productos para la mujer en los distintos ciclos de la vida. As! también, cuidamos la salud animal de diversos áreas tales como la ganaderla y acuicultura (salmones y camarones). Este proyecto consistió en desarrollar un producto microbiológicamente el fin de disminuir el impacto de la producción de peces bajo cultivo. activo para los fondos aculcolas con El objetivo general consistió en desarrollar un nuevo producto biorremediador que fuera capaz de reducir la materia orgánica de los fondos acuícolas (mares y lagos), dejándola en condiciones adecuadas y que cumplan con la normativa vigente. Los objetivos especlficos se orientaron al diseno del producto, diseño del proceso de fabricación del producto, producción de prototipos, evaluación de una producción piloto, difusión, capacitación y el sondeo de mercado, todo junto la protección intelectual del producto. El proceso consistió en el aislamiento de bacterias nitrificantes y denitrificantes de los sedimentos bajo las balsas-jaulas donde se desarrolla la producción aculcola, multiplicación de dichas bacterias en condiciones controladas de laboratorio, su incorporación a un excipiente y su aplicación a los fondos acu!colas bajo condiciones controladas. Se procedió a observar su evolución en terreno y luego a medir los resultados de la aplicación. El resultado final del proyecto fue la obtención de un nuevo producto biorremediador específico para los fondos aculcolas de lago y mar, cuya principal característica es que está formulado a base de bacterias autóctonas de los propios fondos donde se desarrolla el cultivo del salmón en Chile. Los resultados parciales son los que a continuación se mencionan y que se explican detalladamente punto C del presente informe: ~ Aislamiento de los consorcios bacterianos desde los sedimentos aculcolas -Página 6 de 130- en el INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 );> Evaluación de la actividad de degradación a nivel laboratorio );> Formulación del producto );> Diseño del proceso de producción ,adquisición de equipos y montaje );> Producción prototipo );> Pruebas en condiciones reales en fondos acuícolas );> Correlacionar frecuencia y dosis );> Patentamiento y certificaciones Enero 2010 para validación del producto Tras el análisis de parámetros ambientales monitoreados bajo las balsas-jaulas posterior a la siembra de unidades biorremediadoras, el bentos experimentó cambios atribuidos al efecto biorremediador. Variables utilizadas por la autoridad para Gestión Ambiental, y que en la actualidad son exigidas por las normas de acuicultura nacional, tales como oxigeno disuelto, potencial redox, materia orgánica y Macrofauna bentónica, experimentaron una respuesta positiva y beneficiosa desde la perspectiva ecológica, lo cual permite la recuperación del sedimento bajo las balsas-jaula de un centro de cultivo aculcola. El nuevo producto desarrollado tendrá gran impacto económico y medioambiental para la industria salmonera, ya que aporta una solución al problema ambiental ligado al cultivo del salmón, otorgando la posibilidad de lograr una armonla entre el crecimiento económico de la industria y el mantenimiento del equilibrio del medio ambiente. -Página 7 de 130· INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 B. EXPOSICiÓN Enero 2010 DEL PROBLEMA B.1. PROBLEMA A RESOLVER QUE JUSTIFICÓ LA EJECUCiÓN DEL PROYECTO La salmonicultura es una de las actividades productivas más relevantes en Chile. Las prácticas actuales de cultivo pueden impactar el medio ambiente a través de varias formas. Una de ellas es la alimentación de los peces, la que interviene, tanto en la columna de agua como en el fondo acuático, a través del alimento no consumido que es altamente proteico, y a través de los desechos eliminados por los peces. Lo anterior genera un aumento en la cantidad de nitrógeno y fósforo del sistema, lo que disminuye el oxigeno disponible, genera eutrofización, estimula la aparición de algunos organismos y la ausencia de otros y además, altera gravemente el medio por la acumulación de materia orgánica compuesta por los restos de alimento y las mismas materias fecales de los organismos en cultivo (ver Figura N° 1). '''''.1110 An~DIOl:co, Pa:ógcno, E.c~ NitrOgono Pillógono. Antlblótlcos . Alimcnto NoCOMUmlóo .---.------Figura N° 1: representación - -----esquemática del problema Las jaulas de salmón llegan a unos 15 m de profundidad (12-20 m). Existe un aumento drástico en las tasas de sedimentación a partir de la salmonicultura en jaulas luego de alimentar a los peces. Los restos de alimentos y las fecas se depositan relativamente rápido y afectan el lugar inmediato a la zona, pero las partículas formadas por la producción primaria se depositan más lejos del lugar ya que entre la liberación del nutriente inorgánico y la captación y aumento de la biomasa fitoplanctónica transcurren entre 3 y 7 días. Una gran cantidad de sedimentación de producción primaria es un indicador que el ecosistema planctónico marino ya no es capaz de asimilar los aportes mejorados de nutrientes del cultivo de salmón en jaulas. -Página 8 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Se produce así una serie de efectos ambientales en la columna de agua. Esto se debe, principalmente, a que un 70%- 80% del nitrógeno liberado por los peces queda disuelto en ella, además del fósforo que se deposita en los fondos. La presencia de estos nutrientes genera eutrofización, lo que quiere decir que la productividad primaria aumenta como consecuencia de una mayor disponibilidad de alimento para otros organismos como invertebrados y peces, pero también con la posibilidad de disminuciones estacionales de los niveles de oxígeno y de la biodiversidad propia del lugar (Beveridge, 1996). Los principales tres factores que determinan el impacto de la salmonicultura columna de agua, en la calidad del agua y en los ecosistemas pelágicos son: en los nutrientes de la 1. Tasa de carga de nutrientes inorgánicos, especialmente el nitrógeno en el caso de los sistemas marinos y el fósforo en sistemas de agua dulce, la hidrodinámica y la profundidad de los lugares donde se instalan las jaulas. 2. Morfometrra y topografía (grado de "exposición") de las bahías y de zonas costeras. 3. Densidad del stock de peces. A su vez, la acumulación de materia orgánica depende de varios factores, entre otros de la especie en cultivo, la calidad del alimento, el tipo de manejo, las corrientes y la profundidad (hidrodinamia). Las heces y restos de alimento tienen mayores contenidos de carbono (C), nitrógeno (N) y fósforo (P) que los sedimentos naturales, ello produce que los fondos, bajo los sistemas de cultivo, puedan tener muy alto contenido de materia orgánica y nutrientes. La materia orgánica acumulada estimula la producción bacteriana, cambiando la composición qulmica, la estructura y funciones de los sedimentos. Ello puede explicar la disminución significativa de la biodiversidad en las zonas utilizadas por la acuicultura. La abundancia de fitoplancton disminuye, así como el número de especies en sitios de cultivo pese a existir más nutrientes. La importancia y distribución del nitrógeno en el mar es muy similar a la del fósforo y, dentro de las diferentes concentraciones en que aparecen en las aguas marinas, existe un gran paralelismo entre dichas concentraciones y sus variaciones. El nitrógeno aparece en el mar, básicamente, en forma de nitratos, nitritos y amoniaco (N03-N02-NH3), aunque suelen aparecer en mayor cantidad los nitratos. En cultivos de salmones, cuando se registra un aumento de las concentraciones de amonio y disminuciones de las concentraciones de oxigeno, se pueden alterar los ciclos normales de nutrientes, afectando la abundancia del fitoplancton, zooplancton y peces, fenómenos que han sido detectados en diferentes cuerpos de agua utilizados por prácticas de acuicultura. De aquí la importancia en el manejo de los ecosistemas y los nutrientes presentes en los cuerpos de agua, ya que con la implementación de buenas prácticas, adicionado a la aplicación de técnicas nuevas utilizando bioproductos que no alteren el ecosistema, se podrá alcanzar un desarrollo sustentable de industria acufcola en Chile. Así nace el proyecto de BIORREMEDIACIÓN DE FONDOS, basado en el fundamento de nitrificación/denitrificación, reacciones de oxido-reducción biológicas necesarias para descomponer los compuestos contaminantes, mediante la intervención de bacterias autóctonas del ecosistema acuático. La técnica considera el suministro de microorganismos remediadores nativos para ser utilizados en procesos de remediación in situ. En este caso, tiene por objetivo reactivar el proceso de biodegradación natural de la materia orgánica acumulada, transformándola en elementos no contaminantes e inocuos para el medio ambiente. -Página 9 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Para lograr el objetivo descrito se elabor6 un producto biorremediador compuesto por bacterias liofilizadas nitrificantes y denitrificantes, denominado UNIDAD BIORREMEDIADORA que está diseñado para regenerar los equilibrios disminuyendo la materia orgánica de los fondos acuicolas (lagos y mar), a niveles aceptados por la normativa vigente. Producto de la contaminaci6n por compuestos nitrogenados, existe una serie de alteraciones que se generan en paralelo: fisicas (apariencia, olor), quimicas (variaci6n de niveles de compuesto nitrogenados inorgánicos), fisicoquimicas (variaciones del pH, potencial redox), y biol6gicas (alteraci6n de las cadenas tr6ficas, aparici6n de microorganismos patógenos, algas, parásitos etc.). El fundamento biol6gico de la tecnologia desarrollada es el llamado CICLO DEL NITRÓGENO, la eliminaci6n del N se lleva a cabo por el proceso de nitrificaci6n-denitrificaci6n. • La nitrificación es la principal ruta por la que el amonio es aer6bicamente Ésta la realizan las bacterias Nitrificantes. en el que oxidado a nitrato. En forma esquemática la nitrificaci6n ocurre de la siguiente forma: Nitrobacter Nitrosomonas NH4----------------~ N02 Amonio • --------------~ nitrito N03 nitrato La denitrificación por el contrario es un proceso por el que ciertas bacterias en condiciones anaer6bicas reducen el nitrato hasta N2 gas. Este proceso tiene lugar en varias etapas en las que aparecen distintos productos intermedios. Esquemáticamente, N03 Nitrato --. N02 nitrito ocurre así: __ --. NO óxido nftrico ~ N20 óxido nitroso El CICLO DEL NITRÓGENO es un ciclo natural de nutrientes continuamente bajo distintas formas entre distintos compartimentos aire, el agua, el suelo y los organismos (ver Figura Ir 2). -Página 10 de 130- .....•.N2 gas nitrógeno en el que los elementos circulan del medioambiente, por ejemplo el INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 RJACllÍC BfClRMUfllllCA (tormentas) L,LUVIA ACIDA FIJACUÍl IIDISTRIAI. (amorrieco. 8b0n08) I Productares fllEllTO Consumidores RESTOS HANICOS ABSIRUÍl • EXCRECION NR"RIFlCACIÓN CICLO DEL NITRÓGENO Figura N° 2: Representación esquemática del ciclo del nitrógeno El N2 atmosférico, gas que forma el 78% del aire, no puede ser usado en forma normal por los seres vivos, sino que tiene que ser transformado en compuestos absorbibles. El N2 del aire sólo puede ser usado directamente a través de bacterias que viven en el suelo. Los compuestos nitrogenados que se acumulan en mares y ríos procedentes de la descomposición, as¡ como de los restos de alimentos y desechos de los peces de cultivo, sólo pueden ser descompuestos con la intervención de bacterias hasta N2 gas, que retornará a la atmósfera para reiniciar el ciclo o lo usarán las propias bacterias para su metabolismo. -Página 11 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 B.2. OBJETIVOS TÉCNICOS DEL PROYECTO Y LOS RESULTADOS Enero 2010 PERSEGUIDOS OBJETIVO GENERAL El objetivo general del proyecto consistió en desarrollar un nuevo producto biorremediador, para reducir la materia orgánica de los fondos acuicolas (lagos y mar), dejándola a niveles aceptados por las normativas vigentes, a partir de microorganismos autóctonos del ecosistema acuático donde se desarrolla la producción de salmón. Para ello se desarrolló un producto consistente en una tableta a base de microorganismos liofilizados que se deposita en el medio acuicola y empieza a reaccionar bacteriológicamente actuando sobre los residuos no deseados y transformándolos en elementos no contaminantes. El mecanismo de acción básico está basado en la actividad metabólica de los microorganismos, que se adaptan al medio y comienzan el restablecimiento de microorganismos nativos o autóctonos del medio y descomponen la materia orgánica. Así mismo, se desarrollaron los procesos de fabricación necesarios para escalar una producción prototipo y los protocolos para validar la efectividad del nuevo producto como biorremediador. -Página 12 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 OBJETIVOS ESPECíFICOS Para conseguir el objetivo general se plantearon los siguientes siguientes resultados esperados de cada uno de ellos: OBJETIVO objetivos específicos con los RESULTADO PERSEGUIDO DESCRIPCiÓN Obtención de consorcios nitrificantes y las bacterias Aislamiento de aislados activos de medio ambiente natural desde denitrificantes nitrificantes y (fondos acuícolas). Se obtendrán consorcios DN y N denitrificantes para lagos y de fondos marinos y lacustres mar. Diseño de las características del nuevo producto biorremediador Evaluación de la actividad bacteriana nitrificante y denitrificante de los consorcios aislados desde los fondos acufcolas Determinar la eficiencia de degradación de materia orgánica de los sedimentos Definición de dosis y frecuencia de uso del producto en base a la degradación de la materia orgánica Dosis y frecuencia de uso establecidas Producto de fácil aplicación que no se desintegre o disuelva antes de llegar al fondo Formulación del producto Caracterización del medio ambiente donde se va a aplicar el producto Diseño e ingeniería del proceso para la adquisición de equipos y producción prototipo Puesta en marcha de la linea y Producción prototipo Evaluación producción Disponer información real del grado de contaminación Caracterización química y biológica del sedimento aculcola impactado Disponer de las Ingeniería básica, planos y establecimiento de los capacidades instaladas de requerimientos de servicio e ingenierra para el los servicios como agua, montaje. gas, energía eléctrica y otros Determinación de las etapas de producción producto y de los equipos para su adquisición funcionamiento la Poner en satisfaciendo las normas vigentes. planta del piloto, de la Pruebas en condiciones reales en centros de cultivo piloto en de salmón: agua dulce y mar. -Página 13 de 130- Disponer de una planta piloto para la fabricación Fabricación de tabletas necesarias para evaluar la eficiencia del producto en condiciones reales Determinar el grado de eficacia en condiciones INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 condiciones reales in-situ Estudios de eficacia por degradación de materia y ffsico-químicos orgánica y otros parámetros biológicos de interés Enero 2010 reales del producto desarrollado Correlacionar frecuencia y dosis en función a los parámetros del medio acuático Vida útil y condiciones de manejo Evaluar el comportamiento del producto en almacenamiento y con diferentes condiciones de temperatura y humedad. Establecimiento de la vida útil de los componentes del producto para su uso y almacenamiento correcto Certificación del nuevo producto Obtención de las certificaciones necesarias para validar el producto desde el punto de vista comercial (uso masivo) En fase de obtención de la Autorización para su uso masivo (comercial) por para de la Subsecretaría de Pesca. Plan de negocio Se establece la estrategia de marketing para ingresar al mercado Protección intelectual del nuevo producto Obtener la patente del producto biorremediador -Página 14 de 130- Plan diseñado Presentación de patente INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 B.3. PRODUCTO DESARROLLADO A través del proyecto que se describe en el presente informe se ha desarrollado un nuevo producto que es un elemento sólido conformado por microorganismos liofilizados nitrificantes (N) y denitrificantes (DN) capaces de descomponer los compuestos nitrogenados así como de modificar beneficiosamente otros parámetros ambientales. Los requerimientos específicos que se establecieron para el diseno del producto son: • Debe poseer una forma tal que evite su ingestión por parte de los peces u otra biota presente en la zona de aplicación de la forma farmacéutica. • Debe ser capaz de viajar al fondo marino o lacustre sin romperse o desintegrarse trayecto ni en el momento de contacto con el fondo. • Su forma debe ser amigable en presentación posterior transporte. • Los elementos componentes empleados (excipientes) deberán en lo posible ser de naturaleza amigable con el medio ambiente, estándar o comercial, de manera de conseguir un producto final que sea viable tanto desde el punto de vista ambiental, técnico y económico. Las condiciones consideradas y debe facilitar su fabricación, para el desarrollo son: • Solvente: agua salada yagua dulce • Rango de temperatura entre 5°C y 15°C • Rango de profundidad de aplicación entre 15m y 60 m. En las figura N° 3 Y N° 4 puede verse un esquema del objetivo perseguido. -Página 15 de 130- durante su manipulación y INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 APLICACiÓN DEL Enero 2010 SUPERFICIE lAGO/MAR TRATAMIENTO ~ BAlSAJAUlACOH PECESENCUlnvO MATERIA Fig. N° 3: representación de la aplicación del producto sobre el sedimento DESPUÉS DEL SUPERFIOE TRATAMIENTO lAGO/MAR MATERIA ORGANICA / Fig. ND 4: representación Obsérvese ACUMUlADA del efecto del producto después de 1 mes de uso la disminución de la materia orgánica del sedimento bajo la balsa-jaula. En base a los requerimientos planteados se definió que la fonna fannacéutica más adecuada para cumplir con los objetivos esperados era un elemento comprimido del tipo tableta que deberla ser capaz de transportar al fondo el principio activo que se encargará de realizar la biorremediación requerida, ya que así se pueden lograr densidades adecuadas y tiempos esperados de desintegración. -Página 16 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 El producto se desarrolló en dos versiones: o Una para agua dulce (lagos), formulada a base de bacterias nitrificantes aisladas de los sedimentos lacustres. o Otra para agua salada (mar), que contiene como principio activo consorcios nitrificantes y denitrificantes aisladas de los sedimentos marinos. Este nuevo producto biorremediador es una tableta denominada principales características son (ver figura N° 5): y denitrificantes de bacterias UNIDAD BIORREMEDIADORA cuyas -Color blanco oscuro -Dimensiones aproximadas: 2 cm espesor X 10 cm de diámetro -Peso de 100 gr / unidad aprox. -Densidad 1,81 gr/cm3 -Presión de compactación: 12 toneladas -Buena friabilidad, capaz de resistir el roce sin desmoronarse -Tiempo de desintegración en agua bueno: mayor a 24 horas y su composición es:10 % principio activo (liofilizado de bacterias nitrificantes diluyente; 39% aglutinante; 1% lubricante Figura N° 5: Unidad Biorremediadora -Pagina 17 de 130 y denitrificantes); 50% INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 C. METODOLOGíA, PLAN DE TRABAJO Enero 2010 Y RESULTADOS OBTENIDOS A raiz del transcurrir del proyecto, se hicieron algunos ajustes de la carta Gantt y que representan la realidad del proyecto. La Carta Gantt original fue levemente modificada por necesidad durante el desarrollo del mismo, puesto que actividades que inicialmente se suponfan que iban a llevar más tiempo, llevaron menos tiempo y viceversa. Asf como otras que se han ido haciendo simultáneamente para poder lograr los hitos de cada actividad. Previamente, se solicitó a Corfo la Modificación de la Carta Gantt para ajustarla a la realidad de cada actividad programada. Dichos cambios fueron aprobados por Corfo mediante la Resolución N° 1160 con fecha 17/11/2008. Como anexo nO 1 se encuentra la Carta Gantt del proyecto completo, mientras que a continuación representan las Cartas Gantt por etapas 1, 2 Y 3 Y las actividades realizadas durante las mismas. se Todas