IMPLEMENTACIÓN DE LA AGROTRANSFORMACIÓN EN CEPAS NATIVAS MEXICANAS DEL ENTOMOPATÓGENO METARHIZIUM ANISOPLIAE Ruth Araceli Ruiz Martínez1, Gloria Angélica González Hernández2 1 División de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, Ap. Postal 187, Noria Alta s/n, Guanajuato, Guanajuato., México, E-mail: rarmfb_shire@hotmail.com. 2 Departamento de Biología de la División de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad de Guanajuato, Ap. Postal 187, Noria Alta s/n, Guanajuato, Guanajuato., México, E-mail: gonzang@ugto.mx RESUMEN Para conocer la participación de nuevos genes en el proceso infectivo del hongo entomopatógeno M. anisopliae, es importante contar con un método alternativo de transformación. Por esta razón, en el laboratorio se implementó la transformación de cepas nativas del hongo mediante Agrobacterium tumefaciens empleando dos plásmidos: pGG622 y pGG623 los cuales llevan el gen BAR quien confiere resistencia a glufosinato flanqueado por las regiones derecha e izquierda del tDNA del plásmido pTi, esperando se facilite la transferencia de DNA de la bacteria al hongo. PALABRAS CLAVE: Metarhizium, Agrotransformación, INTRODUCCIÓN En la actualidad existen diferentes tipos de organismos que afectan la calidad y tiempo de cosecha de diversos productos agrícolas como la remolacha, la caña de azúcar, el maíz, etc. Entre ellos se encuentran insectos plaga que pueden atacar los cultivos en cualquier etapa de su desarrollo [1]. En el estado de Guanajuato los cultivos destinados a la producción de maíz se ven afectados, principalmente, por el complejo “gallina ciega” (Phyllophaga spp). La especie P. ravida presenta la distribución más amplia en el estado [2]. El ciclo de vida de este insecto se desarrolla de tal manera, que la larva se mantiene viva a expensas de los nutrientes del suelo, sobreviviendo un considerable periodo de tiempo. Para erradicar este problema se han utilizado distintos plaguicidas, que además de provocar cierta resistencia en los insectos, son dañinos para la salud humana y el medio ambiente. Debido a esto, a mediados del siglo XIX se comenzó a proponer el uso de microorganismos para el control de plagas. De las bacterias, virus y hongos entomopatógenos, éstos últimos han adquirido importancia, ya que su mecanismo de interacción con su hospedero es muy específico al igual que su proceso infectivo [3], a este tipo de microorganismos se les denomina biopesticidas. Uno de estos biopesticidas es Metarhizium anisopliae, el cual es un hongo entomopatógeno que infecta más de 200 especies de insectos. Está ampliamente distribuido en la naturaleza y se encuentra en el suelo, en la rizósfera de las plantas o en cadáveres de artrópodos como saprófito. Su ciclo infectivo comienza cuando el conidio se adhiere a la cutícula del insecto hospedero, después germina y forma un apresorio que le permite adherirse y de éste emerge la hifa infectiva que es capaz de penetrar la cutícula y llegar al hemocele del hospedero. Una vez en el hemocele forma hifas, que pueden o no desarrollar blastosporas, las cuales terminan de invadir al hospedero. Una vez agotados los nutrientes el micelio emerge y crece cubriendo la cutícula del insecto, cerrando su ciclo de vida al formar nuevos conidios los cuales a su vez podrán infectar un nuevo insecto reiniciando el ciclo de vida del hongo. Son varios los genes implicados en el proceso infectivo del hongo, algunos de ellos se conocen y muchos otros no. Por lo que el aislamiento de éstos y el análisis de su participación en el ciclo de vida del hongo y su papel durante el proceso patogénico, proporcionarán herramientas de genética molecular para el mejoramiento de la patogenicidad. Por ejemplo, disminuir el tiempo en el cual el hongo provoca la muerte del insecto [4]. Para este tipo de estudios es importante contar con un buen proceso de transformación. En los últimos 30 años se han desarrollado diversas técnicas de transformación, tales como transformación mediada por polietilenglicol, electroporación (electropermeabilización), bombardeo de partículas y, más recientemente, transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (Agrotransformación). Ésta última, permite la transformación de células intactas como los conidios, Memoria de Veranos de la Investigación Científica UG 2012 ISBN: 978-607-441-191-1 DR.