La aplicación de modelos del physico

Resumen
El uso de modelos físico-químicos para explicar la adhesión microbiana sobre
superficies ha tenido éxito para un número limitado de cepas y especies (Capítulo
1), debido en parte a la naturaleza macroscópica de los datos experimentales de que
se dispone (es decir, potencial zeta y ángulos de contacto). En general, desde el
punto de vista físico-químico, se han asimilado los microorganismos a partículas
inertes de poliestireno. Ahora bien, los microorganismos no son partículas lisas,
sino que, a diferencia de las de poliestireno, poseen ciertas estructuras finas y largas
que se extienden desde su superficie hacía el liquido circundante. Sin embargo,
hasta el momento, permanece sin identificarse para la mayoría de las cepas de
bacterias la función específica realizada por tales estructuras en los procesos de
adhesión microbiana, así como su influencia en las propiedades físico-químicas
macroscópicas de las superficies celulares. En consecuencia, las medidas relevantes
desde el punto de vista físico-químico de la superficie microbiana, precisan de una
resolución microscópica que no puede lograrse con la mayoría de los métodos
tradicionales. La introducción del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) y su
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Macroscopic and microscopic approaches toward bacterial adhesion
aplicación a las superficies biológicas ha abierto un nuevo camino para poder tener
acceso a las propiedades físico-químicas microscópicas de las superficies
bacterianas.
Iniciamos esta tesis con la intención, a largo plazo, de desarrollar una nueva
teoría que permita explicar la adhesión microbiana a superficies, la cual habrá de
tener en cuenta interacciones complejas (como pueden ser la heterogeneidad en las
distribución superficial de cargas o los enlaces macromoleculares) que no han sido
consideradas en la teoría de DLVO. Más concretamente, los objetivos de esta tesis
han sido caracterizar microscópicamente las propiedades físico-químicas de las
superficies bacterianas y dilucidar si tales propiedades microscópicas pueden
amalgamarse -y cómo- en propiedades macroscópicas de la superficie celular y
relacionarse con la adhesión observada macroscópicamente de las bacterias a los
substratos sólidos.
Se ha completado la caracterización macroscópica de una colección de nueve
cepas de Streptococcus mitis, de las que se disponía de su hidrofobicidad
superficial, determinada mediante medidas de ángulos de contacto con agua, y su
composición química superficial, por espectroscopia de rayos X de fotoelectrones
(XPS), con la evaluación de su deformabilidad electroforética y su densidad de
carga fija asociada a la capa de polielectrólitos de las cepas de S. mitis,
generalmente portadores de largos fibrilos distribuidos de modo poco denso,
utilizando el análisis de partículas deformables para las medidas de la movilidad
electroforética en función de la fuerza iónica (Capítulo 2). En general, la superficie
celular de S. mitis es electroforéticamente deformable, con densidad de carga fija
negativa. Sin embargo, la comparación con otras cepas de bacterias que han sido
descritas como deformables, indica que la teoría de Ohshima no permite obtener
información sobre las características morfológicas de la superficie que provocan su
deformabilidad. La razón más probable es que el flujo electroosmótico tiene lugar
solo en la región más externa de las gruesas capas extracelulares. A pesar de ello, la
determinación de la deformabilidad superficial es esencial para una correcta
caracterización de la electrostática de la superficie celular.
Para realizar los experimentos de AFM es preciso anclar con suficiente fuerza
las bacterias a un sustrato, de modo que sean capaces de resistir la fricción ejercida
por la punta de nitruro de silicio. Pero para caracterizar las propiedades físicoquímicas de la superficie de los microorganismos es preciso que dicha
inmovilización no afecte ni a la integridad química ni estructural de la superficie
celular. Existen varias estrategias, descritas en la bibliografía, para la
inmovilización de bacterias. En el Capítulo 3 se presenta la comparación de la
fuerzas de interacción determinadas por AFM entre Klebsiella terrigena y nitruro
de silicio obtenidas empleando tres métodos comunes de inmovilización: bloqueo
mecánico de las bacterias en filtros, adsorción física de bacterias cargadas
negativamente sobre superficies cargadas positivamente y fijación de las bacterias
con glutaraldeido a la punta de la sonda del microscopio AFM. Se ha puesto de
manifiesto que métodos diferentes de preparación de las muestras conducen a
fuerzas de interacción disimilares. La adsorción física de las bacterias sobre
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sustratos modificados puede provocar reordenamientos estructurales en la
superficie celular, mientras que se considera que el empleo de glutaraldeido induce
cambios en las propiedades físico-químicas y mecánicas de la superficie bacteriana.