las actividades del proyecto se han ceñido al máximo posible a la Carta Gantt. No obstante, se puede observar alguna desviación en cuanto a la duración de las actividades así como de las fechas de inicio/fin de las mismas respecto de la Carta Gantt, puesto que se adaptaron al dia a dla del proyecto. C.1. ETAPA 1, DISEÑO DEL PRODUCTO A continuación la Carta Gantt correspondiente a esta primera etapa. Las actividades contempladas esta primera fase, correspondieron casi en su totalidad a trabajo de laboratorio. oct-07 nov-07 dic-07 ene-08 feb-08 mar-08 abr-08 may-08 jun-08 tES1 tES2 tES3 tES4 tES5 tES6 Etapa 1.1hctm:ia11e1llO Diseñar 1-----+---+---+el producto IcoOanillldos , -Página 18 de 130- tES7 tES8 jul-08 ago-08 sep-08 oct-08 en nov-08 tESt tES10 tES11 tES12 tES13 MES 14 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 ACTIVIDAD 1.1: AISLAMIENTO, IDENTIFICACiÓN Y CULTIVO DENITRIFICANTES DESDE SEDIMENTOS MARINOS Y LACUSTRES Fecha de Ejecución: DE BACTERIAS NITRIFICANTES y Mes 1 y 2 (Octubre y Noviembre 2007) 1.1.1. MUESTREO PARA AISLAMIENTO DE CONSORCIOS Objetivo: Obtener muestras representativas Descripción y desarrollo de sedimentos marinos y lacustres de centros de cultivo de salmón. del muestreo: El muestreo se realizó mediante la extracción de sedimento con draga. Las muestras se colocaron en envases preparados adecuadamente para ello y se dispusieron al destino final (laboratorio) mediante vla aérea, con el fin de hacerlo de la forma más rápida y asegurar que las muestras sufrieran el menor cambio en su traslado. Dicho proceso se hizo asegurando en todo momento la trazabilidad de las muestras desde muestreo, hasta la recepción de las mismas en laboratorio. el minuto del Los centros de cultivo de los que se obtuvieron las muestras (tabla N' 6) de sedimento pertenecen a la empresa Marine Harvest Chile S.A. Tabla N° 6: Caracterlsticas MUESTRA de las muestras de sedimentos lacustres y marinos extra Idos PROFUNDIDAD TEMPERATURA (OC) pH OXIGENO DISUELTO (mg OiL) LLC 32 12 7,8-8,0 LLP 32 12 7,8- LMC 15 11,9 7,23 33 11,5 7,23 LMP LLC: Lodo Lacustre Control; LLP: Lodo Lacustre Problema; LMC: Lodo Marino Control; LMP: Lodo Marino Problema -Página 19 de 130- 8,0 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.1.2. AISLAMIENTO, DENITRIFICA N TES IDENTIFICACiÓN Y Enero 2010 CULTIVO DE BACTERIAS NITRIFICA N TES y Objetivo: Obtener y aislar consorcios bacterianos aeróbicos marinos con actividad nitrificante V denitrificante. y cepas bacterianas aeróbicas desde sedimentos Descripción: - Obtención de muestras: Las muestras extra idas (actividad 1.1) fueron recepcionadas y analizadas inmediatamente. Para pruebas posteriores las muestras fueron conservadas a 5°C. - Preparación de medios de cultivo: los medios de cultivo que se usaron en el aislamiento de consorcios bacterianos con potencial nitrificante v denitrificante fueron: • Minimal medium for denitrifying bacteria: composición por litro: ~nhI~ión A 980 mi Solución B 10 mi Solución e 10 mi Solución A: (gil) 5g 4a 1g 0,87 a O,54g KN03 Fuente de Carbono (NH4)2S04 K2HP04 x 3H20 KH2P04 Solución B: (gil) 1 MgS04 x 7 H20 12, O9 Solución C: (gil) CaCI2 x2 H20 FeS04x7 H20 MnS04xH20 CuS04x 5 H20 NaMo04 x 2 H20 HCI (0,1 N solución) • Winogradsky's 0,29 0,1 g 0,05 g 0,01 9 0,01 9 100 mi médium modified (Nytrifying B): (gil) CaC03 lNH4)2S04 K2HP04 NaCI MgS04x7 H20 FeS04 -Página 20 de 130- 5,0 1,0 1,0 1.0 0,5 0,4 9 9 9 9 9 9 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 - Cultivo de consorcios: El aislamiento de consorcios bacterianos con posible actividad nitrificante se llevó a cabo en matraces de 100 mi de capacidad con 50 mi de medio de cultivo. Se agregó a cada matraz un inóculo de la muestra original de 1 g de sedimento en condiciones asépticas. Cada muestra se incubó a las mismas condiciones de temperatura y salinidad en las que se tomaron las muestras originales. Para la mantención de los consorcios bacterianos se ajustó pH periódicamente, y se agregó medio de cultivo nuevo para asegurar el ingreso de fuentes de enerqía. - Determinación de actividad Nitrificante: Se realizó mediante la utilización de indicadores de viraje de pH, en este caso se utilizó el indicador rojo de metilo, ya que este vira de rojo a amarillo cuando el medio se hace ácido (indicando presencia de N02 y N03). - Determinación de la actividad Denitrificante: Se realizó mediante la utilización de indicadores de viraje de pH, en este caso se utilizó el indicador azul de bromotimol, ya que este vira de amarillo a azul cuando el pH del medio se hace básico( indicando la presencia de NH3). - Liofilización de cepas con actividad: Se usó crioprotector (skim milk), se esterilizó mediante autoclave a 121°C por 15 min; éste fue dispensado en volúmenes de 3 mi en viales de capacidad 5 mI. Desde placas de cultivo crecidas con las cepas de interés, se colectó en condiciones estériles bajo campana de flujo laminar, con un asa de cultivo las colonias de las cepas de interés, las cuales fueron disgregadas en el crioprotector. Los viales conteniendo las cepas con actividad fueron congelados a -20 o C durante 24 horas, y posteriormente sometidos a proceso de liofilización. -Página 21 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.1.3. RESULTADOS DEL AISLAMIENTO Enero 2010 Y CULTIVO DE BACTERIAS Tabla Ir 7: Test realizados sobre los cultivos de consorcios bacterianos inoculados y monitoreados semanalmente para determinar su actividad. INCUBACION 1'" 5° TaAMBIENTE MEDIO DE CULTIVO MUESTRA N LAGO 1 (-) LAGO 2 M.MAR 1 (-) M.MAR2 LAGO 1 I I DN DN N No No No No (-) (-) (-) (-) (-) (-) No No No No No (+0-) LAGO 2 M.MAR 1 No No No No No (-) (+) (+) M.MAR2 LAGO 1 LAGO 2 No No No M.MAR 1 M.MAR2 H (-) No (-) (-) No No (+0-) (-) (+) (+) No No (-) (-) No No (-) (-) FECHA CONTROL SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA 3 Inicialmente los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (18° C) Y luego almacenados frta a 5° e, donde se observó actividad. en cámara A partir de los consorcios con actividad positiva para nitrificación y denitrificación, se realizó aislamiento bacteriano utilizando los medios de cultivo descritos y agregando agar bacteriológico para proporcionar un soporte en placas de cultivo para aislamiento de cepas con actividad. Se realizaron diluciones seriadas decimales desde los consorcios con actividad, y se sembraron en placas de cultivo con los respectivos medios usando la técnica de placa extendida. Se realizaron traspasos sucesivos de las cepas en aislamiento hasta obtener cepas puras con actividad. La actividad de las cepas se verificó en medios de cultivo líquidos mediante los indicadores mencionados. -Página 22 de 130- antes INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Tabla Enero 2010 N' 8: Test de actividad para cepas y consorcios aislados desde muestras Lago y Mar. Se realizó test ON para cepas denitrificantes y test N para cepas nitrificantes. MUESTRA ORIGEN ROTULO TEST ACTIVIDAD ON LAGO 1 ONl1-OO1 (-) 1 ON LAGO 1 ONl1-OO2 (+) 2 ON LAGO 1 ONl1-OO3 (-) 3 NOVIAL ON LAGO 1 ONl1-004 (-) 4 ON LAGO 1 ONl1-OO5 (-) 5 ON LAGO 2 ONL2-OO1 (+) 6 ON LAGO 2 ONL2-OO2 (+) 7 ON MAR 1 ON M 1-001 (-) 8 ON MAR 1 ON M 1-002 (-) 9 ON MAR 1 ON M 1-003 (-) 10 ON MAR 2 ONM2-OO1 (-) 11 ON MAR 2 ONM2-OO2 (+) 12 ON MAR 2 DNM2-OO3 (-) 13 N LAGO 1 Nl1-OO1 (+) 14 N LAGO 2 NL2-OO1 (+) 15 NMAR2 NM2-OO1 (+) 16 ON LAGO 1 (-ON LAGO 1 (+) 17 ON LAGO 2 (-ON LAGO 2 (+) 18 ON MAR 1 (-ON MAR 1 (+) 19 DN MAR2 (-ON MAR 2 (+) 20 N LAGO 1 (-N LAGO 1 (+) 21 N LAGO 2 (-N LAGO 2 (+) 22 NMAR2 (-N MAR 2 (+) 23 -Página 23 de 130- (-) no existe actividad (+) existe actividad INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figuras Ir 9: Micrograf1a 100 X, Consorcios bacterianos aislados desde muestra Mar M2 positivos para DN Figura N" 11: Micrograf1a 100)(, consorcios bacterianos aislados desde muestra Lago1 positivos para actividad N -Página 24 de 130- Enero 2010 Figura N" 10: Micrograf1a 100 X, Cepa bacteriana NMar2-001 Figura N" 12: Micrograf1a 100 X, Cepa bacteriana DNLag2-001 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figura N° 13: Test actividad denitrificantes para cepas bacterianas aisladas desde consorcios bacterianos obtenidos desde muestras Mar con actividad. Enero 2010 Figura N-14: Test actividad denitrificantes para consorcios bacterianos obtenidos desde muestras Mar con actividad. Figura N-15: Test actividad nitrificantes para Figura N- 16: Producto liofilizado de cepas consorcios bacterianos obtenidos desde muestras Lago con actividad bacterianas con actividad -Página 25 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD 1. DENI TRIFI CANTE 2: EVALUACIÓN DE LA Enero 2010 ACTIVIDAD BACTERIANA NITRIFICANTE y Fecha de ejecución: mes 3 y mes 4 (Diciembre 2007 y Enero 2008) Objetivo: Evaluar el potencial biorremediador de los inóculos de bacterias nitrificantes y denitrificantes Marinas y Lacustres. Se disei'laron pruebas de laboratorio de modo de remediar el sistema natural, por 10 que los resultados se pueden extrapolar a lo esperado en terreno al utilizar dichos inóculos al realizar biorremediación in situ. Descripción: Para el desarrollo de las pruebas se ha dividido el trabajo en dos etapas, una de adaptación de las cepas a las condiciones de prueba y otra de biorremediación propiamente tal. 1.2.1. MATERIALES Material de Vidrio: • • • • Reactivos: • • • • Reactores con camisa para regulación de temperatura. Capacidad 2 L. Capilares de Vidrio largo aprox. 15 cm. diam. aprox. 0,5 cm. Botellas graduadas de 2 l para preparación de medios de cultivo. Cámara de Recuentos Petroff Hausser profundidad 0,01 mm. Medio de Cultivo de Winodrasky Medio para Denitrificantes, Denitrificans Sedimento Lacustre Contaminado Cultivo fresco Bacterias Nitrificantes y Denitrificantes de concentración conocida. Instrumentación • • • • • • • • • • • y Equipos: Termómetro digital Bafio termorregulado a 12° C Autoclave Soplador 50 Umin Microscopio Óptico pH metro Medidor de 02 disuelto MedidorORP Conductivlmetro Medidor Salinidad Kit medición Amonio, nitrito, nitrato -Página 26 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Material Biológico: Las muestras de sedimentos lacustres y marinos, tanto controles (de zonas limpias) como problemas (de zonas acuicolas) que fueron tomadas de los centros de cultivo de la empresa Marine Harvest. 1.2.2. PROCEDIMIENTO Las pruebas han sido ejecutadas en dos etapas, las que se describen a continuación: I Etapa: Adaptación Cepas En esta etapa, las cepas del cultivo fresco, fueron contactadas paulatinamente con sedimento lacustre contaminado, en condiciones de menor a mayor concentración, para así, conseguir la adaptación de ellas a las nuevas condiciones de trabajo, de modo que sean capaces de trabajar de mejor manera en sedimentos con una alta carga contaminante (materia orgánica). El periodo de adaptación tiene una duración de aproximadamente 10 días. En los cuales, se prepara dos adaptaciones, una para cepas nitrificantes y otra para cepas denitrificantes. Ambas experiencias se trabajan por duplicado y en condiciones de TO y pH optimas (12 C y pH 7.0 aprox.) Q Para el caso de las cepas Nitrificantes (N) se trabaja en condiciones aerobias, en cambio, en el caso de las cepas Denitrificantes (DN), se opera en condiciones anóxicas, debido a sus características anaerobias. El plan de adaptación, aplicable en todos los casos, se presenta a continuación en la tabla N° 17. Tabla N° 17: plan de adaptación de cepas Adaptación Cepas - - - - ----_.- ora Lodo (%v/v) In6culo (%vlv) 3 60 40 7 70 30 13 80 20 N1LL: N2LM: DN1LL: DN2LM: Cepa Cepa Cepa Cepa nitrificante en adaptación Lodo Lacustre nitrificante en adaptación Lodo Marino denitrificante en adaptación Lodo Lacustre denitrificante en adaptación Lodo Marino En esta etapa se observa que la adaptación de las cepas a los lodos fue bastante fácil. Lo cual nos lleva a pensar que esta fase puede eliminarse y que es posible agregar microorganismos cultivados en laboratorio directamente al sistema a remediar; ya sea un batch o lodo contaminado en el proceso de remediación in situ. -Página 27 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 11 Etapa: Biorremediaeión Para la etapa de biorremediación propiamente tal, se trabajó en biorreactores mantuvieron a una temperatura constante de 12°C. La blorremediación se realiza en tres etapas consecutivas: de 2 L, los cuales se a) La primera es una etapa de denitrifieaei6n (ON), en la cual, las cepas deben actuar en condiciones anóxicas (en ausencia de oxígeno), y deben abatir la alta carga de materia orgánica para la posterior acción de las bacterias nitrificantes. En esta etapa se inocula un biorreactor que contiene sedimento lacustre contaminado, con cepas denitrificantes adaptadas previamente; se realizan tres ciclos de inoculación. Éstas reducen bioqulmicamente aniones de nitrógeno oxidado, lo que conlleva a la transformación progresiva desde nitrato a nitrito y oxido nitroso a nitrógeno molecular. Este proceso, en su ambiente natural, puede ocurrir tanto en condiciones aerobias como anaerobias. b) Finalizada la primera etapa de denitrificación, se pasa a una etapa de nitrifieaeión (N), en la cual se inocula células nitrificantes , adaptadas al lodo, en el mismo biorreactor. Para la nitrificación ocurra, se debe trabajar en condiciones aerobias, para lo cual se adiciona al biorreactor, un flujo constante de 7 mg/L de aire, para entregar las condiciones necesarias para metabolizar oxidativamente los compuestos nitrogenados del sedimento. En esta etapa ocurre la conversión de amonio a nitrato. El amonio es oxidado a nitrito, el cual es transformado en nitrato, el cual no es tóxico para las especies acuáticas de un cultivo. e) Para terminar el ciclo, se pasa a una segunda etapa de den itrifieaei6n , en la cual se inocula nuevamente con células DN adaptadas, para la conversión de nitrato a nitrógeno molecular (gaseoso), esperando obtener un sedimento aun menos contaminado que en la etapa nitrificante. Cada una de las etapas antes descritas, tiene una duración aproximada de seis días, de los cuales, se reinocula microorganismos cada dos días. Los microorganismos inoculados, corresponden a la etapa en que se encuentre (DN/N). a las inoculaciones durante el ensayo) Tabla N° 18 (los cuadros claros corresponden Regla de tiempo ensayo Biorremediaci6n ora ciclo O 1 2 ON 3 4 5 6 7 8 9 N 10 11 12 13 14 15 16 ON 17 ra 19 20 post ciclos I d) La siguiente etapa, escapa a la etapa de biorremediaei6n propiamente tal. Se realizó un seguimiento posterior del ensayo durante 3 días, de modo de tener una visión más acabada de la remediación completa, puesto que en un pre-ensayo realizado con anterioridad a esta prueba, se encontró un desfase en los ciclos de reducción de los contaminantes, en relación a lo esperado, pensándose en la necesidad de esperar un periodo superior a un dla para observar los efectos del ciclo completo . • -Página 28 de 130· INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Diseño Pruebas El sistema consiste en cuatro biorreactores, con un sistema de recirculación de agua por donde circula agua a temperatura 12°C, temperatura óptima para el crecimiento de las células. Para las pruebas se homogenizó el lodo y se preparó con una densidad 1.08gr/ml, de modo de lograr condiciones estandarizadas y de que en cada prueba particular se utilice la misma preparación base tanto en el control como en la prueba de biorremediación. Los microorganismos del sistema, son fotosensibles, por lo cual se debe cubrir cada uno de los reactores, para protegerlos de la luz. A continuación se puede observar fotograffas de cada una de las pruebas y el sistema de reacción de cada una de las etapas. a) Prueba control, la cual solo contiene sedimento lacustre o Marino contaminado el que a su vez aporta los microorganismos propios de éste. Figura N' 19: Reactor control b) Prueba W1 : Esta prueba contiene 2 L de sedimento lacustre, preparado con una densidad 1.08, el cual es inoculado según la frecuencia descrita en la tabla N° 18, con células adaptadas, de modo de llegar a una concentración de 1.6 x 10 6 células/mL. Figura N' 20: Reactor problema -Página 29 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 FIgura Enero 2010 ti' 21: Sistema de reacción, en ausencia de oxigeno (FaseDN) • Figura ti' 22: Sistema de reacción, en condiciones aerobias (N) -Páglna 30 de 130- Figura ti' 23: Sistema de reacción en condiciones finales de trabajo (fotoprotegido) INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.2.3. RESULTADOS Se realizaron evaluaciones de distintos parámetros, la evaluación comparativa de dichos resultados se expresa a continuación. 1.2.3.1.- Concentración celular Las muestras de lodo inicialmente tenían conteos altos en tiempo cero. Los lodos problema Lago 5,Ox10E+8 cel/mI y los lodos problema Mar con 1,7*10E+8 ce/mi; por tanto el aporte en el conteo total de los microorganismos ON y N agregados por vez: 1,6*10E+6 cel.lml es pequeño, considerando que estas células se diluyen en el batch que es un pequeño ecosistema vivo donde existen otros microorganismos que compiten. Tabla N° 24: Porcentaje microorganismos microorganismos lodo inoculados en relación 1 inoculación a microorganismos % total del Iodo. 9 % total inoculaciones Ensayo Lacustre 5,OOE+08 1,60E+06 0,320/. 1.44E+07 2,88% Ensayo Marino 1,70E+07 1,60E+06 9,41% 1.44E+07 84,71% Observando el porcentaje de microorganismos (Tabla N°24) que se inocula cada vez en comparación a los microorganismos presentes en el lodo, se observa que este porcentaje es menor al 1% en el caso del ensayo lacustre y menor al 10% en el caso del ensayo marino. Esto es un equilibrio dinámico donde existe una competencia de las bacterias inoculadas, entonces, a pesar que la sumatoria de microorganismos inoculados en el periodo completo que duró el ensayo (ver regla de tiempo, Tabla N° 18) da un total del 2,88% en el caso Lacustre y de un 84,77%, en el segundo caso recién el al día 14 se produce un salto considerable en la concentración celular. Si analizamos los datos de los ensayos lacustres (ver gráfica N° 25), la dispersión de datos muestra una mayor concentración celular siempre para la muestra Remediación-Lago inoculada. Ejemplo: el día 2 se contaron 8*10E8 cel./ml para la muestra ensayo, un 1*108 cel.lml mas (un 14% más) que las 4,1*108 observadas en el control lacustre; del mismo modo el día 4 observamos una diferencia de 2,3*106 cel.lml más (un 56%), entre las 6,4*106 ceVml vistas en el caso del ensayo Lago y las 4,1*108 vistas en el control. Esta tendencia se aprecia en toda la prueba de remediación Lago salvo pocas excepciones (días 3,9, 10, 14). -Página 31 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1----9.00E+08 . 8.00E+08 7.00E+08 _ 6.00E+08 E 5.00E+08 4.00E+08 3.00E+08 2.00E+08 1.00E+08 O.OOE+OO Concentración celular pruebas remed~-l6n-La-g~ • • • • ¡ Enero 2010 • • o • • 2 4 8 6 • 10 12 • cellml Control .~lmlEl'ISay 14 16 18 20 ~ Gráfica N° 25: Gréfica dispersión concentración celular durante el ensayo, Columna Control-Lago y Columna Remediación-Lago 22 tlempo(." En los ensayos Marinos (ver gráfica N° 26), observamos la misma tendencia que la observada en el ensayo lacustre donde solo los dlas 1, 3 Y 10 se marcan las excepciones en que los conteos en el control son superiores a los conteos en el biorreactor prueba. Tenemos asi el dia 14 una diferencia de 1,1 *108 bacterias. Observamos en los últimos días de análisis de los resultados, que se observa una predominancia en el número celular en las pruebas de remediación (inoculadas). Si observamos la tendencia los dias 15, 16 Y 17 se observa siempre un mayor conteo para el caso de las pruebas de remediación. í-~-- Concentración celular ensayo rernediación Mar • • •• • • T- 024 • •• • • • • • 8 8 ro u ... • ~ • cellml • • ffl [ .cellmlE~o ffl 20 Control Gráfica N° 26: Gréfica dispersión concentración celular durante el ensayo, Columna control-Mar, Columna remediación-Mar. 22 tiempo (di• ., Se puede concluir que paulatinamente se va generando una incorporación de las bacterias inoculadas a los sistemas batch que contiene lodo contaminado, lo que se refleja en el aumento cuantitativo en la concentración bacteriana. Esta incorporación es un poco más lenta o dificultosa en el caso del ensayo Marino, lo que se puede entender por el esfuerzo adicional que necesitan los microorganismos para mantener su metabolismo en conjunto con la regulación de la osmosis en condiciones de salinidad alta. Lo anterior implica la creciente incorporación y adaptación de las bacterias benéficas a dicho sistema experimental y se puede extrapolar a lo que sucederé en la columna de agua con la continua aplicación del Bioproducto y el restablecimiento de la flora nativa benéfica. -Página 32 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.2.3.2.