MOMENTOS DE Universidad de la AMAZONIA Momentos de Ciencia 7:(1), 2010 CIENCIA Caracterización física, química y sensorial de la hoja de Stevia rebaudiana (var. morita II) cultivada en tres paisajes del Caquetá (Colombia) Wilson Rodríguez-Pérez1,*, Diana Cristina Perdomo-Giraldo2, Israel Sánchez-Ortiz2, 3 2 Gelber Rosas-Patiño , Carmen Dolores Bedoya de Muñoz 1 Grupo de Investigación en Biotecnología y Control de Calidad. Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá). Colombia. 2 Grupo de Investigación Produciendo. Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá). Colombia. 3 Grupo de Investigación en Geociencias. Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá). Colombia. Recibido 19 de Enero de 2010; aceptado 4 de Mayo de 2010 Resumen En los laboratorios de química de la Universidad de la Amazonia (Florencia-Caquetá, Colombia), se estudiaron las características físicas, químicas y sensoriales de las hojas de Stevia rebaudiana cultivada en tres tipos de paisajes (montaña, lomerío y vega) del municipio de El Doncello (Departamento de Caquetá, Colombia). El mayor rendimiento de extracto se obtuvo de las hojas obtenidas en el lomerío (6,5 %). Los extractos glicosídicos fueron solubles en agua por un período de 14 d a temperatura ambiente y luz natural. Se determinó un 80,85 % de clarificación usando carbón activado al 4 % durante 60 min, en el caso de extracto acuoso de muestras obtenidas en montaña y lomerío, y de 120 min para el extracto acuoso de las muestras colectadas en vega. El valor de pH de los extractos acuosos y del extracto glicosídico de las tres localidades es ligeramente ácido. El valor de grados Brix varió entre 7 y 12, para los extractos acuosos, y entre 39,9 y 40,4 para el extracto glicosídico. La determinación de carbohidratos totales por el método de antrona reportó variación entre 7,2 a 16,1 %, por el método de fenol sulfúrico entre 36,4 a 52,8 % y por el método de Lane Eynon entre 21,7 a 22,2 %. El análisis fitoquímico preliminar de las hojas registró presencia de: compuestos reductores, esteroles o triterpenos, glicósidos cardiacos, saponinas y taninos en los tres casos. El análisis proximal de las hojas reportó los siguientes valores: humedad (3,16 a 10,35 %), proteína (14,22 a 15,59 %), extracto etéreo (2,03 a 2,17 %), cenizas (8,57 a 9,64 %), fibra (3,12 a 7,28%) y carbohidratos 46,8 a 58,5 %. Los extracto acuoso obtenidos a partir de hojas colectadas en el lomerío fueron significativamente más edulcorantes (P < 0,05) que los extractos preparados con hojas obtenidas en vega y montaña, mientras que el extracto glicosídico de las muestras colectadas en la montaña fue significativamente más edulcorante (P < 0,05) que los extractos de las muestras obtenidas en lomerío y vega. © 2010 Universidad de la Amazonia. Todos los derechos reservados. Palabras clave: Stevia, glicósidos, análisis proximal, análisis sensorial, carbohidratos. Abstract At the chemistry labs of the Universidad de la Amazonia (Florencia-Caquetá, Colombia), physical, chemical and sensorial characteristics of Stevia rebaudiana leafs harvested in three landscapes (mountain, mildly sloping and flooding planes) within the Municipality of El Doncello (Department of Caquetá, Colombia), were studied. The leafs collected from the mildly sloping landscape showed the highest yield of extract (6,5 %). Glycosidic extracts were miscible in water during 14 d at environmental temperature and sunlight. A clarification of 80,85 % was determined by using activated charcoal at 4 % during 60 and 120 min, for aqueous extract of leafs collected from mountain and mildly sloping, and flooding plane landscapes, respectively. The pH values of both aqueous and glycosidic extracts of leafs from all the three landscapes were slightly acidic. The Brix degree values ranged between 7 to 12, 39,9 to 40,4 for