Profesor Patrocinante Dr. Alejandro Claude Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias ESTUDIO DE INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA DEL ARF-GEF GBF1 MEDIANTE EL SISTEMA DE DOBLE HÍBRIDO EN Saccharomyces cerevisiae, ESTABILIZACIÓN DE COMPLEJOS POR ENTRECRUZAMIENTO Y PRECIPITACIÓN POR AFINIDAD CON GST Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico ANDREA GEMITA VARGAS PARRA VALDIVIA – CHILE 2008 COMISIÓN EVALUADORA Profesor Patrocinante: Dr. Alejandro Claude Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Instituto de Bioquímica Profesor Informante: Dra. Ilona Concha Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Instituto de Bioquímica Profesor Informante: Dr. Juan Guillermo Cárcamo Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Instituto de Bioquímica Esta tesis fue realizada en el laboratorio de Biología celular y Secreción de Proteínas, dirigido por el Dr. Alejandro Claude, en el instituto de Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile. La tesis fue financiada por el proyecto Fondecyt Nº 1030346. AGRADECIMIENTOS Mis más sinceros agradecimientos al Dr. Alejandro Claude, mi profesor patrocinante, por toda su ayuda, apoyo, guía, orientación, enseñanza y conocimiento brindado durante este período. A los profesores informantes, la Dra. Ilona Concha y el Dr. Juan Guillermo Cárcamo por su abierta disposición para integrar la comisión, corregir y evaluar esta tesis. Al director de escuela, Dr Alejandro Reyes por su siempre cordial orientación y apoyo. Gracias a todos quienes en algún momento integraron el laboratorio de Biología Celular y Secreción de Proteínas por su especial dedicación y ayuda en el inicio de mis actividades prácticas, desde el taller de investigación, como por su constante colaboración durante el transcurso de mi tesis. A la profesora Cecilia Rauch, por su gran apoyo, confianza, consejos y cariño. A quienes fueron mis compañeros de laboratorio Javier Rosas y Alejandro San Martín por su cooperación, apoyo y ayuda constante. A la srta Karina por su dedicación y guía inicial en el trabajo con levaduras, y a Tatiana Pérez por su colaboración y amistad. A mis compañeros de carrera y buenos amigos Lorena Abarzúa, Ella Matamala, Catherinne Jaramillo, Marco Negrón, Sharin Valdivia y Marco Vidal. Mis agradecimientos finales a mi familia, mis padres Juan Antonio y Olvia, a mis hermanos Jenny, Carola y Antony, a Willow, Horacio, y a mis sobrinitas Tanya, Agatha, y Katy por su cariño y apoyo incondicional. “ Everything that is or was… began with a dream” ÍNDICE DE CONTENIDOS i 1. RESUMEN………………………………………………………...…………………1 Summary…………………………………………………………………………..…..2 2. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………...……3 2.1 La vía secretoria……………………………………………………….……..3 2.2 Transporte vesicular y cubiertas tipo COPI, COPII y de Clatrina……….…..7 2.3 Familia Arf…………………………….………………………..………......11 2.4 Familia Arf-GEF………………………………………………..…………..14 2.5 Dominio Sec7………………………………………………………………17 2.6 Familia Arf- GAP....…………………………………………...……….......18 2.7 Tráfico vesicular y BFA……………………………………………………20 2.8 GBF1………………………………………………………………....….....22 3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………….28 3.1 Amplificación por PCR de fragmentos de GBF1 carnadas por PCR.……...28 3.2 Cultivo microbiológico……………………………………………………..29 3.3 Clonamiento a pGEM-T Easy…………………………………...……….....29 3.4 Clonamiento de carnadas en el vector de expresión pGBKT7…………..…30 3.5 Medios de cultivo de levaduras………...…………………………………..30 3.6 Cepas de Saccharomyces cerevisiae………………………………………..30 3.7 Vectores utilizados en el sistema Doble Híbrido………………………...…32 3.8 Ensayo de Beta- galactosidasa en filtro…………………………………….32 ii 3.9 Preparación de extractos de proteína de levaduras…………………………32 3.10 Transformación de levaduras por el método de acetato de litio…….…….33 3.11 Extracción de pDNA desde levaduras…………………………………….34 3.12 Extracción de pDNA por el método de ebullición………………………...34 3.13 Apareamiento de levaduras………………………………………..............35 3.14 Entrecruzamiento de proteínas con DTBP................……………………...35 3.15 Preparación de extractos proteicos de células EBNA……………………..36 3.16 SDS-PAGE………………………………………………………………..36 3.17 Western Blot………………………………………………………………37 3.18 Anticuerpos………………………………………………………………..37 3.19 Stripping de membranas…………………………………………………..38 3.20 Purificación por afinidad con GST...........................……………………...38 3.21 Tinción de geles de poliacrilamida con sales de plata…………………….39 4. RESULTADOS……...……………………………………………………………...40 4.1 Doble Híbrido………………………………………………………………40 4.1.1 Amplificación por PCR de fragmentos de GBF1 para posterior construcción de híbridos carnadas………………..40 4.1.2 Clonamiento de los fragmentos de PCR carnadas en pGEMT- easy… …………………………………………..….47 4.1.3 Clonamiento de los fragmentos carnadas en el vector de expresión pGBKT………………….……..……….…………..50 4.1.4 Transformación de construcciones GBF1 carnadas en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae.............................................52 iii 4.1.5 Detección de construcciones híbridas en Saccharomyces cerevisiae…………………………………………….………...….53 4.1.6 Análisis de expresión de carnadas por Western Blot……………..55 4.1.7 Construcciones presas…………………………………………….56 4.1.8 Apareamiento de levaduras…………………………………..…...58 4.1.9 Ensayo de Beta-galactosidasa en filtro…………………….……..59 4.1.10 Controles de interacción………………………………………...59 4.1.11 Análisis estructural de las carnadas positivas en la búsqueda de clones de interacción para GBF1 en el sistema Doble Híbrido…………………………………………………….62 4.2 Estabilización de complejos proteicos expresados en célula de mamífero por entrecruzamiento con DTBP…………….………………………………………64 4.2.1 Procedimiento A………………………………………………….64 4.2.2. Control de entrecruzamiento: interacción GBF1-p115………….66 4.2.3 Procedimiento B…………………………………………………..66 4.2.4 Aproximación a una posible interacción GBF1- Snapin mediante estabilización de complejos proteicos………….………..68 4.3 Detección de interacciones proteicas de GBF1 mediante purificación por afinidad de fusiones con GST.........................................................70 4.3.1 Construcciones GST- GBF1...........................................................70 4.3.2 Transfección y análisis de expresión construcciones GST-GBF1……………………………………………………….72 iv 4.3.3 Ensayos de purificación de complejos proteicos por afinidad con GST………………………………………………...72 5. DISCUSIÓN.........………………………………………..…………………….…...74 5.1 El modelo propuesto……………………………………………….……….74 5.2 Sobre las técnicas empleadas………………………………………….……78 5.3 Sobre los resultados obtenidos………………………………………….…..86 5.4 Experimentos y análisis pendientes…………………………………….…..88 5.5 Publicaciones paralelas de interacción proteína-proteína con GBF1………91 6. BIBLIOGRAFÍA...................................……………………………...……………95 7. ANEXO……………..……………………………………………………………...129 7.1 Análisis del marco de lectura de GBF1 en construcciones híbridas carnadas……………………………………………………………129 7.2 Secuencia de GBF1 utilizada para el análisis de las construcciones carnadas…………………………………………………………….….…...131 7.3 Construcciones reporteras del sistema doble híbrido………………….…...133 7.4 Genes reporteros y marcadores de selección utilizados en el sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae…………………………......134 ÍNDICE DE FIGURAS v Página Figura 1. Esquema utilizado para la construcción de las carnadas de GBF1 en el sistema de Doble Híbrido en Saccharomyces cerevisiae……………….41 Figura 2. Amplificación por PCR de fragmentos carnadas………………….. …..........46 de los fragmentos de GBF1 a ser utilizados como “carnadas” 3 y 7. Figura 3. Clonamiento a pGEM-T Easy………………………………………………..49 Figura 4. Clonamiento de carnadas al vector pGBKT7………………………………...51 Figura 5. Extracción de pDNA de levaduras..…..…………...…………………………54 Figura 6. Construcciones presas………………………………………………………..57 Figura 7. Selección de clones de interacción para GBF1………………………………61 Figura 8. Carcterísticas de las carnadas positivas en la selección de clones de interacción para GBF1 mediante el screening de la librería de cDNA de cerebro fetal humano……………………………………………………..63 vi Figura 9. Estabilización de complejos proteicos con DTBP…………………………...65 Figura 10. Control de interacción GBF1-p115 y entrecruzamiento por procedimiento B…………………………………………………………...67 Figura 11. Esquema de interacciones proteicas necesarias para la detección de la posible interacción GBF1-Snapin………….………………………….69 Figura 12. Construcciones GST-GBF1………………………………………………...71 Figura 13. Expresión de construcciones GST-hGBF1 en células 293 EBNA………….73 Figura 14. Esquema de las interacciones proteicas de GBF1 publicadas de forma paralela a esta tesis………………………………………………………….94 Figura 15. Construcciones reporteras de las cepas AH109 e Y187…………………..133 ÍNDICE DE TABLAS vii Página Tabla I. Características genotípicas de de las cepas AH109 e Y187…………………..31 Tabla II. Características de los fragmentos de GBF1 amplificados por PCR para ser utilizados como carnadas en el sistema doble híbrido…………………………………………………………………43 LISTA DE ABREVIACIONES ARF ADP- ribosylation factor ARF- GEF ARF-specific guanine nucleotide exchange activity BFA Brefeldin A BIG Brefeldin A-inhibited Guanine nucleotide exchange factor BME Beta- mercaptoethanol Bp Base pair CCVs Clathrin- coated vesicles COP Coat protein COPI Coat protein complex I COPII Coat protein complex II DMSO Dimethyl sulfoxide DTT Dithiothreitol DTBP Dimethyl 3,3´-dithiobispropionimidate•2 HCl ERES ER exit sites ERGIC ER- Golgi intermediate compartament EBNA Epstein- Barr nuclear antigen FBS Fetal bovine serum Gal4 AD Gal4 activation domain Gal4 DNA BD Gal4 DNA binding domain GAP GTPase -activating protein GBF Golgi- specific Brefeldin A resistance factor GDP Guanosine diphosphate GEF Guanine nucleotide exchange factor viii ix GGA Golgi- localizing, γ-adaptin ear homology domain, ARF-binding GST Gutathione S- transferase GTPasa Guanosín trifosfatasa HA (epitope) Hemagglutitin HDS Homology Downstream of Sec7 HUS Homology Upstream of Sec7 LB Luria-Bertani medium NEM N- ethylmaleimide NLS Nuclear localization signal NSF NEM- sensitive factor ORF Open reading frame PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PMSF Phenylmethylsulphonyl fluoride SD Synthetic defined SDS- PAGE SDS- Polyacrilamide gel electrophoresis siRNA Small interfering RNA SNAP Soluble NSF attachment protein SNARE SNAP receptor TGN Trans- Golgi network UAS Upstream activating sequence VSV-G Vesicular stomatitis virus glycoprotein X-gal 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-b-D- galactopyranoside YPD medio Yeast extract, Peptone, Dextrose 1 1. RESUMEN GBF1 es un Arf GEF que mediante la activación de Arf1 regula el ensamblaje de las cubiertas proteicas de tipo COPI, las cuales median el tráfico vesicular retrógrado desde el complejo de Golgi hacia el retículo endoplasmático. La activación de Arf1 es dependiente del intercambio de GDP por GTP, catalizado por el dominio Sec7 de GBF1, esto produce un cambio conformacional que desplaza la región N-terminal miristoilada de Arf1, promoviendo el anclaje a membranas por interacción con fosfolípidos. GBF1 es una proteína de alto peso molecular, y el dominio catálitico Sec7 representa solo aproximadamente el 10 % de la proteína. Del resto de la estructura proteica no se conocen funciones específicas. Para lograr entender los mecanismos que regulan la actividad de este Arf GEF, se realizó la búsqueda de interacciones proteínaproteína a través del sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae, estabilización de complejos por entrecruzamiento y ensayos de purificación por afinidad al expresar fusiones con GST en células de mamíferos. Para el sistema de doble híbrido fueron amplificados por PCR ocho fragmentos estratégicos de las regiones N-terminal, Sec7, C-terminal y regiones intermedias de GBF1. Estos fragmentos fueron clonados en el vector de expresión en levaduras pGBKT7, para expresar fusiones con el dominio de unión al DNA de GAL4. Cada carnada fue utilizada para realizar el screening de una biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano, logrando aislar clones de interacción para las carnadas 1, 4 y 7, pero la caracterización de estos clones no fue completada. Para la estabilización de complejos proteicos fue utilizado el agente de entrecruzamiento amino-reactivo DTBP, permitiendo detectar a GBF1 formando complejos de alto peso molecular por análisis en Western Blot. Para los ensayos de precipitación por afinidad se utilizaron fusiones GST- GBF1 (total, N- terminal, sec7 y C-terminal), construidas previamente. Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular 293 EBNA, y analizadas por Western Blot. En los primeros ensayos no fue posible obtener alguna banda de interés, pero la estabilización de los complejos era una nueva estrategia, que también quedó sin completar. 2 SUMMARY GBF1 is an Arf GEF that through Arf1 activation regulates the assembly of the coat proteins COPI, which mediate the retrograde vesicular trafficking from the Golgi complex towards the endoplasmic reticulum. Arf1 activation is dependent upon the exchange of GDP for GTP, catalyzed by the sec7 domain of GBF1. This generates a conformational change that displaces the myristoylated N-terminus region of Arf1, promoting the anchorage to membranes by interaction with phospholipids. GBF1 is a high molecular weight protein, and the catalytic Sec7 domain represents only 10% of the protein, the rest of the protein structure has no known specific functions. In this work to achieve understanding the mechanisms that regulate the activity of this Arf GEF, a protein-protein interaction screen was attempted through two hybrid system in Saccharomyces cerevisiae, complex stabilization by crosslinking and affinity purification with GST-fusion proteins expression in mammalian cells. In the two hybrid system eight strategic fragments from N-terminal, Sec7, C-terminal and intermediate regions of GBF1 were amplified by PCR. These fragments were cloned into the yeast expression vector pGBKT7 to express fusion proteins with GAL4 DNA-binding domain. Each bait was used for the screening of a human fetal brain cDNA library, positives clones were isolated by the bait 1, 4 and 7, but the characterization of these clones was not completed. To stabilize the protein complexes was used the aminoreactive crosslinking agent DTBP, GBF1 was detected forming high molecular weight complexes by Western Blot analysis. For affinity precipitation assay were used GSTGBF1 fusion protein (Full length, N-terminal, sec7 and C-terminal), built previously. These constructs were transfected in 293 EBNA cells, and analyzed by Western Blot. In the first test was not possible to obtain any band of interest, but the stabilization of the complex was a untested strategy, which was not completed. 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1 La vía secretoria Para mantener la integridad y organización de sus diversas estructuras, rutas metabólicas, vías de señalización y otros procesos, las células eucarióticas requieren una constante síntesis y tráfico de biomoléculas. En la vía secretoria el movimiento de proteínas y lípidos entre diferentes compartimentos membranosos es un proceso altamente dinámico y mediado por el tráfico de vesículas secretorias. Los principales sistemas membranosos que en la célula eucariótica conforman la ruta secretoria corresponden al retículo endoplásmatico, los compartimentos intermedios ERGIC /VTC, el Complejo de Golgi, la red trans- Golgi, el sistema endo- lisosomal y la membrana plasmática (Bonifacino and Glick, 2004; Appenzeller-Herzog and Hauri, 2006). Las proteínas que ingresarán a la vía secretoria son reconocidas por una secuencia señal en la cadena polipeptídica naciente (Walter et al., 1981; Pool et al., 2002). Esta señal consiste de una estructura canónica caracterizada por residuos aminoacídicos cargados positivamente (1-5aa) y un núcleo hidrofóbico (7-15 aa) seguido de una región más polar (Nothwehr and Gordon, 1989). Luego son reconocidas por el complejo de reconocimiento de señal (SRP) y dirigidas a las membranas del RE (Walter and Johnson 1994; Wilkinson et al., 1997). La interacción entre el SRP y el receptor de SRP, media la entrega del complejo ribosoma/cadena polipepetídica naciente al complejo de translocación (Gilmore et al., 1982). Las proteínas son translocadas cotraduccionalmente hacia el lumen del retículo endoplásmico (Walter and Johnson, 1994). Según la naturaleza de éstas comienzan las modificaciones y 4 clasificación que determinarán el destino a través de la vía secretoria, ya sea como proteínas residentes del RE, del complejo de Golgi, de los lisosomas, endosomas, membrana plasmática o medio extracelular. La modificación por N- glicosilación se inicia por la adición de una unidad del oligosacárido compuesta de 3 glucosas, 9 manosas y 2 moléculas de N- acetilglucosamina (Glc3Man9Nac2) sobre el residuo de asparagina en la secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr (Kornfeld and Kornfeld, 1985). Las proteínas integrales de membrana son retenidas en la membrana del retículo endoplásmico o dirigidas hacia la membrana plasmática de otros organelos (Hegde and Lingappa, 1997; Matlack et al., 1998). Las proteínas solubles luego de ser translocadas se mantienen en el lumen del RE o son transportadas al lumen de otros compartimentos. Algunas proteínas de la superficie celular luego de ser liberadas al lumen del RE son unidas a membrana mediante anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Lisanti et al., 1990). En el retículo endoplásmico las proteínas son modificadas para adquirir su correcto plegamiento y oligomerización, lo cual es ayudado por las proteínas accesorias de la familia de chaperonas y enzimas de plegamiento (Helenius et al., 1992). El tráfico vesicular entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi requiere de los compartimentos intermedios ERGIC (ER- Golgi intermediate compartment) o también llamados VTCs (vesicular tubular clusters) (Hauri and Schweizer, 1992; Balch et al., 1994). En estos compartimentos se regula y organiza el movimiento en sentido anterógrado hacia las cisternas cis-Golgi, y recuperación de proteínas hacia el RE por movimiento retrógrado. La vía de recuperación de proteínas residentes del retículo endoplásmico desde los compartimentos post-RE es mediada por secuencias del tipo KDEL para las proteínas solubles (Munro and Pelham, 1987; Lewis et al., 1990) o por el motivo KKXX del extremo C-terminal de las proteínas de membrana residentes del RE (Jackson et al., 1990). 5 El movimiento hacia el complejo de Golgi permite continuar las sucesivas modificaciones en las proteína transportadas, las que incluyen procesamiento de las Nglicosilaciones (Farquhar, 1985) y extensión de los O-glicanos (Schweitzer et al., 1994; Roth et al., 1994). Estas modificaciones pueden cumplir roles estructurales, funcionales y de señalización. El complejo de Golgi está organizado por apilamientos membranosos en forma de cisternas, las que se caracterizan por su composición diferencial en cuanto al contenido de lípidos y tipo de enzimas residentes, esto origina un sistema polarizado de membranas donde el contenido de colesterol aumenta desde la cara cis hacia la cara trans del Golgi (Bretscher and Munro, 1993; Farquhar and Palade, 1998). Estas propiedades han permitido aislar y caracterizar las diversas regiones del complejo de Golgi por fraccionamiento en gradientes sacarosa. Al final del tráfico a través del complejo de Golgi, en la red trans- Golgi (TGN), las proteínas son ordenadas, clasificadas y empaquetadas para ser transportadas hacia las membranas diana (Traub and Kornfeld, 1997; Keller and Simons, 1997). El proceso de formación de vesículas secretoras requiere una serie de modificaciones a nivel de la membrana donante, los cuales incluyen el reclutamiento de los mantos proteicos, proteínas modificadoras de lípidos, proteínas accesorias y proteínas reguladoras, implicadas en la selección de la carga, direccionamiento y fusión de las vesículas con las membranas dianas (Rothman and Wieland, 1996; Schekman and Orci, 1996). Se conocen tres tipos de cubiertas proteicas de vesículas secretoras, las que dirigen los distintos pasos de la vía secretoria: vesículas con cubiertas de clatrina (Schmid, 1997; Nakatsu, 2003), vesículas con cubiertas de tipo COPI (Barlowe, 2000 ) y vesículas con cubiertas tipo COPII (Hughes H, Stephens DJ, 2008). Las vesículas con cubierta de clatrina median el transporte desde la red trans- Golgi hacia los endosomas y la endocitosis de receptores de transmembrana. Las vesículas de cubierta tipo COPII 6 controlan el transporte desde el retículo endoplásmico hacia el complejo de Golgi, conocido como transporte anterógrado. Las vesículas con cubierta tipo COPI median el transporte desde el Complejo de Golgi al retículo endoplásmico y también el transporte intra Golgi, y es denominado transporte retrógrado. El direccionamiento y fusión de las vesículas secretoras con sus membranas dianas permite entregar la carga transportada de forma selectiva, a través de los eventos de reconocimiento, apareamiento, anclaje y fusión de membranas. La especificidad de la fusión en este proceso está controlada por la complementariedad entre los pares de proteínas SNARE (soluble NSF attachment protein (SNAP) receptores) presentes en la superficie de las vesículas y membranas blanco (Hunt et al., 1994; Weber et al., 1998; Litteton et al., 1998). Las proteínas SNARE que se encuentran en las membranas de las vesículas secretoras se denominan v-SNARE y las presentes en la membrana blanco se denominan t-SNARE (Soellner et al., 1993). La interacción entre v-SNARE y t-SNARE es el primer paso de regulación en la selectividad del reconocimiento entre membranas (Rothman and Warren, 1994). El punto de interacción entre v-t SNARE está localizado en los dominios helicoidales de estas proteínas (Skehel and Wiley, 1998), los que forman un complejo trans- SNARE que permite el anclaje a la membrana blanco, previo al evento de fusión. Existe una gran variedad de isoformas de proteínas SNARE (Linial, 1997) las que se localizan en distintos estructuras membranosas, y donde la gran posibilidad de combinaciones entre v/t-SNARE explica la alta especificidad del transporte vesicular con los distintos organelos. Para los posteriores eventos de fusión los complejos SNARE deben ser disociados a través del reclutamiento de SNAP / NSF (NEM (N-ethylmaleimide) sensitive factor) (Clary et al., 1990; Weidman et al., 1989). (Barnard et al., 1997; Nagiec et al., 1995). NSF (Block et al., 1988) es una proteína oligomérica compuesta por tres subunidades de 76 KDa, presenta actividad ATPasa y se 7 une a SNAP a través del extremo N-terminal, permitiendo así la interacción con los complejos SNARE de membrana (Whiteheart et al., 1993), que a su vez interaccionan con SNAP. Existen tres isoformas de SNAPs; α- SNAP, β- SNAP y γ-SNAP. Las formas α y γ SNAP son ubicuas, mientras que la forma β- SNAP se expresa sólo en cerebro (Whiteheart et al., 1993). La actividad ATPasa de NSF está concentrada en el dominio C-terminal. La fusión entre la vesícula y la membrana objetivo requiere el previo desprendimiento de la cubierta proteica de la vesícula de transporte, para así permitir el contacto directo de las bicapas lipídicas en proximidad. Otra familia de proteínas implicadas en la especificidad de la fusión vesicular son las GTPasas de direccionamiento Rab, las cuales también presentan localización específica en los distintos organelos de membrana (Novick & Zerial 1997). A través de sus múltiples efectores, las proteínas Rab permiten mantener el contacto entre v- SNARE y t-SNARE (Bourne 1988; Søgaard et al., 1994). 