- Temperatura La temperatura en las pruebas, fue controlada con el sistema de chaquetas de agua recirculada. Esto permitió mantener la temperatura alrededor de la temperatura operacional óptima de 12°C. T" ensayo remadlaclón lago 15 14 •• 12 10 8 • •• • ... • •- - Gráfica N° 27: Gráfica dispersión Temperatura durante el ensayo, Columnas Control Lago y Remediación-Lago 5 • 4 2 O o 10 5 20 15 25 T" ensayo remadlaclón mar 18 16 14 12 10 8 6 4 2 O & O • ••• • 5 • •• 10 15 Gráfica N° 28: Gráfica dispersión Temperatura durante el ensayo, Columna Control Mar y Columna Remediación-Mar & • 20 25 En ambos casos, Columnas Remediación-Lago como Columna Remediación-Mar se observan variaciones alrededor de este óptimo, consistentes en la habilidad del sistema para regularse en relación a la temperatura ambiente. -Página 33 de 130· INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.2.3.3.- Evolución pH de los ensayos Al observar la Tabla NO 29, observamos claramente que en los lodos contaminados se genera una acidificación, donde el LLP (Lodo Lacustre Problema) posee un pH levemente más ácido de 6,66 en relación al pH del LLC (Lodo Lacustre Control) 7,2. Del mismo modo el pH del LMP (Lodo Marino Problema), es levemente inferior al pH del LMC (Lodo Marino Control). NO 29: Muestras de sedimentos lacustres y marinos Tabla pH MUESTRA LLC: Lodo Lacustre Control LLP: Lodo Lacustre Problema LMC: Lodo Marino Control LMP: Lodo Marino Problema 7.2 6.66 7.52 7.43 Gráfica N° 30: Gráfica de dispersión pH durante el ensayo, Columnas Control Lago y RemediaciónLago pH pruebas ramediación lago 8 7.8 7.8 7.4 7.2 7 6.8 6.6 6.4 - 6.2 -.. . • -.-. • .• • • - 8 o : .• 10 5 • .• 20 15 25 Gráfica N° 31: Gráfica dispersión pH durante el ensayo, Columnas Control Mar y Remediación-Mar pH pruebas ramedlaclón mar 7.6 7.4 7.2 7 6.8 6.6 6.4 6.2 6 . .~ 8 7.8 ~ lO •• • o 5 10 • ... --] • pH Control ~ pHE",,!y'o 15 -Página 34 de 130- 20 25 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Tabla N° 32: Reacciones nitrificación y desnitrificación NH4+ NH20H + H+ + + 2e- + O2 H20~ Y:z O2 + 2 H+ ~ N02+ 2e ~ oao ~ + 5H+ H20 + 4 e- + biomasa H20 N03- + biomasa N02- + 0,5 O2 ~ 2 N03- + + NH20H N2 + H20 + 2 OH- + biomasa Podemos entender la deriva de la concentración de protones, y la leve alcalinización de los medios de reacción de las pruebas columnas del ensayo lago, por la aparición de especies oxidadas intermedias, como hidroxilaminas (NH20H) e iones hidroxilo. Este efecto es menos notorio para el caso marino que para los ensayos lacustres. Si bien en las reacciones qufmicas en juego existen productos que balancean el equilibrio, ya sea hacia lo acídico o alcalino (especies resaltadas: H+, OH- NH20H); la observación experimental dice que la contaminación acidifica levemente los lodos, de este modo el estado normónico de los lodos tiende hacia la alcalinidad, a pHs levemente sobre el pH neutro. Por tanto, la acción del sistema remediador regula los niveles hasta niveles más cercanos al estado normomco. -Página 35 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.2.3.4.- Oxígeno disuelto La característica inicial de los lodos agotados era completamente anóxica con 0,08 mg/L en el caso de los lodos lacustres y 0,11 mg/L en el caso de los lodos marinos. Al evaluar la concentración de oxígeno disuelto, condición que se mantiene a pesar de la aireación realizada en las fases aerobias, nos encontramos con una observación interesante. En el caso de la columna de remediación lacustre, se produjeron dos peacks de concentración de oxigeno al inicio del primer ciclo denitrificante el dfa 2, en el cual se registró una concentración de oxigeno de 0.32 mg/L, y el dla 12, al inicio de la segunda fase anaerobia, en el cual se registró una concentración de 0.45 mg/L. Del mismo modo, se observó un peak similar en el ciclo de remediación DN en la columna marina, siendo el valor más alto alcanzado, 0.6 mg/L el dia 2 registrándose, manteniéndose alto en 0.5 mg/L el dfa 3. [02J disuelto pruebas I Gráfica N° 33: Gráfica 0.4~------------------------------------- dispersión Oxigeno disuelto durante el ensayo, Columnas Control Lago y RemediaciónLago t--"-'------------------------------------ ~.3 ti s.a.2 8 Lago - 0.5 e -e remedlaci6n 0.1 . .., ~----------------------- :!---,---------~.------------ • • • I '1, - • O~----~~----~------~------~----~ 10 5 O 25 20 15 tiempo (dla" [02J disuelto pruebas remediaci6n Mar I • 02 Dis. Control ~_[)s' 0.7 0.6 Gráfica N° 34: Gráfica dispersión -!--*------------------------------ Oxígeno disuelto durante el ensayo, Columnas Control Mar y Remediación-Mar ~ u_ Q5+--~------------------------ i 'i 1-------------------------------ti +-------------------------------8 Q2+--------------------------0.4 .§.0.3 0.1 Ensayo +---1---.....,.......!(--c--;;--;;-.,....-::---.....,-------::------------ O~----~----~----~~--~--~------~ • O • 9 .".. 5 • .". 10 15 20 25 tlempoldla" La observación de los peacks de concentración de oxigeno en las etapas Oenitrificantes (ON) son interesantes, aunque no existe ninguna base dentro del estado del arte que apoye alguna teone de la formación de oxigeno molecular a partir de las especies nitrogenadas oxidadas, nitrato o nitrito. -Página 36 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.2.3.5.- Potencial Enero 2010 Redox Se parte de la premisa que los lodos contaminados en un estado más oxidado (Bushmann, 2005). con la gran concentración de materia orgánica están Las variaciones de potencial Redox deben ser compatibles a los ciclos de remediación. El ciclo denitrificante es un ciclo reductor, donde a partir de especies nitrogenadas oxidadas (Nitritos y Nitratos) se llega a nitrógeno molecular gaseoso: especie nitrogenada reducida (Kishida, 2003). El ciclo nitrificante en cambio es un ciclo oxidante, donde a partir de una especie nitrogenada reducida (amonio), se producen nitratos y nitritos, especies nitrogenadas oxidadas. En las gráficas siguientes, se expresa las variaciones en ORP (Oxido reduction Potencial). ORP pruebas remedlación lago 200 - ::~!-.-.------------'--------------- i E 50 .!-------.--- • ORP Control -.--~5 ----,~O----~,5~· - o r' .: -·····1 I~E~ayo --------------20 Gráfica N° 35: Gráfica dispersión Potencial Redox durante el ensayo, Columnas Control Lago y Remediación-Lago 25 lIempoldl •• , ORP ensayllll ",mediación mar 200 100 j------------------------------ >" I : o -100 f----• __---• 5 • 1:o __----~--~--~ • 10 -.c ,15 20 25l;::;~ -200 +--------~~-.-.----------------- Gráfica N° 36: Gráfica dispersión Potencial Redox durante el ensayo, Columnas Control Mar y RemediaciónMar tiempo tela •• En ninguno de los dos casos se observa que al término de la experiencia se tengan valores más bajos de potencial en los ensayos inoculados con bacterias en comparación a los controles. Sin embargo si comparamos punto a punto, de los 13 puntos mostrados para el experimento remediaci6n Lago, ocho son más bajos para el ensayo inoculado que para el control; del mismo modo para el ensayo marino seis de los trece puntos están más abajo. -Página 37 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.2.3.6.- Evolución concentración especies contaminantes • AMONIO Gráfica N° 37: Gráfica porcentajes de remediaci6n de Amonio durante el ensayo, Remediaci6n-Lago I AmoniO rilQIL REIIEDlAClÓN AMONO CNitI 'lft relativo movll I i -2 Columna pero media mólAl (Amonio m¡jL) 15O%------------------------l 100% +--------- -150% En el ensayo lacustre, como observamos en las figuras, y a pesar de lo previsto se observa una deriva de la concentraci6n de Amonio coherente a lo esperado: disminuci6n-aumento-disminuci6n. Se observan los efectos claros de remediaci6n el dla 12, luego de un ciclo DN y un ciclo N. La disminución de los niveles de amonio el dfa 11 antes de la nueva inoculaci6n de bacterias DN, se puede entender como la reacci6n de las bacterias que aún están en el sistema. Gráfica N° 38: Gráfica porcentajes de remediaci6n de Amonio durante el ensayo, Columna Remediaci6n-Mar 25 En el ensayo Marino, como observamos en las figuras, al igual que en el Lacustre, se observa una deriva de la concentraci6n de Amonio coherente a lo esperado: leve disminuci6n-aumento-disminuci6n. Se observan los efectos claros de remediaci6n el dla 14, luego de un ciclo DN y un ciclo N. Notar que este efecto en el caso lacustre se observ6 dos dfas antes. Los controles se mantienen cercanos al valor inicial durante toda la prueba. -Página 38 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 • NITRITO Gráfica N° 39: Gráfica porcentajes Remediación-Lago Enero 2010 de remediación de Nitrito durante el ensayo, 1 __ IREMEDlAClÓN NTRlTO (HOz) i % ral.tlvo mOYiI ""( Columna .. -2 pero media mÓloiI . (Nitrito mg/L) 100% ~+---~~~ -100% .J-- 5__~-.-aH 11 13 ~~~~l --'~L.-I!!~~~L.__1L 1920 __18----~ ...•.. -150% l2OO%--,-..;;...._=-__.Al comienzo del ensayo, se observó un aumento drástico de la cantidad de nitrito en la fase inicial de remediación -coherente a la acción de las bacterias denitrificantes- la tendencia general en el ensayo fue la disminución de los valores de concentración de nitrito, sin embargo las medidas son sólo referenciales por encontrarse en el limite de detección de la técnica. Gráfica N° 40: Gráfica porcentajes Remediación-Mar [REMEDlAClÓN NTRlTO (H02) % ral.tlvo mOYiI I I :: de remediación _ de Nitrito durante el ensayo, Columna NitrIto mg/L +-------- 400 200 o -200 Se observa un peak en la concentración de nitrito el día 8 y posteriormente un gran peak de la concentración de Nitrito el dla 12, al comenzar el segundo ciclo Oenitrificacnte (ON), el desfase en relación al ensayo Lacustre se puede entender por lo tenito del ensayo mar en relación al ensayo Lacustre. Si bien el Nitrito es una de las especies a remediar, su aumento relativo en este ensayo se puede comprender dentro del restablecimiento de los ciclos naturales, como especie intermedia de la oxidación a nitrato y posteriormente el paso a Nitrógeno gaseoso. -Página 39 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Grctfica N° 41: Gráfica Dorcentaies de remediación de Nitrato durante el ensavo. Columna Remediación-Laao 1_ % relatilos IREMEDlAClON tlTRATO (NOJ) i '" relativo I~ :-2 150% I 100% I 50% I 0% I -50% +------------- Io8riaci6n I pero meda mólAl(%1 relatiws I I movll 108Iiaci6n) 1 ----------1 - 1 I ::: 1------- =------;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;,...;;;;,...~ Concordante a lo esperado, se observa una variación de los niveles de Nitrato acorde a la actividad de los ciclos DN: aumento al inicial y al final concordante a los ciclos N: con la disminución en los niveles al medio del experimento. Gráfica N° 42: Gráfica porcentajes de remediación de Nitrato durante el ensayo, Columna Remediación-M~r IREIIEDlAClóN tlTRlTO (N02) I I '" _Nitrato relativo movll 200 -2 per_ meda mólAl(Nitrato) --------------------1 ---------------------..--...---- 150 100+-----------------~~~--50 O -I--~~_._~~~_ •.•.•• -50O 1 2 -------------- -----~ Del mismo modo que para el caso que para el ensayo Lacustre y concordante a lo esperado, se observa una variación de los niveles de Nitrato acorde a la actividad de los ciclos DN: aumento al inicial y al final, y concordante a los ciclos N: con la disminución en los niveles al medio del experimento. -Página 40 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.2.4. CONSTRASTACION MEDICIONES LABORATORIO Enero 2010 EXTERNO A continuación se presentan los resultados obtenidos en un laboratorio externo para contrastación nuestros resultados. Para evaluar se comparó respectivos. en tiempo final los valores obtenidos en los ensayos de y sus controles Tabla N° 43: Mediciones laboratorio externo, ensayo Remediación Lago y Control Lago Parámetro Nitrato Nitrito Amonio Unidad mglL mglL mg/L lago día O < 0,10 < 0,05 9,71 control día 20 <1 <0,05 12,3 lago día 20 <1 <0,05 9,5 % remediaci6n control dla 20 YS -22,8 Tabla N° 44: Mediciones laboratorio externo, ensayo Remediación Mar y Control Mar Parámetro Nitrato Nitrito Amonio Unidad mg/L N-N03 mg/L N-N02 mgJL N-NH3 mar día O < 0,10 < 0,05 29,4 control día 20 <0,1 <0,05 18,8 mar día 20 0,2 <0,05 11,9 % remediaci6n vs control día 20 -36,7 De los analitos observados solo se pudO tener valores del Amonio. Encontrándose una disminución en un 22% para el caso del ensayo Lacustre y de 37% en el caso del ensayo Marino. -Página 41 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.3. FORMULACIÓN DEL PRODUCTO Fecha de ejecución: meses 7,8,9 Y 10 (Abril-Julio 2008) ACTIVIDAD Objetivo Desarrollar una formulación farmacéutica para uso industrial, que permita la aplicación de un nuevo principio activo bacterial en el tratamiento de los fondos marinos y lacustres, afectados por la actividad acuícola. En base a los requerimientos planteados, se definió que la forma farmacéutica más adecuada para cumplir con los objetivos esperados es un elemento comprimido del tipo tableta, que tras su desarrollo, deberá ser capaz de transportar al fondo marino el principio activo que realiza la biorremediación requerida. Descripción de metodología empleada para el desarrollo Para realizar el estudio requerido, se completaron un conjunto de tareas (o etapas) siguiendo metodología lógica indicada en el diagrama N° 45. la ResII1ce,ones FIsoeo-Oufmoeas !lel PnnclptO Actovo Diagrama NfI45: Esquema metodológico empleado para el desarrollo del estudio El desarrollo fue de naturaleza recursiva en algunas de las tareas realizadas en las cuales no se alcanzaron los resultados esperados, hasta obtener mediante ensayos sucesivos la mejor aproximación a las características establecidas en las condiciones de diseño. La descripción de las condiciones establecidas ylo actividades desarrolladas en cada una de las etapas indicadas es la siguiente: -Página 42 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.3.1. DEFINICIÓN DE CRITERIOS GENERALES Enero 2010 DE DISEÑO En esta etapa preliminar del desarrollo se tuvieron en cuenta el siguiente conjunto de requerimientos especificos (o resultados esperados) a ser cumplidos por la nueva forma farmacéutica: o o Debe servir como transporte del principio activo hacia el fondo marino o lacustre que se requiere remediar. Esto significa que la forma farmacéutica a desarrollar debe poseer una densidad final mayor a la del agua, de manera de permitir su hundimiento directo, una vez aplicada en la superficie del lugar que se espera tratar. Debe poseer una forma tal que evite su ingestión por parte de los peces u otra biota presente en la zona de aplicación de la forma farmacéutica. o Debe ser capaz de viajar al fondo marino o lacustre sin romperse o desintegrarse trayecto ni en el momento de contacto con el fondo. durante su o Su forma debe ser amigable en presentación y debe facilitar su fabricación, posterior transporte. o Los elementos componentes empleados (excipientes) deberán en lo posible ser de naturaleza amigable con el medio ambiente, estándar o comercial, de manera de conseguir un producto final que sea viable tanto desde el punto de vista ambiental, técnico y económico. manipulación y Las condiciones que deberán ser consideradas para el desarrollo serán: }oo solvente: agua salada yagua dulce }oo rango de temperatura entre 5°C y 15°C }oo rango de profundidad de aplicación entre 15m y 40 m En base a los requerimientos anteriores, se estableció que la forma farmacéutica más adecuada para cumplir con los objetivos planteados seria un comprimido de forma cilíndrica, con un diámetro de 8 cm. 1.3.2. DETERMINACiÓN DE LAS CONDICIONES FíSICO-QuíMICAS DEL PRINCIPIO ACTIVO Se suministró como principio activo para desarrollar la formulación farmacéutica, muestras de material liofilizado, con propiedades variables entre las distintas posible caracterizar fisicamente como sigue: un conjunto de muestras, el que fue }oo Color: Café rosáceo variando de pardo a oscuro }oo Olor: Variable desde inodoro a sulfurado }oo Rango de densidad específica granel (g/cm3): desde 0,3 hasta 0,7 (Nota: Muy dificil de medir debido a la variabilidad de los liofilizados) }oo Humedad: No medida, aparentemente }oo Tamafio de partícula: Variable, las muestras se presentaron en estado agregado, por lo cual se requirió de un proceso previo de desagregación antes de la etapa de preformulación -Página 43 de 130- baja ya que se presenta seco INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.3.3. SELECCIÓN PRELIMINAR Enero 2010 DE EXCIPIENTES Para el diseno de la formulación del elemento comprimido se identificó un conjunto de excipientes comerciales de amplio y permanente uso en la industria farmacéutica nacional, a partir de 105 cuales se seleccionó el siguiente grupo funcional en base a su conveniencia y disponibilidad: o o o o Diluyentes (fillers): o Carbonato de Calcio o Carbonato de magnesio o Celulosa Vegetal Microcristalina o Sulfato de Calcio o Lactosa Anhidra o Almidón de malz Aglutinantes o Glucosa Microcristalina o Sorbitol o Almidón de maíz (se usó también como filler) o Sacarosa Lubricantes o Estearato de Magnesio o Talco Desintegrantes o Carboximetilcelulosa o Hidroximetilcelulosa o Lactosa Anhidra (se usó también como filler) -Página 44 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 1.3.4. FORMULACIÓN PRELIMINAR Enero 2010 DE LOS COMPRIMIDOS Utilizando un conjunto bastante diverso de excipientes, se estableció tentativamente un conjunto inicial de formulaciones, el que fue paulatinamente mejorado en base a la retroalimentación de los ensayos físicos realizados en laboratorio. La tabla N° 46, muestra el resumen de formulaciones que fueron consideradas en el estudio. Tabla N° 46: Resumen de formulaciones ensayadas para el desarrollo del estudio N· Fonnulación excipiente ('la) Principio ActIvo Wofilizada Bacterial Dlh"nte. ,filie,.): Carbonato da CalCIO Carbonato de maanesio Celulosa Microcrislllina Sulfato de Calcio Lactosa Anhidra Almidón de m.