En general, el método de inmovilización mediante el bloqueo mecánico de
bacterias individuales en filtros parece ser el más adecuado.
Una vez establecido el método más idóneo para la inmovilización de las
bacterias de cara a su estudio por AFM, se ha realizado un análisis detallado de las
fuerzas de interacción entre la punta de nitruro de silicio de la sonda del
microscopio AFM y la superficie de nueve cepas de la bacteria S. mitis. El
Capítulo 4 es un primer intento de correlacionar las propiedades microscópicas y
macroscópicas de la superficie bacteriana. Es interesante el hecho de haber podido
relacionar las características particulares de las curvas fuerza-distancia de modo
que se ha logrado obtener relaciones entre las propiedades microscópicas y
macroscópicas, aunque no se haya conseguido dar una justificación completa sobre
el origen de estas relaciones.
En el Capítulo 5 hemos tratado de correlacionar la adhesión microscópica de
las cepas de S. mitis a la punta, hidrófila y cargada negativamente, de nitruro de
silicio de un AFM con su adhesión macroscópica a vidrio, hidrófilo y cargado
negativamente, empleando una cámara de flujo plano-paralela. Se ha encontrado
que la fuerza repulsiva observada al aproximar la sonda del AFM a la superficie de
la célula se corresponde con una barrera de activación que gobierna la adhesión
macroscópica inicial de los microorganismos a la superficie del vidrio. Además, se
ha encontrado que la distancia máxima a la que se han detectado las fuerzas
atractivas al alejar la sonda del AFM está relacionada con el área bloqueada por
cada bacteria adherida, es decir, con la distancia entre bacterias adheridas. La
desorción de las bacterias no ha sido posible relacionarla con la fuerza adhesiva
determinada con AFM, posiblemente por las diferencias en la naturaleza de los
procesos que se llevan a cabo en la cámara de flujo plano-paralela y la separación
forzada en el AFM.
La desorción de microbios había sido estudiada in situ en función del tiempo de
residencia de los microorganismos sobre la superficie en dispositivos de flujo
controlado (Meinders et al., 1994), encontrándose una disminución muy importante
de la desorción de Streptococcus thermophilus después de transcurridos
aproximadamente 50 s de la adhesión inicial, proponiéndose que podría estar
relacionada con el fortalecimiento del enlace al aumentar el tiempo de contacto
entre la bacteria y el sustrato. En el Capítulo 6, se ha corroborado
microscópicamente el efecto del tiempo de contacto sobre la intensidad del enlace
entre la superficie de S. thermophilus y la punta de nitruro de silicio del AFM y se
ha relacionado con la dependencia de la desorción en condiciones de flujo con el
tiempo de residencia de las bacterias sobre la superficie. Los experimentos de AFM
han puesto de manifiesto un fortalecimiento del enlace entre la sonda y la superficie
de la célula tras 100 s de contacto, tiempo del mismo orden de magnitud que el
inferido del estudio de la desorción en función del tiempo de residencia sobre la
superficie. Además, la comparación entre las energías de interacción obtenidas por
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Macroscopic and microscopic approaches toward bacterial adhesion
AFM y de la desorción macroscópica parece indicar que el fortalecimiento del
enlace está debido a la adhesión de múltiples polímeros extracelulares a la
superficie del sustrato.
Esta generalmente aceptado que la hidrofobicidad de la superficie bacteriana,
habitualmente determinada depositando gotas de agua sobre una capa de bacterias
compactadas y secadas, influye en la interacción del microorganismo con su
entorno. Sin embargo, el ángulo de contacto de las gotas de agua sobre esas capas
de bacterias informa sobre las características de un recubrimiento desordenado de
material de la superficie de las bacterias colapsadas en un cierto empaquetamiento.