2.2 Transporte vesicular con cubiertas tipo COPI, COPII y de clatrina. El transporte retrógrado está mediado por vesículas de cubierta proteica tipo COPI. Para el ensamblaje de las vesículas de tipo COPI se requiere de la proteína Arf1 (ADP- ribosylation factor 1) y un complejo proteico hetero- heptamérico, el coatómero (Serafini et al., 1991; Waters et al., 1991). La caracterización de este tipo de vesículas fue realizada por ensayos in vitro con vesículas aisladas de las membranas del complejo de Golgi (Ostermann et al., Serafini et al., 1991). El coatómero está formado por las subunidades α-COP, β-COP, β`-COP, γ-COP, δ-COP, ε-COP y ζ-COP. Las subunidades de este complejo se encuentran en el citosol formando parte del coatómero y también en 8 la forma unida a membrana. Para la formación de vesículas secretoras tipo COPI es necesaria la activación de una familia de GTPasas denominada factores de ADPribosilación, Arf. Los Arf en la forma unida a GDP se encuentran en un estado inactivo, solubles en el citoplasma. La activación de estas proteínas es realizada por la familia de los Arf- GEF (factores de intercambio de nucleótidos de guanina), los cuales promueven el intercambio de GDP por GTP. En la forma activa Arf es anclado a membrana para reclutar las cubiertas proteicas COPI. Inicialmente uno de los dilemas sobre la actividad de Arf fue si éste formaba parte de la estructura de las vesículas COPI o si solamente actuaba como un catalizador en el proceso de inicio del reclutamiento de los mantos proteicos a membrana (Ktistakis et al., 1996). Posteriormente se logó demostrar que Arf sí formaba parte del ensamblaje de las cubiertas COPI, esto a través de la determinación de Arf1 en cantidades estequiométricas al coatómero (Stamnes et al., 1998.). Luego por experimentos de foto-entrecruzamiento sitio específico se demostró la interacción de Arf1-GTP con el coatómero, la interacción fue dependiente de una fenilalanina fotoreactiva de la posición 82, siendo también encontrada en la fracción vesicular (Zhao et al., 1997). En otro estudio se logró identificar que las subunidades β y δ COP eran reclutadas a membrana dependiendo de Arf1 y GTP (Pavel et al, 1998). Otro punto para la estabilización y ensamblaje de las cubiertas COPI es la interacción de algunos miembros del coatómero con determinadas proteínas de membrana. La participación de las proteínas de transmembrana durante el proceso de gemación se ha sugerido como una plataforma para la formación de los complejos proteicos de las cubiertas tipo COPI (Springer et al., 1999). A través de los dominios citoplasmáticos de los miembros de la familia p24 se ha logrado demostrar la estabilización del coatómero con las membranas donantes (Stamnes et al., 1995; Bremser et al., 1999). 9 Los miembros de la familia de proteínas p24 ciclan continuamente entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi, y son ensambladas en complejos heteroméricos (Sohn et al., 1996; Rojo et al., 1997). En levaduras se ha demostrado que en las vesículas derivadas del retículo endoplásmico los complejos de p24 participan en la selección y reclutamiento de carga (Muñiz et al., 2000). En los complejos p24 de levaduras se ha descrito la presencia de los miembros Emp24, Erv25p, Erp1p y Erp2p (Marzioch et al., 1997). La participación de p24 en la formación de vesículas de tipo COPI fue originalmente definida por la capacidad de unión a las proteínas de COPI (Stamnes et al., 1995). En base a la homología de secuencia la familia p24 en mamíferos ha sido dividida en 4 subfamilias (Dominguez et al., 1998), denominadas subfamilia p23, subfamilia p24, subfamilia p25 y subfamilia p26. Los estudios de la familia p24 en mamíferos han identificado a la proteína p23 como un receptor de las cubiertas proteicas COPI (Bremser et al., 1999). Una interacción entre la subunidad γ-COP del coatómero y el extremo citoplamático de p23 fue determinada por ensayos de entrecruzamiento (Harter and Wieland, 1998). Trabajos con cepas de levaduras depletadas de los miembros de la familia p24 no demostraron ser críticos en los eventos de tráfico vesicular (Springer et al., 2000). Sin embargo, experimentos análogos en mamíferos revelaron la importancia de la actividad de p23 durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de ratones (Denzel et al., 2000). Posteriormente mutaciones en uno de los alelos de p23 evidenciaron modificaciones estructurales del complejo de Golgi, reafirmando la relevancia de p23 en los eventos de transporte vesicular en este organelo. De este modo el reclutamiento de las cubiertas proteicas COPI en mamíferos está regulada de un forma bivalente a través de las interacciones entre las subunidades βCOP y γ- COP con Arf1 y, por las interacciones entre la subunidad γ- COP con p23. 10 El transporte de vesículas COPII regula el tráfico desde el RE al complejo de Golgi. La formación de vesículas de tipo COPII requiere, de forma análoga a COPI, el reclutamiento de una serie de proteínas solubles (Barlowe et al., 1994) que a través de la generación de mutantes en Saccharomyces cerevisiae resultaron ser esenciales en el transporte intracelular (Kaiser and Schekman, 1990). Las cubiertas proteicas COPII están formadas por la proteína Sar1p y los complejos Sec23p-Sec24p y Sec13p-Sec31p. La activación de Sar1p es mediada por Sec12p, una glicoproteína integral de membrana del RE (Barlowe and Schekman, 1993), que promueve el intercambio de GDP/GTP. Luego Sar1p inicia el ensamblaje de las cubiertas de tipo COPII (Futai et al., 2004), mediando el reclutamiento sucesivo de los complejos Sec23p/Sec24p y Sec13p/Sec31p (Matsuoka et al., 1998). En la formación de estas vesículas secretorias se requiere además de las cubiertas proteicas COPII, los SNAREs ER- GOLGI Sed5, Bos1, Sec22 y Bet1, y algunas proteínas integrales de membrana como miembros de la familia p24 y de los complejos Erv41/46 (Otte et al., 2001; Miller et al., 2002). Las vesículas con cubierta de clatrina participan en distintas etapas del transporte vesicular post- Golgi de la vía secretoría y endocítica (Hirst and Robinson, 1998; Smith and Pearse, 1999) y están formadas de clatrina y de complejos de proteínas adaptadoras tetraméricas APs y monoméricas GGAs (Golgi- localizad, gamma ear-containing, ADP ribosylation factor (Arf)- binding protein). En estas cubiertas clatrina es ensamblada en forma de una red tridimensional de triskelion, compuesta de tres cadenas pesadas y tres cadenas livianas (Ungewickell and Branton, 1981). Los complejos APs funcionan de forma específica en distintos compartimentos intracelulares (Kirchhausen, 1999) y están relacionados a la formación de las vesículas secretoras y selección de carga. Se han descrito cuatro tipo de complejos APs, denominados AP-1, AP-2, AP-3 y AP-4 (Boehm and Bonifacino, 2001). Por medio de la interacción con fosfoinosítidos o pequeñas 11 proteínas G de la familia Arf los adaptadores son reclutados a membrana. Los adaptadores AP1 y AP2 actúan a nivel de la red trans- Golgi y membrana plasmática. AP3 funciona en el sistema endosomal, interaccionando con clatrina, o de forma independiente. La actividad de AP4 ha sido asociada al sistema endosomal y de modo independiente a clatrina (Boehm and Bonifacino, 2001; Robinson, 2004). Las proteínas GGA1, GGA2 y GGA3 median en tráfico desde el TGN y del sistema endosomal (Boman et al., 2000; Dellʼ Angelica et al., 2000; Hisrt et al., 2000). 2.3 Familia ARF Los factores de ADP- ribosilación (Arf) pertenecen a la familia de proteínas Arf, de la que también forman parte los grupos Sar y Arl (Arf-like), con representantes ortólogos en distintas especies. A su vez, la familia de proteínas Arf pertenece a la superfamilia de proteínas Ras de bajo peso molecular, cuyos miembros ciclan y dependen de los estados unidos a GDP ó GTP. Los estudios filogenéticos de la familia Arf demuestran un alto nivel de conservación evolutiva en muchos de sus miembros eucarióticos. La historia de las proteínas Arf está ligada a la actividad de la toxina del cólera, donde Arf fue identificado como un cofactor para la ADP- ribosilación en la subunidad Gs de adenil ciclasa (Enomoto and Gill, 1980; Kahn and Gilman, 1984). Las propiedades de Arf regulan el tráfico vesicular, la organización de los organelos de membrana y también el metabolismo de algunos fosfolípidos, lo cual es mediado por la interacción con sus diversos efectores (Nie et al., 2003; Burd et al., 2004; Kahn et al, 2004). Dentro de estos efectores se encuentran los componentes de las cubiertas vesiculares proteicas COPI, AP-1 y AP-3; las enzimas modificadoras de lípidos PLD1, 12 fosfatidilinositol 4- kinasa y fosfatidilinositol 4,5 kinasa; y las proteínas adaptadoras GGAs (Golgi- associated γ- adaptin homologi Arf- binding protein)1-3 y MINT13/X11α-γ/ APBA1-3) (Bonifacino, 2004; Robinson 2004). Los Arf se encuentran ciclando entre los estados inactivos unidos a GDP y la forma unida a GTP que constituye la forma activa. La activación de Arf es mediada por la familia Arf-GEF y la actividad catalítica de estos GEF es realizada por el dominio sec7, denominado así en homología al Arf-GEF de levaduras sec7p. El estado inactivo de Arf1 humano fue la primera estructura de un Arf descrito (Amor et al., 1994), y la estructura del estado activo fue descrita con la mutante humana de Arf1 (Arf1∆17) que perdía la región N-termianal necesaria para la asociación a membrana (Golderberg, 1998). Los Arf unidos a GTP sufren un cambio conformacional que permite el desplazamiento y exposición de la región N-terminal, la cual posee una secuencia hidrofóbica miristoilada, modificación cotraduccional que media el anclaje a las membranas por asociación con la bicapa lipídica (Huang et al., 2001). En la activación están involucrados los siguientes componentes estructurales de Arf: la hélice NH2 terminal que se asocia con la forma retraída del sitio de unión a GDP; las regiones denominadas “switch 1” y “switch 2”, un conector interno o “interswitch” que es desplazado durante la unión a GTP; y los residuos aminoacídicos involucrados en la flexibilidad del movimiento (GG) como también en la estabilización de la nueva forma conformacional activa (R/W) (Pasqualato et al., 2001). Los cambios conformacionales en la estructura de ARF están localizados entre la región de los denominados switch 1 y switch 2, donde se une con alta afinidad el nucleótido de GTP, y débilmente la forma GDP. El extremo N-terminal de Arf en la forma unida a GDP se conecta con una cavidad hidrofóbica localizada entre la región “interswitch” y el extremo del “switch1” 13 (Amor et al., 1994). Al estar unidos a membranas los Arf inician el proceso de reclutamiento de los mantos proteicos necesarios para la formación de las vesículas secretoras. Otra función de los Arf es la activación de enzimas involucradas en las modificaciones lipídicas a nivel de las membranas donantes. Arf ha demostrado ser un activador de fosfolipasa D (Brown et al., 1993), la cual hidroliza fosfatidilcolina para generar ácido fosfatídico y colina. El aumento de los niveles de fosfolípidos acídicos conduciría en un incremento de la carga negativa en superficie lo que a su vez induciría modificaciones estructurales a nivel de membrana, mediando así el anclaje de las cubiertas proteicas (Bi et al., 1997). Además los fosfolípidos acídicos estarían involucrados directamente en el proceso de curvatura de la membrana y gemación de la vesícula secretora (Ktistakis et al., 1996). En base a la similitud de secuencias los Arf han sido clasificados en tres grupos; la clase I formada por Arf1, Arf2 y Arf3, la clase II compuesta por Arf4 yArf5, y la clase III con Arf6. Los Arf se localizan de forma diferencial en distintos superficies de membranas, luego la activación y regulación de los ciclos en la forma unida a GDP/GTP son determinados por la presencia también específica de los miembros de las familias Arf-GEFs / Arf-GAPs. Arf1 ha sido localizado en ERGIC, en las caras cis y tras del complejo de Golgi y en TGN. En la región cis- Golgi Arf1 regula el reclutamiento de las cubiertas COPI y en el TGN y sistema endosomal regula el reclutamiento de los adaptadores AP1, AP3 y AP4 (Bonifacino et al., 2004) En la región cis-Golgi y ERGIC Arf1 se une a la proteína membrina, y luego es activado por el Arf-GEF GBF1 para controlar el reclutamiento del manto proteico COPI. Estudios en levadura demostraron que Arf1 en el estado inactivo podía unirse a las proteínas SNARE del sistema ER- Golgi Sec22, Bet1 y Bos1 (Rein et al., 2002). Membrina es el 14 homólogo de Bos1 en mamíferos, y a través de experimentos in vitro se ha demostrado la capacidad de unión con Arf1 (Donaldson, 2004; Honda et al., 2005). En la cara transGolgi y TGN Arf1 es activado por los Arf-GEF BIG1/BIG2, lo que gatilla el reclutamiento de AP1, AP3, AP4 y GGAs. Arf6 se localiza en la membrana plasmática regulando el tráfico vesicular hacia los endosomas y organización del citoesqueleto (Donaldson et al., 2003), cuya actividad ha sido asociada a la activación de fosfolipasa D y PIP5K. La actividad reguladora de Arf es a su vez controlada por los Arf- GEF que promueven el intercambio GDP/GTP y por la hidrólisis de GTP catalizada por la familia de proteínas Arf-GAPs (GTPase activating proteins). 2.4 Familia ARF-GEF. En base a la organización estructural y tipo de dominios, los Arf- GEF eucarióticos han sido agrupados en las siguientes familias: familia GBF/BIG, familia ARNO/ cytohesin, familia EFA6, familia BRAG y familia FBX8 (Casanova, 2007). De la familia Arf-GEF GBF/ BIG en mamíferos se expresan GBF1, BIG1 y BIG2. En levaduras se encuentran dos ortólogos de GBF1, Gea1p y Gea2p y un ortólogo de BIG1/BIG2, la proteína Sec7p. GBF1 y BIG1/BIG2 se localizan de forma diferencial en el complejo de Golgi (Manolea et al., 2008), regulando distintos procesos del tráfico vesicular a través de la activación de Arfs de clase I y II. GBF1 se localiza en los “cluster” vesículo- tubulares (VTCs) del sistema RE-Golgi, y en la cara cis- Golgi. BIG1 y BIG2 localizan en los compartimentos tardíos del complejo de Golgi (Zhao et al., 2002), BIG2 ha demostrado regular el reclutamiento de AP-1 y de GGA en el TGN 15 (Shinotsuka et al., 2002) lo cual es mediado por la activación de Arf. Además, BIG2 también ha sido asociado al reciclamiento endosomal perinuclear (Shin et al., 2004). El análisis de secuencia de los miembros de esta familia revela la presencia de 6 regiones características con distinto grado de homología, y corresponden a: (1) un dominio DCB (dimerization and cyclophilin binding), localizado en la región N- terminal, de una longitud de aproximadamente 150 aminoácidos. (2) Un dominio HUS (Homology Upstream of Sec7), se localiza luego del dominio DCB y aún no se le ha asignado función específica. (3) Un dominio Sec7, que es donde se localiza la actividad catalítica Arf- GEF. (4)Tres dominios HDS (Homology Downstream of Sec7) de los que igualmente no se tiene mayor conocimiento (Casanova, 2007). En la familia ARNO/ cytohesins de vertebrados se expresan las isoformas cytohesin-1, citohesin-2 /ARNO, cytohesin-3/Grp1/ARNO3 y cytohesin-4. Se caracterizan por una organización estructural compuesta de un dominio N- terminal de tipo “coiled- coil”, el dominio Sec7, un dominio PH y una región C- terminal con carga positiva. Se localizan en la periferia celular cumpliendo diversas funciones (Frank et al., 1998). ARNO / cytohesin-2 han demostrado activar Arf6 (Santy et al., 2001). Por su parte ARNO ha sido también identificado en los procesos de “docking” y fusión de gránulos secretorios, y en el tráfico postendocítico (Caumont et al., 2000; HurtadoLorenzo et al., 2006; Maranda et al., 2001) La familia EFA6 tiene los representantes de mamíferos EFA6A, EFA6B, EFA6C y EFA6D (Franco et al., 1999; Derrien et al., 2002), con una organización estructural caracterizada por un dominio N-terminal variable, un dominio sec7, un dominio PH y un C-terminal con un motivo “coiled- coil”. Activan Arf6 (Franco et al., 1999), se caracterizan por un dominio PH que interacciona con Ptdlns(4,5)P2, se localizan en la 16 membrana plasmática y promueven la reorganización cortical de actina en estructuras semejantes a microvellos (Derrien et al., 2002). La familia BRAGs (Brefeldin- resistant Arf- GEF) en mamíferos está representada por IQsec2 (gen BRAG1), IQsec1/Arf GEP100 (gen BRAG2) y IQsec3/synArfGEF (gen BRAG3). Se caracterizan por un dominio de tipo IQ, el dominio sec7, un dominio PH y por uno o más dominios “coiled- coil”. BRAG1 y BRAG3 de mamíferos son expresados principalmente en cerebro asociados a densidades postsinápticas de las sinapsis exitatorias (Murphy et al., 2006; Inaba et al., 2004). BRAG2 se expresa en diversos tejidos (Someya et al., 2001) La familia FBX8 se caracteriza por presentar cajas- F, correspondientes a secuencias de aproximadamente 40 aminoácidos, que les permite unir proteínas que regulan la unión a los complejos ubiquitín- ligasa. FBX8 presenta un motivo caja- F en el extremo N- terminal y el dominio sec7 localizado hacia el extremo C-terminal. Otro tipo de clasificación de los Arf GEF basada en los pesos moleculares y sensibilidad a BFA los divide en las clases de Arf- GEF de alto peso molecular y los Arf- GEF de bajo peso molecular (Donaldson et al., 2000; Jackson et al.,2000). En la clase de Arf- GEF de alto peso molecular, comprendida por proteínas de sobre 100 KDa, se encuentran las proteínas de levaduras Gea1p, Gea2p y Sec7p, el Arf- GEF de Arabidopsis GNOM, y los representantes de mamíferos GBF1, BIG1 y BIG2. GNOM es un Arf- GEF involucrado en el tráfico vesicular de Arabidopsis, con efectos reguladores sobre los procesos de polaridad celular, lo que a su vez origina un sistema de transporte polarizado para el flujo de auxina (Steinmann et al., 1999). GNOM fue originalmente identificado mediante selección de alelos mutantes en Arabidopsis que afectan la organización estructural de estos embriones (Mayer et al., 1991). Auxina es una hormona vegetal que es transportada de forma polarizada a través 17 del eje tallo- raíz de Arabidopsis, regulando los procesos de dominancia apical, formación de raíces y tejidos vasculares, fototropismo y gravitropismo (Went, 1929; Sachs, 1991). Este sistema de transporte vectorial depende de la correcta localización del transportador de eflujo para auxina PIN1, siendo alterada en los mutantes gnom (Steinmann et al., 1999). Los Arf- GEF de bajo peso molecular o pequeños Arf- GEF, presentan un tamaño de aproximadamente 45- 50 KDa y se caracterizan por ser resistentes al tratamiento con Brefeldina A (Donaldson and Jackson, 2000). En este grupo se incluye el representante de mamíferos ARNO (Chardin et al., 1996), cytohesin-1 (Meacci et al., 1997), GRP1/ARNO3 (Klarlund et al., 1997), EFA6 (Franco et al., 1999) y cytohesin-4 (Ogasawara et al., 2000). Los Arf- GEF de bajo peso molecular presentan actividad principalmente asociada al reciclamiento endosomal, y también en la reorganización del citoesqueleto, a través de la activación de Arf6. La actividad de Arf6 regula distintos eventos en el sistema endosomal, de forma dependiente o independiende de clatrina (Sakagami, 2008). Dentro de estos se encuentran el reciclamiento de proteínas de membrana como el receptor de transferrina (DʼSouzaSchorey et al., 1995), de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Naslavsky et al., 2003), de la subunidad alfa del receptor de interleuquina-2 (Naslavskt et al., 2003), de E- caderina (Palacios et al., 2003) y receptores acoplados a proteína G (Claing et al., 2001). 