íz 1 2 3 " 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 70 70 70 40 70 50 60 40 50 60 40 50 21 22 23 60 40 50 19 49 50 55 50 44 39 1 1 100 100 4 4 Total 100 200 2 72 70 70 70 70 28 2B 28 28 28 28 29 29 29 29 29 29 29 29 29 40 28 49 28 28 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 30 20 10 100 100 4 100 100 4 100 100 4 1 1 1 30 20 10 100 100 4 100 100 4 100 100 4 1 1 1 30 20 10 100 100 4 100 100 4 100 100 D•• In~lIrlnte. Carboximetilcelulcsl Hidroximetilcalulosa Lactosa AnhIdra Total ¡o,;, I TOlal/or91 N" Mueslras Ensa -adas 20 10 lubricante. Ellearato de rAsan.sio Talco 19 10 AglutJnlnte. Glucosa Anhidra Sorbrtal Almidón de maíz Sacarosa 18 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 100 100 2 4 1 1 1 100 100 4 100 100 100 100 4 Una vez preparadas las formulaciones preliminares, se las sometió a un exhaustivo mezclado manual de manera de lograr una distribución homogénea de los componentes antes del proceso de confección de prototipos mediante compresión . • -Página 45 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.3.5. CONFECCIÓN DE PROTOTIPOS Los comprimidos prototipos fueron fabricados mediante la utilización de un molde de laboratorio, diseñado y confeccionado para cumplir con los estándares impuestos en los criterios generales de diseño. El molde empleado, fue fabricado en tres partes que le otorgan la funcionalidad deseada (Figura N° 47): La base que soporta el conjunto completo, la cámara que contiene el producto y permite el desaireado de la mezcla y el émbolo que transmite hacia el compuesto la presión hidráulica recibida de una prensa, permitiendo así la formación de la forma comprimida. Figura N° 47: Molde para confección de prototipos de comprimidos para ensayo La prensa utilizada en conjunto con el molde, es de accionamiento hidráulico manual, para uso industrial, con capacidad máxima de cierre de 15 toneladas, y se encuentra provista de indicador manométrico. Figura N° 48: Prensa hidráulica para confección de prototipos de comprimidos para ensayo. Manómetro Accionamiento Manual Pistón Hidráulico -Páglna 46 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 El procedimiento de fabricación de los prototipos consistió en las siguientes etapas: Figura N" 49: Armado conjunto base y cámara del molde. Figura N" 50: Llenado de cámara con la formulación a comprimir. Figura N" 51: Cierre del molde con el émbolo. Figura N° 52: Compresión del molde lleno en prensa. -Página 47 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Figura N° 53: Desarme de base del molde Figura ~ 54: Compresión del molde sin base para soltar el comprimido. Figura ~ 55: Obtención del comprimido formulado -Página 48 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 1.3.6. PRUEBAS Y ENSAYOS FíSICOS REALIZADOS Enero 2010 A LOS PROTOTIPOS Los comprimidos prototipos obtenidos mediante compresión directa con el molde y la prensa laboratorio, fueron sometidos a las siguientes mediciones y ensayos: • de Densidad Compactada 3 La densidad compactada en todos los casos ensayados, se mantuvo en rangos entre 1,78 grs/cm y 2,28 grslcm3, con lo cual se asegura que ninguna de las formulaciones alternativas tendría riesgo de flotar. No se aprecio un cambio significativo, en términos de, variaciones observadas en la densidad compactada, entre aquellos prototipos compactados entre 8 toneladas y el máximo de 15 toneladas. • Friabilidad La capacidad del comprimido para resistir al desmoronamiento producto de su manipulación. Fue clasificada cualitativamente para cada una de las formulaciones señalados y para las formulaciones indicadas en la Tabla N° 56. en los siguientes términos Tabla N° 56: Clasificación Cualitativa de Friabilidad Comportamiento Frente a la Abrasión Manual Resiste el roce de los dedos en sus bordes sin dejar rastros de residuos en los dedos. Clasificación de Friabilidad NO Formulación Muy Buena Los bordes no se rompen producto de la aplicación de un apriete moderado. Resiste el roce de los dedos sin desmoronarse, pero al tacto deja rastros o residuos en los dedos. No resiste el roce de los dedos, se desmorona pero sólo en los sectores aguzados de los bordes No resiste el roce y se desmorona o se parte frente a solicitaciones menores en los bordes o en cualquier parte del comprimido. -Página 49 de 130- Buena 1,2,4,5,6,12,15,18,20,22,23 Regular 3,7,9,10,11,13,14, 16,17,19,21. Mala 8 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 • Tiempo de desintegración Enero 2010 en agua Para asegurar que el comprimido no se rompa antes de alcanzar los fondos marinos o lacustres, y por otro lado asegurar que el comprimido si se desintegre en un periodo prudente de tiempo y libere así el principio activo motivo de su objeto. Se realizaron ensayos de desintegración en agua para todos los comprimidos prototipos formulados. Los resultados de los ensayos se clasificaron en categorías, de acuerdo al tiempo requerido por el prototipo para lograr su desintegración total y permitir asl la liberación del comprimido. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla N° 57. Tabla N° Comportamiento 57: Clasificación Cualitativa de desintegración en agua Frente a la Abrasión Manual El comprimido no se desintegra Clasificación de desintegración NO Fonnulación Malo El comprimido se desintegra en un tiempo mayor a 24 horas Bueno 1,2.4,5,6,22,23 El comprimido se desintegra en un lapso menor a 24 horas. Regular 3,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20, 21 1.3.7. RESULTADOS Las principales conclusiones obtenidas en el desarrollo de este estudio son las siguientes: o Se valida que la forma farmacéutica comprimida es la mejor alternativa para realizar la aplicación del principio activo, ya que se pueden lograr densidades adecuadas y tiempos esperados de desintegración. o Se validó que el principio activo mantuvo su viabilidad después de ser reconstituido del comprimido desintegrado. o La formulación final r.¡o 23 parece alcanzar los estándares planteados al inicio del desarrollo y debe por tanto ser probada en condiciones de uso industrial para validar lo obtenido en condiciones de laboratorio. -Página 50 de 130- a partir INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD 1.4. DEFINICIÓN DE LA DOSIS DEL PRODUCTO La dosis de producto fue definida en base a la actividad microorganismo nitrificantes y denitrificantes". Enero 2010 1.2. "Degradación de sedimentos con En estas pruebas se definió una dosis en base a ensayos de laboratorio y que tuvo como base de cálculo una concentración celular de 10 6 cel/ml en un reactor de volumen de 250 mi, con ello se obtuvieron los mejores resultados de biorremediación a esta escala. Esta concentración celular, respecto al volumen y área de las columnas de prueba, fue definida la dosis de producto, como "número de células por área de sedimento biorremediado", cel/Ha. De acuerdo a ello se determinó que para una Ha de suelo aculcola contaminado se requiero 30 gr de biomasa. Considerando para esta misma superficie una distribución espacial que cumpla con los aspectos de: a) Ser factible su manejo operacional en las salmoneras, tabletas razonable de manipular por dosis/mes lo cual quede reflejado en un número de b) Que las células queden distribuidas en el área uniformemente de manera de asegurar el biotratamiento lo más homogéneo posible (ver figura Ir 58 que representa la malla de distribución para una hectárea) En caso de requerir remediar un área más impactada esta dosis aumentará a 60 o 90 tabletas /Ha. De acuerdo a lo descrito anteriormente, se definió que el contenido celular en cada tableta es de un 10 % para tabletas de 100 gr c/u. El % restante corresponde a los excipientes que permiten que la tableta recorra el trayecto deseado sin desintegrarse, hasta llegar a los fondos marinos o lacustres según corresponda, y ahr liberar el principio activo durante 30 días al entrar en contacto con los sedimentos (medios naturales de las bacterias que constituyen el principio activo del biorremediador). La dosis fue proyectada con el fin de abarcar de manera lo más uniforme posible la hectárea tratada, dado que un menor número de tabletas significa la posibilidad de dejar zonas sin tratar y, por el contrario, un mayor número de tabletas, significa mayor dificultad operacional, lo que no haría atractivo comercialmente el producto en una faena productiva. A continuación la malla de distribución pensada para el tratamiento de 1 Ha de superficie. La idea es concentrar las tabletas en 15 puntos, que permitan cubrir de la mejor manera el área deseada, sin que esto constituya un problema operacional para el cliente. La distribución considera por tanto, 1,2 o 3 tabletas por punto, es decir, 30, 60 o 90 tabletas/Ha función del grado de impacto. e: ~ o o ) o > o o Figura NO 58: malla de distribución de las tabletas en una hectárea de fondo aculco/a o I ,J. -Página 51 de 130- en INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD 1.5. CARACTERIZACIÓN Fecha de ejecución: Enero 2010 DE SEDIMENTOS Mes 4, 5- Enero y Febrero 2008 Objetivo: Realizar un monitoreo tipo INFA para identificar cualitativamente y cuantitativamente cual es el impacto ambiental generado por el centro de cultivo en su entorno. Dicho monitoreo fue realizado por la empresa Consultora en Control de Calidad y Medio Ambiente Geeaa Ltda. El monitoreo se realizó en el centro de salmones Marine Harvest y emplazado en la X Región. categorfa 3, Huelmo, perteneciente a la empresa Descripción: Las actividades realizadas fueron: 1.5.1. MUESTREO EN TERRENO Para la realización del análisis del sedimento que se solicitó, fue necesario la extracción del mismo y que al igual que en la actividad W 1 ésta se llevó a cabo mediante draga, la cual está confeccionada completamente en acero inoxidable, posee diseflo de gatillo que asegura que las rnandlbulas permanezcan abiertas durante el descenso. El volumen del muestreo es de 1800 cm" 'dragado (aproximadamente). ~. \ •......... l Figura N° 59: Draga Figura Ir' 60: Embarcación para el muestreo Se usó una embarcación con las siguientes caracterfsticas: 6,30 m de largo, 1,9 m de ancho de fibra de vidrio (lancha inscrita para actividades oceanográficas y otros). Figura N° 60 -Página 52 de 130· INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 A continuación, imágenes de la toma de muestra: Figura N° 61: Vista del centro de Salmones Huelmo, X Región Figura Figura Ir' 63: Muestra Ir' 65: Medici6n de sedimento de Temperatura -Página 53 de 130- Figura N° 62: Draga de extracci6n de sedimento Figura Ir' 64: Medición Figura de parámetros in situ NO 66: Disposici6n de las muestras INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 1.5.2. ANÁLISIS EN LABORATORIO Se tomaron muestras de las 8 estaciones de muestreo y de 2 estaciones de referencia o controles (alejadas de los centros y que sirven de control de sedimento no contaminado). De cada una de estas 10 estaciones se tomaron 3 réplicas. Tras la obtención de las muestras se procedió al análisis de los resultados parámetros para clasificar el centro en función del grado de impacto. y determinación Las estaciones se definieron tal como muestra la siguiente tabla N° 67: Tabla N° 67: Plano de estaciones de muestreo Estación N" Fecha HonI:Mlnuto UTlI_E urll_N Longitud Latitud Geoar6llc:a Geoar.nc. 11:30 12:20 663163 663279 5383136 41°41'12.61" 5383517 41°41'00.18" 13:10 662884 73"02'22.12" 73002'17.48" 44 41°40'53.86" 41°41'02;19" 73002'34.76" 55 73002'42.42" 38 5383690 5383409 41°40'55.02" 73002'43:85" 41°41'04.10" 663130 5383318 39 39 52 663035 5383422 41°41'06.74" 41°41'03.44" 73002'41.97" 73002'23.73" 73002'27.94" 50 663520 663317 5382556 5382548 73002'06.12" 73002'14,89" 38 27 1 21-01-2008 2 3 4 21-01-2008 21-01-2008 21-01-2008 14:00 862701 5383721 5383468 5 21-01-2008 8 7 21-01-2008 21-01-2008 14:50 15:40 862673 662710 16:30 8 Ret,1 Ret,2 21-01-2008 21-01-2008 17:20 18:10 19:00 21-01-2008 Profundidad audelml 41°41'31.14" 41°41'31.55" 65 1.5.3. RESULTADOS ;.. Descripción organo/éptica del sedimento: • • • • ;.. Color: Café oscuro Olor: en general, sin olor Textura: arenosa Temperatura: 12,7° C promedio Materia orgánica (%). Tabla N° 68 Porcentaje Materia Orgánica Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Estación 1 0,76 0,84 0,84 0,81 Estación 2 1,09 1,20 1,04 1,11 Estación 3 1,22 1,29 1,14 1,22 Estación 4 1,01 0,98 0,96 0,98 Estación 5 1,01 1,13 1,10 1,08 Estación 6 1,28 1,40 1,50 1,39 -Página 54 de 130- Promedio los de INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Estación 7 ~ Enero 2010 1,83 1,14 1,02 1,33 Estación 8 1,03 0,94 1,00 0,99 Referencia 1 0,77 0,91 0,93 0,87 Referencia 2 0,97 0,93 1,02 0,98 pH Y potencial Redox. Tabla N° 69 Potencial ~ ESTACION REDOX(mV Ag/AgCI) pH 1 5 7,1 2 7 7,8 3 -48 7,6 4 19 7,9 5 7,9 6 -34 -8 7 -124 13,7 8 133 7,2 Referencia 1 173 7,6 Referencia 2 223 7,4 7,9 Perfil de oxigeno disuelto y temperatura. Tabla N° 70 Perfil de oxigeno disuelto en la columna de agua Capa Profundidad (m) Oxígeno disuelto (mglL) Temperatura (OC) Salinidad (PSU) 15,3 30,0 Porcentaje de saturación (%) 1 O 8,6 2 -5 8,7 15,1 30,0 100 30,7 100 100 3 4 -11 8,9 14,0 -16 8,9 12,9 31,3 98 5 -20 8,9 11,6 32,2 96 6 -25 8,5 11,2 32,3 95 7 -30 7,8 10,8 32,6 86 6 -40 7,1 10,7 32,6 79 7 -42 6,3 10,6 32,7 70 -Página SS de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ~ Enero 2010 Macrofauna bentónica Tabla N° 71: Macrofauna bentónica para la estación N° 1 Phytlum Cirratulidae Glvceridae Glycera sp. Lumbrineridae Lumbrineris sp. Nephtvidae Nephtys sp. Phyllodocidae Eteooe sp. Prionospio sp. Nereidae Nereidae Polvnoidae PoIynoidae Ampharetidae Ampharetidae Terebellidae Terebellidae Syllidae Syllidae Flabelligeridae Flabelligeridae Paraonidae Polygordiidae Phoxocephalidae Cumacea Aoridae Diastylidae Mollusca Nemertina Echinodermata Nassaridae Réplica 2 RépDca3 40 10 30 50 10 70 30 10 10 20 280 10 10 Aoridae Mytilus chilens;s Aul8comya Btra Nsssarius Nuculidae NucuJa pisum Tindariidae Tíndaria striBta Verenidae T8Weragayi Nemertina Nemertina n d. Ophiuroidea Ophiuroidea n.d. Echinidae LDxechinus a/bus Schizasteridae Schizasteridae -Página 56 de 130 60 10 10 10 10 30 is 10 240 10 10 10 30 40 30 10 10 10 190 19 N° detaxa 20 10 Paraonidae Schistomeringos PoIygord;us sp. Phoxocephalidae Mytilidae Réplica 1 10 s soederstroemi Spionidae Dorvilleidae Arthropoda S· Número de Individuos en la muestra c:IenIifIco Cirratulidae Spionidae Annelida Nombnt Familia 10 20 80 10 11 10 10 280 20 20 10 10 10 10 40 240 10 20 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Tabla N° 72: Macrofauna bentónica para estación de referencia N°1. Phyllum Annelida Arthropoda Mollusca Nemer1ina Echinoderrnata Número de individuos en la muestra Familia Nombre cientifico Cirratulidae Cirratulidae 2 Glycendae Glycera sp. 20 Nephlyidae Nephtys sp. Prionospio sp. 40 Amphinomidae Amphinomidae Goniadidae Goniadidae Paraonidae Paguridae Paraonidae Pagurus sp. Lysianassidae Lysianassidae Phoxocephalidae Phoxocephalidae Diastylidae Nuculidae Nucula pisum Nemer1ina Nemertina n d. Ophiuroidea Ophiuroidea n.d. Echinidae Schizasteridae Loxechinus albus Schizasteridae N" de taxa Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 10 10 20 50 10 10 10 10 20 10 10 20 20 10 10 10 80 180 6 8 10 9 Estos valores obtenidos se tomarán como referencia a la hora de valorar el efecto del bioproducto. La valoración de la eficacia del producto se hará mediante comparación de resultados de los diferentes parámetros monitoreados, verificando asf la eficacia o no del producto en desenouo. -Página 57 de 130 40 10 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 C.2. ETAPA 2, DISEÑO DEL PROCESO EN CONDICIONES REALES PRODUCTIVO, Enero 2010 PRODUCCIÓN PROTOTIPO Y EVALUACIÓN A continuación la Carta Gantt correspondiente a esta segunda etapa y la descripción de las actividades realizadas para lograr los hitos de esta fase. Objetivo Disenar el proceso a escala piloto, producción prototipo y evaluación del producto en condiciones reales. -Página 58 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD Enero 2010 2.1: DISEÑO DEL PROCESO, DEFINICiÓN DE EQUIPOS Y ADQUISICiÓN Fecha de ejecución: Noviembre 2007 a Julio 2008 Objetivo: Definición de la línea del proceso y 105 equipos para su adquisición. Descripción: Se solicitó el diseno a nivel de ingenierla en detalle de un biorreactor piloto, con las siguientes especificaciones e indicando que el biorreactor será usado para fermentaciones de suspensiones microbianas nitrificantes (aerobias) y desnitrificantes (anóxicas). Tabla N° 73: Especificaciones para el disei10 del biorreactor piloto. Valor solicitado ESR!cificación 1.000 L 0,95 m 25 o C Volumen de reacción de la unidad Diámetro máximo de la unidad (T) Temperatura de fermentación Sistema de esterilización Con vapor saturado Para el diseño del sistema se entregaron 105 siguientes parámetros cinéticos de la suspensión microbiana nitrificante y desnitrificante. Se seleccionaron 105 valores máximos para cada una de las suspensiones. Tabla N' 74: Parámetros cinéticos y ffsico-qufmicos de las suspensiones nitrificantes y desnitrificantes entregadas. SusR!nsión nitrificante SusR!nsión desnitrificante Velocidad especifica máxima de crerecimiento, IJm (h-1), 0.013 (cepa N lago) 0.28 (cepa DN lago) Viscosidad dinámica, v (cst) 1.225 (cepa N mar) 1.085 (cepa DN lago) -Página 59 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.1.1. CALCULaS Enero 2010 DE DISEÑO 2.1.1.1. Volumen y dimensiones del equipo Las dimensiones de la unidad se entregan en la Tabla N° 75. La nomenclatura puede observarse en la Figura N° 76. Todos los cálculos de diseno, relaciones geométricas de la unidad y sus componentes, fueron efectuados respetando las recomendaciones dadas por la literatura. Tabla N° 75: Dimensiones del biorreactor piloto. Especificación Valor Volumen total de la unidad (V) Volumen de reacción (VL) Diámetro de la unidad (TB) Numero de deflectores Altura total de la unidad (H) Altura de liquido de la unidad (HL) 1.5 m3 1.0 m3 0.85 m Restricción impuesta o Recomendación considerada <=0.95 m 4 2.80 m 1.82 m t J A Figura Ir 76: Esquema del biorreactor y el sistema de agitación, usando la nomenclatura estándar usada en equipos de fermentación. ~ , t ' .. F t E te o +----T-------a. Las dimensiones del sistema de agitación y los deflectores con que contará la unidad se presentan en la Tabla N° 77. Se seleccionó un rotor de turbina de disco, turbina de Rhunston, que es el clásicamente usado en fermentaciones aerobias, por su alta eficiencia en la dispersión de gases en medios liquidos y además de que resulta adecuado según los valores de la viscosidad de la suspensión. Se usaran 3 rotores de modo de satisfacer los requerimientos de agitación dado el volumen y las dimensiones de la unidad. -Página 60 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Tabla tr 77: Enero 2010 Dimensiones del sistema de agitación y deflectores del biorreactor piloto. Turbina de disco (de Rhunston) Tipo de rotor seleccionado 0,38 m Diámetro rotor (O) Numero de aspas Altura ubicación rotor 1, Altura ubicación rotor 2, E+ Altura ubicación rotor 3, F+E+ Ancho deflector (J) Diferencia rotor 3-nivel liquido (A) e e 6 0,3m 0,9m 1,5 m 0,08 m 0.32 m e 2.1.1.2. Aireación Para estimar el flujo de aire requerido a suministrar se deben calcular previamente las demandas en oxigeno de los cultivos microbianos. En este caso la demanda de las suspensiones microbianas nitrificantes. Estos valores serán también usados para estimar la generación de calor metabólico de los cultivos microbianos. 