© Universidad de Guanajuato 141 disminuyendo la manipulación de las células y por tanto disminuyendo las probabilidades de contaminación. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram-negativa fitopatógena que tiene la capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero, habilidad que ha sido explotada para introducir DNA no solo a plantas, sino también a otros organismos que no son hospederos naturales de la bacteria. Durante el proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal un fragmento de DNA contenido en el plásmido pTi (plásmido inductor de tumor), denominado T-DNA (DNA de transferencia) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los genes contenidos en el T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la síntesis de compuestos fenólicos que son aprovechados por la bacteria. El T-DNA está localizado en el plásmido pTi, que además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de DNA en el genoma de la planta [5]. El T-DNA está delimitado por secuencias repetitivas en su extremo izquierdo LB (left border) y en su extremo derecho RB (right border). El descubrimiento de que el rango de hospederos de A. tumefaciens se podría extender incluyendo hongos, provee una herramienta alternativa de transformación para especies en donde es complicado dirigir experimentos genético-moleculares [6]. Se cree que el mecanismo de transferencia del DNA en hongos se lleva a cabo de manera similar que en las plantas, por lo que se han desarrollado vectores con genes foráneos a los de Metarhizium anisopliae para llevar a cabo la introducción de los mismos dentro del genoma del hongo. Esto es posible ya que sólo las secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo, lo que permitirá realizar interrupciones mutagénicas al azar y posiblemente la integración dirigida en caso de usar información genética del propio Metarhizium. Por lo que en este trabajo nos enfocaremos a realizar la Agrotransformación de M. anisopliae, utilizando los plásmidos pGG622 y pGG623 los cuales contienen al gen BAR, quien confiere resistencia a glufosinato, flanqueado por los bordes Derecho RB e Izquierdo LB del T-DNA. MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismos y plásmidos empleados: Metarhizium anisopliae, cepas CARO4 y CARO19; Escherichia coli MATCH1 (Invitrogen) y Agrobacterium tumefaciens (donada por el Dr. Augusto Schrank). pGG622 y pGG623 se consideran plásmidos binarios debido a que: contienen la secuencia ORIC y el gen de resistencia a Kanamicina para su amplificación y selección en E. coli, y además contienen una región de T-DNA delimitada por las regiones RB y LB y dentro de esta región está el gen BAR de resistencia a Glufosinato para su transferencia y selección en Metarhizium anisopliae. Células competentes de Agrobacterium tumefaciens Se preparó un preinóculo de Agrobacterium en medio YPS conteniendo Carbenicilina, incubando a 28 ºC durante 48 h. Se inocularon 2 mL de este cultivo en caldo YPS fresco y se incubó por 3 horas, hasta lograr una D.O. (660nm)≈0,5. Luego se incubaron a 30 ºC y se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min a 4ºC. La pastilla se resuspendió en NaCl frío y se centrifugó de nuevo a 8000 rpm por 10 min a 4ºC. La pastilla se resuspendió en CaCl2 frío y glicerol. Las células fueron alicuotadas y almacenadas a -80°C Transformación Bacteriana: Se transformaron células químicamente competentes de E. coli como sigue: A 20µL de células competentes se le adicionó 1µL de plásmido, seguido de incubación en hielo durante 20 min, otra a 42 ºC por 2 min y una última en hielo por 2 min. Se añadieron 500 µL de medio LB al tubo, mezclando suavemente y se incubaron a 37 ºC por 1 hora. Las células contenidas en el tubo se sembraron en cajas con medio LB-Kanamicina, las cuales se dejaron incubando a 37 ºC por 24 horas. Transformación de A. tumefaciens. A las células competentes se les adicionó 5 µL de DNA plasmídico, seguido de una incubación en hielo por 30 min. Posteriormente la suspensión se congeló en nitrógeno líquido y enseguida se sometió a un choque térmico a 37ºC y después a un choque frío en hielo. Se añadió 1mL de caldo YPS a la suspensión y se incubó a 28ºC en agitación constante. Enseguida las células se colectaron por centrifugación y la pastilla obtenida al final se resuspendió en caldo YPS. Las células se sembraron en agar YPS conteniendo Carbenicilina y Kanamicina. Las colonias transformantes se recuperaron a las 48 h de incubación. Memoria de Veranos de la Investigación Científica UG 2012 ISBN: 978-607-441-191-1 DR.