aqueous and glycosidic extracts, respectively. Variations of total carbohydrates between 7,2 to 16,1%, 36,4 to 52,8 %, and 221,7 to 22,2 % were determined by using anthrone, phenol-sulphuric acid, and Lane Enyon methods, correspondingly. Preliminary phytochemical analyses revealed the presence of reducing compounds, sterols or triterpenes, cardiac glycosides, saponnins and tannins in all cases. The proximal analysis showed data of moisture, protein, fat, ash, fiber and carbohydrates ranged between 3,16-10,35, 14,22-15,59, 2,03-2,17,8,57-9,64, 3,12-7,28 and 46,8-58,5%, in that order. Both aqueous and glycosidic extracts obtained of leafs collected from mildly sloping and mountain landscapes, respectively, were significative (P < 0,05) more edulcorant than the other samples. © 2010 Universidad de la Amazonia. All rights reserved. Key words: Stevia, glycosides, proximal analysis, sensorial analysis, carbohydrates. Introducción múltiples productos alimenticios, proporcionan calorías que pueden llevar a obesidad, un factor de riesgo para algunas enfermedades crónicas como Los azúcares, aparte de ser endulzantes de * Autor para correspondencia. E-mail: wisonrod@hotmail.com 57 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 sición proximal, contenido de minerales y realizaron un análisis fitoquímico preliminar de S. rebaudiana, de la India y se reportaron los siguientes valores: proteína (20,42 %), grasa (4,34 %), carbohidratos (35,2%) y ceniza (13,12%) en peso seco. El análisis mineral mostró alto contenido de K, Ca, Mg, P, Na y S. El análisis fitoquímico reveló alto contenido de taninos, seguido por alcaloides glicósidos cardíacos, saponinas, esteroles, triterpenos, agentes reductores y antraquinonas. Tadhani et al. (2007) analizaron extractos acuosos y metanólicos de S. rebaudiana en cuanto a su contenido de fenoles, flavonoides y capacidad antioxidante total de hojas y callo (FRAP y DPPH). El contenido de compuestos fenólicos totales fue de 2,18 mg.g-1 para hojas y 35,86 mg.g-1 para tallo (peso seco). El contenido de flavonoides fue de 21,73 y 31,99 mg.g-1 en hojas y tallo, respectivamente. La actividad antioxidante total fue expresada como mg equivalente de ácido gálico, ácido ascórbico, hidroxianisol butilado (BHA) y trolox por g en base seca. Actividad antioxidante total encontrada fue entre 9,66 a 38,24 mg y 11,03 a 36,40 mg equivalentes, a diferentes estándares, en hojas, extractos acuosos y metanólicos de respectivamente. En el caso de tallo, los valores registrados oscilan entre 9,44 a 37,36 mg para extracto acuoso y 10,14 a 34,37 mg equivalente a están da res para extracto met a nó-lico. La concentración requerida para una inhibi-ción del 50 % (IC50) de radical DPPH fueron 11,04, 41,04 y 57,14 mg.ml-1 para ácido gálico, trolox y BHA, respectivamente. El porcentaje de inhibi-ción del radical DPPH de varios extractos de hojas y tallo encontrados, variaron entre 33,17 a 56,82 %. El porcentaje más alto de inhibición fue observado en el extracto metanólico del tallo. Savita et al. (2004) realizaron análisis proximal, contenido de minerales y análisis sensorial de hoja de S. rebaudiana cultivada en India. Se encontró que un gramo de S. rebaudiana es tan edulcorante como 20 g de sacarosa y produce más de 40 s de resabio, el análisis proximal indicó un aporte de 269 Kcal, 9,8 g proteína, 10,5 g ceniza y fibra cruda 18,4 g. El contenido mineral mostró altos valores de Ca, Fe, Na y K acompañado de alta cantidad de ácido oxálico. Las propiedades funcionales de S. rebuadiana también fueron estudiadas, tanto como s u comporta m iento al almacenamie n to e n formulaciones y finalmente se evaluó el índice glicémico. La clarificación de un extracto de S. Rebaudiana es un aspecto importante ya que proporciona diabetes mellitus, hipertensión y enfermedad cardiovascular, entre otras (Savita et al. 