2.5 El dominio Sec7. Todos los ARF- GEF tienen en común el dominio catalítico central sec7, esta es una región de aproximadamente 200 aminoácidos (Cox et al., 2004; Jackson et al., 2000; Liu and Pohajdak, 1992; Shevell et al., 1994). Se caracteriza por una estructura 18 cilíndrica elongada de 10 alfa- hélices transversas, las que están separadas en dos subdominios por medio de un loop hidrofóbico expuesto a solvente (Goldberg et al., 1998; Cherfilis et al., 1998). En la actividad catalítica Arf- GEF ha resultado ser clave un residuo de glutamato en el extremo del loop hidrofílico, localizado entre las hélices 6 y 7. El residuo de glutamato compite electrostáticamente con el fosfato beta del nucleótido de guanina, ya que este residuo queda inserto en la cavidad de unión (Beraud et al., 1998). En el proceso de intercambio GDP/GTP el dominio Sec7 gatilla la apertura de los denominados “switch 1 y 2” de Arf, lo que produce una reorientación en el núcleo de Arf. Este movimiento produce el plegamiento del nucleótido hacia el denominado “dedo glutámico”, con el siguiente desplazamiento de GDP (BeraudDufour et al., 1998). Paralelamente la reorganización interna en el núcleo de Arf también afecta la región “interswitch”, traspasando el movimiento al extremo Nterminal de Arf, el cual es desplazado y expuesto hacia la superficie de la proteína (Renault et al., 2003), entonces a través del residuo miristoilado Arf es anclado a membrana para iniciar el reclutamiento de sus efectores (Antonny et al., 1997) 2.6 Familia de Arf-GAP En la regulación del ciclo de Arf la hidrólisis de GTP es catalizada por las proteínas Arf GAP (GTPase –activating proteins). La actividad GAP ha sido asociada a la capacidad de interaccionar con componentes de las cubiertas vesiculares y la unión a las proteínas de carga. Además ha sido propuesta la participación directa de los Arf GAP en el proceso de formación de las vesículas, donde actuarían como parte de las proteínas de la cubierta (Nie and Randazzo, 2006). La actividad GTPasa de GAPs ocurre antes de que las vesículas se formen y también se ha descrito como un punto de 19 regulación en la clasificación de las vesículas. Un rasgo común a los miembros de la familia Arf GAPs es el dominio Arf GAP, el cual contiene un motivo de unión a zinc (Cukierman et al., 1995). De acuerdo a la organización estructural de los dominios los Arf GAP han sido divididos en los grupos ArfGAP y AZAP (Randazzo et al., 2004). ArfGAP1 regula la dinámica del complejo de Golgi, el primer fenómeno asociado a esta actividad GAP fue el desamblaje de las cubiertas de las vesículas de transporte en el complejo de Golgi, esto debido a la inactivación de Arf1 (Lanoix et al., 1999, Tanigawa et al., 1993). Algunos reportes señalaban la participación de ArfGAP1 como componente estructural de los complejos de las cubiertas vesiculares, promoviendo la clasificación de la carga transportada y formación de las vesículas (Yang et al., 2002; Nie and Randazzo, 2005). Los miembros SMAP1 y SMAP2 presentan un dominio de unión a clatrina y demuestran actividad GAP con especificidad para Arf6 y Arf1, respectivamente (Tanabe et al., 2005; Natsume et al., 2006). Los Arf GAP de tipo AZAPs a su vez han sido divididos en los subtipos ASAPs, ACAPs, ARAPs y AGAPs. Estudios de actividad in vitro muestran preferencia de los miembros ASAP1 y ASAP2 por Arf1 y Arf5 sobre Arf6 (Brown et al., 1998; Andreev et al., 1999). La sobreexpresión de ASAP1 conducía a una disminución de los niveles de Arf1-GTP e incremento de Arf6-GTP (Furman et al., 2002; Liu et al., 2005). En ASAP1, uno de los Arf GAPs mas estudiados, la actividad GAP ha sido descrita ser estimulada sobre 10000 veces por PI(4,5)P2 y por ácido fosfatídico (Brown et al., 1998; Kam et al., 2000). Los efectos producidos por estos agentes serían debido a un cambio conformacional en ASAP1 cuando a través del dominio PH une PI(4,5)P2 (Kam et al., 2000; Che et al., 2005). Algunas referencias postulan que Arf1 y ASAP1 formarían un complejo binario induciendo así la hidrólisis de GTP (Luo et al., 2007). 20 ArfGAP1 y ACAP1 pueden unirse a proteínas de membrana relacionadas a la selección de la carga durante la formación de vesículas. ArfGAP1 se une a las proteínas cargo p24 y al receptor ERD2, que reconoce las proteínas portadoras de la señal KDEL (Aoe et al., 1997). Además, se ha demostrado que las proteínas de la familia p24 inhiben la actividad Arf GAP (Goldberg et al., 2000). Se ha descrito que ArfGAP puede unirse al coatómero y a AP1 (Watson et al., 2004; Hirst et al., 2003). 2.7 Tráfico vesicular y BFA Muchas de las propiedades del tráfico de membranas en células eucarióticas han sido estudiadas gracias al uso de la droga de origen fúngico Brefeldina A, la cual inhibe los procesos secretorios al bloquear la formación de las cubiertas proteicas vesiculares. BFA es una lactona heterocíclica, que fue descrita por primera vez en 1958 (Singleton et al., 1958). Sus efectos son variados y localizados sobre distintos organelos de membrana, pero uno de los rasgos más dramáticos es observado sobre la organización y estructura del complejo de Golgi (Doms et al., 1989). El tratamiento con BFA conduce al desamblaje del Golgi, lo que ocurre por reabsorción de éste hacia el retículo endoplásmico. Las primeras observaciones en torno a este proceso revelaron que durante el tratamiento con BFA, las enzimas residentes del complejo de Golgi, como también aquellas proteínas secretadas, eran localizadas en el retículo endoplásmico (Doms et al., 1989). BFA conduce a la formación de estructuras membranosas tubulares únicas, como una consecuencia indirecta de la alteración en la dinámica del tráfico vesicular de membranas. Los primeros estudios sobre los mecanismos de acción de BFA demostraron la inhibición de la actividad de Arf1 en el complejo de Golgi (Donalson et al., 1992). De forma complementaria a estos resultados, la expresión de una forma inactiva de Arf1 (T31N) conducía a los mismos efectos que producía el uso 21 de BFA (Dascher and Balch, 1994). Posteriormente se logró demostrar que el blanco primario de BFA es el dominio sec7 de los Arf- GEF (Peyroche et al., 1999). BFA bloquea la activación de Arf, ya que inhibe la actividad de los Arf- GEF al formar complejos de tipo Arf-GDP- Sec7d (Peyroche et al., 1999). Estos complejos quedan atrapados en un estado intermedio abortivo. La inhibición es específica del proceso de secreción sin alterar la síntesis de proteínas (Misumi et al., 1986). BFA actúa de forma no competitiva, estudios cristalográficos demuestran que en una cavidad hidrofóbica presente en el complejo Arf-GDP-Sec7 se inserta BFA, durante un período previo a la actividad catalítica que promueve el intercambio de GDP por GTP (Mossessova et al., 2003; Renault et al., 2003). BFA afecta las primeras etapas del tráfico vesicular en el sistema ER-Golgi, mientras que los eventos de transporte tardíos no suelen ser afectados. Ensayos de transporte de células BHK infectadas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) revelaron que el tratamiento con BFA bloqueba la localización de la proteína VSV-G en la membrana celular, pero era retenida intracelularmente (Takatsuki and Tamura, 1985). Mediante técnicas de inmunoflorescencia se ha observado que durante el proceso de fusión del complejo de Golgi hacia el RE, luego del tratamiento con BFA, las membranas del Golgi sufren tubulación y enseguida ocurre un rápido vaciamiento del contenido de éste hacia el interior del RE (Sciaky et al., 1997). Los efectos de BFA pueden variar de acuerdo al tipo celular que se emplee, como también del estado inicial. La sensibilidad a BFA en los distintos Arf- GEF también es variable, en los ensayos in vitro los miembros de la familia de Arf- GEF de alto peso molecular Gea1p (Peyroche et al., 1996), el dominio Sec7 purificado de E. coli (Sata et al., 1998) y p200 bovino purificado de baccolavirus (Morinaga et al., 1999), han demostrado ser sensibles a BFA. Los miembros Arf- GEF de bajo peso molecular de la familia de ARNO 22 /cytohesin/GRP son resistentes al tratamiento con la droga (Chardin et al., 1996; Meacci et al., 1997). Esta diferencia en la sensibilidad a BFA es determinada por una secuencia interna del dominio catalítico Sec7 (Peyroche et al., 1999). A través de la selección de mutantes resistentes a la acción de BFA en el gen GEA1 se localizó una secuencia de 40 aminoácidos dentro del dominio sec7, la cual se sobreponía con el sitio de unión a BFA (Peyroche et al., 1999). Posteriormente estudios mutacionales en las secuencias de Gea1p y ARNO modificando dos residuos de la previamente delimitada secuencia de sensibilidad a BFA, produjeron un cambio del fenotipo de sensibilidad al tratamiento con BFA (Peyroche et al., 1999). Dado que esta secuencia estaba contenida dentro del dominio sec7 se creyó en un principio que el mecanismo de acción de BFA podría ser como inhibidor competitivo de la actividad Arf- GEF, más tarde se demostró que BFA actuaba de forma no competitiva y que el blanco era el complejo Arf- Sec7. Los ensayos de sensibilidad a BFA in vivo / in vitro pueden variar significativamente en ciertos sistemas de mamíferos, es así como se ha determinado que para inhibir el reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI hacia las membranas del complejo de Golgi, e iniciar el proceso de tubulación, en los ensayos in vitro se requiere de una concentración aproximadamente 10 veces más alta que la determinada en los procesos in vivo (Orci et al., 1991) 2.8 GBF1 GBF1 (Golgi- specific Brefeldin A-resistance guanine nucleotide exchange factor 1) es un Arf- GEF de mamíferos de alto peso molecular (206 KDa) que muestra especificidad por Arf1 y Arf5. GBF1 participa en el trasporte retrogrado regulando el reclutamiento de los mantos proteicos de cubierta tipo COPI. Se ha descrito que GBF1 23 in vitro presenta actividad Arf- GEF con las clases I y II de ARF (Claude et al., 1999). Los estudios de sobreexpresión de GBF1 han revelado que éste activa Arf1, Arf3 y Arf5 (Kawamoto et al., 2002). La sobreexpresión de GBF1 en células tratadas con BFA mantiene las características morfológicas típicas del complejo de Golgi (Claude et al., 1999). En esta publicación, GBF1 fue aislado por expresión y selección de una biblioteca de cDNA de una línea mutante derivada de células CHO, la cual presentaba resistencia al tratamiento con la droga BFA (Claude et al., 1999). GBF1 se localiza en las membranas cis del complejo de golgi, en los clusters vesículo- tubular (VTC) y como una fracción soluble presente en el citoplasma (Zhao et al., 2002; Kawamoto et al., 2002, Claude et al., 1999). Mediante ensayos FRAP (Flurescence recovery after photobleaching) se evaluó la dinámica de asociación de GBF1 con las membranas de Golgi utilizando construcciones YPF-GBF1. Los resultados indicaron que GBF1 cicla rápidamente entre la forma unida a membrana y el estado soluble (Niu et al., 2005), y que la actividad Arf1- GEF es inhibida por BFA. Además se demostró que BFA estabilizaba la asociación de GBF1 con las membranas del Golgi. A través de la generación y expresión de una proteína mutante de GBF1, E794K, se pudo observar que los efectos obtenidos eran como los producidos por BFA, debido a la disociación de COPI (García-Mata et al., 2003). Mediante la inhibición de la expresión de GBF1 por siRNA, se evidenció que COPI se localizaba de forma dispersa, pero que la estructura del Golgi no era colapsada, aunque producía tubulación de la región cis- Golgi (Szul et al., 2007). Luego estas estructuras tubulares eran dirigidas a los sitios ERGIC. Los efectos primarios de la depleción de GBF1 resultaron en la detención del tráfico de proteínas de transmembrana, pero no alteraban la secreción de proteínas solubles. En base a estos resultados propusieron la existencia de una vía de 24 secreción que puede dirigir el tráfico de las proteínas solubles pero no así las de transmembrana, que requerirían el ensamblaje de las cubiertas COPI, mediado por la actividad de ARF que a su vez depende de la activación por GBF1. Por técnicas de siRNA y knockdown de GBF1 Manolea e investigadores analizaron la especificidad de GBF1 en el tráfico vesicular, sus resultados indican que GBF1 es requerido para el ensamblaje de las vesículas de secreción tipo COPI y mantenimiento de las estructuras de la cara cis- Golgi, además con efectos en la subcompartimentalización del complejo de Golgi y movimiento de las cargas transportadas hacia la membrana celular (Manolea et al., 2008). La interacción de GBF1 con el factor de transporte de membranas p115, ha sido descrita previamente (García -Mata et al., 2003). p115 a su vez interacciona con las proteínas de la matriz del Golgi GM130 y giantina (Linstedt et al., 2000; Nelson et al., 1998), con Rab1b (Allan et al., 2000) y con varios miembros de la familia SNAREs (Shorter et al., 2002). La actividad de p115 ha sido asociada al transporte vesicular desde el retículo endoplásmico hacia el complejo de Golgi, en el transporte intra Golgi y también en el proceso de reensamblaje del complejo de Golgi luego de la mitosis (Álvarez et al., 1999). En esta misma publicación se evidenció la colocalización de GBF1 y p115 en el complejo Golgi y en los clusters vesículo-tubulares. Publicaciones realizadas durante el desarrollo de esta tesis dieron a conocer nuevas interacciones de GBF1 con Rab1b, con GGA y con la proteína 3A de picornavirus. Rab1b es una GTPasa que está involucrada en el reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI (Monetta et al., 2007). Por medio de siRNA se lograba evidenciar la importancia de Rab1b en el reclutamiento de GBF1 a membranas, y postularon que Rab1b regula el reclutamiento de GBF1 en los sitios ERES y en el complejo de Golgi. 25 Otra interacción de GBF1 descrita recientemente es con la proteína 3A de Picornavirus (Wessels et al., 2007). La proteína 3A de coxsackievirus ha demostrado inhibir el tráfico entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi, específicamente al nivel del reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI dependiente de Arf1. El verdadero blanco de CVB3 3A es GBF1. La interacción entre GBF1 con GGAs (Golgi- localized, gamma ear-containing, ADP ribosylation factor (Arf)- binding protein) demostró mediar el reclutamiento a membranas de GGAs (Lefrançois and McCormick, 2007). Esta interacción fue requerida para el tráfico lisosomal, donde GGAs participan en el reclutamiento de clatrina. Las proteínas GGAs interaccionan con Arf1 en la forma activa, unida a GTP (Puertollano et al., 2001), pero el Arf- GEF requerido para este etapa no había sido identificado aún. Como posibles candidatos fueron postulados los Arf GEF GBF1, BIG1 y BIG2 por su localización en el Golgi y asociación con Arf1. Por inmunofluorescencia se detectó colocalización de GBF1 con GGA1, GGA2, GGA3, parcialmente con AP1 y no con AP3. Una característica importante de GBF1 para el estudio de las interacciones proteicas es que posee, como los demás miembros de la familia GBF/BIG, un dominio DCB que interaccionaría con ciclofilinas. Las ciclofilinas son proteínas que catalizan las reacciones de isomerización de tipo cis/trans de los enlaces peptidil-prolil (Fischer et al., 1989). Este proceso de isomerización es un evento clave en el plegamiento proteico y es inhibido en distintos grados por el tratamiento con la droga inmunosupresora Ciclosporina A (CyA). Las ciclofilinas se encuentran tanto en procariontes como en eucariontes, y se localizan en diversos compartimentos celulares. En humanos se conocen 6 tipos de ciclofilinas, en Saccharomyces 8 y en Arabidopsis hasta 29. La actividad de las ciclofilinas está asociada a diversas rutas de señalización, dentro de las 26 que se destacan la activación de células T y la transducción de señal dependiente de la proteína de shock térmico Hsp90 (Mattila et al., 1990). La dimerización y oligomerización fueron nuevos roles estudiados en ciclofilinas, dentro de este contexto se demostró la interacción de Cyp40 con el dominio de dimerización de Hsp90 (Carrello et al., 1999). Así como también se demostró que Cpr6, un homólogo de Cyp40 era capaz de reactivar la actividad ATPasa de Hsp90 (Prodromou et al., 1999). Por ensayos in vitro y doble híbrido en levaduras se demostró que el Arf- GEF de Arabidopsis, GNOM, interacciona con ciclofilina 5 (Grebe et al., 2000). Esta interacción resultó ser clave durante el período de desarrollo embrionario en Arabidopsis. Sobre la interacción específica entre GBF1 y ciclofilinas hasta el momento no existen referencias publicadas. Una interacción entre homodímeros de GBF1, BIG1 y BIG2 fue identificada (Ramaen et al., 2007). Las interacciones descritas fueron mediadas por los dominios DCB y HUS de estos Arf GEF, con estructuras de tipo DCB/DCB y DCB/HUS. Investigaciones a nivel celular de los efectos producidos en la inhibición de GBF1 por tratamiento con BFA han demostrado estrés del RE por acumulación de proteínas no plegadas o mal plegadas (Citterio et al., 2008). Como consecuencia de esto las células acumulan los productos génicos de los elementos de respuesta al estrés del RE, lo que produce muerte celular por apoptosis. Los múltiples y relevantes aspectos de la caracterización de GBF1 reportados hasta el inicio de esta tesis, revelan fundamentalmente antecedentes de localización, nivel de regulación en la vía secretoria, preferencia por substrato y sensibilidad a Brefeldina A. El enfoque general se basa en la actividad Arf GEF catalizada por el dominio sec7 de GBF1 que permite la activación de Arf1, necesaria para el reclutamiento de los mantos proteicos de las vesículas COPI. De esto destaca de forma especial el que GBF1 sea una proteína de alto peso molecular (206 KDa) y el dominio 27 Sec7 sólo represente aproximadamente el 10 % de la proteína, desconociéndose funciones específicas para otras regiones o dominios. Los determinantes moleculares que regulan la actividad de GBF1 en el transporte vesicular retrógrado permanecen desconocidos, y para intentar dilucidarlos se realizó aquí la búsqueda de interacciones proteína-proteína, bajo la hipótesis y objetivos que se señalan a continuación. Hipótesis de trabajo: “El nuevo Arf- GEF de mamíferos, GBF1, es más que un activador de los factores de ADP-ribosilación (Arf), actuando como un andamiaje molecular que regula las interacciones entre las proteínas necesarias para el tráfico de vesículas de tipo COPI.” Objetivos generales: Estudiar e identificar algunas de las interacciones entre GBF1 y otras proteínas que modulan la actividad de este ARF- GEF de mamífero. Objetivos específicos: Identificar interacciones de GBF1 con otras proteínas a través de las técnicas de doble híbrido y co-Inmunoprecipitación” Caracterizar de aquellas regiones críticas de GBF1 que median las interacciones de tipo proteína- proteína cuando son empleadas diversas mutantes de GBF1. 28 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Amplificación de fragmentos de GBF1 “Carnadas” por PCR. Mediante PCR se amplificaron 8 fragmentos de GBF1 clonado en pCEP4. Se utilizaron partidores diseñados para generar fusiones entre el dominio de unión al DNA de Gal4 y la carnada correspondiente. Las reacciones de PCR fueron realizadas empleando una mezcla de las enzimas Pfu Turbo (Invitrogen) y DNA Taq polimerasa (Fermentas) en una relación 1:3 y de acuerdo a la siguiente reacción: Tampón de reacción con MgSO4 1X, dNTPs 2mM c/u, partidor sentido 1 µM, partidor antisentido 1µM, templado 50ng (GBF1 clonado en el vector pCEP4), mezcla Pfu Turbo/Taq DNA polimerasa 1:3 (1.5 unidades). Para cada reacción de PCR se llevó a cabo el siguiente programa: 1) calentamiento inicial a 95 ºC por 1 minuto, 2) 30 ciclos de PCR: a) denaturación por 1 minuto a 95ºC, b) hibridación de partidores por 1 minuto a 55 ó 60 ºC, y c) extensión por 1-2 minutos a 72 º C, 3) extensión final por 2 minutos a 72ºC. Los fragmentos amplificados fueron preparados con tampón de carga para DNA 6X y cargados en geles de agarosa al 1%, corridos a 70 volts en tampón TAE 1X (TAE 50X:Tris base 242 g/l, acido acético 57.1 ml/l, EDTA 0.5 M 100ml/l) y teñidos con bromuro de Etidio. Carnada 1: 5`TTT GCC ACC ATG GTG GAT AAG 3`(NcoI) y 5`ACC AGA CAC AGG GAC TGC AGT CTT 3`(PstI), Carnada 2: 5`GAG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3`(NcoI), 5`AAG GAA GCA GAA TTC TTG TGC 3`(EcoRI), Carnada 3: 5`GCA CAA GAA TTC TGC TTC CTT 3` (EcoRI), 5`GCC TTA GTG GAT CCC AGA GGT 3`(BamHI), Carnada 4: 5`TTT GCC ACC ATG GTG GAT AAG 3`(NcoI), 5`AGA GGG ACT GAC CAC TGC AGA GGC 3` (PtsI), Carnada 5: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT GCA 3` (NcoI), 5`ACC AGA CAC AGG GAC TGC AGT CTT 3`(PstI), Carnada 6: 5`GCA CAA GAA TTC TGC TTC CTT 3`(EcoRI), 5` ATC AGC TTG GAT CCT CTG GCC (BamHI), 29 Carnada 7: 5`GAC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3`(EcoRI), 5`GCC TTA GTG GAT CCC AGA GGT 3`(BamHI), Carnada 8: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT GCA 3` (NcoI) ,5`GAA TAC TGT CTT GGC TGC AGT ATG 3`(PstI) 3.2 Cultivo microbiológico. Para el clonamiento de las construcciones carnadas y para la preparación de DNA plasmidial se utilizaron las cepas de E.coli XL1 – Blue y JM109. Se empleó el medio de cultivo LB (peptona 10g/L, extracto de levadura 5g/L y cloruro de sodio 10 g/L) con los antibióticos correspondientes; ampicilina (100 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml), tetraciclina (30 µg/ml). Para los medios sólidos se agregó agar (15 g/l). Las células competentes químicas se prepararon por el procedimiento estándar de tratamiento con cloruro de calcio, fueron alicuotadas y almacenadas a -70ºC. 3.3 Clonamiento en pGEM-T-Easy. Los productos de PCR fueron purificados utilizando el Kit Clean up PCR (Promega) y se realizó el procedimiento estándar de Atailing (4 µl del fragmento de PCR purificado, 1 µl de tampón 10X de Taq DNA Polimerasa, 1 µl de MgCl2 25 mM, 1µl de dATP 2mM y 5U de Taq DNA Polimerasa, incubando a 72 ºC por minutos. Los fragmentos fueron ligados a pGEM-T Easy (Promega) de acuerdo a la siguiente reacción: 5 µl de tampón de T4 DNA ligasa 2x, 1 µl del vector pGEM-T Easy, 3 µl del producto de PCR y 1 µl de T4 DNA ligasa (3 U/µl), las reacciones fueron incubadas por 1.5 horas a temperatura ambiente y 4 horas a 4ºC. Con las ligaciones se transformó en la cepa XL1- Blue de E.coli plaquendo en medio LB/ampicilina/ previamente preparadas con IPTG 100 mM (100 µl) y X-GAL 50 mg/ml (20 µl). Las placas fueron incubadas a 37º C por 20 horas. 