81) DEMANDA DE OXIGENO PROCESO DE NITRIFICACION En la Tabla N° 78 se aprecia la demanda de oxigeno del cultivo nitrificante. La concentración celular fue fijada de modo de obtener una demanda en oxigeno posible de ser satisfecha por el sistema de aireación, así como también una generación de calor factible de ser retirada por el sistema de refrigeración. Se fijó una concentración celular máxima, obtenida al final de la fase exponencial de crecimiento. igual a 4.5 g biomasa·L-1. Tabla N° 78: Demanda de oxigeno del cultivo nitrificante y parámetros cinéticos considerados Parámetro Velocidad especifica de crecimiento (IJ) Concentración celular máxima (XfNIT) Rendimiento oxigeno en células (V02) Velocidad de consumo de oxigeno (NA) Velocidad de consumo de oxigeno (NA) en su determinación. Valor considerado Unidades 0,013 h-1 4,5 0,018 3,3 102 gSSV.L-1 gSSV.g02-1 g02.L-1.h-1 rnrnoles02.L-1.h- 82) DEMANDA DE NITROGENO PROCESO DE DESNITRIFICACION -Página 61 de 130- Consideración o Referencia Laboratorio Impuesta Ruiz, (2000) INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 En la Tabla N° 79 se aprecia la demanda de nitrógeno del cultivo desnitrificante, obtenida según los valores incluidos en la misma Tabla ND 79. Esta demanda fue usada para estimar la generación de calor metabólico del cultivo desnitrificante. La concentración celular máxima quedó fijada en 5.0 g blomasa-L1, para que la generación de calor del cultivo pueda ser retirada por el sistema de refrigeración. Tabla ND 79: Demanda de oxigeno del cultivo desnitrificante y parámetros cinéticos considerados en su determinación. Valor considerado Parámetro Velocidad especifica de crecimiento (IJ) Concentración celular máxima (XfDES) Rendimiento nitrógeno en células (YN) Velocidad de consumo de nitrógeno (NAN) Velocidad de consumo de nitrógeno (NAN) 0,28 5 1,2 1,2 83 Unidades Consideración o Referencia Laboratorio h-1 gSSV.L-1 Impuesta Ruiz, (2000) gSSV.gN-1 gN.L-1.h-1 mmolesN.L-1.h-1 83) FLUJO DE AIRE REQUERIDO El flujo de aire necesario para satisfacer las necesidades del cultivo nitrificante se presenta en la Tabla ND 80. En ella se incluyen las principales variables que fueron consideradas para la obtención de este flujo. Tabla N° 80: Flujo de aire requerido y variables operaciones consideradas en su determinación. Unidades Parámetro Valor Velocidad de consumo de oxigeno (NA) Temperatura suministro aire (T) 102 298 Presión del aire (P) 2 Atm absolutas Eficiencia de transferencia del aire, E Flujo de aire por volumen de reactor (WM) Flujo de aire (F) 0,15 0,66 657 Laire- L-1' min-1 Consideración o Referencia mmolesoz- L-1' h-1 K Temperatura fermentación Presión de trabajo < 0.7 tairemin-t 2.2.2.3. Potencias de agitación Se estimaron las potencias de agitación sin y con aireación del equipo. El segundo valor, con aireación, es sustancialmente menor al primero por efecto de la presencia de burbujas de aire en el medio. Sin embargo dado que se efectuaran fermentaciones con suspensiones desnitrificantes (anóxicas), se utilizara como valor de diseno la potencia de agitación sin aireación. -Página 62 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 2.1.1.4. Transferencia Enero 2010 de calor Se calculó el calor metabólico generado por los procesos de nitrificación y desnitrificación y se evaluó el calor transferido entre el biorreactor y el medio ambiente producto de las diferencias de temperatura entre ambos. El metabolismo celular es una reacción global exotérmica. Por lo tanto si se desea operar una fennentación a una temperatura constante prefijada (25 "C para las fennentaciones consideradas), será necesario remover ese calor de fermentación (OF). En la Tabla N° 81 se presentan los valores respectivos de las distintas formas de calor y las consideraciones efectuadas para su estimación. Tabla N° 81: Cuantificación de las formas de calor consideradas en el balance de energia efectuado al biorreactor. Valor Parámetro Calor Calor Calor Calor Calor Calor Calor de fermentación nitrificación (OFN) de fermentación desnitrificación (OFO) de agitación nitrificación (QAN) de agitación desnitrificación (OAO) transferido por las paredes (OP) total a intercambiar nitrificación (OIN) total a intercambiar desnitrificación (010) 2188 10000 1219 1000 -1177 14583 12177 Unidades Kcalh-t Kcal h-1 Kcalh-t Kcalh-t Kcal'h-1 Kcal-h-t Kcalh-t Consideración Referencia T ambiente 35D o e Como se aprecia en la tabla los procesos de nitrificación requieren de un intercambio de calor superior al de los procesos de desnitrificación. Equipo de enfriamiento El sistema de enfriamiento fue diseñado para satisfacer la condición de intercambio de calor más exigente de los procesos de nitrificación con un margen de seguridad de 10%. Como sistema de enfriamiento se selecciono un serpentin sumergido en el caldo de cultivo, dado su bajo costo y la alta área de transferencia de calor que permite. Como fluido refrigerante se utilizara agua. En la Tabla Ir 82 se presentan los distintos valores de diseño del sistema de enfriamiento y las consideraciones efectuadas: -Página 63 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Tabla N' 82: Dimensiones del sistema de enfriamiento seleccionado: serpentfn sumergido. Valor Parámetro Coeficiente global de transferencia de calor (U) 500 Superficie de intercambio requerida (AS) 2.15 Diámetro tubo serpentfn 1 largo serpentrn (l) 26.9 Radio serpentln (R) 0.3 Avance serpentin (k) 0.1 Numero de vueltas (nV) 14.91 Altura serpentfn (HS) 1.49 Unidades Consideración o Referencia Kcal' h-1· m-2· DC-1 m2 pulgadas m m m m m 2.1.1.5. Esterilización Se estimaron los flujos de vapor necesarios para esterilizar el biorreactor y el medio de cultivo. De ellos podrá ser seleccionado el equipo de suministro de vapor adecuado. Se estimo la cantidad de energia necesaria, calor, para efectuar el proceso de esterilización, 0 considerando que se desea obtener una temperatura en la superficie de la unidad de 121 C. la superficie de esterilización corresponderá a la suma del área de manto y las áreas de las tapas de alto y fondo de la unidad. los resultados obtenidos y las consideraciones efectuadas se presentan en la Tabla N° 78. Tabla N' 83: Flujo de vapor requerido para esterilizar el biorreactor y consideraciones efectuadas. Parámetro Valor Unidades Coeficiente de convección Superficie de esterilización manto Superficie de esterilización tapas Calor requerido Calor de condensación del vapor Flujo de vapor 25 6.7 2.27 30000 538.9 60 Kcal h-t m-2·oC-1 m2 m2 Kcalh-t Kcal·kg-1 Kg'h-1 -Página 64 de 130- Consideración o Referencia 121 121 -c, -c, 1 atm 1 atm INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.1.2. LA Y-OUT DE PROCESOS En la Figura N° 84 se aprecia un esquema tipo lay-out del fermentador y de los sistemas auxiliares del proceso. En diferentes colores se muestran los sistemas auxiliares más importantes para la operación. Figura N' 84: Lay-out del fermentador y de los sistemas auxiliares del proceso. AIre s: PM M.~-up ~":J @ C~ Gv @ -H W ,t,'re <. •. Cdtvc 2.1.3. SISTEMAS AUXILIARES Sistemas de refrigeración Permite retirar el calor generado por el proceso fermentativo. Consiste en un intercambiador interno tipo serpentln que retira el calor de fermentación, mediante circulación de agua fria. Esta agua a su vez, es reciclada por una torre de enfriamiento, donde se desprende el calor retirado del fermentador y reinyectada al equipo a través de una bomba. En la torre de enfriamiento se considera un "make-up" de agua para reponer las perdidas por evaporación. En este sistema, existen 2 lazos de control básicos: ~ ~ Lazo Control Temperatura Fermentador. este lazo de control obtiene la temperatura del fermentador y actúa sobre la bomba de recirculación, que inyecta agua fria al serpentln del fermentador. Lazo Control Nivel agua en enfriador. este lazo mantiene el nivel dentro de un rango que permita a la bomba de recirculación operar en forma correcta. El lazo de control verifica el nivel de agua y actúa sobre una válvula de "make-up" que rellena el sistema con agua fresca. Sistema de esterilización Permite controlar el proceso de esterilización mediante inyección de vapor directo al fermentador. proceso de esterilización se ha diseñado para la esterilización del fermentador vaclo. -Página 65 de 130- El INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 );> Enero 2010 Lazo de control esterilización: un sensor de presión verifica que la presión dentro del fermentador es de 1 atm manométrica durante el proceso de esterilización, actuando sobre la válvula de ingreso de vapor. Sistema de control del Ph Permite controlar el pH dentro de un rango predeterminado para la fermentación. El control se hace en base a una solución de base o ácido según se requiera para la fermentación. );> Lazo de control pH: el sensor de pH mide el pH de la fermentación y actúa sobre la bomba de adición de solución de control. Sistema de aireación Este sistema es el que permite aportar el oxIgeno necesario para la fermentación aerobia. El sistema se compone del impulsor de aire y del filtro aséptico. Además de esto se debe considerar como medida de seguridad una válvula check, para evitar que en un corte de suministro de aire, el contenido del fermentador se devuelva por esta linea. Sensores adicionales Se ha solicitado la incorporación de otros sensores que no están incluidos en lazos de control, los que se muestran en la figura con las siguientes siglas: OD: oxIgeno disuelto;Tb: turbidez; Rx: potencial redox. -Página 66 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.1.4. PLANOS CONSTRUCTIVOS MOTOR seu.oACEPTICO ROUPEDOR ESPUI E..E AGITADOI1 SOPaITE SERPEN1 SERPENT1N _ AGITADOR AIREADOR Flaura NO 85 v N° 86: Diseflo del biorreactor -Página 67 de 130- Figura N' 87: Esquema interior del biorreactor INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.1.5. INSTRUMENTACIÓN Y CONTROL A continuación se indican los parámetros controladores en los lazos de control. 1. Enero 2010 de selección para los instrumentos requeridos y para los TEMPERATURA (P) En este caso, corresponde a la temperatura del fermentador. Parámetros para selección de Instrumento Tipo Carcasa Unión de montaje Otros Conexión a controlador 2. pH PT100 Acero inoxidable %"NPT Esterilizable La requerida por el controlador Parámetros para selección de Instrumento Galvánico o polarográfico Metálica o plástica %nNPT Recomendado para operación en fermentadores La requerida por el controlador Tipo Carcasa Unión de montaje Otros Conexión a controlador 3. POTENCIAL REDOX (RX) Sensor utilizado en procesos especiales, donde este parámetro puede ser importante para el buen desarrollo de la fermentación. Parámetros para selección de Instrumento Metálica o plástica %"NPT Recomendado para operación en fermentadores No requerida Carcasa Unión de montaje Otros Conexión a controlador -Página 68 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.1.6. ADQUISICION Enero 2010 DE EQUIPOS PARA LA PLANTA Para la selección de los equipos e instrumentos, se realizó un acabado trabajo de búsqueda de proveedores, dado que prácticamente no existe proveedores despeclficos de equipos para plantas biotecnologicas. Por lo anterior se seleccionó entre los preveedores existentes que ofrecieron alternativas que fuesen adaptables a los requerimientos de la planta y que ofrecieran una buena relación precio/ calidad/plazo de entrega. A continuación un detalle de los rtems en que se invirtió para la planta piloto asi como los proveedores y el sistema al que corresponden según el diseño anterior descrito . •:. .:. BIORREACTOR: • Proveedor: Gacsinox • Descripción: Estanque de acero inoxidable 316 L da capacidad 1 m 3 SISTEMA DE ENFRIAMIENTO Enfriador (chiller) • .:. • Proveedor: Anwo • Descripción: Enfriador para agua de refrigeración, Flange, Junta elástica SISTEMA DE ESTERILIZACiÓN Generador de Vapor (caldera) • Proveedor: Combustión Integral • Descripción: generador de vapor Marca QTA/Modelo: FLLR-100 / N1 Serie CI-010. Accesorios generador de Vapor • Proveedor: Combustión integral • Descripción: Estanque agua de alimentación 300 L Chimenea altura 6 m, diam 200 mm Estanque preparación medios de cultivo • Proveedor: Gacsinox • Descripción: Estanque acero inoxidable 316 (300 1) Bomba recirculación para estanque de medios de cultivo • Proveedor: Punto hidráulico -Página 69 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 • .:. Enero 2010 Descripción: Bomba para recirculación medios cultivo SISTEMA DE FILTRACiÓN Filtros • Proveedor: Filterpore • Descripción: 3 Carcasas: 3 pulg., 1 pulg., O, 22 pulg Bomba Filtración .:. • Proveedor: Punto hidráulico • Descripción: Bomba para filtración de medios de cultivo SISTEMA DE AIREACiÓN Filtro de aire • Proveedor: Filterpore • Descripción: Opticap XL 4W/Aervent, Carcasa de Acero Impulsor de aire: soplador .:. • Proveedor: Busch Chile S. A. • Descripción: soplador trilobular Cat Modelo WD0040AP SISTEMA DE LIOFILIZACiÓN Liofilizador .:. • Proveedor: Ivens • Descripción: Liofilizador de sobremesa modelo L 101 INSTRUMENTACiÓN y CONTROL Controlador de pH • Proveedor: Hanna Instruments Ltda. • Descripción: Controlador de pH modelo H1504224-2 Electrodo de pH • Proveedor: Hanna Instruments Ltda. • Descripción: Electrodo pH modelo HI6101805 -Página 70 de 130- y Cartucho 0,2 micras INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Bomba control pH • Proveedor: Hanna Instruments Ltda. • Descripción: Bomba dosificadora (2 unidades) Accesorios controlador pH • Proveedor: Hanna Instruments Ltda. • Descripción: Soporte electrodos HI6050, Solución solución limpieza y solución almacenamiento pH 7.01,pH 4.01, pH 10.01, Medidor de oxigeno disuelto .:. • Proveedor: Hanna Instruments Ltda. • Descripción: medidor de oxigeno disuelto modelo HI9147-04 OTROS ACCESORIOS Motor variador de frecuencia • Proveedor: Dimet Ltda. • Descripción: motor eléctrico Eberle % HP 380 Volt. Medidor de Flujo • • Proveedor: Vignola industrial Válvulas • Proveedor: Veto y Cia Ltda. • Descripción: válvula solenoide NC inoxidable, válvula solenoides NC uso general. Si bien no existen en Chile proveedores de equipos e instrumentación espectñca para biotecnologla a escala piloto y que esté al alcance de este proyecto, se seleccionaron proveedores que tenían equipos operables a esta escala y que se pudieran adaptar a los requerimientos del proyecto. El único inconveniente de trabajar con sistemas adaptados es que, muchas veces, el proveedor es una pequel'\a empresa, que no puede responder a la velocidad que se necesita. Por ello la causa de que varíen ciertos tiempos y duración de actividades contempladas en el proyecto respecto a la carta Gantt. -Página 71 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD Enero 2010 2.2. PRODUCCION PILOTO Fecha de ejecución: Mes 11-Mes 17 (Agosto OS-Febrero 09) Objetivo El objetivo de esta etapa fue hacer una producción prototipo de tabletas biorremediadoras la evaluación in situ del producto. para realizar Descripción: Esta actividad implica: 2.2.1. PUESTA EN FUNCIONAMIENTO DE LA PLANTA PILOTO Cabe decir que inicialmente en el proyecto se consideró el montaje de la planta piloto para la producción prototipo en las instalaciones de la empresa de Biotecnologias Antofagasta S.A. en Antofagasta, pero dicha empresa se trasladó a Santiago (Comuna de !\Iunoa), donde no disponian de los espacios fisicos para la instalación de los equipos lo cual dificultaba su operación y cumplir con las normas de seguridad. Por lo tanto, previo acuerdo entre la empresa subcontratada Biotecnologia Antofagasta y Laboratorios Recalcine, se decidió subcontratar otras instalaciones como Laboratorios Dukay S.A., empresa que es de confianza de Recalcine y asl poder disponer del espacio adecuado para la instalación de los equipos y cumplir con los requerimientos de seguridad en su operación. Dicho cambio de ubicación fue informado a la Subdirección de Innova Chile mediante Oficina de Partes y aprobado mediante pronunciamiento nO299 de fecha 25/0212009, ya que la ubicación de la planta fue constatada en terreno por la ejecutiva técnica, corroborando que cumplla los requisitos técnicos para una adecuada ejecución del proyecto. Una vez habilitado el nuevo espacio para la instalación de la planta piloto y teniendo todos los servicios de agua, gas y electricidad operativos, se comenzó con el montaje de la planta, es decir, la integración de todos los equipos en unea para la fabricación de biomasa. Para ello, se elaboró un instructivo para su montaje (anexo N' 2). Una vez armada la planta y con las conexiones de los equipos finalizadas se llevó a cabo la puesta en marcha de la planta, para lo cual fue necesario hacer una baterla de pruebas previas tales como: • • • • • • • • • • Instalación de bomba dosificadora para la caldera Tratamiento anticorrosivo de la caldera Tratamiento del chiller y puesta en marcha (enfriador) Revisión del sistema de filtración (fase aeróbica) Calibración del pH metro, del sensor de oxigeno disuelto y de la temperatura Graduación del reactor, del estanque auxiliar, del contenedor de aguas limpias, del contenedor de Riles Esterilización del reactor y del estanque auxiliar Pruebas hidráulicas Pruebas de esterilización y vapor Puesta a punto de todos los equipos y conexiones entre ellos -Página 72 de 130- --------------~ INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 A continuación se muestran fotos de los equipos Figura N° 88: caldera y estanque de la cekters. Enero 2010 y de planta piloto: Figura ~ cultivo. Figura ~ 90: Sistema de enfriamiento y estanques de aguas limpias y Riles. -Página 73 de 130- 89: Estanque auxiliar para medio de Figura ~ 91: Biorreactor y panel de control INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figura Ir 92: vista exterior planta biomasa Figura NO 93: vista interior planta biomasa En el DVD anexo se puede ver una grabación de la planta piloto. -Página 74 de 130- Enero 2010 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.2.2. OPERACIÓN Enero 2010 DE LA PLANTA BIOMASA Para la operación de la planta biomasa se elaboró un protocolo para estandarizar el proceso, el cual se encuentra inserto como anexo N' 3 (sólo en formato OVO). En el siguiente diagrama N' 94 se muestra un esquema del flujo del proceso de la planta biomasa. LABORATORIO MICROBIOLOGICO D INOCULO Nubientes Biorreactor Aireación D I Centrifugación Presión ~ -1 I ]-V810cidad. rpm SOLUCION DESCARTE 1- Liofilización r D Biomasa en POlVO) D Detonante-- ( Mezclado I y Tableteado]- Excipientes D Envasado Final) - TABLETA BIORREMEDIADORA Figura N' 94: Diagrama de flujo del proceso. -Página 75 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 La primera etapa: laboratorio microbiológico corresponde con eí escaíamiento ae oactenas, es oecu, la aeneraci6n de forma secuencial de los in6culos bacterianos. aue son eJ ounto de cartida del oroceso a escala piloto. En la flaura N° 95 se ouede ver el escalamiento de una de las cecas (DN-Iaao) desde 5 mi a 250ml. 2L v QI Figura ti" 95: escalamiento cepa DN Este escalamiento se hizo con cada una de las cepas que constituyen la base del biorremediador. v aue son 4: 1. Ceca N-Mar: nitrificante de mar 2. ceoa 3. Cepa N-LaQo: Nitrificante de laoo 4. Cepa DN-Lago: Denitrificante de lago DN-Mar: Denitrificante de mar -Página 76 de 130- producto INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.2.3. PRODUCCiÓN Enero 2010 PROTOTIPO Objetivo Fabricación reales. de tabletas necesarias para evaluar la eficiencia del producto en condiciones Descripción La producción se dividió en dos lineas productivas: 1. Biomasa para sedimentos marinos 2. Biomasa para sedimentos lacustres. A su vez, cada Ifnea productiva tiene dos fases: 1. Fase microorganismos nitrificantes 2. Fase microorganismos 2.2.3.1. PRODUCCiÓN » desnitrificantes DE UNIDADES BIORREMEDIADORAS Producción Escala Laboratorio Esta primera etapa de la producción anterior, tuvo una duración de 30 dias PARA SEDIMENTOS que se refiere al escalamiento mencionado y el volumen que se obtuvo fue de 10 L. » Producción a Escala Piloto (planta biomasa) Tuvo una duración de 30 días y los ciclos fueron: • 2 ciclos de DN-Lago ( 1000 L c/u) • 2 ciclo de N-Lago ( 1000 L) » Producción de las tabletas biorremediadoras para lago: • Centrifugación ( 3 dfas) • Liofilización ( 15 dias) • Tableteado y envasado (5 dfas) Obtención de 50 tabletas de 100 grs. cada una. • -Página 77 de 130- LACUSTRES en el punto INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 En las gráficas N° 96 Y N° 97 se pueden observar las curvas cinéticas obtenidas en estos ciclos de producción de lago: Concentración Celular vis Tiempo DN Lago íJ-'OE-n? ,--- r 1I.(lüE"OO L) - --- ---- I i(''''F-''~ r-- §.f.lIIl-:-+-I)H ~.'-hIF (2000 - \ ~ B·oOE+r:,:? j.(IOE.08 - - f- ~ I _ /1 ___ /1 --- ~ V .•.nrl ~ ./ 1 .-A' r t-> -" 30 20 TlelTllpo - Cdios, Gráfica N° 96: concentración celular vs tiempo DN-Iago Concentración Celular vis Tiempo N Lago ::::i E I.40E"'ü9 •• 1.20E+09 .!:!. :v i .. ! U 4.00E·08 O.OOE-+-Ol) / ./ ./ \ 2.00E·08 o ~ <..> Gráfica 2_2_3.2_PRODUCCiÓN ------ \ ¡"IR -ü -lS - \ , .00'::+09 8.00E*08 t";.(U)E" L) ~ 1.00E*09 ;¡¡ ~'" (1000 - 1.3QE+Utl 4 T --- 12 14 ".¡;-- ./ 8 lO J T / 10 18 Tiempo (dias) Ir 97: concentración celular vs tiempo N-lago DE UNIDADES BIORREMEDIADORAS PARA SEDIMENTOS MARINOS ~ Producción Escala Laboratorio Esta primera etapa de la producción que se refiere al escalamiento, tuvo una duración de 30 dias y el volumen que se obtuvo fue de 10 L ~ Producción a Escala Piloto (planta biomasa) Tuvo una duración de 30 dias y los ciclos fueron: • 2 ciclos de DN-Mar ( 1000 L c/u) • 2 ciclo de N-Mar ( 1000 L) ~ Producción de las tabletas biorremediadoras para mar: • Centrifugación ( 3 dfas) • Liofilización ( 15 dlas) • Tableteado y envasado (5 dlas) Obtención de 50 tabletas de 100 grs_ cada una. En las gráficas Ir 98 Y N° 99 se pueden observar las curvas cinéticas obtenidas en estos ciclos de producción de mar: -Página 78 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Concentración Celular vis Tiempo ON Mar (2000 L) 1.40E+09 *.. ~ - ./ ll.00E+09 ¡ ·0 ! ~ .1 8.00E+08 6.00E+08 4.00E+08 2.00E+08 u I - 1.20E+09 V O.OOE+OO »: o / / ~ 5 7 / ./ / 1,.-'" Ir 98: concentración I I / / 25 20 Tiempo Gráfica 7 ~ 15 10 i / 35 30 (dlas) celular vs tiempo DN-mar Concentración celular vis Tiempo N MAR (1000 L) -~---- 1.40E+09 i 1 1.20E+09 1.00E+09 •.• 8.00E+08 i 6.00E+08 lo:!! 4.00E+08 u 2.00E+08 / / / o Gráfica 2 4 6 I I -- -----;-----iI ...,/' 8 10 T1empo (dles) Ir 99: concentración I l.