2004, Tadhani & Subhash 2006). Esto ha llevado a una búsqueda permanente de agentes endulzantes alternativos (aspartame, ciclamato, sacarina, sucralosa, acesulfame potasio y estevia), que permitan ofrecer a los consumidores el sabor dulce sin las calorías. Estos agentes endulzantes agregan un sabor similar al de la sacarosa y, sin embargo, son generalmente más endulzantes que esta. No proporcionan calorías, y los que las proporcionan son usados en poca cantidad debido a su propiedad endulzante concentrada (Porto & André 2007). En este contexto aparece la Stevia rebaudiana (Bertoni), una hierba perenne de la familia Asteraceae (Compositae), oriunda del Paraguay y Brasil, cuyo cultivo se ha extendido en regiones del Asia, Europa, Canadá, India y se ha empezado a cultivar en Colombia, inicialmente, en las regiones de Antioquia y Huila. Se han llevado a cabo estudios con la S. rebaudiana y sus especies relacionadas, para evaluar su actividad antimicrobiana (Ghosh et al. 2008), el efecto de la radiación incidente sobre su crecimiento (Jarma et al. 2006), contenido de lactonas sesquiterpénicas en hojas de S. vaga (Hernández et al.1996), elucidación de longipinenos (TorresValencia et al. 1998), estudios de equivalencia de edulcorante (Porto & André 2007), biosíntesis de glicósidos (Brandle & Telmer 2007), toxicidad de rebaudiósido (Carakostas et al. 2008), entre otros. Dentro de los estudios químicos realizados en S. rebaudiana, se han encontrado glicósidos diterpénicos, compuestos de origen natural, estables en un amplio rango de pH y calor. No proporcionan calorías, no son nutritivos, no son fermentables, previenen la caries y placa dental, por lo tanto son de importancia industrial. Dentro de estos, sobresale el esteviósido, principal componente dulce en las hojas de S. rebaudiana, el cual es 300 veces más dulce que la sacarosa (solución 0,4 %). Los componentes dulces de la S. rebaudiana se presentan principalmente en las hojas. Su contenido varía entre 4 a 20 % del peso seco de las hojas, dependiendo las condiciones climáticas. Otros componentes presentes, pero en menor concentración, son: esteviolbiósido, rebaudiósidos A, B, C, D, E, F y dulcósido A. La presencia de esteviolbiósido y rebaudiósido B en extractos puede ser debido a artefactos del proceso de extracción (Geuns 2003, Moraes & Camargo 2001). Tadhani & Subhash (2006) estudiaron la compo- 58 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 rotatorio Laborota 400-efficient, a 50 ºC. Todos los reactivos utilizados fueron grado analítico y el agua utilizada fue desionizada y destilada. El jarabe fue disuelto en alcohol metílico, se separaron las dos fases y se procedió a secar el sobrenadante a 100 ºC durante 24 h, en estufa WTC-binder, p ara obtener un a p r ime r a cristalización. La fase más densa de la primera cristalización fue mezclada con acetona 1:3, con agitación intensa (manual) y secado en estufa WTC-binder a 100 ºC. El extracto seco se disolvió en alcohol metílico y se dejó cristalizar en estufa WTC-binder a 100 ºC durante 24 h, hasta obtener una segunda cristalización. mejor calidad visual al producto final. Moraes & Camargo (2001) hicieron un estudio sobre clarificación de extractos de S. rebaudiana por adsorción selectiva sobre zeolitas modificadas. Los intercambiadores iónicos fueron hechos con iones Bario y Calcio en zeolitas NaX y NaA y el efecto de contacto del extracto acuoso de hojas secas de S. rebaudiana con zeolitas CaX, BaX, CaA y BaA fue evaluado. El extracto de Stevia en contacto con la zeolita CaX mostró la más alta clarificación y no presentó alteraciones de características iniciales en concentración, glicósidos y sabor. En pruebas de lotes a temperatura ambiente, el contacto de extracto acuoso de S. rebaudiana y zeolita CaX proporcionó 70-80 % de clarificación. Una vez que la zeolita puede ser