© Universidad de Guanajuato 142 Agrotransformación de Metarhizium anisopliae: Se inoculó una colonia de la Agrobacterium, previamente transformada con el plásmido de interés, en caldo LB con Carbenicilina y Kanamicina. Se incubó a 28 ºC en agitación constante hasta alcanzar una D.O.660nm de 0,6 y se diluyó una D.O. de 0,15 empleando medio de inducción IMAS adicionado de acetosiringona. Se incubó 4 horas en agitación constante. Por otra parte se prepararon alícuotas de conidios o blastosporas de M. ansiopliae a una concentración de 5X105 células/mL, se centrifugaron a 5000 rpm 5 min, y a la pastilla se le adicionó Agrobacterium previamente inducidas. Se mezclaron y después se esparcieron sobre celofán depositado sobre cajas Petri con agar IMAS. Después de 2 días de co-cultivación a 28 ºC, el celofán con las células se trasfirieron a cajas Petri con agar M-100 fresco con cefotaxima y glufosinato de amonio. Después de 1 día de incubación a 28 ºC, se transfirieron nuevamente a medios M-100 frescos con cefotaxima y glufosinato de amonio y se volvieron a incubar a 28 ºC. A los 3 días de incubación se recogieron las recombinantes cada día sembrándolas en medio selectivo MDS-glufosinato. Restricción de DNA con nucleasas específicas Aproximadamente a 1 µg de DNA plasmídico se le adicionó 2-3 U de cada enzima de restricción y 1/10 de volumen de regulador en un volumen final de 10 µL. La mezcla de reacción se incubó durante 2-3 h a la temperatura adecuada siguiendo las instrucciones del fabricante (Biolabs). Los productos de restricción se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% tiñendo el DNA con SiberSafe (Invitrogen) observando el gel en el transiluminador. En uno de los pocillos del gel se cargó un alícuota del GeneRulerTM DNA Ladder Mix de Invitrogen para ser usado como referencia y estimar el tamaño en pb de los fragmentos de DNA observados. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Preparación de Agrobacterium con el vector binario: Para realizar la Agrotransformación de Metarhizium anisopliae, primero fue necesario amplificar y comprobar el patrón de restricción de los plásmidos binarios pGG622 y pGG623. Para ello, una alícuota de cada plásmido se utilizó para transformar células químicamente competentes de E. coli como se indica en Material y métodos. Cinco colonias de cada transformante fueron inoculadas en LB-kanamicina líquido durante toda la noche y se procesaron para rescatar el plásmido mediante el protocolo de lisis alcalina descrito por Sambrook y Russell [7]. Una alícuota de estos plásmidos se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1% para estimar la cantidad necesaria para la restricción (ver Fig.1A). Para comprobar la identidad de los plásmidos, estos se sometieron a restricción simultánea con las enzimas EcoRI y HindIII como se indica en Material y métodos. Los productos de la restricción se observan en la figura 1B los cuales coinciden con los tamaños esperados. Memoria de Veranos de la Investigación Científica UG 2012 ISBN: 978-607-441-191-1 DR.© Universidad de Guanajuato 143 Figura 1. Plásmidos binarios pGG622 y pGG623. A. Electroforesis en gel de agarosa de los plásmidos pGG622 (carril 1-5) y pGG623 (carril 6-10). B patrón electroforético de los plásmidos cortados con las enzimas EcoRI y HindIII: carriles 2-6, pGG623; carriles 7-11, pGG622; carril 1, marcador de tamaño en pb. Una vez comprobada la identidad de los plásmidos pGG622 y pGG623 mediante patrón de restricción, se introdujeron por transformación de células competentes de Agrobacterium tumefaciens como se indica en Material y métodos, seleccionando los transformantes por su resistencia a carbenicilina y kanamicina, obteniéndose colonias aisladas como se observa en la