----- -4 O.OOE+OO / ) i l I 12 14 16 celular vs tiempo N-mar Como resultado de esta etapa se obtuvieron las tabletas biorremediadoras necesarias para llevar a cabo las pruebas de eficacia en condiciones reales en los centros de cultivo de mar y centro de cultivo de lago. 2.2.4. OBTENCiÓN DE PERMISOS DE LA SUBSECRETARíA DE PESCA Para poder llevar a cabo las pruebas en terreno cumpliendo con lo establecido en el Reglamento ambiental para la Acuicultura (RAMA), fue necesaria una Autorización por parte de la Subsecretaria de Pesca. Para la obtención de dicha Autorización se presentó una solicitud que incluyó: • Protocolo de las pruebas • Resumen ejecutivo del proyecto • Detalle de los centros de cultivo asignados por la empresa Marine Harvest para el desarrollo de las pruebas Tras largos meses de espera, la Subsecretaria de Pesca otorgó ambas Autorizaciones: .:. Res. Ex. N° 2683 de fecha 15 Octubre 2008 para el centro de Mar . •:. Res. Ex. N° 718 de fecha 24 Febrero 2009 para el centro de Lago. -Página 79 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD Enero 2010 2.3: EVALUACiÓN IN SITU DEL PRODUCTO BIORREMEDIADOR Fecha de ejecución: Enero 2009- Agosto 2009 2.3.1. PRUEBAS DE EFICACIA EN AGUA DE MAR Objetivo El objetivo fue presentar un diseño de pruebas para la evaluación del producto biorremediador (Unidades Biorremediadoras), de fondos aculcolas mediante la medición de parámetros en 105 sedimentos marinos con respecto a valores iniciales (TO), luego de la aplicación del producto biorremediador. Descripción Para cumplir este objetivo, Recalcine, solicitó a Marine Harvest un centro de cultivo para llevar a cabo la experiencia de biorremediación en un piso marino que haya sido sometido a un impacto antrópico por algunos años, El centro escogido por Marine Harvest estaba ubicado en Chiloé, y se encontraba en descanso pero que tuvo actividad productiva por varios años. Con fecha 22 de enero de 2009 y mediante buceo autónomo, se instalaron unidades biorremediadoras de acuerdo a cantidad y disposición espacial definida, momento que es considerado como tiempo O (T o) (ver filmación de la implantación contenida en formato electrónico del presente informe). Desde esa fecha, a intervalo de aproximadamente 7 a 10 dlas se efectuaron una serie de monitoreos ambientales. El trabajo incluyó por parte de la empresa Geeaa Ltda. la elaboración de los servicios de muestreo, parte de 105 ensayos de Laboratorio y su análisis, de manera de evaluar, entre otros, los resultados desde un punto de vista ambiental y el cumplimiento normativo atingente a la acuicultura vigente (OS 320/00 Y Resolución N° 3.411/06). Para lograr el objetivo planteado se destacó: a. b. c. d. Diseño del área de estudio, número de estaciones, disposición espacial y elección de variables a monitorear. Monitoreo de las condiciones ambientales a un tiempo "cero" (TO), momento previo a la instalación de las unidades biorremediadoras. Filmación del proceso de instalación mediante buceo en el sedimento de las unidades biorremediadoras. Monitoreo de seguimiento ambiental semanal del sector en estudio (T1 a T3). 2.3.1.1. Método de estudio El diseño final del trabajo contempló la información necesaria para evaluar desde un punto de vista ambiental los posibles cambios en el sedimento atribuibles a las unidades biorremediadoras. El detalle del alcance se encuentra detallado en la Tabla N" 100. -Página 80 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Tabla N° 100. Alcance del trabajo centro mar 0bItervacI0nae 118m Monitoreo Ambiental de Sedimento Incluye UN (1) muestreo completo de variables ambientales fisico-químicas y biológicas (*) con DRAGA + OTICORER Instalación de Unidades de Bacterias mediante Buzo y filmación del proceso Incluye la instalación del set con 3 unidades (con buzo) y la filmación correspondiente. Aplica para 15 puntos de siembra Informe Inicial Informe de Base con el análisis integrado de todas las variables ambiéntales monitoreadas TRES (3) muestreos intermedios Monitoreo Ambiental de Sedimento Incluye TRES (3) muestreos completos de variables ambientales fisico-quimicas y biológicas (1) con DRAGA + OTICORER. Se excluye Granulornetría y Fauna bentónica. Muestreo Final Monitoreo Ambiental de Sedimento Incluye UN (1) muestreo completo de variables ambientales flsico-qulmicas y biológicas (*) con DRAGA + OTICORER Informe FINAL Informe Final integrado Análisis FINAL integrado de la información de los monitoreos ambientales monitoreadas durante el estudio. Muestreo Inicial Nota: La metodologia empleada en el análisis de las variables contempladas en el estudio, correspondieron a las estipuladas en la Resolución N° 3411/2006 de Subsecretaría de Pesca. Area de Estudio El estudio se efectuó en el centro de cultivo perteneciente a Marine Harvest, localizado en Chiloé, Región de Los Lagos (ver Figura N° 101). El centro de cultivo, durante el tiempo que duró el seguimiento ambiental no estuvo en funcionamiento y no se encontraba instalado ningún artefacto naval, jaulas de cultivo, etc. Área de estudio Figura ND 101: Sitio de estudio (Referencia de Imágenes; Google Earth V. 4.3.7284.3916 (beta). -Página 81 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Diseño del muestreo La Figura N° 102 esquematiza la situación del centro de cultivo en relación a la línea de costa, Concesión Marltima (CCMM), jaulas, etc. Los módulos con las balsas jaulas que aparecen corresponden a la situación existente durante la última INFA realizada en este centro de cultivo, y que aconteció en febrero del año 2007, ano en el cual dejó de operar el centro de cultivo. Esto implica que el centro en cuestión, estuvo en descanso aproximadamente 1,5 anos previo al momento del inicio del implante de las unidades biorremediadoras. , N C.C".M. D ~ I I • ControI1 AREADE ¿,/ ESlUDIO i'-::¡' Control 2 ••• TIerra Om 200m Figura N° 102: Afea de estudio en el contexto de la linea de costa y Concesión Marftima. El área de estudio en donde se instalaron las unidades biorremediadoras, se ubicó en el módulo norte de la concesión maritima (CCMM) (ver Figura N° 102). Esta área rectangular, se dividió imaginariamente en 30 cuadrados de 15 m * 15 m evocando un tablero de ajedrez (ver Figura N° 104). En estos cuadrantes, se eligieron en forma intercalada 15 áreas para depositar un set de tres unidades biorremediadoras (celdas negras, ver Figura N° 104). Estos 15 cuadrantes fueron asignados como Tratamiento (T) y fueron numerados de T1 a. Estos puntos fueron marcados mediante bollas (botellas), las que fueron lastradas mediante muertos de 15 Kg. (Figura N° 105 Y 106), Las 15 cuadriculas restantes (blancas), fueron usadas como Referencia (R) y fueron rotuladas como R1 a R 15 Y sirvieron para contrastar al mismo tiempo el o los efectos ambientales de las unidades biorremediadoras sobre el sedimento de las zonas de tratamiento. -Página 82 de l30- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Adicionalmente, tal como aparece en la Figura N° 102, se utilizaron dos estaciones Control ubicadas en los 2 vértices de la CCMM más cercanos a la costa. Estas estaciones, son las estaciones que en un INFA (documento exigido por Subsecretaria de Pesca), serian las estaciones con las cuales se contrastarfan los resultados obtenidos en la periferia de cada uno de 105 módulos de cultivo, metodología que no será utilizada en este estudio por estar fuera del alcance del mismo. La profundidad media del sector fue de 40 m, razón por la cual se utilizó buzos especialistas de la Empresa Ecosub (Figura Ir 107 Y 108) para la filmación del proceso de siembra de las unidades biorremediadoras. Foto Ir 103: Unidades Biorremediadoras: Fotografía tomada mediante buceo. Se observan las tres unidades biorremediadoras depositadas en cada uno de los 15 puntos de Tratamiento. Figura fIO 104: Area de Estudio. Nomenclatura de la disposición espacial del set tratamiento con unidades biorremediadoras utilizadas originalmente por los buzos durante la filmación Submarina. om -- 50 m -Página 83 de 130- -------------------- --- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Figura Enero 2010 N' 105 Y 106: Pesos (muertos) utilizados para individualizar y georreferenciar cada punto de tratamiento Figura N' 107 Y 108: Preparación de los buzos encargados de sembrar las unidades biorremediadoras durante la campana en tiempo TO. Muestreo de sedimento Las muestras de sedimento se tomaron en estaciones georreferenciadas mediante un GPS Garmin Map 75 (+/5 m), utilizado unidades planas UTM (Universal Transverse Mercator). Las muestras se obtuvieron desde una embarcación mediante draga Ponnar de 0,1 m2 de área. Se intentó la colecta mediante OTICORER, pero las caracter!sticas del sedimento (poco fango) impidieron un resultado efectivo. En el monitoreo Tiempo 0, las muestras las tomaron los buzos, llenando ellos 2 mismos los corer. De ah! en adelante, se muestreó usando una draga de 0,1 m , y submuestreando -Página 84 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 mediante el uso de los corer de diámetro interno de 90 mm, de manera de asegurarse que en cada uno de los monitoreos se colectara sólo los 3 primeros cm superficiales del sedimento (Figura N° 109 a 112). Las muestras de agua fueron colectadas del agua superficial del contenido en el corer (Figura N' 115). Las muestras para los análisis de fauna fueron fijadas "in situ" mediante una solución de formalina-agua de mar al 10%. Todo el material recolectado, debidamente depositado y rotulado en bolsas de polietileno con cierre hermético, fue almacenado y transportado al laboratorio a baja temperatura utilizando bolsas de hielo. ,.,.... Los análisis efectuados se encuentran en la siguiente tabla: _. -¡c ~' , ~ 'a.Q'h20D9 . • l)3.O2~ 1, - 2 11eQaao3 1().()2..;20Q9 19-02-2009 pH In situ + + + + REDOX In situ + + + + M.O.T. Laboratorio + + + + GRANULOMETRIA Laboratorio + + FAUNA Laboratorio + + NOTA: Todos los muestreos, ensayos de variables ambientales y análisis in situ fueron realizados por personal de Geeaa Ltda. Figura N° 109 a 112: Uso del corer durante el estudio -Página 85 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figura N° 113 Y Enero 2010 114: recolección del sedimento en bolsas de polietileno Figura ~ 115: Obtención de agua de los primeros centlmetros del sedimento usando el carero -Página 86 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.3.1.2. Resultados Contenido de Materia Orgánica La materia orgánica en el sector analizado es baja. No obstante, como lo demuestra la Figura N° 116, se aprecia claramente que el sector Nor-Oeste del área monitoreado es el que contiene mayor contenido porcentual de materia orgánica (2,4 %). Tal como se aprecia, esta región, está asociada con la zona donde estuvieron ubicadas las balsas jaulas del centro de cultivo. Se aprecia también que los controles presentaron un bajo contenido de materia orgánica « 1%). N C.C.M.M. + ~ • ConIroI1 /~~~ AREADE ¡¿- ESTUDIO ~1IO*I6n --J8u''<, íT~ \ 2,4 % 'I,_---~ 2.1 % 1.8% CooIroI2 Dm 200m Figura NO 116: Distribución espacial del contenido de MOT en el tiempo ··0··(TO) -Página 87 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ["~O"~ Enero 2010 . Figura N° 117: Reagrupación de las estaciones en niveles. Nótese, que las corrientes provienen desde el Noroeste y esto genera un arrastre de sedimento y material biorremediador en dirección Sureste, generando un efecto acumulativo en las estaciones del Nivel 3 y 4. Los resultados indican que las variaciones observadas en el contenido de MOT a través del tiempo en la estaciones de muestreo es bastante heterogénea. Las corrientes del sector tienen el potencial de generar un arrastre o transporte efectivo de partículas en dirección Sureste. En este caso particular, tal transporte se habría verificado desde el Noroeste hacia el Sureste (Figura N° 117), Y claramente las estaciones de muestreo situadas en la cuarta columna (Nivel 4, estaciones 12, 13, 14 Y 15, son las que tienen la mejor oportunidad de ser beneficiadas por la actividad biorremediadora de las unidades implantadas, pues además se generaría un efecto acumulativo de la actividad biorremediadora producto de material activo proveniente de las unidades biorremediadoras sembradas en el Noroeste. Esto último, durante el análisis de la información, sugirió la agrupación de las estaciones de monitoreo en 4 niveles, tal como se observa en la Figura N° 117. De esta manera, se encontró que los mayores cambios ocurrieron en los niveles 3 y 4. Estos resultados se encuentran en la tabla N° 118. Los resultados indican que en las estaciones de Tratamiento los mayores cambios porcentuales en el contenido de MOT se detectan en los niveles 3 y 4, Y a los 20 dias de iniciado la experiencia. Al día 29 se aprecia que la tasa de degradación de MOT disminuye notablemente. Los cambios en el promedio de MOT es significativo (p < 0,05) al dia 20 del nivel 4. Los porcentajes de disminución al dfa 13, son significativos en el nivel 2, 3 Y 4. Al dia 20 y 2 9 no existen diferencias significativas. Sector - Nivel N01 de dlas transcurridos 1.113 1.120 1.28 39,65 47,63 27,63 -15,91 9,58 -1,58 N02 -6,63 -28,88 -13,7 N03 -11,74 -30,79 N04 -11,51 Tabla N° 118: Porcentaje de cambiO en el contenido de MOTentre la primera y las sucesivas campañas, ordenadas por sector y nivel analizado. Tratamiento -Página 88 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 TrlllllmienlD ND4 N03 N02 N01 3,0 2,5 I • 1,5 ! ! ! 1 1 1 1,0 1 I I ! 1 13 20 29 13 20 29 1 13 20 • ! "1" 29 1 13 20 29 IflDía Figura ND 119: Cambios en el contenido de MOT de las estaciones de Tratamiento por nivel y dla de seguimiento Cambios en el ORP del sedimento La Tabla ND 120 Y la Figura N° 121, muestran los cambios promedios que experimenta el potencial de óxido reducción en el sedimento sometido al tratamiento con las pastillas biorremediadoras. Los resultados indican que existe un aumento en el valor de Eh en el nivel 3 y en el nivel 4. En el nivel 4, los cambios se hacen significativos hacia el final de la experiencia. Tabla ND 120: Promedio de Eh por nivel y csmpeñe. NIvel Dlllde •••••••••• 20 29 76 58 147 144 N01 1 144 N02 81 13 142 122 N03 N04 123 116 125 196 91 136 167 264 -Página 89 de 130- ----------------------------------------------~- ~ - INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 ..,1 350 250 m 150 100 50 Y •••• ..,3 ..,2 300 200 Enero 2010 t-tI Iv' ~ o 1 W D ~ 1 D W ~ 1 W D NO DiII ~ 1 W D ~ Figura N° 121: Variaciones en el Eh por nivel y por día de muestreo Cambios en el pH del sedimento Tal como lo muestra la Figura N° 122, los cambios que experimenta el pH son erráticos, no presentan un patrón definido y no exhiben cambios significativos. Esto no es algo nuevo, puesto que existe consenso que el pH no es un buen indicador de los cambios que experimenta el sedimento producto del enriquecimiento orgánico, conclusiones derivadas de un taller organizado por Subsecretaria de Pesca en diciembre del 2008. ..,1 II1II2 fII4 II1II3 8,0 7,8 7,6 z: Q. 7,4 f 7,2 ¡¡ t f 11 T I 6,8 1 13 I J - 20 29 1 13 •, - 1 f ! -r- T I J... I 1 - 7,0 I f 1 !1 ¡ , , t 20 1 29 NO Dí! 13 20 29 1 13 20 29 Figura N° 122: Variaciones en el pH por nivel y por dla de muestreo -Página 90 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Cambios en la macrofauna Enero 2010 bentónica Los resultados indican que en sector sometido al tratamiento con las pastillas biorremediadoras, un incremento en el número de especies posterior al implante (Tabla Ir' 123). •••••• Tratamientll .,"'., I 4 I Ola 21 11 •••• 18 ,...2 ••• 12 ,.."I di 1 19 I 1lIa:2I 14 existe NIvel 4 Dlli29 Ola 1 21 17 Tabla Ir' 123: Variaciones en el número de especies, por nivel y dfa de monitoreo La diversidad del sector es baja, lo cual es normal considerando la existencia por años de una actividad acurcola. No existen diferencias significativas entre la diversidad de Tratamiento (donde se implantaron las unidades) respecto del sector de Referencia (cuadrantes sin tratamiento). Un análisis rápido de los resultados, muestra como la mayor diversidad (H) de especies se sitúa en los sectores donde más tarde se detectó las mayores bajas en el contenido de MOT. Cambios en parámetros físico-químicos Los resultados que a continuación se presentan muestran los valores obtenidos en los muestreos de la prueba de biorremediación de mar de ciertos parámetros que se consideraron clave para evaluar la eficacia del producto biorremediador. Dichos análisis fueron realizados por la empresa Labs&Testing, a la cual, semanalmente muestras de sedimento y de agua obtenidas en los muestreos. se le hizo llegar En la tabla Ir' 124 se muestran los parámetros analizados y la metodologfa empleada para su análisis Tabla Ir' 124: Parámetros y metodologfa analftica -Página 91 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 El estudio de estos parámetros se hizo en función del ciclo natural del nitrógeno (ver figura N° 125), el cual es intervenido por el efecto del producto biorremediador. Este ciclo se inicia cuando la materia orgánica compleja se transforma en amonio al reaccionar con el oxigeno disponible en el medio. Luego de ello se activan dos etapas: Una de desnitrificaci6n (DN), donde se transforma progresivamente nitroso a nitrógeno molecular. Lo anterior en condiciones anóxicas y • desde nitrato a nitrito y oxido Una de nitrificaci6n (N), la cual ocurre en condiciones aerobias, para metabolizar (descomponer) materia orgánica. En esta etapa el amonio se transforma en nitrato, con un paso intermedio, en que el amonio es oxidado a nitrito y éste es luego transformado en nitrato. El nitrato no es toxico para las especies acuáticas que podrian estar presentes en el medio. 'C7 Peces Algas y plantas Desechos + ,400' Amoniaco Nitratos ~, Nitritos T' Figura N° 125: ciclo de nitrógeno -Página 92 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 AMONIO, NH4 Los datos medidos de amonio nos muestran un aumento del orden del 72% (tabla Ir 126) entre el tiempo inicial y 1 (dfa 13), del 54% entre el tiempo 1 y 2 (29 dfas) para luego disminuir del orden del 70% entre los tiempos 2 y 3 (29 dfas), ellos es explicado por esta transformación de la materia orgánica en amonio. Con estos resultados se puede apreciar que el sector en prueba ha experimentado los cambios esperados según los equilibrios reestablecidos, ya que al inicio hay formación de especies (aumento amonio) y transformación a otras en tiempos posteriores (disminución del amonio). Es importante, también, apreciar la directa relación que han tenido las transformaciones de amonio con las de Nitrato, son directamente proporcionales, tal como deberla ser al existir un equilibrio. AM ONIO mglKg MUESTRAS TIEM PO 2- di. 20 TIEMPO 3-dl. 29 TIEMPO O TIEMPO 1-dla 13 E-1 6,45 11\3 205,1l3 81,26 E-2 33,35 87,81 83,6 88,07 E-3 73,94 f17,46 6145 51 E-4 38,93 70,8 tl6,33 92,26 E-5 30,55 88,26 7148 65,17 E-a 34,51 56,93 117,15 78,54 E-7 50,72 44,16 117.93 89,89 E-a 12,55 28,26 54,75 37,62 E-9 35,52 30,2 24,58 45,78 E-1O 55,09 26,05 93,31 65,15 E-H 26,01 60,71 69,44 -50,39 E-12 14,24 30,23 93,98 32,75 E-13 24,99 40,23 55,67 39,8 E-M 1'.t1 31,59 50,58 38,1 E-15 22,87 43,61 48,11 39,16 Medi. 3t73 54,51 84,1 59,52 Tabla N° 126: resultados amonio por estación y campaña de muestreo -Página 93 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 NITRATO, N03 Como era de esperarse este parámetro debe comportarse en forma equivalente a lo medido para el amonio, dado que este es el compuesto que lo origina producto de las reacciones involucradas. • Se observa ello en los resultados (tabla N' 127), en donde se aprecia que existe un aumento en promedio del orden del 54% entre la campaña inicial (O) y la 1, del 62% entre las campañas 1 y 2, Y luego una posterior disminución del 68% entre las campañas 2 y 3. NITRATO mglKg MUESTRAS TIEMPO TIEMPO TIEMPO TIEMPO 2-dIa 3-dia 29 1-dia 13 O 20 E-1 33,65 151,89 153,65 146,94 E-2 48,15 94,97 94,72 91,91 E-3 84,21 122,55 122,19 103,85 E-4 66,43 80,14 132,26 101,59 E-5 36,26 52,36 192,59 79,9 E-6 50,49 54,38 107,79 45,66 E-7 63,06 64,69 86,62 87 E-8 31,9 28,06 96,65 55,79 E-9 39,45 37,63 81,01 127,48 E-10 30,8 78,03 104,43 91,7 E-11 48,6 52,97 75,53 37,3 E-12 40,79 82,79 62,85 23,45 E-13 36,81 55,41 88,41 46,6 E-14 29,64 37,04 132,66 50,02 E-15 34,91 46,68 154,71 65,74 Media 45,01 69,31 112,4 77 Tabla N' 127: resultados nitratos por estación y campana de muestreo -Página 94 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 FOSFATO. P03 El fosfato es parte de la materia orgánica presente en los sedimentos marinos, si bien no está directamente relacionado con el ciclo del nitrógeno, su aumento o disminución, demuestra restablecimiento de los equilibrios del sistema. Las mediciones realizadas del fosfato en el sedimento, van en directa concordancia con lo observado en los parámetros anteriores, aumento en los tres primeros tiempos y una fuerte disminución en el último tiempo medido, del orden del 300% (véase tabla N° 128). FOSFATOS mgIKg MU3STRAS 11EMPOO nEMP01- nEMP01- nEMP03- dla13 cla20 dia29 6-1 2045 3437 9649 453,9 6-2 2402 3154 7007 440,3 6-3 6615 5589 8191 1130,2 E-4 1503 5537 6409 1482,7 6-5 1737 3599 4906 497,8 E-6 2797 3460 5739 352,5 6-7 2516 4244 4560 808,5 E-8 185 2717 6212 1173,5 6-9 1274 2636 5411 487 6-10 4363 2889 3606 382 6-11 1132 3456 4544 319,1 6-12 1502 2638 3957 1790,7 6-13 896 7850 3437 542,6 6-14 1166 4018 4487 407,8 6-15 1916 2440 3671 365,5 Media 2.137 3.844 5.452 709 Tabla N° 128: resultados fosfatos por estación y campaña de muestreo -Página 95 de 130- • INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 SULFUROS, S04 El sulfuro de hidrogeno o ácido sulfhídrico es un parámetro que mide las condiciones de anoxia de un medio, mientras más alto, más an6xico se encuentra el medio. Ello implica que su aumento nos indicaría que están ocurriendo reacciones que usan oxigeno, es decir, disminuye la cantidad de oxigeno disponible en el sistema. Esto es así y se puede correlacionar en forma clara, al observar que en los periodos en que este parámetro aumenta en promedio entre un 13 a un 63% (véase tabla Ir 129), el contenido de amonio también aumenta, provocándose tal como ya fue explicado reacciones que consumen oxigeno. SULFURO mglKg MUESTRAS TIEMPO I • a TIEMPO J- dla 20 TIEM PO S-di. ZI E-1 1 1,04 1 1,49 E-2 1 \09 1 1,68 E-3 1 1,1 1 1,58 E-4 1 2,03 1 1,37 E-6 1 1,06 1 1,79 E-6 1 1,04 1 1,83 E-7 1 1,07 1 1,95 E-a 1 1,02 1 1,64 E-9 1 1,03 1 1,49 E-1O 1 1,05 1 \7 E-11 1 1,06 1 1,73 E-12 1 1,09 1 1,46 E-13 1 1,09 1 1,86 E-M 1 1,09 1 1,46 E-U 1 1,08 1 1,4 1 1,-0 1 1,63 Media Tabla TEMPOWIa Ir 129: resultados sulfuros por estación y campafla de muestreo -Página 96 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.3.1.3. Conclusiones El análisis de los parámetros ambientales monitoreados, ha detectado cambios, atribuibles a las unidades biorremediadoras depositadas sobre el piso marino de un centro de cultivo sometido a la actividad acurcola intensiva, lo que permite sugerir el uso de las unidades biorremediadoras para lograr una disminución significativa del enriquecimiento orgánico del piso marino y las consecuencias ambientales que suelen derivarse de la actividad acuícola. Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que posterior al implante de las unidades biorremediadoras, se detectan cambios importantes en variables ambientales de interés ecológico, medioambiental y de gestión ambiental. Los resultados indican que existe un efecto en la disminución de la materia orgánica y un incremento en el potencial redox. Los resultados, sugieren la posibilidad de un aumento en la dosis inicial y/o efectuar una re-implantación de pastillas cerca del dia 20, de manera de regular el efecto. Se prevé, que estos resultados serán aún más eficaces en sedimentos con valores más altos de contenido orgánico (ejemplo> 10%). Se sugiere que las corrientes del sector juegan un rol preponderante en el transporte del material biorremediador, generando un efecto acumulativo en los sectores de mayor depositación. Cada centro de cultivo posee caracteristicas oceanográficas propias. Por esta razón, se recomienda previo a la implantación de las unidades bioremediadoras, modelar el área de depositación del material orgánico generado por la actividad acuicola, puesto que el área de depositación de residuos orgánicos dista de la forma de las estructura de cultivo, es decir, no necesariamente la depositación ocurre inmediatamente bajo las jaulas. La modelación del área de depositación, permitirá además, cuantificar espacialmente la cantidad de material orgánico depositado en cada caso, pudiendo de esta manera establecerse una dosis diferencial para el área a tratar. • El contenido de materia orgánica es una de las variables que experimentaron los cambios más favorables. Para el caso de la materia orgánica la mayor disminución promedio ocurrió en la medición del dia 20 y en el nivel 4, con un promedio 30,8% de disminución. En los dias 13 y 29, existe disminución de la materia orgánica pero sus promedios oscilan entre un 6 y un 13 %. Esto permite argumentar, que el mayor efecto de las pastillas biorremediadoras se genera entre los primeros 20 días de iniciada su siembra. Este resultado, permite argumentar que el efecto de las pastillas biorremediadoras en el medio marino, presenta un área de influencia mucho mayor a 15 metros y con dosis adecuadas, el promedio de disminución de MOT bordearla un 30%, proceso que no afecta los ensambles bentónicos, lo que además predice una recuperación del piso marino en menor tiempo, comparado con los 2 a 8 años que en forma natural puede demorarse en recuperar un centro de cultivo sometido a la actividad aculcola El potencial de óxido reducción, es otra variable ambiental que experimenta cambios sustanciales. A diferencia de lo que ocurre con la materia orgánica, el patrón de incremento de los valores promedio de Eh se mantiene en incremento hasta el dia 29. Si bien en este periodo de tiempo, la materia orgánica ha demostrado que inicia nuevamente a incrementarse (tal vez para llegar a un punto de equilibrio) los mecanismo por los cuales se verifican los procesos biogeoquímicos en el sedimento han cambiado sustancialmente y el sedimento presenta caracterlsticas que permiten concluir que predominan los procesos aeróbicos u oxidativos. Este aspecto es muy novedoso, y abre la posibilidad de observar el problema del impacto antrópico de la acuicultura (entre otros) desde otra perspectiva (la biogeoqulmica). -Página 97 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 Los resultados indican que no existen cambios significativos en la estructura comunitaria de los macroinvertebrados del sector. Más bien, pareciera que en el sector de tratamiento se han producido cambios favorables desde el punto de vista de la riqueza de especies, aunque prevalezcan grupos de baja biomasa y elevada abundancia, lo que probablemente sea un aspecto positivo si se trata de el inicio de un proceso de sucesión ecológica encaminada a la recuperación del bentos. Las variaciones medidas en el tiempo para los compuestos amonio y nitrato son los esperados en el reestablecimiento del equilibrio del nitrógeno presente en el sistema. • Lo anterior, se complementa en una fuerte disminución del los fosfatos, compuestos presentes en la materia orgánica, el cual si bien no está directamente involucrado en el ciclo del nitrógeno, resulta ser, una medida indirecta de los resultados de biorremediación observados, extendiendo la biorremediación más allá de los compuestos nitrogenados a los fosfatados. -Página 98 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.3.2. PRUEBAS DE EFICACIA EN AGUA DULCE Objetivo El objetivo fue elaborar un diseño de pruebas para la evaluación del producto biorremediador de fondos acutcolas (Unidades Biorremediadoras), mediante la medición de parámetros en los sedimentos de lago con respecto a valores iniciales (To), luego de la aplicación del producto biorremediador. Descripción Para cumplir estos objetivos se solicitó a Marine Harvest un centro de cultivo para llevar a cabo la experiencia de biorremediación en un piso lacustre que haya sido sometido a un impacto antrópica por algunos años. El centro escogido por Marine Harvest fue Rupanco 11,centro de cultivo ubicado en Lago Rupanco, activo hasta un par de meses. En este centro, mediante un sistema mecánico, se instalaron unidades biorremediadoras de acuerdo a cantidad y disposición espacial definida por Recalcine (véase filmación anexa en formato electrónico del presente informe) Las etapas a destacar son: 1. 2. 3. 4. 5. Diseño del área de estudio, número de estaciones, disposición espacial y elección de variables a monitorear. Monitoreo de las condiciones ambientales a un tiempo "cero" (TO), momento previo a la instalación de las unidades biorremediadoras. Filmación del proceso de instalación en el sedimento de las unidades biorremediadoras entregadas por Recalcine. Monitoreo de seguimiento ambiental semanal del sector en estudio (T1 a T3). Monitoreo de las condiciones ambientales a un tiempo "finar (T4). 2.3.2.1. Método de estudio El diseño final del trabajo contempló la información mínima necesaria para evaluar desde un punto de vista ambiental los posibles cambios en el sedimento atribuibles a las unidades biorremediadoras. El detalle del alcance se encuentra detallado en la Tabla N° 130. ContenIdo ftam Monitoreo Ambiental de Sedimento Induye un (1) muestreo completo de variables ambientales Químicas v biológicas 'C*) con DRAGA + OTICORER físico- Muestreo Inicial (TO) Instalación de Unidades de Bacterias mediante sistema mecánico y filmación del proceso Induye la instalación del set con 3 unidades y la filmación remota correspondiente. Aplica para 15 puntos de siembra Monitoreos intermedios Monitoreo Ambiental de Sedimento Induye tres (3) monitoreos completos de variables ambientales físico-químicas y biológicas (1) con OTICORER. Se excluye Granulometría y Fauna bentónica. Monitoreo Final (T4) Monitoreo Ambiental de Sedimento Incluye un (1) monitoreo completo de variables ambientales físicoQuímicas v biológicas con DRAGA + OTICORER Tabla ~ 130: alcance del trabajo -Página 99 de 130- h INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Area de estudio El estudio se efectuó en el centro de cultivo perteneciente a Marine Harvest Chile, (ver Figura N° 131). El centro de cultivo, dejo de funcionar sólo una par de semanas previo al inicio del monitoreo y se encontraban presentes las jaulas de cultivo, las cuales sirvieron de referencia para el estudio. Para la realización de este estudio, Marine Harvest, por intermedio de Recalcine, solicitaron un permiso especial a Subsecretaria de Pesca, permiso que está estipulado en la actual resolución acompai'lante del RAMA, Resolución N° 3411 del 2006. ~-Figura Ir 131: sitio de estudio Diseño Muestrea! Se utilizó la disposición espacial de las jaulas del centro de cultivo para la siembra de las unidades biorremediadoras. Se eligieron en forma intercalada 15 jaulas para depositar un set de tres unidades biorremediadoras (circulas negros de la Figura Ir 132). Estas 15 jaulas fueron asignadas como tratamiento (T) y fueron numerados de T1 a T15. Las 15 jaulas restantes (blancas), fueron usadas como referencia (R) y fueron rotuladas como R1 a R15 y sirvieron para contrastar al mismo tiempo el o los efectos ambientales de las unidades biorremediadoras sobre el sedimento de las zonas de Tratamiento. La instalación de las unidades biorremediadoras (Figura Ir 133), fue efectuada con la ayuda de un dispositivo mecánico que se encuentra en la Figura N° 134, el cual llevaba adosada una cámara de -Página 100 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 filmación Submarina en su extremo posterior. El proceso de siembre de las unidades biorremediadoras en el sedimento fue filmado en cada punto, y una secuencia completa de este proceso se encuentra en la Figura N' 135. o e a T15 TOI ROl e o ROl 0- e_ o e- o- e- o PUNlOSCENTRAlB TOO 1011 e RG5 DE JAUlAS + T1Ir .- Ono e e- oo- e_ Figura Ir' 132: Area T13 e eR10 0- Om e e a R11 Figura o R12 RU T12 a R15 T~ e~ de estudio ti" 133: Fotograf1as subacuática de las unidades biorremediadoras. Figura N' 134: Equipo para instalar unidades Biorremediadoras -Página 101 de 130- en e/ sedimento de/lago. INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Figura NO 135: Secuencia de instalación de las unidades biorremediadoras. -Páglna 102 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Muestreo de sedimento yagua Las muestras de sedimento se tomaron en estaciones contempladas en la Figura N° 132, que fueron georreferenciadas mediante un GPS Garmin Map 75 (± 5 m), utilizado unidades planas UTM (Universal Transverse Mercator). Las muestras de agua y sedimento se obtuvieron desde una embarcación mediante un OTICORER (Figura ND 137, 138). Para el sedimento, se colectaron aproximadamente los 3 primeros centfmetros superficiales (Figura N° 142). In situ se midió el pH y el ORP mediante un equipo multiparamétrico (Figura N° 140). Las muestras de agua fueron tomadas del agua superficial del contenido en el corer (Figura ND 139), cuya agua se extrajo mediante una sonda para llenar botellas enviadas por el laboratorio para tal efecto. El oxígeno disuelto del agua fue medido al interior del corer con multiparamétrico (Figura N° 140), obteniéndose la concentración del los primeros decimetros del agua del fondo. Las muestras para los análisis de fauna fueron fijadas "in situ" mediante una solución de formalinaagua al 10%. Todo el material recolectado, fue depositado y rotulado en bolsas de polietileno con cierre hermético (Figura N° 143), almacenado y transportado al laboratorio a baja temperatura utilizando bolsas de hielo. Los análisis efectuados se encuentran en la Tabla N° 136. Todos los muestreos fueron realizados por personal de Geeaa Ltda. Los ensayos de variables ambientales en el sedimento fueron efectuados por el Laboratorio de la Empresa Geeaa Ltda. Todos los análisis tomados in situ fueron efectuados por la unidad de muestreo de la empresa Geeaa Ltda. ••••••••• ••• AttItipst8lTlé Oxígeno Disuelto trico OxyGuanJ •...- ••••••••• •••••••••• •••••••• TIeMpo' 10 1IeMpo1 Tt TIHIpoZ 12 1I8111J103 1S TIempo 4 T4 ••••• 1HtI + + MlJJtj~ PoIencial meo Hanna HI Redox 991003; SondaHl + + + + + + + + + + + + + + + + 1297 Labolatorio M.O.T. Resolución ti' 3411 Labolatorio Granulomelrfl Resolución ti' 3411 Labolatorio Fauna Resolución N" 3411 Tabla ND 136: Parámetros analizados, fecha de monitoreo y entidad que realizó los ensayos. -Página 103 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figura Enero 2010 ti" 137: OTI-Corer con sedimento en el tubo de muestreo. Figura N" 138: muestreo con oticorer -Página 104 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Figura N' 139: Procedimiento para la toma de agua para análisis qulmico. Figura N' 140: Procedimiento para la medición de oxigeno disuelto en los primeros centfmetros del sedimento. -Página 105 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Figura fIO 141: Procedimiento para la medici6n de Eh, pH Enero 2010 Y Temperatura en el sedimento. Figura fIO 137: OT/-Corer con sedimento en el tubo de muestreo. Figura fIO 143: Almacenamiento del sedimento para ensayos posteriores. -Página 106 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.3.2.2. Resultados Caracterización del sedimento El sedimento se caracterizó por ser extremadamente fangoso (Figura N° 144a), con una capa superficial oscura que indica probablemente un sedimento reducido. Esta caracterlstica fangosa es normal en un lago. En el corer (Figura N° 144b), se puede apreciar con más detalle la naturaleza fangosa del sedimento, donde además se aprecia al menos tres niveles diferenciados por color (números 1, 2 Y 3), originado por la composición del sedimento y asociado a distinto origen geológico o a distintos estados de descomposición producto de alimento y fecas depositados en el fondo, asociado a estados de oxidación diferentes . . '. b) .a) . : : . Figura N' 144: Sedimento caracterfstico de la zona en estudio. La foto a) muestra el sedimento contenido en la draga y la foto b) muestra el sedimento al interior del corer. Técnicamente, el sedimento se sitúa mayoritariamente en gravosa de acuerdo al diagrama triangular de la Figura conformado por las fracciones arena mediana (AM), arena que la arena gruesa y muy gruesa suman en conjunto cerca la clasificación de arena fangosa levemente N' 146. Cerca del 98 % de la arena está fina (AF) y arena muy fina (AMF), mientras del 2%. Como se puede apreciar el tamaño medio de las partlculas del sedimento corresponde a la fracción de fango. No se encuentran diferencias entre los resultados de los estadlsticos sedimentarios en el tiempo TO y el T4, lo que indica que la composición del sedimento es constante en el tiempo, al menos en el periodo que duró el estudio. -Página 107 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 61.••••1 Figura N' 145: Diagrama Triangular mostrando la textura de acuerdo a e/ases texturales predefinidas. -Contenido de Materia Orgánica El sedimento del área bajo las jaulas presentó al tiempo TO un promedio general un 8,77 % ± 2,10%. Al tiempo TO, el sector tratamiento ubicado bajo las jaulas presentó un promedio de MOT de 9,07% ± 2,32. Posteriormente, en el sector tratamiento el porcentaje de materia orgánica disminuye de 9,07 % hasta 8,06 % en el tiempo T1, incrementándose levemente en el tiempo T2 (8,14%), manteniéndose el valor constante en el tiempo T3 y luego disminuir hacia el tiempo T4 a un valor de 7,38% (Ver Tabla Ir 146) . •••••• Tabla ,.........• l' TO 9,07 ±2,32 T1 8,06 ±245 T2 8,14 +2,46 T3 8,14 ±2,76 T4 7,38 ± 1,81 N' 146: promedio de MOTen sedimento En las estaciones sometidas al tratamiento con las unidades biorremediadoras, el sedimento disminuye la MOT a una tasa que oscila entre un 5,81 % Y un 14,29. Las mayores tasas se detectan en las primeras dos semanas de seguimiento (T1 y T2). Entre el monitoreo inicial y el primer monitoreo de -Página 108 de 130- • INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 seguimiento, la tasa de disminución promedio es de un 7,36 %, tasa que es mejorada hacia el último seguimiento (T4), donde luego de casi un mes de tratamiento, llega a un 14,29 %. El sector de tratamiento disminuye en promedio la MOT en un 8,48% y el sector de referencia lo hace en un 6,93%. Tabla fIO 147: Promedio de disminución de Mor en el sedimento durante el estudio. En los siguientes diagramas fIO 148 Y 149 se observa la diferencia en la distribución espacial de la materia orgánica entre la campana a tiempo O (antes de la implantación del producto) y la última campana (después de un mes de tratamiento). 12~ 11~ 10~ Dlagtama fr 148: distribución espacial MOr tiempo O. 9% 8% 7~ 8'110 T1a + R.5 -l 12~ 11~ • 10~ T14 + 9% 8% 11M + 7% 8~ 5~ 4~ -Página 109 de 130- Dlagtama N' 149: distribución espacial MOr a tiemp04 INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Caracterización del potencial Enero 2010 redox (Eh) La Tabla N o 150 y la Figura N° 151 presentan los resultados de los valores promedio de Eh para cada uno de los monitoreos entre el tiempo TO y el T4. Los resultados indican que posterior a la instalación de las unidades biorremediadoras, en las estaciones de tratamiento el valor promedio de Eh se incrementa desde 100 ± 46 mV (tiempo TO) hasta 166 ± 84 mV (tiempo T1). A partir del tiempo T1 hasta el tiempo T3, el incremento del valor promedio de Eh es menor, incrementándose de 166 ± 84 mV (tiempo 1) hasta 178 ± 34 mV (tiempo T3). Del tiempo T3 hasta el tiempo T4, existe un descenso importante del valor promedio de EH, desde un valor de 178 ± 34 mV (tiempo T3) hasta 122 ± 29 mV (tiempo T4). Tabla NO 150: Promedios de Eh Periodo ele TIeIl1llO TO T1 T2 T3 T4 Figura N o a través Referencia (nM T ••••• ±22 ±47 ±59 ±57 ±17 100 166 170 178 122 130 143 148 146 112 ~ Referencia ±46 ±84 ±59 ±34 ±29 ---Tratamiento 178 170 166 170 ~ o.u ntoTrlM· 151: Promedios de Eh a través del tiempo. 190 :;.