Aunque los resultados son útiles para interpretar las interacciones de largo alcance
entre el microorganismo y la superficie del sustrato, no lo son necesariamente para
la interpretación de las interacciones de corto alcance, que podrían estar controladas
por las heterogeneidades estructurales y químicas de la superficie celular. En el
Capítulo 7, se han estudiado las fuerzas de interacción mediante AFM de la
superficie de L. acidophilus ATCC4356 y L. casei ATCC393 con y sin SLP,
respectivamente, con sondas funcionalizadas, es decir terminadas con grupos
hidrófobos (CH3) e hidrófilos (OH), en disoluciones con fuerza iónica baja y alta.
La hidrofobicidad superficial macroscópica de ambas cepas se determinó mediante
ángulos de contacto, empleando disoluciones con las dos fuerzas iónicas
investigadas. En general, fuerzas de interacción altas con la sonda hidrófila
coinciden con valores bajos del ángulo de contacto, mientras que las células que
muestran ángulos de contacto altos presentan una interacción más fuerte con la
sonda hidrófoba. Asimismo, ambas cepas invierten su naturaleza hidrófoba al
aumentar la fuerza iónica de 10 a 100 mM. Es interesante el que el comportamiento
dinámico de la hidrofobicidad superficial de los lactobacilos sea posible medirlo no
solamente macroscópicamente mediante ángulos de contacto, sino también por
AFM a nivel microscópico. El comportamiento dinámico de las superficies
celulares de L. acidophilus ATCC4356 y L. casei ATCC393 frente a los cambios de
la fuerza iónica confiere a estos microorganismos una versatilidad que les permite
adherirse a superficies hidrófobas e hidrófilas en disoluciones con baja y alta fuerza
iónica, respectivamente.
En general, la adhesión de los lactobacilos a sustratos sólidos no tiene lugar de
acuerdo con las expectativas deducidas de la hidrofobicidad superficial. En el
Capítulo 8 se ha investigado el papel que juega la hidrofobicidad superficial para
dos cepas de lactobacilos con y sin capa de SLP en su adhesión a superficies de
vidrio funcionalizado hidrofóbica o hidrofílicamente, en condiciones de flujo bien
definidas de suspensiones con baja y alta fuerza iónica. Por similitud, se midió la
interacción de los lactobacilos con sondas de AFM funcionalizadas del mismo
modo. En las suspensiones de baja fuerza iónica, ambas cepas de lactobacilos
presentan una adhesión inicial más alta al vidrio hidrófobo que al hidrófilo,
mientras que con fuerzas iónicas altas no se ha observado una influencia clara de la
hidrofobicidad superficial sobre la adhesión. Independientemente de la fuerza
iónica, los experimentos de AFM indican que las fuerzas de interacción son más
intensas cuando, tanto la bacteria como la sonda, son hidrófobas o hidrófilas que
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cuando tienen hidrofobicidades opuestas. Estas intensas fuerzas de adhesión no
tienen reflejo en las observaciones de la adhesión macroscópica, lo que sugiere que
la fuerza que actúa cuando una bacteria se pone en contacto con un sustrato afecta
su modo de adhesión. Por otra parte, se ha podido correlacionar sólo
cualitativamente la dependencia con la distancia de la energía de interacción total
de Gibbs con la deposición y la desorción de las bacterias en la cámara de flujo
plano-paralela, mientras que no se han detectado, mediante AFM, las fuerzas
DLVO al aproximar las sondas funcionalizadas a la superficie de las bacterias.
En la Discusión General, se han discutido las conclusiones principales
obtenidas de esta tesis que son:
(a) las curvas fuerza-distancia al aproximar la sonda a la superficie se
corresponden con la razón con que se adhieren macroscópicamente los
microorganismos a los sustratos.
(b) la distancia máxima a la cual se pueden detectar las fuerzas atractivas
mediante la retracción de la sonda del AFM están relacionadas con el área que
bloquea una bacteria adherida sobre un sustrato, y
(c) la desorción de bacterias de sustratos sólidos no muestra relación con las
fuerzas adhesivas determinadas por AFM, excepto si se considera el tiempo de
contacto entre las bacterias y el sustrato.
Además, se presentan algunas de las limitaciones del sistema de cara a la
interpretación precisa de las curvas fuerza-distancia, así como algunas perspectivas
para futuros trabajos.