30 3.4 Clonamiento de carnadas en el vector de expresión pGBKT7. Los fragmentos clonados en pGEM-T Easy fueron preparados para el subclonamiento en pGBKT7 por extracción de DNA plasmidial desde los clones recombinantes (por el método de ebullición) y posterior digestión con las enzimas de restricción seleccionadas para cada construcción carnada. Carnadas 1, 4, 5 y 8 (Digestión NcoI/PstI): 5 µl Tampón 3 10X, 0,5 µl de BSA 100X, 0.5 µl de NcoI (10 U), 0.5 µl de PstI (10U), 28,5 µl de H20 grado biología molecular. Carnadas 3, 6 y 7: EcoRI y BamHI. Carnada 2: NcoI y EcoRI. Paralelamente se realizó la preparación del vector pGBKT7 por doble digestión con las enzimas indicadas. Los fragmentos doblemente digeridos fueron ligados a pGBKT7 y transformados en la cepa XL1- Blue. Los transformantes fueron seleccionados en medio LB/kanamicina/agar incubando a 37 º C por 20 horas. Las colonias obtenidas fueron inoculadas en medio líquido LB/kanamicina para realizar extracción de DNA plasmidial y digestión enzimática que permita comprobar la liberación de los fragmentos carnadas clonados. 3.5 Medios de cultivo de levaduras. Medio YPD (peptona 20 g/L, extracto de levaduras 10 g/L, pH 6.5, glucosa al 2 %). Medio YPDA (peptona 20 g/L, extracto de levaduras 10 g/l, hemisulfato de adenina 15 ml/L de una solución al 0.2 %, pH 6.5, glucosa al 2 %). Medio YPD 2X. Medio YPD 0.5X. Medios SD (Base nitrogenada de levaduras sin aminoácidos 6.7 g/L, SD Dropout según indicación, pH 5.8, glucosa al 2 %). Medios SD: SD –Trp, SD –Leu, SD/-His, SD/-Ura,SD- Trp/-Leu, SD- Ade/- His/Leu/-Trp. 3.6 Cepas de Saccharomyces cerevisiae. Para el sistema de doble híbrido se utilizaron las cepas AH109 e Y187 con el genotipo descrito en la tabla I. 31 Tabla I. Características genotípicas de las cepas AH109 e Y187 Cepa Genotipo Genes Marcadores reporteros AH109 MATa, Trp 1- 901, leu2-3,112, HIS3,ADE2 ura3-52, his 3-200, gal4∆, gal80∆, , MEL1, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA- LacZ Trp, leu2 HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2 URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-LacZ MEL1 Y187 MATα, ura3-52, his3-200,ade2101,trp1-901,leu2-3,112, Gal4∆, gal80∆,met-, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ MEL1 MEL1,LacZ Trp, leu2 32 3.7 Vectores utilizados en el sistema doble híbrido. pGBKT7, pGADT7, pCL1, pGADT7- T, pGBKT7- 53, pGBKT7- Lam. Todos los vectores fueron preparados por DNA miniprep (Promega) y DNA midipreps (Quiagen) y cuantificados por medición de la absorbancia a 260. 3.8 Ensayo de Beta galactosidasa en filtro. Tampón Z (Na2HPO4-7 H2O 16.1 g/L, NaH2PO4-H2O 5.50 g/L, KCl 0.75g /L, MgSO4- 7H2O 0.246 g/L, pH7.0). Solución Xgal stock (20 mg/ml en DMF). Solución tampón Z/ X- gal (tampón Z 100 ml, Bmercaptoetanol 0.27 ml, solución X- gal stock 1.67 ml). Placas con colonias frescas de los clones a evaluar fueron presionadas y transferidas a papel Whatman Nº 5 estéril, con las colonias hacia el interior los filtros fueron sumergidos en nitrógeno líquido por un período de 10 segundos. Se dejó descongelar a temperatura ambiente y luego cada filtro fue puesto sobre un filtro previamente sumergido en tampón Z/X- gal en una placa de 100 mm. Se incubó a 30 º C controlando la aparición de colonias azules indicadoras de reacción beta-galactosidasa positiva. 3.9 Preparación de extractos de proteínas de levadura. Solución inhibidora de proteasas 100 X, PMSF 100 X (0.01742 g/ml de isopropanol), Glass Beads 425- 600 µm (Sigma). Solución Stock de tampón Cracking (Urea 8 M, SDS 5 % p/v, Tris- HCl pH 6,8 40 mM, EDTA 0.1 mM, azul de bromofenol 0.4 mg/ml). Tampón Cracking (solución stock de tampón Cracking 1ml, B-mercaptoetanol 10 µl, solución inhibidora de proteasas 70 µl, PMSF 50µl de una solución stock 100 X). Desde cultivos ON de la cepa transformada con las construcciones carnadas en medio SD/-Trp se inoculó 50 ml de medio YPD, incubando a 30ºC y 250 rpm hasta lograr un OD600 de 0.4- 0.6, se calcularon las unidades totales y el cultivo fue enfriado y centrifugado a 1000xg por 5 33 minutos a 4ºC. El pellet fue resuspendido en 50 ml de H2O estéril fría, el pellet fue centrifugado a 1000xg y guardado a -70ºC. Los pellets fueron descongelados resuspendiendo en tampón Cracking precalentado (100 µl /7,5 unidades de OD600), cada 7 minutos se añadió PMSF 100X, las suspensiones fueron transferidas a tubos eppendorf conteniendo 80 µl de glass beads por cada 7,5 unidades. Las muestras fueron calentadas por 10 minutos a 70ºC. Las muestras fueron vortexeadas vigorosamente por 1 minuto, se centrifugó 5 minutos a 16000xg a 4ºC, el sobrenadante fue transferido y mantenido en hielo. Los pellets fueron tratados para recuperar una nueva fracción soluble que fue añadida al sobrenadante anterior, finalmente las muestras fueron prepara con tampón de carga de proteínas 5X (Tris- HCl 0.313 M, pH 6.8, SDS 10 %, azul de bromofenol 0.05%, glicerol 50 %) para cargar en geles de SDS- PAGE o almacenadas a – 70ºC. 3.10 Transformación de levaduras por el método de acetato de litio. Varias colonias frescas de la cepa AH109 fueron inoculadas en 50 ml de medio YPD, incubando por 1618 horas a 30 ºC y 250 rpm, hasta obtener una OD600 ˃1.5. Desde este cultivo se transfirieron 30 ml de cultivo a 300 ml de medio YPD y se incubó hasta obtener una OD600 de 0.2- 0.3. Se incubó por 3 horas más para lograr una OD600 de 0.4- 0.6, el cultivo fue centrifugado por 5 minutos a 1000xg a temperatura a ambiente. El pellet fue resuspendido en 1.5 ml de tampón TE 1x/LiAc (300 µl de acetato de litio 10x +2,7 ml de tampón TE).0,1 ml de cada plásmido fue mezclado con 0.1 mg de DNA de espermio de salmón (Sigma), se agregó 100 µl de las células competentes, se mezcló y se añadió 0.6 ml de la solución PEG/ LiAc (PEG 3350 50% 800 µl/ml, tampón TE 10X 100 µl/ml, LiAc 10 X 100 µl /ml). Las mezclas fueron incubadas a 30ºC por 3 minutos a 200 rpm. Se agregó 70 µl de DMSO y se sometió a shock térmico en un baño a 42º C por 15 34 minutos. Las células fueron enfriadas en hielo y se centrifugó por 3 minutos a 1000xg, el pellet fue resuspendido en tampón TE 1X, plaqueando en el respectivo medio SD. 3.11 Extracción de pDNA desde levaduras (método modificado). Desde colonias frescas de AH109 transformadas con las construcciones carnadas se inoculó 5 ml de medio YPD con 100 µl de un cultivo en medio SD saturado. Se centrifugó a 1000xg por 5 minutos, el pellet total fue resuspendido en el medio residual y se agregó 10 µl de liticasa (5U/µl en tampón TE), incubando por 1 hora a 37º C. Se agregó 10 µl de SDS al 20%, la muestras fueron vortexeadas y congeladas a -20 º C. Se descongeló y se agregó 150 µl de glass beads acidificadas (glass beads obtenidas de Sigma fueron acidificadas por tratamiento con ácido nítrico concentrado), iniciando un ciclo de congelado, descongelado y vortexeo por 3 veces. Las muestras fueron diluidas con tampón Breacking y vortexeadas. Se añadió 200 µl de una mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), vortexeando vigorosamente. La mezcla fue centrifugada por 10 minutos y se extrajo la fase acuosa. Se lavó dos veces con 200 µl de cloroformo, se centrifugó por 5 minutos y se extrajo la fase acuosa cada vez. El pDNA fue precipitado agregando 12, 5 ml de acetato de amonio 6 M y 500 µl de etanol frío. Se mantuvo por 1 hora a – 70ºC y luego se centrifugó por 30 minutos a 4º C y 16000xg. El pellet fue lavado con 500 µl de etanol 70 % frío y se centrifugó nuevamente por 10 minutos. El pellet fue dejado secar a temperatura ambiente y se resuspendió en 25 µl de tampón TE. 3.12 Extracción de pDNA por el método de ebullición. Solución STET (sacarosa 8 %, Tris-HCl 50 mM pH8.0, EDTA, Triton X-100 5 %). Lizosima 50 mg/ml, isopropanol, etanol 70%, tampón TE. Este procedimiento fue realizado de acuerdo a los protocolos estándares. 35 3.13 Apareamiento de levaduras. Desde una colonia fresca de la cepa AH109 transformada con las construcciones carnadas se inoculó 50 ml del medio SD/-Trp incubando por 16- 24 horas a 30 ºC y con agitación de 250 rpm. Cuando se obtuvo una densidad de 0.6- 0.8 se procedió a centrifugar el cultivo por 5 minutos a 1000x g. El pellet fue resuspendido y se mezcló con una alícuota de 1ml de la biblioteca de cerebro fetal humano (Clontech), recién descongelada en un baño a temperatura ambiente. La mezcla fue llevada a un matraz de 2 L adicionando 45 ml de medio YPDA 2X/kanamicina. Se incubó por 24 horas a 30 ºC con agitación de 50 rpm. Los productos del mating fueron centrifugados por 10 minutos a 1000xg y el pellet se resuspendió en 4 ml de medio YPDA 0.5 X/Kanamicina plaqueando en medio SD /-Ade/-His/-Leu/-Trp. Las placas fueron incubadas a 30 ºC hasta la aparición de colonias. 3.14 Entrecruzamiento de proteínas con DTBP. Procedimiento A. Células EBNA 293 fueron cultivadas en medio DMEM, suplementado con 10 % suero fetal bovino y cultivadas a 37º C y 5 % de CO2 hasta obtener una confluencia de 70-80%. Se eliminó el medio de cultivo y las células fueron lavadas en PBS y luego incubadas con 1mg/ml de DTBP en DMEM sin suplementar, se incubó a 37 ºC por 30 minutos. La reacción de entrecruzamiento fue detenida por adición de glicina a una concentración final de 50 mM, incubando 15 minutos a temperatura ambiente. La células fueron centrifugadas y lisadas en tampón PBS/mix antiproteasas por pasaje 6 veces a través de una aguja calibre 28. Se centrifugó a 16000xg durante 30 minutos a 4 ºC para separar las fracciones solubles y de membrana. 36 La fracción de membrana fue solubilizada por tratamiento con PBS/ Tritón X-100 1%. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8 % y analizadas por Western Blot. Procedimiento B. Las células 293 EBNA fueron lavadas con PBS, resuspendidas en tampón de lisis y pasadas 8 veces a través de una aguja calibre 28. Se agregó DTBP a una concentración final de 1mg/ml, incubando por 1 hora en hielo. La reacción fue detenida agregando glicina a una concentración final de 50 mM, por 15 minutos. Se centrifugó a 16000xg por 30 minutos a 4º C, separando las fracciones de proteínas solubles y asociadas a membrana. La fracción asociada a membrana fue solubilizada con PBS – Triton X- 100 1%. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8% y analizadas por Western blot. 3.15 Preparación de extractos proteicos de células 293 EBNA. Células 293 EBNA fueron cultivadas en medio DMEM/ 10 % suero fetal bovino, a 37º y 5% CO2 hasta obtener la densidad deseada y transfectadas con Perfectin incubando por 24 horas más. Se eliminó el medio de cultivo, las placas fueron puestas en hielo y se añadió el tampón de lisis (PBS-T 1%, mezcla de antiproteasas, PMSF 0.1 M (10 µl/ml en PBS-T), incubando por10 minutos. Se pasó 6 veces suavemente a través de una aguja de calibre 28 y se centrifugó por 10 minutos a 4ºC y 1000xg. Las muestras fueron preparadas con tampón de carga 5 X y guardadas a -20º C. 3.16 SDS PAGE. Gel separador al 8 % (8 ml): 2,75 ml Acrilamida-bisacrilamida 30%, 2,0 ml de tampón Tris/ HCl 1.5 M, pH 8.8/SDS 0.4 %, 3.2 ml de agua destilada, 60 µl de persulfato de amonio al 10%, 5 µl de TEMED. Gel espaciador al 6% (4ml):0, 8 ml de acrilamida-bisacrilamida al 30 %, 1.3 ml de tampón Tris- HCl 0.5 M, pH 6.8 /SDS 37 0.4 %, 1.9 ml de agua destilada, 30 µl de persulfato de amonio al 10 %, 7.5 µl de TEMED. Tampón de corrida. Tampón de transferencia. Los soportes de los geles fueron montados en la cámara de electroforesis cubriendo con tampón de corrida para geles de SDS- PAGE 1X (tampón de corrida 5X: Tris base 15.1 g/L, glicina 72 g/L, SDS 5 g/L). Las muestras fueron precalentadas por 5 minutos a 95 ºC y luego cargadas, se cargó también 5 ul del estándar de proteínas Protein Plus dual color (BioRad). La transferencia fue realizada a membranas de nitrocelulosa (BioRad) en tampón de transferencia con aplicación de 12 volts por un periodo de 16 horas. 3.17 Western Blot. Las membranas de nitrocelulosa fueron bloquedas con PBS- T/ 5% leche descremada por 1.5 horas agitando suavemente. Se lavó en PBS-T 1% leche descremada y se incubó con el anticuerpo primario correspondiente diluido en PBS- T/1 % leche descremada por 1.5 horas y agitación suave. El anticuerpo primario fue lavado en PBS T / 1% leche descremada 4 veces por 10 minutos cada uno. Se incubó con el anticuerpo secundario diluido en PBS-T 1% leche descremada por 1.5 horas. El lavado del anticuerpo secundario fue realizado en PBS- T 1% leche descremada y agitación durante 10 minutos repitiendo 4 veces. Finalmente las membranas fueron lavadas en PBS-T y luego en PBS. El revelado fue realizado usando el sistema ECL Western Blotting (BioRad) y films CL-Xposure (BioRad). 3.18 Anticuerpos. Anticuerpos primarios: Para la detección de GBF1 se utilizaron los anticuerpos 9D4 (conejo, dilución 1:10000), 9D2 (conejo, dilución 1:10000) y H154 (conejo, dilución 1:10000). Anti c-myc (ratón, dilución 1:5000, Santa Cruz). Anti p115. Anti α-SNAP (Dilución 1:1000, Santa Cruz). Anticuerpos secundarios: anti- conejo 38 HRP conjugado (cabra, dilución 1:5000,) y anti-mouse HRP conjugado (cabra, dilución 1:5000). 3.19 Stripping de membranas. Las membranas fueron incubadas en tampón de stripping (2-mercaptoetanol 100 mM, SDS 2 %, Tris- HCl 62.5 mM pH6.7) por 30 minutos a 50º C y agitación ocasional. Se lavó dos veces con PBS-T por 10 minutos. Las membranas fueron bloqueadas con PBS-T 5 % leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente. 3.20 Purificación por afinidad con GST. Construcciones GST- GBF1 clonadas en el vector de expresión en mamíferos pEBG fueron transfectadas en la línea celular 293 EBNA empleando el kit comercial de transfección con lípidos catiónicos Perfectin. Se prepararon extractos proteicos de GST- hGBF1 por lisis mecánica en tampón PBS/ Mix antiproteasas/ NP40 0.1 %, pasando 6 veces a través de una aguja de calibre 28. Previamente la resina Glutatión sefarosa 4B (Bioworld) fue lavada y equilibrada en tampón PBS/DTT para obtener glutation –sefarosa al 50 %. 400 µl de los extractos fueron incubados con 50 µl de la resina glutatión-sefarosa 4B (Bioworld) que había sido bloqueada por incubación con DMEM y equilibrada en PBS /DTT. Se incubó por un periodo de 6 horas a 4 ºC con agitación. Las muestras fueron centrifugadas por 2 minutos a 1000xg a 4º C guardando la fracción eluida. La resina fue lavada cuatro veces y las construcciones GST fueron eluidas por incubación con tampón PBS/glutatión reducido 50 mM durante 10 minutos, se centrifugó por 1 minuto a 1000xg a 4ºC. Las muestras fueron preparadas con tampón de carga para proteínas 5X y fueron cargadas en geles de SDS- PAGE al 8 %. Los geles fueron teñidos usando el kit para tinción de proteínas con sales de plata (Winkler). 39 3.21 Tinción de geles de poliacrilamida con sales de plata. Los geles de poliacrilamida fueron lavados en agua destilada y fijados en una solución metanol 40% /ácido acético 10 %, luego fueron teñidos con el kit de tinción para proteínas con sales de plata (Winkler) de acuerdo al protocolo proporcionado por el manufactor. 40 4. RESULTADOS 4.1 Doble híbrido 4.1.1 Amplificación por PCR de fragmentos estratégicos de GBF1 para posterior construcción de “Carnadas”. GBF1 es una proteína de alto peso molecular (206 kDa aproximadamente). El gen se localiza en el brazo largo del cromosoma 10, en la banda 10q24.32 (PubMED id 9828135), con un tamaño de 137.341 bases que se inicia en la posición 103.995.299 y termina en la posición 104.132.639. El ORF del mRNA tiene un tamaño de 5577 pb que permite expresar una proteína de 1859 aminoácidos. Sobre la funcionalidad y estructura de GBF1 al inicio de esta tesis sólo había sido analizado el dominio catalítico Sec7, donde, al igual que el resto de los miembros de la familia Arf- GEF se concentra la actividad de intercambio de nucleótidos de guanina, mediando la activación de Arf. El dominio Sec7 de GBF1 representa aproximadamente el 10 % de la proteína, y al resto de la secuencia no se habían asignado funciones específicas. En la búsqueda de interacciones proteína- proteína por el sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae, se realizó la construcción de 9 carnadas mediante amplificación por PCR de fragmentos estratégicos de las regiones N-terminal, del dominio catalítico Sec7, de la región C-terminal y fragmentos intermedios de GBF1 (Figura 1). La actividad Arf- GEF de GBF1 es catalizada por el dominio sec7, un fragmento de 191 aminoácidos localizado entre los residuos 692 y 882, correspondiente al fragmento 2074- 2646 del ORF del mRNA de GBF1. Dentro de las modificaciones post-traduccionales en GBF1 se tiene referencia de fosforilaciones en distintos sitios, en el residuo 507 se ha descrito un sitio fosfotreonina, y en los residuos 1318, 1773 y 1784 sitios fosfoserina. 41 GBF1 1 5577 DCB Sec7 pro Carnada 1 1-1716 Carnada 2 1579-3577 Carnada 3 3577-5577 Carnada 4 1-853 Carnada 6 Carnada 5 820-1716 3577-4599 Carnada 7 Carnada 8 4446-5577 820-3051 Carnada 9 2998-4434 Figura 1. Esquema utilizado para la construcción de las carnadas de GBF1 en el sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae. Para la búsqueda de interacciones proteína- proteína por el sistema de doble híbrido se diseñaron 9 fragmentos estratégicos de GBF1 para ser amplificados por PCR y luego utilizados como carnadas en el screening de una biblioteca de cerebro fetal humano. Los fragmentos diseñados permiten el clonamiento en el vector de expresión en levaduras pGBKT7 para así expresar proteínas de fusión Gal4 DNA BD- carnada. 42 La región entre los residuos aminoacídicos 1751 y 1854 corresponde a una zona rica en prolina. Como otro antecedente previo se ha descrito la interacción de GBF1 con la proteína factor de transporte de membranas p115 (Garcia Mata et al., 2003), la cual fue confinada en región rica en prolina de GBF1. Los partidores utilizados para la amplificación de estos fragmentos habían sido diseñados previamente y contienen incorporados sitios de restricción que permiten mantener el marco de lectura de GBF1, al ser clonados en el vector de expresión de levaduras pGBKT7. Este vector permite expresar proteínas de fusión entre el dominio de unión al DNA de Gal4 (DNA BD) y las carnadas. Los fragmentos diseñados varían entre los 853 y 2232 pb (Tabla I). La carnada 1, carnada 4 y carnada 5 representan distintos fragmentos de la región amino-terminal de GBF1. La carnada 2 amplifica un fragmento que contiene el dominio Sec7 de GBF1. La carnada3, carnada 6 y carnada 7 amplifican regiones del extremo carboxilo terminal de GBF1. Las carnadas 8 y 9 representan regiones intermedias de GBF1. El vector pGBKT7 posee codones de término en los 3 marcos de lectura, por lo que no fue necesario incluirlos en los partidores. De acuerdo a la compatibilidad entre los sitios de restricción únicos de pGBKT7 y el análisis de restricción de la secuencia de GBF1 se utilizaron los siguientes sitios de restricción por carnada: NcoI / PstI (Carnadas 1, 4, 5 y 8), NcoI/EcoRI (carnada 2), EcoRI/BamHI (carnadas 3, 6 y 7) y EcoRI/SmaI (carnada 9). El sitio de restricción para NcoI C´CATG_G está contenido 2 veces en la secuencia del ORF del mRNA de GBF1, en las posiciones 3975 y 5180. El sitio de restricción de PstI C_TGCA´G está presente 10 veces en el ORF del mRNA de GBF1, en la posiciones 3107, 3851, 4640, 4706, 4821, 4886, 5432, 5453, 5830 y 5884. Las carnadas 1, 4, 5 y 8 fueron diseñadas con los sitios NcoI (sense)/PstI (antisense) ya que representan la región nucleotídica 1-3051 del ORF del mRNA de GBF1. 43 Tabla II. Características de los fragmentos de GBF1 amplificados por PCR para ser utilizados como carnadas en el sistema doble híbrido. Carnada Fragmento Tamaño (pb) Tamaño ( aa) Partidor Partidor sentido Antisentido 1 1-1716 1716 572 NcoI PstI 2 1579-3577 1998 666 NcoI EcoRI 3 3577-5577 2006 668 EcoRI BamHI 4 1-853 853 284 NcoI PstI 5 820-1716 896 299 NcoI PstI 6 3577-4599 1023 341 EcoRI BamHI 7 4446-5777 1138 379 EcoRI BamHI 8 820-3051 2232 744 NcoI PstI 9 2998-4434 1436 478 EcoRI SmaI 44 La carnada1 (1-1716), carnada 4 (1-853) y la carnada 5 (820-1716) amplifican fragmentos del dominio N-terminal de GBF1 y la carnada 8 (820-3051) amplifica una fragmento de la región N-terminal más la región del dominio Sec7. EcoRI (G´AAT_C) corta una vez en la posición 883 del ORF del mRNA de GBF1. La carnada 2 fue construida con los sitios de restricción NcoI/EcoRI amplificando el fragmento 1579- 3577 del mRNA de GBF1, conteniendo la secuencia codificante para el dominio catalítico sec7 donde se concentra la actividad Arf-GEF de GBF1. La secuencia de reconocimiento de BamHI G´GATC_C está presente 3 veces en las posiciones 108, 372 y 3162 del ORF del mRNA, es decir en las regiones codificantes para el dominio N-terminal y Sec7 de GBF1, por lo que se utilizó para el clonamiento de las carnada3, carnada6 y carnada7, que representan la región C-terminal de GBF1 (nucleótido 3577- 5577). La carnada 9 amplifica el fragmento 2998 – 4434 del ORF del mRNA de GBF1, lo cual representa una fracción del extremo C-terminal, y fue construida con los sitios EcoRI y SmaI. La secuencia de corte para SmaI, CCC´_GGG está presente una vez en el ORF del mRNA de GBF1, en la posición 1141. La estrategia utilizada para el diseño de estas carnadas permitió seccionar GBF1 en fragmentos que facilitan el clonamiento y expresión en levaduras, y principalmente, permitiría asignar las interacciones proteína- proteína a una región específica de la secuencia de GBF1. La secuencia de GBF1 fue analizada utilizando el programa pDRAW32 (Acaclone). Para la amplificación por PCR de los fragmentos “carnadas” de GBF1 se utilizó como templado cDNA de GBF1 clonado el vector pCEP4, y una mezcla de las enzimas Taq DNA polimerasa y Pfu Turbo DNA polimerasa , en una relación 3:1. La 45 programación de los ciclos de PCR fue realizada de acuerdo a las condiciones de reacción establecidas para cada carnada. Los productos de amplificación por PCR fueron preparados con tampón de carga para DNA, visualizados por separación electroforética en geles de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio. Los productos de PCR fueron analizados para determinar la pureza de los fragmentos y verificar si los tamaños obtenidos corresponden a lo esperado para cada carnada. Como referencia de tamaño se utilizó el estándar de DNA 1Kb y Lambda /HindIII. De las nueve carnadas diseñadas originalmente para el clonamiento se amplificaron 8 fragmentos, correspondientes a la carnada 1, carnada 2, carnada 3, carnada 4, carnada 5, carnada 6, carnada 7 y carnada 8. La carnada 9 fue amplificada pero no fue clonada debido a una mala elección en los sitios de restriccíon empleados. En la figura 2 A se observa la amplificación de la carnada 3 y de la carnada 7, correspondientes a fragmentos de 2006 y 1178 pb respectivamente. Los fragmentos de PCR obtenidos fueron purificados con el sistema SV Gel and PCR Clean -Up (Wizard, Promega), para su posterior clonamiento en el vector pGEM-T Easy. Los fragmentos carnadas 1 y 4 fueron amplificados utilizando el mismo partidor sentido ya que representan los fragmentos 1-1716 y 1- 853 respectivamente. Las carnadas 3 y 6 fueron amplificadas utilizando el mismo partidor sentido ya que amplifican los fragmentos 3577- 5583 y 3577- 4599 respectivamente. En la figura 2 B se observa la amplificación de los fragmentos de PCR de las carnadas 2, 6 y 9. 