§. del tiempo 148 lijO 130 110 90 70 50 TO T2 T1 Período -Página 110 de 130- T3 T4 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Los resultados indican que el sector noreste del modulo de cultivo es el que mayor cantidad de cambio experimentó. Esta área, conforme avanza el seguimiento, restringe sólo al sector más noreste de las jaulas. -Página 111 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Caracterización Enero 2010 del Oxígeno Disuelto (00) Los resultados del cambio promedio que experimenta el oxigeno disuelto (00) en los primeros centrmetros de la columna de agua se presentan en la Tabla N° 152 yen la Figura nO 153. Los resultados indican que al inicio de la experiencia (tiempo TO), no existen diferencias significativas entre el contenido de 00 en los primeros centlmetros de la columna de agua del sector de referencia y el que seria sometido al tratamiento. Al tiempo TO, el promedio de 00 en el sector referencia es de 5,97 ± 0,63 mg/L, mientras que el sector tratamiento el promedio es levemente inferior de 5,91 ± 1,52 mglL Al tiempo T4, se observan cambios sustanciales en el contenido de 00 en los primeros declmetros de la columna de agua. En el sector de referencia se obtiene un promedio de 7,04 ± 0,78 mg/L, mientras que en el sector de tratamiento se obtiene un promedio de 7,38 ± 0,80 mglL, experimentándose una diferencia significativa entre el incremento de las estaciones de referencias y las de tratamiento. Tabla N° 152: Promedios de OD entre el tiempo TOy el T4. Re"fttncla (mmIL) Periodo de Tiempo TO T4 Tratamiento (qIL) 5,97 ±O,63 5,91 ± 1,52 7,04 ±O,78 7,38 ±O,80 ---+--- Relerene" -e__ Tr~ ',5 8.0 7,5 7,38 ~ !. 7.0 o o 6,5 6,0 '.o' ',5 10 Figura Ir 153: Variación Promedios de OD a través del tiempo. Como en ambos sectores existen cambios, estos pudiesen responder a un proceso naturales o bien a un efecto ampliado de las unidades biorremediadoras, es decir, presentarlan un área de acción mayor a la prevista (15 m). Considerando a las corrientes como variables, es probable que esta última hipótesis sea la más acertada. -Página 112 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Macrofauna bentónica En el sector de tratamiento, se colectaron 4 especies, de las cuales Oligochaeta n.d. fue dominante en el tiempo TO y T4 tanto para la abundancia como para la biomasa. En cuanto a los promedios de abundancia y biomasa del sector tratamiento (Figura NO 154) la mayor abundancia promedio corresponde a Oligochaeta n.d., pero la biomasa promedio se atribuye a Pisidium sp. 250 - 1,20 -Biomasa -o- Abundancia 200 203 1,008 0,975 1,00 - N 0,90 E '":" "C e ;:. 0,60 ni ·u e ni 100 3 1» U! 1» - liQ ..•..• 0,40 "C e ::1 oC oC( o· Gl 134 150 50 1 0,20 Pisidium sp. n.d. ro I H;rUdinea n.d. 20 -1 Oligochaeta n.d. , 0,00 Pisidium sp. T1 Figura ~ 154: Promedio de Abundancia (ind./m2) y Biomasa (g/m2) en el sector tratamiento. A pesar de las diferencias detectadas entre el monitoreo del tiempo TO y T4, el análisis estadlstico de los resultados de macrofauna indica que no existen cambios significativos en la estructura comunitaria entre antes (TO) y despuéS (T4) de aplicar las unidades biorremediadoras. -Página 113 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.3.2.3. Conclusiones El análisis de los parámetros ambientales monitoreados bajo las jaulas del centro en lago, ha detectado que posterior a la siembra de unidades biorremediadoras, el bentos experimenta cambios atribuidos al efecto biorremediador. Los resultados obtenidos sugieren que desde un punto de vista ambiental y normativo, es favorable el uso de unidades biorremediadoras para ser aplicadas a fondos blandos de lagos sometidos a la presión del enriquecimiento orgánico producto de la actividad aculcola, puesto que variables utilizadas por la autoridad para la Gestión Ambiental, y que en la actualidad son exigidas por las normas de acuicultura nacional, tales como oxigeno disuelto, potencial redox, materia orgánica y macrofauna bentónica, experimentan una respuesta positiva y beneficiosa desde perspectiva ecológica, lo cual permite la recuperación del sedimento bajo las jaulas de un centro de cultivo aculcola. Los resultados indican que en lago, la respuesta del bentos a las unidades biorremediadoras es rápida y significativa, generando cambios en variables ambientales como redox, oxigeno, materia orgánica y macrofauna, cuyo efecto tiende a perderse con el tiempo. Esta corta respuesta probablemente sea consecuencia del alto contenido de material orgánico presente en el sedimento, caracteristica propia de los lagos. Este tipo de ambiente, se caracterizan por ser áreas de depositación, ricas en materia orgánica en los primeros centímetros del sedimento, variable directamente relacionada con el consumo de oxigeno, proceso que modifica el potencial redox y genera cambios sustanciales en la estructura comunitaria de macroinvertebrados. En un lago, el porcentaje de materia orgánica suele alcanzar y superar el 15% del sedimento superficial y estas características pueden ser la causa del corto efecto de las unidades biorremediadoras. Esto sugiere que la concentración de unidades biorremediadoras a utilizar en el futuro pueda ser mayor. • Se constata que al inicio de la experiencia, las especies de macroinvertebrados presentes son consideradas en su mayoria como bioindicadoras de enriquecimiento orgánico o bien tolerantes a niveles muy bajos de oxigeno. Particularmente la presencia de Oligoquetos y larvas de Chironómidos son tipicas especies indicadores de enriquecimiento orgánico y/o bajas de oxigeno disuelto (Rubio, 2000). Los Chironómidos están ausentes en T4 y los oligoquetos disminuyeron en un buen porcentaje su abundancia (luego de ser la especie dominante en TO). Si a esto agregamos el hecho que durante el estudio el promedio de oxígeno en los primeros decímetros del fondo se incrementó notablemente, que el nivel de materia orgánica disminuyó y el Eh se incrementó, se puede constatar un escenario que otorga condiciones favorables para un incremento de la diversidad bajo las jaulas. Si bien esto último no acontece por el corto tiempo que dura la experiencia, en condiciones normales de redox y oxigeno en el sedimento los bioindicadores no están presentes, o bien lo están a una muy baja densidad. Por ende, la disminución de organismos bioindicadores es una señal del beneficio de las unidades biorremediadoras en el sedimento, sugiriendo una mejora de las condiciones ambientales destacable.. • Se sugiere que el uso de las unidades biorremediadoras en una dosis más alta que el usado en el presente estudio o bien, de manera dosificada por un período de tiempo mayor, cuya duración dependerá de características propias de cada lugar. De acuerdo a los resultados, esta última opción podrla ser la mejor, puesto que los resultados indican que pasado una par de semanas el efecto de las unidades biorremediadoras tiende a perder el efecto sobre algunas variables. Dada la gran carga orgánica de origen antrópico que suele existir bajo las balsas jaulas, es importante lograr una disminución significativa del enriquecimiento orgánico y que perdure en el tiempo, y se acople y coayude a los procesos biogeoqulmicos naturalmente en el sedimento de cada centro de cultivo. -Página 114 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD Enero 2010 2.4: ESTUDIO DE VIDA UTlL DEL PRODUCTO BIORREMEDIADOR Objetivo Establecer la vida útil de las tabletas prototipo fabricadas. Descripción Se sometieron a pruebas de vida útil para determinar su resistencia a: » » » 2.4.1. PRUEBAS A Temperatura Humedad Tiempo ra VARIABLE Para estas pruebas se sometió una tableta a cuatro temperaturas diferentes (4° e, 15° e, 30° e y 40° C). Para ello, ésta fue dividida en cuatro porciones, las cuales se sometieron a distintas condiciones y se registró el comportamiento. El parámetro de control, es el número de células por mL al resuspender estéril. una porción en agua destilada Se mide estabilidad del comprimido, cualitativamente, describiendo el número de partes en que pudo fragmentarse por efecto de la temperatura y cuantitativamente, pesando cada una de las partes. Los resultados obtenidos siguiente tabla N' 155. tras 7 dias de prueba resuspendiendo en 200 mL, se representan en la Tabla N' 155: resultados a temperatura variable N° Temperatura ° C Masa fragmento (g) Conc.celular cellmL Ola 1 (tableta completa) 1 4 26,2 4,51 x 109 Fragmento 2 3 4 15 30 40 225 24,7 26,6 9 451 x 10 9 4,51 x 10 4,51 x 10 9 N" de fragmentos después prueba Conc. Cellular ora 7 4,34 3,5 2,5 9,2 X X X X 109 9 1 Masa (g) 26,2 1 22,4 9 1 24,7 8 1 26,5 10 10 10 Los resultados indican que bajo ninguna de las condiciones de temperatura estudiadas, el producto presenta mayores alteraciones. Sin embargo, se observa una diferencia relevante respecto a la concentración de células, en la muestra sometida a mayor temperatura. -Página 115 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 2.4.2. PRUEBAS A HUMEDAD Enero 2010 VARIABLE Para estas pruebas se sometió una tableta a cuatro rangos de humedad distintas. Para ello se dividió la tableta en cuatro porciones, las cuales fueron sometidas a estas humedades. El parámetro de control es el número de células por mL que se obtiene al resuspender una porción en agua destilada estéril y la estabilidad del comprimido de manera cualitativa, describiendo el número de partes en que pudo fragmentarse por efecto de la humedad y cuantitativamente, pesando cada una de las partes. Las muestras son sometidas durante 7 dlas a las siguientes humedades: • • • • 20 % 40% 60% 80% Para simular las condiciones humedad. definidas, el producto fue dispuesto Los resultados de esta prueba resuspendiendo siguiente tabla N' 156 Tabla Humedad N° % 1 20 40 para pruebas de para recuento celular en 200 mL se muestran en la N' 156: resultados a humedad variable Fragmento 2 en una cámara Masa fragmento (g) Conc.celul ar cellmL Día 1 (tableta completa) Conc. Cellular Dia7 109 28,1 3,80 x 109 25,2 3,80 x 8,5 6,5 x 1(f 109 3 60 22,4 3,80 x 10S 4 80 24,3 3,80 x 109 3,6 X 2,8 x 10S x 10S N° de fragmento s después Masa (g) prueba 1 28,0 2 6 24,8 20,4 Indetenn inado 18,3 De acuerdo a los resultados puede concluirse, que las mejores condiciones de mantención son a humedad menor al 20 %. Mayor humedad cambia las condiciones originales del producto en cuanto a compactación, y el número de células al final de la prueba disminuye mientras más humedad existe. Probablemente, debido a que las células se activan con la humedad, pero no cuentan con los nutrientes necesarios para su crecimiento en la tableta. -Página 116 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 2.4.3. PRUEBAS A TIEMPO VARIABLE Para realizar estar pruebas se observó una tableta durante 60 días. Se realizó recuento celular al inicio y término de las pruebas. El parámetro de control, es el número de celulas por mL al resuspender una porción en agua destilada estéril y la estabilidad del comprimido de manera cualitativa, describiendo las condiciones del comprimido al inicio y término de la prueba. Las masas fueron analizadas en cada uno de los tiempos. La temperatura y humedad de esta prueba fueron 60% y 15° C. Los resultados se muestran en la siguiente tabla If' 157 Día Masa Tableta (g) 1 102,2 2 100,1 3 100,1 4 98,7 5 98,5 6 98 7 97,7 8 97,5 Tabla N° 157: resultados Conc.celular CellmL Ola 1 (tableta completa) Conc. Celular CellmL día 30 9 4,20 x 10 3,8 x 10 a tiempo variable De acuerdo a los resultados observados, se puede concluir que la tableta puede mantener condiciones, al conservarlas a una temperatura y humedad adecuadas, por al menos 60 días. -Página 117 de 130- sus INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 C.3. ETAPA 3, ESTUDIO DEL MERCADO, DIFUSiÓN Y PROTECCiÓN ETAPAS Etapa 3 : Estudio de ACTIVIDADES INTELECTUAL nov.oS dic.oS ene.o9 feb.o9 mar.o9 abr.o9 1615 1616 1617 1611 1619 1620 3.1: Desarroi> del plan de negocio Establecer la inwrsiÓll de prodlJ:Ci6n Y al personal de 3.4: Seminario y pubicaciores -Página 118 de 130- 1621 DEL PRODUCTO 1622 jul.o9 ago.o9 1623 lE 24 INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD.3.1. DESARROLLO Enero 2010 DEL PLAN DE NEGOCIO Este plan de negocio implicó el desarrollo de todo un plan de marketing, cuyos principales contenidos son: COBERTURA DE MERCADO X REGiÓN XI REGiÓN DISTRIBUIDORES, para la: • X Región • XI Región HERRAMIENTAS • Avisos publicitarios: revistas especializadas • Folletos y manuales • Incentivos al vendedor -Página 119 de 130- "'-r-•.~- - -- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 • Bonificaciones al cliente final por compras grandes • Marketing directo al cliente final (centro a centro) • Creación de pagina web • Incentivos vendedores • Charlas-seminarios Enero 2010 y lanzamiento producto SISTEMA DE GESTlON INTEGRAL DE VENTAS DEFINICIÓN MERCADO CLIENTES ACnJALES VENTA CLIENTES NUEVOS CARTERA CLIENTE INF O Rl\.fAC ION GESTION ANALISISDE RESULTADOS PREPARACIÓN DEPRODUCTO~----~ ARGENTINA I ¡;"IPORTAcró:-,¡ I FACTURACIOl'\ ENTREGA COBRA"lZA -Página 120 de 130- I I INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ASISTENCIA COMERCIAL Enero 2010 POST-VENTA -1 E-MAIUNG ~I----~ RECLAMOS INFORMACIÓN CONSULTAS INFORMACIÓN HELPDESK L....--------I CONTACT CENTER I TELEMARKETING I 1-----1 yWEB 3.2. ESTABLECER PARTICIPACIÓN r LOGISTICA RESPUESTAS ACTIVIDAD GESTIÓN BASE IINFORMACIÓN ENUNEA H PEDIDOS INVERSIÓN PAGO COBRANZA SEGUIMIENTO I Y COSTOS DE PRODUCCIÓN Para el desarrollo de esta actividad se contrataron los servicios de Asesoría de la empresa Tecnovax, empresa especializada en procesos de fermentación biológicos a nivel industrial. Se realizaron estudios de Investigación y Desarrollo con nuestro principio activo fabricado en la planta piloto, con el objetivo de diseñar e implementar un sistema de producción industrial de los microorganismos constituyentes de producto biorremediador. -Página 121 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD 3.3. SEMINARIOS Enero 2010 Y PUBLICACIONES Dentro del plan de difusión del proyecto se realizaron diferentes actividades: 3.3.1. SEMINARIO Realizado en Puerto Montt el día 1 de Diciembre del 2009. A éste asistieron representantes de las diferentes empresas salmoneras pertenecientes al área de medio ambiente, del área de salud, de I+D ... asi como representantes de Semapesca, SISS .... La exposición fue realizada por: • Carlos González- Gerente División Veterinaria- Laboratorios Recalcine S. A. • Elena Sáenz- Jefa de proyecto- Laboratorios Recalcine • Marcelo Rivas- Jefe Depto. Medio Ambiente- GEEAA Ltda. • Igor Stack- Gerente Depto. Medio Ambiente- Marine Harvest Chile S. A. 3.3.2. PUBLICACIONES ~ REVISTA VIS ION ACUICOLA En la siguiente figura ~ N° 117, MES DICIEMBRE 2009 158 se muestra el publirreportaje que se publicó. -Página 122 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 ._III oI•••••1SA Recalcine suma nuevo desarrollo en investigación y refuerza su compromiso con la salmonicultura .EI.-- __ ..._-quo __ • EI"",yocIO",,*,_"/I(I01Odo"""'CIoolIIdoCodoy_.fao ¡xx __ ~_ •• pItJIfCd/lndol .--."-. -,,-- ~~~Ioo~-~::::;~~"':= _doI,.,.,.,.bs_ IIIImiIl'MltlelfI'IettIIt) hIemIt:IOnIIl'IC~ •• ..::iId:sallR:lusnldel."oo,. 1I.,bftm. •.• ~p¡IIiJ DCI05for11b.p::r!oOUlno"" ~ ••• elB"5" •.•..•.... """,,~-..pn:a".,."Seoa.alOl.fI~ __ fI'IiIrJ'ICII,la::usns. lo ur.ando ast JI T'1!tdlrWlIAdt:Trnt:#dB\a SJaMooIIin di! Pesa ~-.IJSO --y. -"......,..'"""'1:IC)eI'me!"Uf,,~'* Iint*fI¡lM'lflEllflllWotellll rIo.~~""dIJj p1IdU;iIpnu 2 •••• --, _ ..-...•. -"-"'_. ........-. '._~11'8" -""FINC--.. GcrtnI!zWcll6bfS.llldosOt 8~c:o'ttIa"'lN" aae.eIIf!'e'ItII¡ranlesdt~ _50, __ 1 ..••.•..• _"""_iala •• lI'tIIzavItiIIIOI~ OemiCIcItepeM'Ílt/eo::nf"lI ~.IoOJlll'lCllpenrdll ••••. elteDO'f)r:.IdudC ~_~.tIiI adImiS ¡:)e pQMIt ~ ~de ~~CNtpPII,,!t.I _"""""' •• 30 •••• , ..,..~1:a'mQS1!II -. --- ~~===:::~ ~c.onl¡lMnIOM:\Iftln ,....".'Ial1íI~MII'*Ot cair1e1W',¡siSAyr:tr1l .•.. _lo_'" -""',,""*"'" .ee-e onr;uefO __ 1I1I·•••• VICMi Hac:fp:x:o U 011 10 afm. ea: liixabIo Le eI,.....,oEIIlwWlII flpllSlNdCU"II aJftel~ RiardlillOeI!IIhtr "'""*' !SRS; .•••••• ee lamr.IidId de 11 ~1rI0We. -~"" Figura N' 158: publicación revista Visión Acufco/a }1> REVISTA AQUA Se está preparando el publirreportaje, el cual saldrá publicado en dicha revista el mes de Marzo 2010 coincidiendo con la Feria Aqua Sur 2010, en la que se entregará a todos los asistentes un ejemplar de la revista. -Página 123 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 ACTIVIDAD Enero 2010 3.4. PROTECCIÓN DEL PRODUCTO Con fecha 16.01.2009 se presentó al INAPI la solicitud de patente, correspondiente a "Productos biorremediadores que contienen microorganismos liofilizados para reducir la materia orgánica". Como información adicional para adjuntar a esta solicitud de patentamiento se realizaron estudios adicionales en la Universidad de Concepción con el fin de determinar la resistencia/no de las bacterias de nuestro producto a los antibióticos usados en la industria salmonera (florfenicol), así se conocieron las CMI (concentraciones mínimas inhibitorias) y las CMB (concentraciones máxima bactericida) de nuestras bacterias frente al florfenicol. -Página 124 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 D. RESUMEN Y CONCLUSIONES • Se cumplió en cabalidad con todos los objetivos del proyecto, que a grandes rasgos son: ~ Aislamiento de cepas (principio activo) ~ Determinar dosis y frecuencia de uso ~ Disei'to y formulación del producto ~ Disei'to del proceso productivo, layout, compra y montaje de planta piloto ~ Obtener una producción prototipo ~ Evaluación del producto en condiciones reales de aplicación ~ Establecer las condiciones de uso y de almacenamiento ~ Establecer una estrategia de marketing ~ Obtener el reconocimiento de la innovación mediante la difusión del proyecto y de sus resultados exitosos, a profesionales de la industria salmonera. ~ Protección intelectual del producto. del producto • Obtuvimos un producto nacional pionero en Chile y de caracterlsticas autóctonas. • Producto de fácil uso y baja necesidad de manipulación en la aplicación de la tecnologia. • Fortalecido por una mayor difusión y conocimiento de la biorremediación • Además la ventaja de que existe una mayor conciencia ambiental y exigencia social por preservar el medio ambiente. • Aplicación del concepto whole-product: • No existe una tecnologia inserta en el mercado, que aporte al impacto ambiental asociado al cultivo del salmón. • Con esta nueva tecnologia se ayuda al cumplimiento de las normativas vigentes para la Acuicultura que introducen mayores exigencias para operar. • Con esta tecnologla se permite la recuperación de sitios a través de un producto inocuo y autóctono y por ende, la permanencia de los centros en sus lugares, disminuyendo los costos que implica la rotación de centros. • Es un proyecto con sustentabilidad: a nivel social. bioproducto asociado a respaldo técnico y capacitación. Ambiental Técnica -Página 125 de 130· INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 Productiva Económica • Con este producto innovador se puede cumplir con el objetivo empresarial de crecimiento manteniendo la armonla con el medio ambiente. -Página 126 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PRO YECTO N° 206-5467 Enero 2010 E. BIBLIOGRAFíA Berg, H., Michélsen, P., Troell, M., Folke, C. & Kautsky, N. (1996). Managing sustainability in tropical Lake Kariba, Zimbabwe. Ecological Economics, 18, 141-159. aquaculture tor Buschman A., (2001) Impacto ambiental de la acuicultura, El estado de la investigacion en chile y el mundo. Terram Publicaciones. 63p. Enell, M. & Ackerfors, H. (1991). Nutrient discharges trom aquaculture operations in Nordic countries into adjacent sea areas. ICES report C.M. 1991/F:56.Ref.MEQC, 17 pp. Kautsky N., Folke C. (1989) aquaculture. Biota 5: 1-11. Management ot coastal areas tor a sustainable development of Morissey, D.J., Gibbs, M.M., Pickmere, S.E. & Cole, R.G. 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A PRACTICAL STRATEGY FOR ANALYSING MUL TISPECIES DISTRIBUTION PATTERNS. MAR. ECOL PROG. SER. 8: 3752. -Página 127 de 130- INFORME TÉCNICO FINAL PROYECTO N° 206-5467 Enero 2010 FOLK, R.L.: 1974, PETROLOGY OF SEDIMENTARY ROCKS, HEMPHILL, AUSTIN, TX, 159 PP. GAMITO, S. 1997. APPLlCATION OF CANONICAL CORRESPONDENCE ANALYSIS TO ENVIRONMENTAL ANO BENTHIC MACROFAUNA DATA OF FOUR SITES IN THE RIA FORMOSA (PORTUGAL). EN: INVESTIGACIONES SOBRE EL BENTOS MARINO: IX SIMPOSIO IBÉRICO DE ESTUDIOS DEL BENTOS Marino (1923 De Febrero, 1996. Alcalá De Henares, Madrid, España), J. M. Viéitez y J. Junoy (Eds.). Publicaciones Especiales. Instituto Espal"lolDe Oceanografla 23: 4152. GRAY, J. S. 1981. THE ECOLOGY OF MARINE SEDIMENTS: AN INTRODUCTION TO THE STRUCTURE AND FUNCTION OF BENTHIC COMMUNITIES. CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS. CAMBRIDGE: 185 PP. HEIP, C., R. M. WARWICK y M. R. CARR. 1988. ANALYSIS OF COMMUNITY ATTRIBUTES OF THE BENTHIC MEIOFAUNA OF FRIERFJORD/LANGESUNDFJORD. 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