reutilizada o regenerada, es posible una clarificación apropiada de 65-70 %. Sin embargo, es necesario estudiar más la Stevia, sobre todo la que se cultiva en la región amazónica. Por esta razón, se planteó este trabajo, con el fin de evaluar las características físicas (solubilidad, clarificación, pH, grados Brix), químicas (carbohidratos totales, análisis fitoquímico, análisis proximal) y sensoriales (edulcorante) de la hoja de S. rebaudiana cultivada en tres paisajes (montaña, lomerío y vega) del municipio de El Doncello, Departamento de Caquetá (Colombia), con el fin de proporcionar información que pueda servir para fundamentar proyectos de fomento a esta especie en el Caquetá. Análisis físico Solubilidad. Se siguió la metodología sugerida por Goto & Clemente (1998), usando temperatura ambiente (28-32 ºC), durante 30 d, con revisiones cada 24 h. Clarificación. El extracto acuoso de hojas de S. fue sometido a un proceso de rebaudiana clarificación siguiendo la metodología de Moraes & Camargo (2001), sustituyendo el agente clarificante (zeolita) por carbón activado. Se usaron proporciones de carbón activado entre 3,75 y 11,25 %, y se evaluaron por 1 h con agitación constante, con lectura a 420 y 670 nm en el espectrofotómetro Milton Roy 20D+ cada 20 minutos, hasta que la absorbancia fuera constante. Metodología Preparación de la muestra Grados Brix. Para determinar los grados Brix, se utilizó un refractómetro Leica de escala 1-50. Secado. Luego de clasificar el material vegetal, el secado de las muestras se hizo en una estufa WTC-binder, a 50 ºC por 48 h (Vanek et al. 2001). Análisis químico pH. Para determinar el pH, se utilizó un potenciómetro calibrado marca Coorning. Molienda y tamizado. Se siguió la metodología de Goto & Clemente (1998) en molino Thurm DDR/GDR, y se usó tamiz vibratorio Veb MLW Labortechnik hasta un tamaño de partícula de 250 µm (malla 60). Carbohidratos totales: El contenido de carbohidratos solubles del extracto de Stevia rebaudiana se determinó por cuatro métodos: Antrona (Yemm & Willis 1954), Fenol-sulfúrico (Moraes & Camargo 2001), Lane Eynon (Akinci et al. 2004) y análisis proximal (Tadhani & Subhash 2006). Extracción fracción glicosídica En concordancia con el método de Goto & Clemente (1998), se hizo una extracción con agua caliente, luego con alcohol isobutílico, seguido de centrifugación en equipo Zentrifugenbau engelsdorf a 12 000 rpm, posteriormente clarificado con carbón activado y concentrado en un evaporador Análisis fitoquímico preliminar. La determinación de alcaloides, antraquinonas, compuestos reductores, esteroles y/o triterpenos, glicósidos cardíacos y cianogénicos, saponinas y taninos se realiza- 59 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 Análisis estadístico ron siguiendo la metodología de Tadhani & Subhash (2006). Las determinaciones se hicieron con tres réplicas cada una y para la interpretación de los resultados se aplicó un análisis de varianza ANOVA, con ayuda del programa estadístico Statgraphics 4, usando las tablas de Fisher y la prueba de Tukey (Anzaldúa-Morales 1994). Análisis proximal. Para el análisis proximal se usaron varios métodos. La proteína bruta se determinó con el método AOAC 920.53/95, las cenizas con el AOAC 942.05/95, la fibra cruda con AOAC 978.10/95 y el extracto etéreo con AOAC 920.39/95. El contenido de carbohidratos totales se reportó por diferencia (Santos & Pillimue, 2006). Resultados Rendimiento Análisis sensorial Según Goto & Clemente (1998), el material tamizado por malla 60 permite obtener masa soluble del orden del 90-95 %. Al verificar esto en el laboratorio se encontró disolución en 100 %, lo que posteriormente facilitó realizar las pruebas de solubilidad. Sin embargo, el rendimiento de esta fracción de tamizado varía entre el 5 a 6 % del total (Tabla 1). De las muestras obtenidas de los