46 A pb 1 2 3 4 5 10.000 2000 Carnada 3 (2006 pb) 1500 1000 Carnada 7 (1178 pb) B Figura 2. Amplificación por PCR de fragmentos carnadas. (A). Amplificación de los fragmentos de GBF1 a ser utilizados como “carnadas” 3 y 7. Carril 1: Estándar de DNA 1kb, carril 2 y 3: carnada 3, carril 4 y 5: carnada 7. Gel de agarosa al 1%, tinción con bromuro de etidio. (B) Amplificación mediante PCR de los fragmentos carnada 2, 6 y 9 de GBF1. Carril 1: Estándar de DNA 1kb, carril 2-3: carnada9, carril 4-5: carnada 6 carril 4 y 5: carnada 9. Gel de agarosa al 1%, tinción con bromuro de etidio. 47 4.1.2 Clonamiento de los fragmentos de PCR (carnadas) en pGEM-T Easy El preclonamiento en pGEM-T Easy fue realizado con el fin de aumentar la eficiencia de digestión en los sitios de restricción incorporados en los partidores, y así facilitar el clonamiento de las carnadas en el vector de expresión pGBKT7. pGEM-T Easy es un sistema de clonamiento basado en un vector linealizado que posee en los extremos 3’ un residuo de timidina, originando un sitio compatible con la adenosina del extremo 3` de los productos de PCR , el cual es añadido por algunas polimerasas termoestables. La enzima Pfu Turbo posee actividad editora por lo que previo a la ligación se realizó el procedimiento estándar de A-tailing, de acuerdo a las indicaciones del manual. Los productos de amplificación fueron ligados a pGEM-T Easy y transformados en la cepa XL1- Blue de E .coli, seleccionando en medio LB/AMP/Xgal / IPTG. La identificación de clones recombinantes fue realizado mediante el ensayo de Bgalactosidasa, por un screening de colonias azules-blancas, ya que la inserción de un fragmento en pGEM-T Easy interrumpe el marco de lectura de B- galactosidasa. Por lo tanto los clones que efectivamente contienen el producto de PCR se observaron como colonias de color blanco, ya que por la ausencia de B- galactosidasa no degradan el sustrato X- gal. Los clones seleccionados en el screening de colonias blancas-azules, fueron inoculados en medio LB con ampicilina para luego realizar extracción de DNA plasmidial por el método de ebullición. Para comprobar la ligación de los fragmentos de PCR “carnadas” al vector pGEM-T Easy, el DNA plasmidial fue digerido con las enzimas de sitios de restricción únicos, que producen la liberación de los insertos carnadas según corresponda a cada fragmento. Los clones fueron analizados por 48 electroforesis en geles de agarosa al 1%. En la figura 3B se comprueba el clonamiento de la carnada 2 en pGEM-T Easy. pGEM-T Easy linealizado tiene un tamaño de 3019 pb y la carnada 2 de1998 pb. La carnada 2, amplificando el fragmento 1579- 3577 del ORF de GBF1 fue creada con los sitios de restricción NcoI/ EcoRI. pGEM-T Easy posee los sitios de restricción NcoI en la posición 37 y EcoRI en las posiciones 52 y 70. Los fragmentos de PCR son clonados en pGEM-T Easy entre las posiciones 52 y 64.Ya que los fragmentos de PCR pueden ser clonados en las dos orientaciones posibles con una probabilidad del 50 % cada una, fue necesario asegurarse que el sitio EcoRI del extremo 5` de la hebra codificante fuese realmente el sitio incorporado en el diseño del partidor sentido y no el sitio del vector. Esta situación fue resuelta determinando la orientación requerida: 5`EcoRI (vector)- 3´/5´-EcoRI hebra no codificante 3´/5´ (SpeI-EcoRI) vector3´, para esto se digirió con NcoI, ya que solo esta orientación permitía visualizar la liberación del fragmento con esta enzima. Luego de seleccionar estos clones se procedió con la doble digestión NcoI /EcoRI. El mismo análisis se hizo para los otros clones. Aunque la liberación de los fragmentos de GBF1 carnadas clonados en pGEM-T Easy requirió de estos procedimientos adicionales, siguió siendo éste el método de elección. Esto debido a alta eficiencia de ligación que se obtiene en el siguiente paso de clonamiento de los fragmentos en pGBKT7 al compararlo con la tradicional ligación directa. Sin embargo cabe destacar que el preclonamiento de los productos de PCR en el sistema pGEM-T Easy no fue contemplado inicialmente como estrategia de construcción de los híbridos carnadas. Afortunadamente aún así fue posible modificar la estrategia; clonarlos, seleccionar la orientación del clonamiento y luego realizar las digestiones requeridas para cada carnada. En la figura 3C se evidencia el clonamiento a pGEM-T Easy de los productos de PCR a ser utilizados como carnada 3. 49 A B C Figura 3. Clonamiento en pGEM- T easy. (A) Mapa del vector pGEM-T Easy (B) Clonamiento de carnada 2 a pGEM-T Easy. Liberación del inserto mediante restricción con EcoRI. Carril 1: Estándar de DNA Lambda / HindIII, Carril 2-5: digestiones clones de “carnada 2”. (C) Clonamiento de carnada 3 pGEM-T Easy. Digestíon con EcoRI para verificar la liberación del inserto (2006 pb). Carril 1: estándar de DNA 1 Kb, carril 2- 4: clones recombinantes conteniendo el fragmento carnada 3, carril 5: clon sin inserto. Geles de agarosa al 1%, tinción con bromuro de etidio. 50 4.1.3 Clonamiento de los fragmentos “carnadas” en el vector de expresión pGBKT7 Los fragmentos “carnadas”de GBF1, preclonados en pGEM-T Easy fueron liberados por digestión enzimática, separados y extraídos desde geles preparativos de agarosa y luego purificados usando un kit para extracción de bandas. Paralelamente se prepararon las dobles digestiones del vector pGBKT7 con los sitios complemetarios a cada carnada. pGBKT7 es un vector de 7.3 kb, que permite expresar en levaduras, bajo la regulación del promotor ADH1, proteínas de fusión con el dominio de unión al DNA de Gal4. pGBKT7 posee el marcador de selección para la transformación en E.coli KANr, y el marcador nutricional TRP1 para la transformación en Saccharomyces cerevisiae, el vector también posee el tag c-Myc, localizado entre la región codificante del dominio GAL4-BD y el sitio de múltiple clonamiento (figura 4 A). Los productos de ligación fueron transformadas en células químicamente competentes de la cepa XL1- Blue de E. coli y se seleccionó en medio LB agar/ kanamicina. Las colonias obtenidas fueron crecidas en medio líquido LB /kanamicina y se extrajo el DNA plasmidial por el método de ebullición. El DNA plasmidial fue sometido a doble digestión según los pares correspondientes a cada construcción, las muestras separadas por electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. El clonamiento fue comprobado por la liberación del inserto “carnada”. De este modo se logró clonar en pGBKT7 los ocho fragmentos del cDNA de GBF1 amplificados por PCR, y preclonados en pGEM-T Easy, para ser transformados y expresados en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae. En la figura 4B se comprueba el clonamiento de la “carnada 2” a pGBKT7, las imágenes del clonamiento de las demás carnadas se destruyeron 51 A B Figura 4. Clonamiento de carnadas al vector pGBKT7. (A) Mapa de restricción y sitio de múltiple clonamiento del vector de expresión pGBKT7.pGBKT7 es un vector de expresión en levaduras, que permite expresar proteínas de fusión entre los residuos 1147 del dominio de unión al DNA del factor de transcripción Gal4 (Gal4 DNA-BD) y una proteína de interés (carnada). (B) Clonamiento de la carnada 2 de GBF1 a pGBKT7. 52 4.1.4 Transformación de construcciones carnadas de GBF1 en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae Desde las carnadas 1-8 de GBF1 clonadas en pGBKT7 y transformadas en XL1Blue, se preparó DNA plasmidial por medio de un kit de “MINI prep” (Promega), para luego transformar en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae. El proceso de transformación fue realizado a través del método mediado por acetato de litio de acuerdo al procedimiento indicado en materiales y métodos. Se prepararon células competentes de la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae, las que fueron transformadas con una mezcla de las construcciones GBF1 “carnadas” y carrier de DNA de espermio de salmón. El tratamiento con litio ayuda a permeabilizar las membranas para facilitar el proceso de transformación. La cepa reportera AH109 es un haploide de tipo MAT_a y posee las mutaciones de los genes que serán empleados como reporteros, la mutación en el gen marcador de selección nutricional para la transformación, mutaciones en el gen GAL4 y GAL80, y lleva las construcciones reporteras en forma de casettes UASGAL-TATA-gen reportero (HIS3, ADE2, LacZ y MEL1, ver anexo). Para la identificación de los clones AH109 transformantes se seleccionó nutricionalmente en medio SD agar/- Trp, ya que la cepa AH109 es deficiente en la síntesis de triptófano por la mutación TRP 1-901 y TRP1 es el gen marcador de selección del vector pGBKT7. Las placas fueron incubandas a 30 º C hasta la aparición de colonias, lo que se obtuvo entre los 3-5 días. Pequeñas colonias se observaron desde el tercer día pero sólo en el 4-5 día se obtuvo el tamaño adecuado para los análisis requeridos. 53 4.1.5 Detección de construcciones híbridas en Saccharomyces cerevisiae Para comprobar la efectiva incorporación de las construcciones carnadas GAL4 DNA BD/GBF1 en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae se realizó extracción de DNA plasmidial por el Método modificado. Este punto es importante ya que en la etapa siguiente se determinará si las construcciones transformadas son expresadas correctamente en la cepa AH109, a través de análisis de western blot, por lo que previamente se debe constatar la presencia de los plásmidos. Aunque la selección nutricional SD/- Trp selecciona un marcador de pGBKT7, de igual forma el procedimiento de extracción de DNA plasmidial desde levaduras es requerido para la caracterización de los clones de interacción que se obtienen durante el proceso de mating. La cantidad de pDNA obtenido desde levaduras empleando este procedimiento, o incluso con los kit de extracción, es muy baja como para ser visualizada directamente en geles de agarosa. Por esto, y de acuerdo a los protocolos estándar, el pDNA obtenido se transformó en la cepa XL1 blue de E. coli, seleccionado con el marcador de transformación del vector de expresión pGBKT7, kanamicina. Las colonias obtenidas fueron inoculas en medio LB/kanamicina para realizar extracción de DNA plasmidial y análisis de restricción para la liberación de los fragmentos carnadas. La incorporación de la construcción carnada 2 clonada en pGBKT7 en la cepa AH109 es confirmada en la figura 5, donde luego de la extracción de pDNA desde ésta cepa, se transformó en XL1- Blue, y el pDNA obtenido fue sometido a análisis de restricción enzimática con EcoRI, verificándose la liberación del fragmento de 1998 pb correspondiente al fragmento amplificado por PCR de la carnada 2, y el fragmento de 7.3 kb correspondiente a pGBKT7. 54 1 2 3 4 5 6 7 pb 10000 pGBKT7 4000 3000 2000 Carnada2 Figura 5. Extracción de pDNA de levaduras. pDNA extraído de la cepa AH109 transformada con la carnada 2 fue transformado en la cepa bacteriana XL1- blue, éste DNA plasmidial fue luego sometído a análsis de restricción con NcoI/EcoRI. Carril 1: Estándar 1Kb. Carril 2-7: clones obtenidos de la carnada 2 digerida con NcoI/ EcoRI. 55 4.1.6 Análisis de expresión de “carnadas” por Western Blot Por el método urea/SDS se realizó la extracción de proteínas de los clones de AH109 transformados con las construcciones GBF1 “carnadas”.La correcta expresión de estas construcciones en Saccharomyces cerevisiae fue evaluada por SDS- PAGE al 8 % y posterior análisis de Western Blot utilizando los anticuerpos primarios anti c- Myc ( tag incorporado en el vector pGBKT7) y anti GBF1. Se utilizaron los siguientes anticuerpos anti- GBF1: 9D2, que reconoce la región N- terminal de GBF1; 9D4, que reconoce el dominio Sec7 de GBF1 y H154, que reconoce el dominio C-terminal de GBF1. Las membranas y films de los Western blot fueron destruidos por lo que no se tienen las correspondientes imágenes. De las ocho construcciones GAL4 BD-GBF1 transformadas en la cepa AH109 solo se expresaron las siguientes: carnada 1, carnada 2, carnada 3, carnada 4, carnada 6 y carnada 7. Las carnadas 5 y 8 no fueron expresadas. El dominio Gal4 DNA- BD representa la región aminoácidica 1-147 del extremo N-terminal de Gal4, con un tamaño de aproximadamente de 16. 29 KDa. Entre el dominio Gal4- BD y el sitio de múltiple clonamiento hay una pequeña secuencia del promotor T7 y el tag anti c- myc. La fusión Gal4 BD /carnada1 tiene un peso molecular de aproximadamente 82.7 KDa, y contiene la región aminoacídica 1-572 de GBF1. La proteína de fusión GAL4 BD/carnada2 tiene un tamaño de aproximadamente 93.3 KDa, y representa la región aminoacídica 527-1192 de GBF1. La fusión Gal4 BD/ carnada 3 tiene una tamaño de 93.3 KDa, aproximadamente, y representa la región aminoacídica 1193-1859 de GBF1. La fusión Gal4 BD/ Carnada 4 tiene una peso molecular aproximado de 50.8 KDa, conteniendo la secuencia aminoacídica 1- 284 de GBF1. La proteína de fusión Gal4 BD /carnada 6 tiene un peso molecular de aproximadamente 57.1 KDa, esta construcción 56 contiene el fragmento aminoacídico 1193- 1533 de GBF1. La construcción híbrida Gal4 BD/ carnada7 tiene un peso molecular aproximado de 61 KDa, y contiene la región aminoacídica 1482-1877 de GBF1. La construcción híbrida Gal4 BD /carnada 5, que contiene la secuencia aminoacídica 274- 572 de GBF1, y la fusión Gal4 BD/carnada 8, conteniendo la región aminoacídica 274- 1017 de GBF1, no fueron detectadas por western blot. 4.1.7 Construcciones “presa” La búsqueda de putativos clones de interacción para GBF1 fue realizada por el screening de una biblioteca comercial de cerebro fetal humano (Clontech) pretransformada en la cepa Y187 de saccharomyces cerevisiae (Matα). La biblioteca fue construida utilizando el método modificado de Gubler & Hoffman. En esta biblioteca los clones aislados del cDNA fueron utilizados para la construcción de fusiones con el dominio de activación de la transcripción de Gal4 (Gal4 AD), en el vector de expresión en levaduras pACT2 (figura 6 B). Luego es amplificada en E.coli, purificada y luego transformada en la cepa Y187 de Saccharomyces cerevisiae. Cada uno de los clones permite expresar, bajo la regulación del promotor de levaduras PADH1, fusiones con el dominio de activación de la transcripción de Gal4. El vector pACT2 (figura 6 A) posee el marcador de selección con antibióticos Amp/R para transformación en E. coli y el marcador de selección nutricional LEU2, para transformación en la cepa Y187 de Saccharomyces cerevisiae. La cepa Y187 lleva la mutación leu 2-3,112 por lo que la ruta de biosíntesis de leucina se encuentra bloqueada. Debido a que el dominio GAL4 AD no posee secuencia de señalización nuclear, y que en la forma nativa de Gal4 está contenida en la región N- terminal dentro del dominio Gal4 DNA-BD, en el vector pACT2 se ha incorporado la secuencia señal de SV40- T. 57 A B Figura 6. Construcciones presas. (A) Mapa del vector de expresión pACT2 para clonamiento de las construcciones “presa” de la bibliotecade cDNA de cerebro fetal humano en el sistema de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae. (B) Esquema utilizado para la construcción de la biblioteca. 58 4.1.8 Apareamiento de levaduras Para la búsqueda de interacciones proteína- proteína en las cuales participe GBF1, por el sistema de doble híbrido se realizaron “matings” o apareamientos de levaduras entre la cepa AH109 (MATa), transformada con las construcciones carnadas y la cepa Y187 (MATα), transformada con las construcciones “presas”. Las construcciones presas corresponden a los clones de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano (Clontech) pretransformada en la cepa Y187. Para cada construcción de GBF1 “carnada” se utilizó una alícuota de la biblioteca, el apareamiento entre las cepas AH109 e Y187 ocurrió porque estas son de identidad sexual opuesta y liberan al medio las feromonas factor a /factor α respectivamente, lo que inicia la vía de señalización par el apareamiento. Las células diploides son entonces portadoras de las construcciones de GBF1 carnada clonadas en el plásmido pGBKT7, y de las construcciones presas de cada clon independiente clonado en el vector pACT2. Completado el período de apareamiento los diploides fueron seleccionados nutricionalmente en medio cuádruple dropout SD agar/- Ade/ -His/-Leu/-Trp. La depleción de triptófano y leucina seleccionó los marcadores de transformación TRP1 y LEU2 de los vectores carnada y presa respectivamente. La depleción de adenina e histidina permitió evaluar la expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3, ya que la presunta interacción entre GBF1 y cada clon “presa” positivo permitió reconstituir la actividad transcripcional reguladora de GAL4. Los diploides obtenidos fueron replicados para ensayar la actividad de los genes reporteros LacZ y Mel1, y almacenados como glicerol stock para luego completar la caracterización de los clones. 59 4.1.9 Ensayo de beta galactosidasa en filtro para evaluación del gen repotero LacZ Los clones obtenidos en el screening de la biblioteca de cerebro fetal humano por el procedimiento de apareamiento de levaduras, fueron almacenados para ser posteriormente evaluados a través de la expresión del gen reportero LacZ, empleando el ensayo de Beta- galactosidasa en filtro según el procedimiento estándar. Para la validación del ensayo se utilizaron las cepas diploides controles, donde el 100% de los clones obtenidos fueron positivos, identificados por manchas de color azul en el papel filtro. Éstas correspondían a las réplicas de las colonias seleccionadas inicialmente por la expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3. Los ensayos para los clones diploides obtenidos con las carnadas de GBF1 no pudieron ser completados. 4.1.10 Controles de interacción Para realizar un control positivo de interacción en el sistema de doble híbrido, se utilizaron los vectores pGBKT7- 53 y pGADT7-T. El vector pGBKT7- 53 permite expresar la fusión entre el dominio de unión al DNA de GAL4 y la proteína p53. El vector pGAD7-T permite expresar la fusión entre el dominio de activación de la transcripción de Gal4 y el gran antígeno T de SV40. pGBKT7- 53 fue transformado en la cepa AH109 de Saccharomyces cerevisiae, y pGADT7-T fue trasformado en la cepa Y187. La interacción entre la proteína p53 y el gran antígeno T de SV40 fue ensayada por el sistema de doble híbrido a través del apareamiento entre estas cepas y posterior 60 selección nutricional en medio SD- /-Trp /-Ade/-Leu/- His y por el ensayo de Beta galactosidasa en filtro. Efectivamente, luego de tres días de incubación en medio QDO, y debido a la interacción entre p53 y el antígeno T de SV40, se observaron las colonias diploides con una alta tasa de eficiencia de apareamiento y el 100% de las colonias ensayadas fueron positivas en el ensayo de beta galactosidasa. Para el control negativo de interacción se utilizaron los vectores pGBKT7- Lam y pGADT7- T. El vector pGBKT7- Lam permite expresar la fusión entre el dominio de unión al DNA de Gal4 y la proteína Laminina C humana. El vector pGADT7- T fue transformado en la cepa AH109 y pGBKT7-Lam fue transformado en la cepa Y187, luego del aparemiento y selección nutricional no se observó crecimiento de colonias. El screening de la biblioteca de cerebro fetal humano permitío obtener clones diploides con las carnadas 1, 4 y 7, seleccionados por los genes reporteros ADE2 e HIS3 en el medio cuádruple dropout, cada carnada fue evaluada 3 veces (figura 7). Con la carnada 1 en el primer screening se obtuvieron 10 clones, 15 clones en el segundo y 12 clones en el tercero, con un total de 37 clones. Con la carnada 4 se obtuvieron 8 clones en el primer screening, 10 en el segundo y 12 en el tercero, con un total de 30 clones. Con la carnada 7 se obtuvieron 6 clones en el primer screening, 12 clones en el segundo, y 10 en el tercero, con un total de 28 clones. Todos los clones obtenidos fueron almacenados a -70 º C y se inició la caracterización de ellos. 61 Ensayo de Beta-galactosidasa en filtro Figura 7. Selección de clones de interacción para GBF1. Las construcciones carnadas GAL4 BD- GBF1, transformadas en la cepa AH109 y las construcciones presas de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano fueron evaluadas por apareamiento de levaduras. Los diploides fueron seleccionados en medio SD QDO para evaluar la expresión de los genes reporteros ADE2 e HIS3. Putativos clones de interacción para GBF1 fueron obtenidos con las carnadas 1, 4 y 7. 