Figura 2. A B Figura 2. Transformantes de Agrobacterium tumefaciens con los plásmidos binarios pGG622 (A) y pGG623 (B). Agrotransformación de Metarhizium anisopliae: Se seleccionó una colonia de Agrobacterium portadora de cada uno de los dos plásmidos, estas bacterias se denominaron AGLp622 y AGLp623. Cada una de estas bacterias se creció en el medio selectivo líquido como preinóculo para inducir en ellas el estado de competencia mediante la adición de acetosiringona. La acetosiringona es una hormona secretada por las plantas la cual dispara en Agrobacterium la expresión de los genes vir preparando a las células para conjugar y transferir el TDNA a una célula receptora. Usamos como células receptoras conidios y blastosporas de M. anisopliae como se indica en Material y métodos. Seleccionando como transformantes las células del hongo M. anisopliae resistentes a glufosinato, eliminando las bacterias por su sensibilidad al antibiótico cefotaxima. En la figura 3 se muestra como ejemplo algunos de los transformantes de M. anisopliae obtenidos por conjugación con AGLpGG622. Colonias individuales de estos transformantes fueron transferidas a medio Mínimo-Glufosinato para permitir su conidiación. Posteriormente en un futuro inmediato se pretende realizar al menos 4 pases monospóricos para asegurar la recuperación de transformantes eliminando los escapes y realizar su caracterización molecular. A B C D Figura 3. Transformantes de Metarhizium anisopliae resistentes a glufosinato. A partir de: A; conidios de CARO4; B, blastosporas de CARO4; C, conidios de CARO19; D, blastosporas de CARO19. Memoria de Veranos de la Investigación Científica UG 2012 ISBN: 978-607-441-191-1 DR.© Universidad de Guanajuato 144 CONCLUSIONES Los resultados hasta ahora obtenidos sugieren fuertemente que se consiguió la transformación del hongo Metarhizium anisopliae mediante la técnica de Agrotransformación, ya que las colonias recuperadas mostraron resistencia a Glufosinato utilizado como marcador de selección en Metarhizium. Con los transformantes obtenidos se puede continuar la caracterización de los transformantes para verificar mediante amplificación en cadena de la polimerasa la presencia del gen BAR, así como determinar el lugar de integración para determinar si es posible usarlo para realizar mutagénesis dirigida o al azar en este hongo entomopatógeno. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó con financiamiento de proyecto específico de SEP-CONACYT Ciencia Básica, y de la Universidad de Guanajuato, Convocatoria Institucional. La estudiante participante del Verano, Ruth Araceli Ruiz Martínez recibió beca como estudiante del Verano del Investigación Científica UG 2012. REFERENCIAS [1] Omar Huici Rojas, (2004), Plagas agrícolas: Fundamentos técnicos para el uso y manejo de plaguicidas, Plaguicidas Bolivia., pp. 2. [2] Marín Jarillo Antonio; Bujanos Muñiz Rafael, (2008), Especies del complejo "gallina ciega" del género Phyllophaga en Guanajuato, México, Agricultura Técnica en México, Vol. 34, Núm. 3, pp. 349355. [3] Augusto Schrank, Marilene Henning Vainstein, (2010), Metarhizium anisopliae enzymes and toxins, Toxicon 56, pp.1267-1274. [4] Juan Carlos Torres Guzmán; Eduardo Salazar Solís; Angélia González Hernández, (2008), Búsqueda de alternativas ecológicamente amables para el control de plagas en la agricultura moderna: Metarhizium anisopliae como modelo de estudio, Ide@s CONCYTEG, Año 3, Núm. 37, pp. 3-9. [5] Ana Milena Valderrama Fonseca; Rafael Arango Isaza; Lucia Afanador Kafuri, (2005), TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS MEDIADA POR Agrobacterium: “INGENIERÍA GENÉTICA NATURAL APLICADA”, Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1, pp. 2569-2585. [6] Rasmus John Normand Frandsen, (2011), A guide to binary vectors and strategies for targeted genome modification in fungi using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, Journal of Microbiological Methods 87, pp. 247–262. [7] Sambrook J. and Russell D, (2001) Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 3° Ed. Cold Spring Harbor Laboratories. Press. Memoria de Veranos de la Investigación Científica UG 2012 ISBN: 978-607-441-191-1 DR.© Universidad de Guanajuato 145