tres paisajes evaluados, las de lomerío presentan mayor contenido de fracción glicosídica, con valores muy similares entre unidades. Comparando los rendimientos obtenidos de la fracción glicosídica en las muestras evaluadas (Tabla 2), se puede ver que son menores a los valores reportados por Goto & Clemente (1998) para Brasil, con un 8 % (base seca) de glicósidos, y Soto y Del Val (2002) para Argentina, con un 5 % (base seca) de estos mismos compuestos. Para este análisis se acondicionó un área de prueba, usando para ello separadores plegables; se seleccionaron 30 jueces consumidores no entrenados (personas tomadas al azar), estudiantes y funcionarios de la Universidad de la Amazonía, (para cada una de las pruebas). Las pruebas se llevaron a cabo en las horas de la mañana (9 AM), procurando que los consumidores no hayan consumido nada durante la mañana. Se suministró aproximadamente 16 ml de cada una de las muestras a una temperatura de 60-66 ºC aproximadamente, con el fin de determinar la preferencia y el ordenamiento. Prueba de preferencia: Se suministró tres muestras que diferían en la concentración patrón de -1 sacarosa (10, 15 y 20 g.100-1ml ) y se solicitó que indicarán la muestra de su preferencia. Para la interpretación de los resultados se hizo una apro-ximación similar al análisis descrito por Anzal-dúa-Morales (1994). Se tuvieron en cuenta los valores del poder edulcorante de hojas de S. rebaudiana 12,5, y del extracto purificado 250 (López & Vargas 2005). Análisis físico Solubilidad. En el caso de las muestras del paisaje de mont a ña , las distint a s proporci o nes preparadas de la fracción metanólica y de acetona, fueron todas solubles en agua hasta por un período de catorce días a temperatura ambiente y luz natural. Similar situación se presento con las muestras provenientes de lomerío y vega, en éste último caso soluble hasta 15 d en las proporciones 85-15 % y 90-10 %. Sin embargo, se empieza a observar separación de material verdoso de la mezcla homogénea después de 15 d, lo cual se podría racionalizar en términos de cierta solubilidad de pigmentos verdes en metanol (índice de polaridad 6,6) y acetona (índice de polaridad 5,4) en el proceso de purificación, que luego se separan del agua (índice de polaridad 9,0) en la cual se hacen las mezclas (Tablas Merck). Por lo tanto, los resultados Prueba de ordenamiento. Con los resultados de la prueba de preferencia se estableció una relación entre sacarosa y el poder edulcorante de la S. rebaudiana (hojas y extracto glicosídico), con la concentración de sacarosa de mayor preferencia. Se le solicitó a quienes sirvieron de jueces que probarán tres muestras (tratamientos) de tisana endulzada primero con las hojas y luego con extracto glicosídico de S. rebaudiana procedente de los tres paisajes objeto de estudio, preparadas a la misma concentración. De la misma forma, se les pidió que las ordenaran de menor a mayor grado de sabor dulce. 60 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 Tabla 1. Parámetros físicos y químicos determinados en hojas de S. rebaudiana cultivadas en tres localidades del Municipio de El Doncello (Caquetá, Colombia). Parámetro Montaña Paisaje Lomerío Vega % % 5 4,4 6 6,5 5 5,1 d % min 14 4 60 6,4 6,5 12 40,1 14 4 60 6,4 6,5 8 40,4 14 4 120 6,6 6,5 7 39,9 % % % 16,1 ± 4,7 52,8 ± 1,7 22,2 15,7 ± 5,2 36,4 ± 2,8 21,7 7,2 ± 3,1 49,3 ± 2,5 21,9 % % % % % % kcal 4,65 15,59 57,53 2,17 8,57 11,49 312,01 3,16 15,06 58,52 2,03 8,84 12,39 312,59 10,35 14,22 46,77 2,10 9,64a 16,92 262,86 + + + + + + + + + + + + + + + Unidad Rendimiento Material particulado de 250 µma Fracción glicosídica Físicos Tiempo solubilidad extracto glicosídico en agua (27ºC) Agente clarificanteb Tiempo de clarificaciónb pH extracto acuosoc pH extracto glicosidicoc Grados Brix extracto acuosoc Grados Brix extracto glicosídicoc Químicos