62 4.1.11 Análisis estructural de las carnadas positivas en la búsqueda de clones de interacción para GBF1 en el sistema de doble híbrido A través del screening de la biblioteca de cerebro fetal humano se logró aislar clones de interacción presa con la carnada 1, carnada 4 y carnada 7 de las construcciones GAL4 BD- GBF1 (figura 8 A), seleccionadas nutricionalmente y por el ensayo de beta galactosidasa en filtro (figura 8 B) La carnada 1 fue construida por el clonamiento en pGBKT7 del fragmento 11716 del cDNA de GFB1 amplificado por PCR. Esta construcción permitió expresar en la cepa AH109, la fusión entre GAL4 BD y la región aminoacídica 1-572 del extremo N-terminal de GBF1. La carnada 4 fue creada por el clonamiento del fragmento 1-853 del cDNA de GBF1 en pGBKT7 para expresar la fusión entre el dominio GAL4 BD y la región aminoacídica 1-284 del extremo N-terminal de GBF1. La carnada 7 fue construida por el clonamiento del fragmento 4446- 5577 del cDNA de GBF1 en pGBKT7. Al transformar en la cepa AH109 se expresa la fusión entre el dominio GAL4 BD y la región aminoacídica 1488- 1859 del extremo Cterminal de GBF1. Por lo tanto, el screening de la biblioteca de cerebro fetal humano podría indicar una interacción de tipo proteína- proteína con la región N-terminal de GBF1 (carnada 1 y 4). Los resultados con la carnada 7 indicarían interacción dependiente del dominio Cterminal de GBF1. Debido a que el estudio de caracterización de los clones de interacción no fue completado no es posible hacer mayor inferencia sobre la naturaleza de éstos. 63 A B Figura 8. Características de las carnadas positivas en la selección de clones de interacción para GBF1 mediante el screening de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano. (A). Representación estructural de las construcciones carnadas GAL4 BD-GBF1 1, 4 y 7 con las que se aislaron clones de interacción positiva. (B) Características fenotípicas de de las cepas transformadas con las construcciones carnadas, clones de la biblioteca y controles por selección en los distintos medios SD. 64 4.2 Estabilización de complejos proteicos expresados en células de mamífero por entrecruzamiento con DTBP. La búsqueda de interacciones proteína- proteína para GBF1 fue también realizada por precipitación por afinidad con expresión en células de mamífero de formas marcadas con GST. Para estabilizar las interacciones se utilizó el agente entrecruzador homobifuncional DTBP, el cual posee dos grupo imidoester- amino reactivo que interaccionan con grupos amino primarios para formar enlaces amidina (figura 9 A). DTBP es permeable a la membrana plasmática y la reacción es reversible al ser tratado con un agente reductor como DTT. Para estos experimentos se utilizó la línea celular 293 EBNA que expresa GBF1 endógenamente. En la estandarización inicial se evaluaron dos procedimientos en los que DTBP fue empleado de forma previa o posterior al lisado celular, con detección de complejos proteicos de GBF1 endógeno. 4.2.1 Procedimiento A Células 293 EBNA fueron tratadas con DTBP (1mg/ml) previo al lisado celular, de acuerdo al protocolo establecido, separando las fracciones de proteínas solubles y de membrana. Durante los primeros experimentos, y para facilitar el manejo de las fracciones se trabajó con muestras de proteínas totales. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8 %y analizadas por Western Blot Los resultados obtenidos permitieron identificar a GBF1 formando parte de complejos de alto peso molecular, estabilizados por el agente de entrecruzamiento DTBP (Figura 9 B). Se observó solo un tipo de banda, en el extremo superior de gel concentrador, de aspecto muy definido. Los complejos fueron disociados al tratar las muestras con el agente reductor DTT (figura 9 C), identificando la banda de GBF1 (206 KDa aprox.) 65 A B DTT Figura 9. Estabilización de complejos proteicos con DTBP. (A) Estructura de DTBP. (B) Estabilización de complejos con DTBP (1mg/ml) por el procedimiento A. Carril 1: Estándar de proteínas Precision Plus Protein Dual Color (BioRad), Carril 2: Control, extractos totales de 293 EBNA sin tratar. Carril 3- 6: extractos totales en células 293 EBNA tratadas con DTBP. (C) Disociación de complejos por tratamiento con DTT, carriles en el mismo orden que en figura B. 66 4.2.2 Control de entrecruzamiento: interacción GBF1-p115 Es conocida la interacción de GBF1 con el factor de transporte de membranas p115 (Garcia-Mata et al., 2003), por esta razón se utilizó esta interacción como control de los experimentos de entrecruzamiento con DTBP. Las membranas utilizadas para la detección de complejos con GBF1 fueron tratadas para la remoción de los anticuerpos por stripping y luego utilizadas para la detección de complejos de p115. p115 es una proteína de 115 KDa y en las reacciones de entrecruzamiento de los extractos de células 293 EBNA se le identificó formando complejos de alto peso molecular (figura 10 A-1). Los complejos fueron disociados al tratar con DTT (figura 10 A-2). Las bandas obtenidas en estos complejos se superponen con las obtenidos en los complejos de GBF1, indicando que el factor de transporte p115 y GBF1 forman parte de un mismo complejo proteico. Es sabido que GBF1 y P115 interaccionan directamente, y de este modo se valida el procedimiento y las condiciones que se utilizaron para lograr estabilizar las interacciones proteína- proteína. 4.2.3 Procedimiento B Las células 293 EBNA incubadas en DMEM-10% suero fueron lisadas mecánicamente y luego tratadas con DTBP (1mg/ml) de acuerdo al protocolo establecido. Al igual que en el procedimiento A al principio se trabajó con las fracciones de proteínas totales. Las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE al 8% y analizadas por Western blot. Los resultados obtenidos también permiten observar la formación de complejos de alto peso molecular (figura 10 B-1), pero a diferencia del procediemiento A, la interacción con p115 no fue comprobada (imágenes no mostradas), por lo que se optó por el primer procedimiento para los posteriores experimentos. 67 A A-1 A-2 +DTT 1 2 3 4 5 1 6 2 3 4 5 Complejos p115 Complejos p115 250 150 100 75 50 B p115 B-1 6 250 150 100 75 50 p115 B-2 +DTT Figura 10. Control de interacción GBF1- p115 y entrecruzamiento por procedimiento B. (A) Formación de complejos de p115, estabilización de interacciones con DTBP 1mg/ml. (A-1) Carril 1: Estándar de proteínas, carril 2: control, carril 3-6: extractos proteicos totales tratados con DTBP. (A-2) Reducción con DTT. Carril 1: estándar de proteínas, carril 2: control, carril 3-6: muestras de entrecruzamiento tratadas con DTT. (B) Estabilización de complejos con DTBP por procedimiento B. (B1) Carril 1: Estándar de proteínas. Carril 2: Control, extractos totales de 293 EBNA sin tratar. Carril 3- 6: extractos totales de células 293 EBNA tratadas con DTBP.(B-2) Muestras tratadas con DTT, carriles en el mismo orden que en B-1. 68 4.2.4 Aproximación a una posible interacción GBF1-Snapin mediante estabilización de complejos proteicos En un estudio previamente realizado en el laboratorio, para la búsqueda de interacciones proteína- proteína de GBF1 con el sistema doble híbrido, durante el screening de una genoteca de testículo humano, se logró aislar como clones de interacción a Snapin y Hrs. Snapin interacciona con el complejo SNARE y fue originalmente identificada como una proteína de unión a SNAP- 25 (Illardy et al., 1999). Snapin es una proteína de 15 KDa, se expresa en muchos tejidos y se localiza como una fracción unida a membranas y como una fracción soluble. Muchas de las publicaciones en torno a Snapin hacen referencia al rol que tendría en neurosecreción, la actividad de Snapin ayuda en la unión de Sinaptotagmina a los complejos SNAREs. SNAP- 25 interacciona a su vez con alfa SNAP, por esta razón se realizaron los experimentos de entrecruzamiento con DTBP para estudiar una posible participación de GBF1 en este complejo por interacción con Snapin, lo cual sería un indentificación de tipo indirecta. Esto debido a que alfa –SNAP interacciona con SNAP- 25, SNAP- 25 interacciona con Snapin, y si GBF1 interaccionara con Snapin podría ser parte de este complejo, al ser detectado con el anticuerpo anti-alfa SNAP (figura 11). Células 293 EBNA fueron tratadas mediante el procedimiento A de entrecruzamiento con DTBP, las muestras fueron cargadas en SDS- PAGE y analizadas por western blot. Las muestras con DTBP revelaron la presencia de complejos de alfa- SNAP en una banda de tamaño de aproximadamente 150 KDa, que evidentemente no se corresponde con los tipos de complejos observados con GBF1. Pero esta forma de detectar una interacción de GBF1 con Snapin está bajo un contexto de interacción ideal, óptimo para el sistema propuesto, con una condición espacial y temporal dada, y aunque este resultado es negativo no es una prueba de que esta interacción no exista. 69 Figura 11. Esquema de interacciones proteicas necesarias para la detección de la posible interacción GBF1- Snapin.Un estudio previo permitió aislar a Snapin como putativo par de interacción para GBF1. Snapin interacciona con el complejo SNARE y fue originalmente identificada como una proteína de unión a SNAP- 25. Alfa –SNAP interacciona con SNAP- 25, SNAP- 25 interacciona con Snapin, y si GBF1 interaccionara con Snapin, en la estabilización de complejos proteicos con DTBP y al utilizar el anticuerpo anti alfa- SNAP, podría ser detectado como parte de este complejo. 70 4.3 Detección de interacciones proteicas en GBF1 mediante purificación por afinidad de fusiones con GST 4.3.1 Construcciones GST- GBF1 La búsqueda de interacciones proteína- proteína mediante purificación por afinidad con GST fue realizada por expresión de construcciones GST- GBF1 en células de mamífero 293 EBNA. Para estos fines se utilizaron las construcciones GST con fusiones a la forma total de GBF1, con la región N-terminal, con el dominio Sec7 y con la región C-terminal, las que habían sido construidas en el laboratorio con anterioridad (figura 12 A, B). GST- GBF1 total, correspondiente a los nucleótidos 1-5577 del ORF de GBF1, expresando el fragmento aminoácido 1-1859. La construcción GST/N-terminal de GBF1 contiene los nucléotidos 1- 2073 del ORF de GBF1, para expresar el fragmento aminoacídico 1- 691. La construcción GST- Sec7 contiene el fragmento nucleotídico 2074- 2646 del ORF de GBF1, lo que permite expresar la región aminoacídica 692882. La construcción GST/C-terminal de GBF1 contiene el fragmento 2647- 5577 del ORF de GBF1, para expresar la región aminoacídica 882- 1859. Originalmente estos fragmentos de GBF1 fueron clonados en el vector de expresión en mamíferos pEBG, el cual, bajo la regulación del promotor EF- 1 Alfa permite expresar fusiones con la región N-terminal de GST. La región N-terminal de GST tiene un tamaño aproximadamente de 26 KDa. Por lo tanto la la proteína de fusión GST- GBF1 (total) tendrá un tamaño aproximado de 232 KDa, la fusión GST /Nterminal un tamaño de 102 KDa, la fusión GST- Sec7 un tamaño de 50 KDa y la fusión GST/C-terminal un tamaño también aproximado de 120 KDa. 71 A GST GBF1- total GST N- terminal GST GST Sec-7 C-terminal B 1 2 3 4 5 6 pb 8000 6000 5000 4000 Figura 12. Construcciones GST-GBF1. (A) Esquema de las construcciones GSThGBF1 utilizadas para los ensayos de purificación por afinidad con fusiones GST. (B) Construcciones GST- hGBF1. (Muestras sin digerir).Carril 1: estándar de DNA 1Kb, carril 2: GST- hGBF1 total, carril 3; GST/N-terminal de GBF1, carril 4: GST-sec 7 de GBF1 (clon 2D), carril 5: GST- sec7 de GBF1 (clon 2E), carril 6: GST/ C-terminal de GBF1. Gel de agarosa al 1 %, tinción con bromuro de etidio. 72 4.3.2 Transfección y análisis de expresión de construcciones GST- GBF1 Células 293 EBNA fueron cultivadas en DMEM- 10% suero e incubadas a 37 º C, 5% CO2, hasta obtener una confluencia de 70- 80%. Las células fueron transfectadas con las construcciones GST-GBF1 empleando el sistema de transfección Pefectin. Después de 24 horas se realizó la extracción de proteínas y análisis de expresión por Western Blot, utilizando los anticuerpos primarios 9D2 que detecta la región N-terminal de GBF1, 9D4 que detecta la región Sec7 de GBF1 y H154 que reconoce la región Cterminal de GBF1. Todas las construcciones se expresaron de acuerdo a los tamaños esperados (figura 13), por lo que quedaron en condiciones de ser utilizadas para los experimentos de purificación de complejos por afinidad. 4.3.3 Ensayos de purificación de complejos proteicos por afinidad con GST Los extractos proteicos de 293 EBNA con las fusiones GST- hGBF1 fueron incubados con glutatión-sefarosa 4B al 50 %, previamente bloqueada y equilibrada. Después de separar la fracción no unida, la resina fue lavada varias veces y entonces incubada con glutatión reducido para liberar los posibles complejos con la fusión GSThGBF1. Las muestras fueron cargadas en geles de SDS- PAGE al 8 %. Los geles fueron fijados y luego teñidos usando un kit comercial para tinción de proteínas con sales de plata (Winkler). Con los patrones de tinción obtenidos no se logró identificar alguna banda de interés que indicase una posible interacción de GBF1 (datos no mostrados).Ya que las construcciones GST- hGBF1 fueron expresadas correctamente en la línea celular 293 EBNA, próximamente éstas hubiesen sido utilizadas para los experimentos de entrecruzamiento con DTBP y purificación por afinidad con GST. . 73 1 2 3 4 5 6 KDa 250 GST- GBF1 GBF1 wild type 150 GST/C-terminal 100 GST/N-terminal 75 50 GST- Sec7 Figura 13. Expresión de construcciones GST- hGBF1 en células 293 EBNA (esquema). Carril 1: Estándar de proteínas Presicion Plus Protein Dual Color (BioRad), carril 2: GBF1 wild type, carril 2: GST- GBF1, Carril 3: GST/N-terminal, carril 4: GSTSec7, carril 5: GST/C- terminal 74 5. DISCUSIÓN 5.1 El modelo propuesto Las principales líneas de investigación en torno a GBF1 han sido enfocadas en determinar como este Arf GEF otorga especificidad al tráfico vesicular. Esto a través de estudios de localización, preferencia por substrato, dinámicas de asociación a membranas, análisis de sobreexpresión y efectos producidos por el tratamiento con Brefeldina A (Zhao et al., 2006; Szul et al., 2005; Niu et al., 2005; García-Mata et al., 2003; Kawamoto et al., 2002; Claude et al., 1999). También han sido analizadas las variantes de splicing, niveles de expresión en tejidos, efectos por generación de mutantes y supresión mediante siRNA (Mansour et al., 1998, Claude et al., 2003; Manolea et al., 2008). La propiedades Arf GEF de GBF1 permiten que active los factores de ADP- ribosilación de tipo I y II mediante el intercambio de GDP por GTP, y su localización en las membranas de la cara cis del complejo de Golgi regula el tráfico retrógrado hacia el retículo endoplásmatico. La hipótesis de este trabajo fue que GBF1 debería tener más funciones que solo la activación de Arf para el intercambio GDP/GTP, esto considerando que GBF1 es una proteína de alto peso molecular (206 KDa), y la actividad ARF- GEF está localizada en el dominio Sec7, que solo representa aproximadamente el 10 % de la proteína. Sobre funciones y actividades específicas para el otro 90 % de GBF1 no se tenía mayor información. Además, la mayoría de las proteínas de alto peso molecular se encuentran formando parte de grandes complejos que actúan como maquinarias moleculares. Los análisis estructurales en base a la secuencia de GBF1, al igual que los miembros de la familia de ARF-GEF de mamíferos GBF/BIG, revelan una organización en sentido N-C 75 terminal compuesta por un dominio DCB, un dominio HUS1, el dominio catalítico Sec7 y tres dominios HDS. Además un rasgo característico es la región rica en prolina localizada en el extremo C-terminal. Por lo tanto, en consecuencia al alto peso molecular de GBF1, con la mayor parte de sus dominios de propiedades desconocidas, es probable que la actividad de GBF1 sea modulada por la interacción con los demás componentes de la maquinaría de transporte de membranas o proteínas accesorias. Luego el mismo GBF1 actuaría como un andamiaje molecular, en el que las interacciones proteína- proteína son determinantes de los eventos reguladores que otorgan la especificidad en este proceso. GBF1 y BIG1/BIG2 son Arf GEF de mamíferos de alto peso molecular del complejo de Golgi, que comparten un dominio catalítico Sec7, pero se localizan de forma diferencial en las caras cis y trans respectivamente (Manolea et al., 2008). GBF1 regula el reclutamiento de los mantos COPI y el ensamblaje y organización del complejo de Golgi. BIGs regulan el reclutamiento de los adaptadores de clatrina y ayudan a mantener la estructura del TGN. La preferencia por sus sustratos y etapas de regulación del tráfico vesicular son también específicas en cada uno. Estas propiedades distintivas de cada Arf GEF están ciertamente determinadas en primera instancia por las secuencias proteicas y modificaciones respectivas a cada GEF, pero el detalle de cuales regiones o dominios estaban involucrados permanecían sin definir, siendo la propia asociación con membranas otro proceso no bien detallado. Los Arf GEF de bajo peso molecular se asocian a membrana por medio de la interacción con fosfoinosítidos, la que es localizada en los dominios de homología a pleckstrina (PH) de estos GEFs (Cullen and Chardin, 2000). Para los Arf GEF de alto peso molecular GBF1 y BIGs no existían referencias de homología con este tipo de dominio, que mediaran la asociación con 76 membranas por interacción con lípidos, por interacción con proteínas asociadas a membranas, o receptores de membrana específicos. De GBF1 se sabe que cicla de forma altamente dinámica entre el estado soluble y asociado a membrana (Niu et al., 2005), pero los mecanismos de regulación aun no son totalmente dilucidados. La interacciones de GBF1 con Arf1 y Arf5 hacen referencia a la actividad catalítica intrínseca del dominio sec7, pero la interacción con la proteína factor de transporte de membranas p115, fue la primera interacción descrita para el resto de la estructura proteica (Garcia- Mata and Sztul 2003). En los reportes de GarcíaMata y colaboradores, a través de estudios de mutagénesis, se concluye que la interacción GBF1-p115 no es requerida para la localización de cada uno de ellos hacia las membranas. Pero la disrupción de esta interacción mediante la sobreexpresión de la región rica en prolina de GBF1, condujo al desamblaje del complejo de Golgi. Con estos resultados propusieron que la interacción podría regular la activación de Arf dependiente del intercambio GDP/GTP catalizado por GBF1. Recientemente algunas publicaciones hacen referencia a esta interacción y se le han asignado posibles roles en el reclutamiento a membranas de GBF1. Es así como también la interacción GBF1p115 ha sido contextualizada dentro de un nuevo modelo en la regulación del tráfico vesicular en donde a través de un proceso en dos etapas ocurre la activación secuencial de Sar1 para la formación de vesículas de tipo COPII, y Arfs para la formación de vesículas de tipo COPI. En este modelo la activación de Sar1 permite reclutar los mantos de tipo COPII, los SNARE correspondientes, Rab1 y p115. Luego GBF1 sería reclutado a membranas a través de la interacción con p115 para organizar el reclutamiento de los mantos en el ERGIC. La localización en membranas de GBF1 es estabilizada por el tratamiento con BFA (Niu et al., 2005), lo que se debe a la formación del complejo abortivo Arf- GDP / BFA /Sec7d (Peyroche et al., 1999). El mecanismo 77 general de la explicación para la activación de Arfs, mediada por los Arf GEF, se basa en el cambio conformacional producto del intercambio GDP/ GTP. Esto conlleva a la exposición de la región N- terminal miristoilada de los Arfs, lo que a su vez permite que los Arfs se asocien a membrana por medio de interacción con los lípidos de la bicapa. Pero en este complejo abortivo, estabilizado por BFA y fuertemente asociado a las membranas del complejo de Golgi, Arf1 está en la forma unida a GDP. También se propone que Arf1 y GBF1 son asociados individualmente a membranas, se sabe que Arf1 interacciona con la proteína transmembrana p23, además en levaduras se ha demostrado que Arf1 interacciona también con SNAREs, siendo este un posible mecanismo para el reclutamiento a membranas (Rein et al., 2002). Niu y colaboradores proponen que GBF1 podría ser reclutado en membranas mediante la interacción con hGmh1 (Niu et al., 2005). hGmh1 es una proteína de membrana que fue identificada como compañero de interacción para los Arf Gef Gea1 y Gea2 (Chantalat et al., 2003), y se localiza en compartimentos tempranos del complejo de Golgi en levaduras y células humanas. Una nueva interacción entre GBF1 y Rab1b (Monetta et al., 2007) ha sido descrita, sugiriendo regular el reclutamiento de GBF1 y a través de éste la activación de Arf1, lo cual es seguido por la asociación de los mantos proteicos COPI. Los resultados obtenidos demostraron que el patrón de localización de GBF1 es afectado por la depleción de Rab1b, donde GBF1 es redistribuido desde las membranas del Golgi al citosol. Esto es también respaldado por la expresión de una mutante negativa de Rab1b que conduce al mismo patrón de disociación en GBF1. En esta publicación se describe que Rab1b regula el reclutamiento de GBF1 en los sitios ERES para mediar el intercambio de las cubiertas proteicas COPII/ COPI y en el complejo de Golgi para la 78 formación de las vesículas COPI. Además, Rab1b también interacciona con p115 (Allan et al., 2000) Bajo este contexto la búsqueda de interacciones proteína- proteína se convirtió en un medio para llegar a conocer y entender las propiedades reguladoras de este ArfGEF, del proceso de formación de vesículas de tipo COPI y de la vía secretoria en general. Las interacciones están enfocadas en varios de los procesos que determinan especificidad en la actividad de GBF1. Dentro de éstas se encuentran interacciones que regulen el reclutamiento a membranas, interacciones que controlen y permitan concretar la activación de Arf, o interacciones que permiten establecer una plataforma para los posteriores eventos en la formación de las cubiertas proteicas COPI. 5.2 Sobre las técnicas empleadas El amplio espectro de sistemas para el estudio de las interacciones proteínaproteína que existen en la actualidad tienen sensibilidades y especificidades variables, ventajas y limitaciones (Berggard, 2007). La elección de un sistema en particular está sujeta a las consideraciones y posibilidades de cada investigador en base a las propiedades del modelo en estudio. Las propias características de una interacción en particular pueden favorecer la detección por un método u otro, dependiendo por ejemplo de si forman complejos proteicos estables o temporales, si es una interacción débil o fuerte, del tipo de estructura, naturaleza de la interacción y dependencia de factores como pH, fuerza iónica, temperatura, modificaciones enzimáticas, etc. (Archakov, 2003). En los complejos proteicos temporales las características de las interfaces son propias de cada par de interacción, y el hallazgo de estás es mas difícil que en los 79 complejos proteicos estables, especialmente en el caso de interacciones de carácter débil. Algunas de las técnicas tradicionales en la búsqueda de interacciones proteínaproteína corresponden a : (1) métodos físicos, como cromatografía por afinidad, afinidad por blotting, inmunoprecipitación, coinmunoprecipitación y entrecruzamiento; (2) métodos basados en interacciones genéticas dentro de los que se encuentran las sondas de proteínas, bibliotecas de fagos, el sistema de doble híbrido y otros sistemas derivados de éste; (3) métodos genéticos tales como supresión extragénica, mutaciones con efectos sintéticos letales, sobreproducción de proteínas silvestres y sobreproducción de proteínas mutantes (Phizicky and Fields, 1995). Otros técnicas con nuevas aplicaciones al estudio de interacciones proteicas incluyen espectrometría de masas (Brymora, 2004; Vasilescu, 2006), complementación bimolecular fluorescente BiFC (Kerppola, 2008), FRET (fluorescente resonante energy transfer (Hallworth, 2006)), SPR (surface plasmon resonante (Torreri, 2005)), DPI (Dual polarisation interferometry (Swann et al., 2004)), inmunoprecipitación cuantitativa combinada con knock down (QUICK), y técnicas con dispersión de luz estática y dinámica (Geerlof, 2006). Algunas de estas últimas técnicas requieren de implementación y equipos de uso no masificado, por lo que se requiere de una mayor inversión de recursos. Los avances de la proteómica han desarrollado un nuevo campo en el área de la bioinformática para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Diversos programas analizan diversas propiedades de los complejos proteicos y permiten predecir o validar una interacción. Dentro de las herramientas para la predicción de interacciones proteicas se encuentran los análisis en base perfiles filogenéticos, predicción de interacciones por similitud de árboles genéticos, mapeo en base a vías metabólicas, creación de bases de datos y asociación por similitud de secuencias, formación de 80 patrones estructurales y modelamiento por redes Bayesianas (Droit, 2005; Archakov, 2003). Otra rama para los análisis de interacciones proteicas en base a programas conforma los denominados métodos de “docking”, donde se encuentran los programas de modelamiento en base a los refinamientos conformacionales de los ensamblajes proteicos por algoritmos, desarrollo de gráficas moleculares para estudiar las estructuras e interacciones, programas para estudiar las superficies de interacción mediante complementación geométrica y química, análisis de la energía potencial electrostática, entre otros. Algunos de estos programas para este tipo de análisis son 3D- Dock Suite, 3D- Garden, Bielefeld Protein Docking, BiGGER, ClusPro, DOT, ESCHER NG, FireDock, HADDOCK, HEX, RosettaDock Server, etc. La búsqueda de interacciones proteína- proteína de GBF1 en este trabajo fueron realizadas por medio de las técnicas tradicionales de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae, estabilización de complejos proteicos con el agente de entrecruzamiento DTBP y purificación por afinidad mediante precipitación por afinidad con GST y expresión en células de mamífero. Desde un punto de vista comparativo el sistema de doble híbrido representa uno de los métodos más utilizados para estos fines por la simpleza, rapidez, sensibilidad para la detección de interacciones mediadas por proteínas de baja abundancia o de tipo transiente y disponibilidad para continuar los estudios de los clones de interacción seleccionados. También es importante y una ventaja frente a los métodos bioquímicos tradicionales el hecho de detectar las interacciones directamente en las células diploides de levadura, eliminando también la necesidad de posteriores pasos de purificación. La principal desventaja descrita para esta técnica es la presencia de falsos positivos, ya que algunas proteínas sin estar involucradas en la trasncripción al ser fusionadas a un dominio de unión a DNA pueden activar factores de transcripción. Proteínas carnadas con dominios acídicos han sido 81 identificadas como autoactivadoras de genes reporteros, y se cree que justamente esos residuos acídicos estarían involucrados con regiones activadoras de los factores de transcripción. Previo al screeening de las bibliotecas las construcciones carnadas son analizadas mediante las pruebas de autoactivación de los genes reporteros, donde éstas son transformadas en la cepa AH109 y seleccionadas en medio cuádruple dropout SD /Ade/-His/- Leu/- Trp. Con esto se permite evaluar que las proteínas carnadas no contengan una secuencia de activación que conduzca a expresar los genes reporteros y ocasionar falsos positivos. Se ha descrito que durante el screening de una biblioteca alrededor del 70% de las construcciones híbridas carnadas permiten identificar verdaderos pares de interacción, pero también típicamente se identifica por lo menos un clon de interacción falso positivo. Es por esta razón que los clones seleccionados deben ser sometidos a varias pruebas y luego confirmar la interacción por otras técnicas. El sistema comercial de Clontech aquí utilizado, Matchmaker Two-Hybrid System3 posee algunas modificaciones que ayudan a aumentar la fidelidad del ensayo, principalmente en base al uso de las cuatro construcciones reporteras bajo la regulación de tres promotores distintos, con lo que se consigue eliminar muchos de los clones falsos positivos producto de la autoactivación por parte de las proteínas híbridas de la biblioteca. Los principales falsos negativos en el sistema de doble híbrido pueden ser originados cuando las proteínas de fusíon no se pliegan adecuadamente o no se realizan las modificaciones postraduccionales necesarias, alterando así los requrimientos de interacción. Falsos negativos pueden deberse también a interacciones de carácter débil. En el sistema de doble híbrido uno de los puntos determinantes para el éxito en el descubrimiento de interacciones proteína- proteínas mediante el screening de las bibliotecas es justamente la elección de una biblioteca decuada. Dentro de los criterios 82 para la elección de la biblioteca a utilizar es necesario analizar varios parámetros, como la fuente de origen, el tipo de tejido, el método de preparación y la representabilidad de los clones. La biblioteca comercial aquí utilizada (Clontech), es preparada desde mRNA de cerebros fetales completos correspondientes a abortos espontáneos de 20- 25 semanas de edad. La biblioteca fue construida por clonamiento direccional mediante uso de oligo XhoI- (dT)15 y la secuencia adaptadora con los sitios EcoRI-NotI-SalI por métodos tradicionales. En este contexto la elección de una biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano fue debido a que las primeras referencias indicaban al cerebro como uno de los tejidos con más altos niveles de expresión de GBF1. Por lo tanto se esperaría en estos tejidos tener mayor probabilidad de detectar pares de interacción para GBF1 con relevancia funcional. Otro aspecto para considerar en la construcción de las bibliotecas de eucariontes superiores por lo métodos tradicionales pueden contener principalmente los clones de cDNA más redundantes y baja bajos niveles de cDNA de gran tamaño (Ohara et al., 1997). Luego las regiones N-terminal de las proteínas de gran tamaño, o la totalidad de estas proteínas no son bien representadas, y por lo tanto la identificación de ciertas interacciones dependientes de estas regiones no será lograda. En la actualidad existen variadas estrategias para la construcción de bibliotecas de cDNA normalizadas (Nakayama et al., 2002). Otro factor clave en la búsqueda de interacciones en doble híbrido es el diseño de las construcciones utilizadas como carnadas, especialmente cuando se usan fragmentos de una proteína. Tradicionalmente en la búsqueda de interacciones proteína- proteína por doble híbrido se utiliza como carnada el dominio GAL4 BD fusionado a la proteína de interés en su longitud total. Luego cuando es detectada una interacción se construyen nuevas carnadas con fragmentos de la proteína en estudio para localizar el dominio o región de interacción. Pero lo más importante es que efectivamente las proteínas de 83 fusión puedan ser expresadas correctamente en las cepas de Saccharomyces cerevisiae, y las proteínas de alto peso molecular provenientes de otra especie tienen muy baja probabilidad de ser expresadas establemente. Por esta razón para GBF1 se trabajó directamente con fragmentos para ser usados como carnadas. La elección de estos fragmentos carnadas de GBF1 puede eventualmente afectar los requerimientos para el plegamiento, que a su vez podría ser determinante para algunas interacciones. GBF1 no ha sido cristalizado y tampoco se tiene la información de los perfiles de plegamiento. Las construcciones carnadas de GBF1 utilizadas para el screening de la biblioteca fueron diseñadas en base a información manejada en el laboratorio de datos no publicados sobre el plegamiento de este GEF. En esta aproximación se cotransfectaron 3 plámidos que permitían expresar 3 grandes fragmentos de GBF1, reconstituyendo la actividad ARF- GEF, lo que llevó a inferir complementación y correcto plegamiento de cada uno de estos fragmentos. También es importante considerar que talvez el sistema utilizado de doble híbrido clásico pudo no ser el más adecuado, pero ya que los análisis no fueron completados, esto como una especulación. La posible no idoneidad del sistema es debido a que éste se basa en la detección de interacción entre proteínas solubles que deben ser translocadas al núcleo. Aunque el sistema de doble híbrido permite en teoría estudiar cualquier tipo de interacción, y ha permitido detectar muchas interacciones entre proteínas asociadas a membranas, proteínas residentes del núcleo, proteínas mitocondriales, extracelulares y solubles, tiene también ciertas limitaciones. Debido a esto se han desarrollado sistemas específicos para otro tipo de interacciones como el sistema de reclutamiento SOS (SRS) y el sistema basado en la fragmentación de ubiquitina. El sistema SRS se basa en la vía de señalización Ras de levaduras (Aronheimn et al., 1997). La activación de Ras es regulada por el intercambio GDP/GTP estimulado 84 en la membrana plasmática por el factor de intercambio de guanil nucleótidos de Ras (RGEF), cdc25. Las cepas mutantes del alelo cdc25 son sensibles a la temperatura, pueden crecer a 25 º C, pero no a 36ºC, sin embargo a esta temperatura la mutación es complementada por el direccionamiento a membrana de hSOS, el RGEF humano. En el sistema SRS la unión a membranas de hSOS es dependiente de las interacciones proteína- proteína, puesto que las construcciones carnadas contienen la fusión de la proteína de interés con hSOS truncada a nivel C- terminal, que es aun activa pero no puede ser dirigida a membrana. Las proteínas presas son proteínas integrales de membrana o proteínas solubles con señales de miristoilación. Por lo tanto sólo la interacción entre dos proteínas dadas permite reactivar la actividad de hSOS. Otro sistema derivado de doble híbrido para la búsqueda de interacciones de proteínas asociadas a membrana está basado en la fragmentación de ubiquitina (Johnson and Varshavsky, 1998). Para esto el extremo N-terminal mutado de ubiquitina es fusionado con una proteína carnada, la proteína presa es fusionada al extremo Cterminal de ubiquitina, que a su vez está fusionada con una proteína reportera. Luego, solo la interacción específica entre carnada y presa permite reconstruir a ubiquitina, permitiendo la liberación de la proteína reportera mediado por las proteasas específicas de ubiquitina. Para la búsqueda de interacciones mediante precipitación por afinidad con GST fueron expresadas las construcciones GST- GBF1 en células 293 EBNA. Con esta técnica la mayor dificultad es el hallazgo de interacciones de tipo transiente, especialmente las interacciones débiles con constantes de disociación altas, ya que es muy fácil que los complejos se disocien durante el procedimiento de extracción de proteínas, durante la incubación o en los lavados. Y se requiere optimizar el sistema en 85 base al tipo de sales, a la concentración de éstas, períodos de incubación y al pH en los tampones de unión y lavado. Las interacciones de naturaleza estable son generalmente fáciles de detectar y además los falsos positivos, producto de interacciones no específicas pueden ser eliminados por lavados con tampones de alta fuerza iónica. La estabilización de este tipo de interacciones puede ser lograda mediante el uso de cofactores o análogos de nucleótidos trifosfatos no hidrolizables. También los complejos proteicos pueden ser estabilizados por distintos tipos de agentes de entrecruzamiento. Aquí fue utilizado el agente imidoester homobifuncional DTBP. Este es permeable a la membrana, y por lo tanto permite realizar las reacciones de entrecruzamiento en células intactas. Actualmente se han desarrollado nuevos agentes de entrecruzamiento que otorgan mayor especificidad en la estabilización de los complejos, como los fotoreactivos. Esto es debido a que en el uso tradicional de entrecruzamiento químico con agentes homobifuncionales o heterobifuncionales pueden detectarse conjugados proteicos no dependientes de una interacción proteína- proteína real, lo que es eliminado con el uso de agentes fotoreactivos. Sin embargo, en el uso de estos reactivos el nivel de conjugados que se forma suele ser bajo. La forma mas común de expresión de proteínas fusionadas a GST es en E. coli, debido a los altos niveles de expresión, controlada por inducción, y rapidez, que conducen a la más alta producción de proteínas de fusión con GST. Pero la expresión de las construcciones GST-GBF1 en células eucarióticas, específicamente en células de mamífero, aumenta la posibilidad de que las proteínas sean plegadas adecuadamente y se realicen las modificaciones postraduccionales correspondientes, las que pueden ser críticas para una interacción dada, con un también buen nivel de expresión. Pero al igual que las construcciones para las fusiones de doble híbrido está la posibilidad que la 86 propia fusión, o el hecho de expresar fragmentos proteicos, puede afectar el plegamiento o alguna interfaz requerida para una interacción en particular. También al expresar fusiones con GST en células de mamífero es determinante tener un buen sistema de transfección para asegurar obtener suficiente cantidad de proteína de fusión, considerando además que luego la detección de los posibles pares de interacción es aquí realizada por tinción de proteínas con sales de plata. Al usar las células 293 EBNA, en las que GBF1 se expresa endógenamente, los extractos proteicos contienen tanto las fusiones GST- GBF1 como las proteínas presas, y luego el uso de DTBP se utilizó para la estabilización de los complejos. 5.3 Sobre los resultados obtenidos Las primeras etapas para la búsqueda de interacciones proteína- proteína en GBF1 por el sistema de doble híbrido fueron logradas satisfactoriamente. Los ocho fragmentos estratégicos de las regiones N-terminal, del dominio catalítico sec7, C- terminal y regiones intermedias de GBF1 fueron amplificados por PCR y clonados en pGEM-T Easy. Cada fragmento fue subclonado en el vector de expresión en levaduras pGBKT7. Las construcciones carnadas GAL4 BD- carnadas fueron transformadas en la cepa AH109 y la correcta expresión de estas proteínas híbridas fue analizada por western blot. De las ocho construcciones solo se expresaron 6 de éstas, correspondientes a las fusiones del dominio de unión al DNA de GAL4 con las carnada 1 (1-572 aa), carnada 2 (527- 1192 aa), carnada3 (1193-1859 aa), carnada 4 (1-284 aa), carnada 6 (1193-1533 aa) y carnada 7 (1482-1877 aa). La selección de estas carnadas transformadas en la cepa AH109 en medio SD cuádruple dropout permitió verificar que no producían autoactivación de los genes reporteros y por esto fue posible emplearlas para el screening de la biblioteca de cerebro fetal humano. Las carnadas 5 y 8 no fueron 87 expresadas en Saccharomyces cerevisiae, esto podría ser debido a algún efecto de toxicidad producida por estas proteínas híbridas, o por algún problema en la construcción o clonamiento de éstas, cómo por ejemplo la aparición de algún codón de término. Estas 6 construcciones fueron utilizadas como carnadas para el screening de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano, lo que permitió aislar clones con señal de interacción positiva para las carnada 1, carnada 4 y carnada 7 al evaluar la expresión de los genes reporteros por selección en medio QDO SD /-Ade/-Leu/-His/-Trp. El utilizar un medio de alta exigencia permite disminuir la presencia de clones falsos positivos, pero a la vez hace mas difícil identificar aquellas interacciones débiles. El screening por apareamiento de levaduras fue realizado 3 veces para las carnadas 1 y 4 y dos veces con las carnada 7. El total de clones obtenidos para el screening con la carnada 1 fueron 37, 30 para la carnada 4 y 28 para la carnada 7. Los clones seleccionados fueron almacenados en glicerol Stock a -70 º C para la posterior caracterización y secuenciación. El uso de los agentes de entrecruzamiento para la estabilización de interacciones proteína- proteína resulta ser una buena estrategia y con DTBP permitió detectar a GBF1 formando complejos de alto peso molecular, en bandas muy limpias, definidas y únicas. Estos ensayos preliminares fueron realizados en células 293 EBNA, donde GBF1 es expresado endógenamente, y por entrecruzamiento sobre células intactas ya que DTBP es permeable a membranas. En los experimentos iniciales de precipitación por afinidad con las construcciones GST- hGBF1 bajo las condiciones utilizadas no se logró identificar bandas de interés como posibles proteínas de interacción con GBF1. En los primeros ensayos se detectaban muchas bandas inespecíficas y productos de degradación proteolítica, pero luego no fue posible obtener indicios de alguna banda de 88 interés como señal de interacción. Por lo que la combinación de estabilización con DTBP y precipitación por afinidad con GST era la siguiente metodología a evaluar. 5.4 Experimentos y análisis pendientes Desafortunadamente la etapa final de doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae no pudo ser terminada. Los clones seleccionados durante el proceso de mating para el screening de la biblioteca deberían haber sido caracterizados para obtener patrones o perfiles del tamaño y sitios de restricción del inserto, y así agruparlos y poder finalmente secuenciar para obtener la identidad del par de interacción. Inicialmente el proceso requería verificar los putativos clones seleccionados durante el screening, volviendo a comprobar los fenotipos en los medios selectivos cuádruple dropout SD/ Ade/-His/-Leu/-Trp/ y repetir también los ensayos de beta galactosidasa en filtro. Con las colonias diploides verificadas el paso siguiente debía ser realizar la extracción de DNA plasmidial para poder transformar en E.coli o para amplificar por PCR, y luego obtener patrones de digestión que permitiesen ir clasificando los clones para seleccionar representantes de cada grupo y estos enviarlos a secuenciar. Esta etapa que parece ser bastante simple tiene la limitación técnica que al no utilizarse el Kit con columnas para la extracción de DNA plasmidial desde levaduras, y usar como en este trabajo el método modificado la cantidad obtenida de DNA es bastante baja, no puede analizarse directamente en geles de agarosa y se requiere de transformación en E. coli por electroporación o células químicamente competentes de alta calidad. El método aquí utilizado para el procedimiento de lisis utiliza la enzima liticasa y bolitas de vidrio acidificadas en combinación con ciclos de congelamiento/ descongelamiento, seguido de extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Luego que se extrae el DNA plasmidial desde bacterias, se realizan las digestiones enzimáticas adecuadas y se 89 comparan entonces los patrones obtenidos en cada clon por tinción con bromuro de etidio de los geles de agarosa. Este técnica produjo buenos resultados y el DNA plasmidial de todas las carnadas GAL4 BD- GBF1 que fueron transformadas en la cepa AH109 de S. cerevisiae fueron obtenidos y analizadas correctamente. Los siguientes pasos en el análisis de los putativos clones de interacción contemplaban volver a transformar en S. cerevisiae, y al tener los clones aislados comprobar la activación de los genes reporteros por selección nutricional en medio triple y/ o cuádruple dropout y en los ensayos de beta galactosidasa en filtro. Esto ya que eventualmente existía la posibilidad que los diploides seleccionados como productos de la interacción carnada-presa pudiesen ser un falso positivo causado por los clones de la biblioteca. La autoactivación de estos clones, a diferencia de las construcciones carnadas de GBF1, no logró ser analizada. Si efectivamente en medio QDO los clones de la biblioteca no producían autoactivación de los genes reporteros, y luego volvían a detectarse como positivos por complementación con las construcciones carnadas, estaban en condiciones ser secuenciados. Posteriormente cuando luego de secuenciar se ha logrado identificar al par de interacción se sugiere realizar algunas pruebas adicionales en el mismo sistema de doble híbrido, como intercambio de vectores o mutaciones sitio-específicas. Adicionalmente la interacción debería ser confirmada por otras técnicas, y también empleando el modelo de doble híbrido en mamíferos. Finalmente, aunque en pocas oportunidades, existe la posibilidad que luego de secuenciar se encuentren dos inesperados resultados con los ORF (Open Reading Frame). Uno de estos corresponde a que simplemente no se encuentre un ORF fusionado al domino de activación del GAL4. Lo que puede ocurrir en estos casos es que en la hebra antisentido exista un ORF cuya transcripción podría estar regulada por un promotor críptico localizado dentro de la secuencia de terminación 90 del promotor de ADH1 (Chien et al., 1991). La activación de los genes reporteros por este tipo de transcrito puede ser lograda cuando la proteína codificada tenga actividad transcripcional y además interaccione con la proteína carnada, de esta forma no sería necesaria la fusión con el dominio de activación de GAL4. Otra posibilidad que puede ocurrir ocasionalmente es que en el análisis de los ORF los putativos clones positivos del screening de la biblioteca presenten codificación para pequeños péptidos. Esto podría deberse a que realmente pueda existir una interacción con tal péptido, pero en doble híbrido no se tiene registro de cual ha sido el tamaño más pequeño identificado. Además también es posible que la señal de interacción positiva esté siendo obtenida producto de un segundo ORF localizado “rio abajo” y con un mayor tamaño, el cual puede ser fusionado al dominio de activación de GAL4. La solución que se tiene para identificar cual de los dos ORF es el que media la interacción, estos deben ser clonados independientemente para expresar fusiones con el dominio de activación de GAL4 y luego volver a realizar los ensayos. Con respecto a los experimentos de precipitación por afinidad con GST quedó pendiente realizar los ensayos con previa estabilización de los complejos proteicos mediante entrecruzamiento con DTBP. Esto parecía ser una buena estrategia y una posibilidad para detectar interacciones de GBF1, por los resultados obtenidos durante la directa detección de complejos por entrecruzamiento y visualización en geles de SDS PAGE. También quedaron pendientes los experimentos precipitación por afinidad con la mutante ∆ NAP de GBF1, la cual fue construida previamente en otro trabajo de tesis del laboratorio. Esta mutante atrapa a GBF1 en complejo abortivos, y se encontraba marcada con Hisx6. Además, y aunque no estaba originalmente contemplado podría haberse realizado la búsqueda dirigida para comprobar la interacción de GBF1 con Snapin y Hrs. 91 5.5 Publicaciones paralelas de interacción proteína- proteína con GBF1 Previamente fue mencionada la interacción de GBF1 con el factor de transporte de membranas p115 (Garcia- Mata et al., 2003), y también la nueva interacción con Rab1b, esto en el contexto de los mecanismos de asociación a membranas de GBF1. La interacción entre GBF1/ p115 fue descubierta utilizando el sistema de doble híbrido en levaduras, en el cual se empleó a p115 de ratón como carnada para el screening de una biblioteca de cDNA de riñón de ratón (Garcia-Mata et al., 2003). Esta interacción también fue comprobada por pruebas de purificación por afinidad con GST y coinmunoprecipitación. La interacción con p115 fue mediada por la región rica en prolina de GBF1. La GTPasa Rab1b está involucrada en el reclutamiento de los mantos proteicos de tipo COPI y la interacción con GBF1 fue confinada en la región N-terminal de éste (Monetta et al., 2007). Para los ensayos de purificación por afinidad utilizaron las fusiones GST- GBF1 (1-380 aa), GST-GBF1 (1430-1859 aa) y GST- Rab1b, las que fueron expresadas y purificadas en la cepa de E. coli BL21. En estos ensayos primero observaron la unión de GBF1 a GST- Rab1b cuando se cargaba con el análogo no hidrolizable GSTγS, y débilmente con GDP. Luego realizaron los ensayos con las fusiones GST- GBF1 de la región N-terminal 1-380 y con los últimos 429 aminoácidos de la región C-terminal de GBF1, donde Rab1b fue recuperado solo con la fusión Nterminal de GBF1, comprobando la interacción y determinando la región de interacción. Adicionalmente fueron publicadas nuevas interacciones de GBF1 con las proteínas GGAs, con la proteína 3A de piccornavirus y una interacción por homodimerización de los dominios de GBF1 DCB (Dimerization and CyclophilinBinding) y HUS (Homology Upstream of Sec7). Para la interacción con GGAs (Lefrançois et al., 2007), realizaron ensayos de coinmunoprecipitación con fusiones 92 GFP- GGA1, GFP-GGA2 y GFP-GGA3 expresadas en células Hela, y utilizando anticuerpos anti GFP detectaron la unión de GBF1 a estas tres formas de GGAs. Luego realizaron los ensayos de coinmunoprecipitación con la fusión YFP- GBF1, con interacción positiva para GGA1, GGA2 y GGA3. Luego mediante doble híbrido utilizaron como carnada GAL4 BD- GGA1 y como presas las fusiones del dominio GAL4 AD con el dominio N-terminal y C-terminal de GBF1 (que excluían el dominio catalítico Sec7), resultando en una interacción positiva entre GGA1 y el dominio Nterminal de GBF1. Las interacciones por homodimerización (Ramaen et al., 2007) en GBF1 fueron descritas a través de los dominio DCB y HUS, localizados en la región N-terminal sobre el dominio Sec7, identificando interacciones de tipo DCB- DCB y DCB- HUS. Para esto se emplearon técnicas bioquímicas y doble híbrido. En los ensayos de coinmunoprecipitación emplearon la forma marcada HA-GBF1, GBF1∆ DCB (deleción de los primeros 297 aa) y GBF1 ∆DCB-HUS (deleción de los primeros 710 aa). Este tipo de interacciones también fueron identificadas para BIG1 y BIG2, proponiendo una posible regulación para la activación de Arfs. La interacción de GBF1 con la proteína 3A de enterovirus fue localizada en la región N-terminal de éste (Wessels et al., 2006). La proteína 3A inhibe el proceso de secreción entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi. La proteína 3A es una pequeña proteína de membrana no estructural e hidrofóbica, varias mutaciones en ella producen defectos en la replicación viral de RNA, pero el proceso de inhibición ha sido descrito no ser necesariamente requerido para la replicación en cultivos de tejidos celular, sino que tendría importancia en la evasión de la respuesta inmune. Los resultados de este trabajo de tesis no pudieron concluir en la identificación de una nueva interacción proteína- proteína para GBF1, no por resultados negativos en 93 base a la hipótesis de trabajo, estrategias, metodología o el desarrollo de trabajo práctico, sino por imposibilidad de continuar los últimos experimentos. No es posible afirmar que en los clones obtenidos en doble híbrido realmente existía un par de interacción real, o que dicha interacción tendría importancia funcional, porque estos debían ser confirmados, lo mismo es aplicado para los experimentos precipitación por afinidad con GST. Tampoco es posible ahora saber si realmente ante la eventual posibilidad de haber continuado se hubiese tenido finalmente éxito en la búsqueda de interacciones proteicas. Independientemente, este trabajo de tesis fue finalizado, respaldado y defendido con el análisis de estos resultados parciales, y la especulación de un hipotético resultado positivo o negativo. Paralelamente la hipótesis planteada es de cierto modo apoyada por las últimas interacciones. Estas nuevas interacciones permiten otorgan nuevas funciones a otras regiones de GBF1 distintas al dominio catalítico Sec7 de GBF1, que originalmente eran totalmente desconocidas. Pero aún no es totalmente entendido ni conocido todo el entorno de interacciones proteicas a través de las cuales GBF1 modula su actividad como Arf- GEF, y eventualmente aún pueden existir varias interacciones sin descubrir o confirmar, con especial interés en la putativa interacción con SNAPIN y Hrs. 94 Figura 14. Esquema de las interacciones proteicas de GBF1 publicadas de forma paralela a esta tesis. 95 6. BIBLIOGRAFÍA Allan BB, Moyer BD, Balch WE. Rab1 recruitment of p115 into a cis-SNARE complex: programming budding COPII vesicles for fusion. Science. 2000 Jul 21; 289(5478):444-8 Alvarez C, Garcia-Mata R, Brandon E, Sztul E. COPI recruitment is modulated by a Rab1b-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 2003 May; 14(5):2116-27. Alvarez C, Fujita H, Hubbard A, Sztul E. ER to Golgi transport: Requirement for p115 at a pre-Golgi VTC stage. J Cell Biol. 1999 Dec 13; 147(6):1205-22 Amor JC, Harrison DH, Kahn RA, Ringe D. Structure of the human ADPribosylation factor 1 complexed with GDP. 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Secuencia mRNA de GBF1: ..GAG GCC ATT GTG CAG CTC TGG CGC ATC E A I V Q L W R I Secuencia pGBKT-7: 5` CAT ATG GCC ATG GAC GCC GAA TTC 3` NcoI Secuencia partidor sense: 5`GAG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3`(Nco I) NcoI Fusión GAL4 BD- Carnada 2: ...5` CAT ATG GCC ATG GTG CAG CTC TGG 3 V Q L W 130 • Carnada 3 y 6: amplifican los fragmentos 3577-5577 y 3577-4599 del ORF del mRNA de GBF1 respectivamente. Secuencia mRNA GBF1: ... GCA CAA GAT TTC TGC TTC CTT GTG A Q D F C F L V Secuencia pGBKT-7: 5´…ATG GAG GCC GAA TTC CCG GGG 3` EcoRI Secuencia primer sense: 5`GCA CAA GAA TTC TGC TTC CTT 3` (Eco RI) EcoRI Secuencia fusión: ´…ATG GAG GCC GAA TTC TGC TTC CTT …3` C F L • Carnada 5 y 8: amplifica el fragmento 820- 1716 del ORF de GBF1 Secuencia mRNA GBF1: CCC ACT CCC ATC TCC TCT GCA P T P I S S A Secuencia pGBKT-7: 5` CAT ATG GCC ATG GAC GCC GAA TTC 3` NcoI Secuencia primer sense: 5`CCC ACT CCC ATG GCC TCT GCA 3` (NcoI) NcoI Secuencia fusión: 5` CAT ATG GCC ATG GCC TCT GCA 3` S A • Carnada 7: amplifica el fragmento 4446 – 5577 del ORF de GBF1 Secuencia mRNA GBF1: GAC GAA GGC GTG CCT GCC AGC TAC CAT D E G V P A S Y H Secuencia pGBKT-7: 5´…ATG GAG GCC GAA TTC CCG GGG 3` EcoRI Secuencia partidor sense: 5`GAC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3` (Eco RI) EcoRI Secuencia fusión: GAL4 BD-ATG GAG GCC GAA TTC GTG CCT GCC AGC 3` V P A S 131 7.2 Secuencia de GBF1 utilizada para análisis de construcciones carnadas (Homo sapiens golgi-specific brefeldin A resistance factor 1 (GBF1), mRNA.Accession NM_004193, PubMed.) 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 gacagggaag agtcccaccc gctaccagag gcggctgccg atggtggata aaacgaaatg catagtttcg cccaatgtat atcactggac acccatgagg tttgtgggca cggactctgc atgcagtctt gcagagcaca gaagaaccca atgagtgatt accaaagtca ctcactggtg gctgcctcag acttccaagg acagagcctg catgtggaaa acgtcccctg cggggcgtgc cttccctgca cataactcag gcccctgtag ttattccagc ttcctactgt aagcttatgg gcactggagg aactatgatt aagaatgcct ctattgacag acccagcaag gaagctagca atcccaggcc tgcagtgatc ccccgatttt aagctgctaa ctgcaagaga cgagagaacc attgacctgt gccctccgcc ttgctggagg gatgcctgct aatgttcgta gtgaatggag aatgaggaaa aatgtgctgc agctatgatc gtctttgaca tgcgccatga ctatgcaaat agcaacccta gacatcctgc caactactgc tctctacagc agctggctaa caagaggcca gtacccggct tgacttcagc ccgggagagc gtcctgggac agaatattta cccgatggag gtcatctaaa tccttcgacc tggcactcac gcacagcaga cggatcctgc tgctaacccc gcttccggat ctctcgtaga agaactatgt catccaaatg caccaggttc gcatgccctt cagtggtcag aagaccttac gaagcagtga agtcccagtc ccgaccactc gctttacaca tccgcgagct aggttatgat cccagtgcca tactcagcat ttgagagcat agatcatcac ccattgtgca gtgactacta tccctgtgtc tgattgacag agaagaagga atactgagag tgcatctgcc tggaggaagc cctgtctcct tcactggcac aaggcctcct ctcggctgga tggagagctt tctacctgga cattcacaga tttccctggc aacagaatgc gcaaggactt ttgtaatgcc ttcatcgagg ttgacctctt aaagccttga tctccgccca tcacagctct aagcccatat gggagggctg ccaaggctat gggaagagac cactgagtgg agagagtggc ctactgcccg ctcaatttcc tgctcggaga taggccccgc catcattcaa cacccataca ggaggtttta ttttctggaa ctctgtcaac gggcatggag cagtgatgaa agtgggtgcc ctgctttgaa catggtgcag ggggaccaac gaagaaacag agagctgccc cattgatgtg tccctctaca tgatctagag gctaggtgtt agcatctgtg tgactctgcc gtcctcccag cttccgcttc tcacatggga gaccctcttg agagcgacta gcgagagcac tgtggagaac gctctggcgc ctgttccaac tggtcaactc caccgaggcc gacagccaga aactgccagc aggtggaggg tgttgactct gccagatcca agagcagttc caccatccca caagaagatg tgtgagcacc agccttccgt gcgttggatg ctatgctgtc acccatgacc tgagcaagac tgaggagcag tgccacccct caccatgacc ggagacaatc ctatggcctc cagcagtgag tgcagccaag gaagaatatc gatagaggta accatcaaac tcctgagcag cttagagtgt tcccggacga aggaaacagg cgcctccggg cattttggat ggggagatta ccactggatg aacagtataa gtgattcgct aagttcctgt aacatggcag gttgtcctga cacctaacca atgaggctca ctgctcttca atgaagaagc aagagatccc actcccaatg cccactccca gacagtggcc caacctggct cccgagcagc gagtccatcc tctgtccatg aaagaaggca ctcatctccc ctgcatttgc ggcctcatca aacctttatg ctcaagttcc cccaagatgc atccccagct ctctttgagg tatacaacac cactgccagg ccaagctgtg gatgggaaag cggctgccac ggggctgaca cgggaactaa aatcagaaac atggacaaca attggagagt ttcagttttc ttgcctgggg aattgtaatg atcatgctta ctggaggagt atcctggagg acaggcttgg gagggcatat tggggcccca atccagaaag agcgatgtgt tctattgaga acagtattcc atggaggcca gaagatttcg cgaggagagt tctagtgttc ataaagcaat ctcatcctgg ctccttctct gtgcgggctg ccgctgacag acattgtggt aagaacggga cagaactctc ctgaagatac cctatgcact atgctgtcac tgaaaatcct atgaatctgt gtgagttatt caaggttacc tgaaaatgag ctcggccccc gaaccacctt tctcctctgc tggaattctc ctccagggta ctgacctcca ctgaagtgtt acatggatta cagctttggt tcaccaatcc tgacagtggc aggatgagat ctgcttccct aaatggagat cttatgagat ttgtcacaga aactcacaaa acctactatc ctaaagtcct agatagtaga ctgtaggcat cagaacatgg aaaagtttgc ttgaaattaa caaagaaggg cagaggttgc ttgtgagtga agggtctgcg aagcaccagt gctccccatt atactgacca ttcgcaaaaa acatgtacca ttcgggagaa tcctgcgtgt ctattgctgc ccatctcagg ttgacaatct acctgcccag atttggccca tgctgcagct tggatcccaa caacagtgct ggggcccatc gtgacccaga cggactgtgc tctcccatct gacatgagca gtttgccaag tggggccatc tcctctgctg agaaattgag cactggccct catagatccc ccatgctcgt tcaggttcta gtgtgagatt gagaaaatcc tcagtttaaa agccggaggc acgccatatg atcatctaac aagttcagaa ctcccaaacc cagcacagct ggaagggacc agaggagtgc cgtcaatccc cccctatggt acacgaccgc ccttgagtca gtgccgtcac gcgagtatgc gtacatcaaa gaaggagatg gctctacatc gctgctgtcc tcttgatgcc caacagcctc tggcacccga ggcctcagac gaaatcagga ccggaagcca aaacaaaaag gattcagttt tcagtggctc ccgcaaaaac actggacgaa catccagagg tgccaatagc gcacaaccac tctgaaaggt tgccatcaag ctatgtgtgg gcctactgcc tctctcttat cttcaggaag catcatctct tgtatttgga tcgtcatggt cttccgagcc tggcaagatc gagctttgtg cactgaaaac aaaaatgatc 132 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 acagaaagca gtgacaccag ctaaggattg catctatacc gtggggttgc ctgctctccc caggttgcgt gatgactggg gctgctctgc gagctcccat gaggtctaca gtggtcaaca cccagccgcc ttggggccac cgtgatgctg tttgtggagg aaatatgaca cggcctcgaa gaaggcgtgc ctgatgcaca cgccacctgg tgctggtgcc cggatgcagg gatgccctgg ttggagaaca acattgctct gcggccctct gacttactgt gcggagattt acctgggaac gtcatccagg ctgacttccg tctgagctgg tccccaggat ccacccttgg gtgccaccta gtgcccctcc ggcaggtcac tggctgtcct ggatggggac ggaccttttt gtcatctgca tgcagtgcct cccactccca tcagtttgga tgcccacagg taaatgtctt agttcctcca atgaagagac tgttggagaa acctctgtgt tacgcctggc tgcgcatttt atgggctcca ccacactctt aggccacagc cctaccatca ctgaccatgg gtggttggtt caggcccttc acgacactaa cccacatcac ccagtctgaa gcaaagggaa cctccagcca ctgccagcta ccctgcacac agacaggtgg ctttactgca cactgaccta aatgggagtc tcagccctgc ctaaggtctt ggctcaccat cagaggcgat tccacagtgc gcattgactg accccatgcc ctgctggcga gggcctgtga caccagtggc ctcagccccc tgactctgcc tggccacacc tcagagatca gcgggccaca ctgaaaaaga cctcctctgc gcctctgcct gcccacggtc ttagccctgg gagttgactg agcatgtaca agtacc gctggagtca atatgatgag cagggatcgt tcaggcacaa cattcggctt gctactgatg tgaactcctg cacactgctg cagggcagat gaatgacgtg caggccgggc agtggttggg acccctgatc gtctctgctt acctgacaac tggcggatgc ccgcttcaag acatgcctct ccatacggtg gcgggcagcc ccagaagatt gggtattgcc tctgcagcga ctgttttaac agatgtgggt cctgcagcac cttggacttc ccctgagtct agatgcacgg ttttctccct catggagcct cactaggaca ctttgagaag ctcaagcccc actgatcctg catcatcctc 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tcatcgaggc ccacctctga gctttccttg agctgctgtt aagaccccca gcctgagagt aggcatccgt aaccactctg ctcttttact gtgggggctg gtggactttt tctggtctca agagatgctg tgttcgagac gcgggcagtg tgctcaggtg agtcagccac ccactcaggt gaagcctcca gtcagatagt ttccgactca agatgccgat caagccaggg gggactggat cttcatcgtg tctccggatc caagagtcac aatgcttcgc tgatgaggac cttgctagac ggaggagcaa ctgggcccac gcgccaggta gcaaaagcta taccaagctc gagggcttcc ctctaccttt aggctccagc gatggacaca ctgggagatc caagcagacc ctcagcccac agagattcca cagcagcagc cgacgggcct gcaggtgggc cacctcacca ggtcaactaa accccacttc gctgccactt atcagctgtg gaactcagct gtgccggccc cactttgttt aattagttgg ggtgggggac tatgatataa 133 7.3 Construcciones reporteras del sistema doble híbrido En levaduras la expresión de todos los genes estructurales está controlada por la región promotora mínima TATA box, y por elementos reguladores- cis. En levaduras las secuencias TATA determinan el sitio de inicio de la transcripción como también el nivel basal de trascripción. Las secuencias TATA son poco conservadas y se encuentran a 25 pb río arriba del sitio de inicio de la transcripción, aproximadamente. Las secuencias reguladoras UAS (upstream activating sequences) son un tipo de elementos reguladores actuando en –cis, estas secuencias son reconocidas por los factores activadores de la transcripción y de este modo potencian la actividad de las cajas TATA. En el sistema de doble híbrido se utilizan construcciones reporteras en forma de casettes transcripcionales que contienen la secuencia UAS, la región promotora mínima TATA y el gen reportero. Los genes reporteros utilizados son ADE2/HIS3, LacZ y MEL1. Estas construcciones han sido insertadas en el genoma de las cepas de Saccharomyces cerevisiae AH109 e Y187 que serán utilizadas para la transformación de las construcciones híbridas “carnadas” y “presas”. Luego por cotransformación o por apareamiento de levaduras (mating) las construcciones híbridas GAL4 BD-carnada y GAL4 AD- presa serán expresadas en la misma cepa reportera o diploide. • Construcciones reporteras en AH109 GAL1 UAS GAL1 TATA HIS3 GAL2 UAS GAL2 TATA ADE2 MEL1 UAS MEL1 TATA lacZ MEL1 UAS MEL1 TATA MEL1 • Construcciones reporteras en Y187 GAL1 UAS GAL1 TATA lacZ Figura 15. Construcciones reporteras de las cepas AH109 e Y187 134 7.4 Genes reporteros y marcadores de selección utilizados en el sistema doble híbrido en Saccharomyces cerevisiae El sistema de doble híbrido Matchmaker Gal4 two Hybrid System3 utiliza los genes reporteros ADE2, HIS3, LacZ y MEL1, y los marcadores de selección nutricional para transformación en las cepas de Saccharomyces cerevisiae Trp1 y Leu2. TRP1 gen que codifica para la enzima Fosforibosilantramilato isomerasa que cataliza el tercer paso en la biosíntesis del triptófano. Las cepas mutantes Trp− (trp1901) requieren la suplementación de triptófano en el medio de cultivo. Este gen es utilizado como marcador nutricional para la selección de trasformantes en Saccharomyces cerevisiae que portan el plásmido pGBKT7 con los clones de las construcciones “carnadas”. LEU2 codifica para la enzima Beta-isopropilmalato deshidrogenada que cataliza el tercer paso en la vía de biosíntesis de la leucina. Las cepas mutantes Leu− (leu2-3, 112) requieren leucina en el medio de crecimiento y LEU2 en utilizado como el marcador de selección nutricional para la trasformación en Saccharomyces cerevisiae con el vector pACT2 que contiene las construcciones “presa” de la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano. HIS3 gen que codifica para la enzima Imidazolglicerol fosfato dehidratasa, la cual cataliza el sexto paso en la biosíntesis de histidina. Las cepas mutantes His− (his 3200) requieren de histidina como suplemento en el medio de cultivo. HIS3 es utilizado como un gen reportero para la selección de clones de interacción bajo la regulación de la secuencias GAL1UAS y GAL1 TATA. ADE2 Fosforibosilaminoimidazol carboxilasa, cataliza un paso en la síntesis de novo de nucléotido de purina, un pigmento rojo es acumulado en células deprivadas de adenina. Los mutantes Ade− (ade2-101) requieren de adenina en el medio de cultivo. 135 ADE2 es empleado como un gen reportero en el sistema de doble híbrido al ser insertado como un casette de regulación bajo las secuencias GAL2 UAS y GAL2 TATA. En la cepa AH109, la mutación ade2-101 fue realizada en la cepa precursora PJ69-2A, donde fue reemplaza con la construcción reportera GAL2-ADE2 por recombinación. MEL1 codifica para la enzima alfa- galactosidasa, la cual es secretada. MEL1 es utilizado como un gen reportero que se encuentra bajo la regulación de las secuencias MEL1 UAS y MEL1 TATA. La expresión de este gen es detectada por el ensayo de alfa galactosidasa en placas con el sustrato X- α-Gal. LacZ permite expresar la enzima beta- galactosidasa. Es utilizado como un gen reportero controlado por las secuencias MEL1 UAS Y MEL1 TATA. La construcción reportera de LacZ fue integrada al genoma de Saccharomyces cerevisiae por recombinación homóloga en la mutación ura3-52. La actividad de la enzima beta galactosidasa es ensayada por la capacidad de actuar sobre el sustrato cromagénico Xgal. Ya que la enzima B- galactosidasa no es secretada, los ensayos para determinar la actividad son realizados en filtro por permeabilización a través de un ciclo congelamiento /descongelamiento en nitrógeno líquido, las cepas de Saccharomyces cerevisiae LacZ+ producirán colonias de color azul, mientras que las cepas LacZ− se mantendrán como colonias blancas. URA3 codifica para la enzima 5- fosfato decarboxilasa, la cual participa en la vía de síntesis de ribonucleótidos de pirimidina.