Carbohidratos totales Antrona (627 nm)d Fenol-sulfurico (490 nm)e Lane Eynonf Análisis proximal Humedadg Proteínag Carbohidratos totalesi Extracto etéreoh Cenizash Fibra+cenizah Energía Análisis fitoquímico Alcaloides Antraquinonas Compuestos reductores Esteroles y triterpenos Glicósidos cardíacos Glicósidos cianogénicos Saponinas Taninos a Base seca; b Carbón activado; Clarificación sobrenadante 85 %; 420 y 570 nm; c n=2; d n=10 ± ds, peso seco; e n = 3 ± ds, peso seco; f n=2; n=1; h n=2; (+): Presencia, (-): ausencia. g Tabla 2. Equivalencia edulcorante del extracto glicosídico de S. rebaudiana y sacarosa por cada 100 ml de agua entre las hojas. a c Sacarosa (%) Equivalencia hojas de S. rebaudiana (g) Equivalencia extracto glicosídico de S. rebaudiana (g) Preferenciaa (%) 10,00 15,00 20,00 0,80b 1,20c 1,60c 0,04b 0,06c 0,08c 50,0 31,3 15,6 solo para la solución de sacarosa; b concentración de S. rebaudiana utilizada en las pruebas de ordenación; no se utilizaron en las pruebas de ordenación. 61 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 ligeramente ácidos, pero muy similares entre sí (Tabla 1), evidenciando poco efecto agroclimático de las tres zonas estudiadas sobre el pH del extracto acuoso. Estos valores son comparativamente mayores respecto de la S. rebaudiana de Brasil, con un valor de 5,6 (Moraes & Camargo 2001) y de India con 5,95 (Savita et al. 2004). Respecto a los grados Brix, indicativo del contenido de sólidos solubles, el material vegetal cultivado en montaña presentó el valor más alto, mientras que los datos de lomerío y vega son similares entre sí. Comparado con la S. rebaudiana de Brasil (4,0), se nota que las muestras evaluadas tienen prácticamente el doble de sólidos solubles. En cuanto al extracto glicosídico, las muestras registraron valores cercanos a cinco veces el valor del extracto original. indican que las proporciones usadas tienen solubilidad límite hasta los 14 d. Clarificación. En el caso de las muestras del paisaje de montaña, con porcentajes de carbón activado superiores al 5 % se obtienen extractos acuosos clarificados del orden de 85-90 %, evidenciando el alto poder absorbente del agente clarificante. No obstante, al utilizar un 3,75 % de carbón activado en todas las muestras, no se logró clarificación de la muestra y, por lo tanto, no se puede hacer lectura en las longitudes de onda evaluadas. Es de notar que en el trabajo de clarificación con zeolitas (Moraes & Camargo 2001) se demostró que la masa del agente clarificante fue del orden del 40 %, reportando valores de clarificación del 75 % en el extracto acuoso, con un contenido de carbohidratos totales de 1,6 g.100-1ml-1. En el presente trabajo se utilizó 4 % de carbón activado como agente clarificante, para un porcentaje de clarificación alrededor del 85 % del extracto y un -1 contenido de carbohidratos de 1,22 g.100-1ml (método antrona), demostrando el alto poder adsorbente del carbón activado. En el caso de lomerío, con cantidades superiores a 6,25 % se obtuvo clarificación superior al 81 % pero no superiores al 95 %. Similar situación se observó en vega, donde con un 5 % de carbón activado se logró clarificar el extracto acuoso en un 80 %. Sin embargo, es de resaltar que porcentajes de clarificación como los anteriores indican fuerte adsorción de los compuestos endulzantes, como se pudo verificar en la catación respectiva. Por lo anterior, teniendo en cuenta que trabajando valores superiores al 5 % de carbón activado la muestra es fuertemente decolorada, y empieza a perder el sabor dulce, y que por debajo del 3,75 % no se logra una decoloración medible en las longitudes de onda de trabajo, por lo tanto se seleccionó el 4 % de agente clarificante, como valor de referencia para determinar el tiempo de clarificación. Con respecto al tiempo de clarificación, en el caso de montaña y lomerío, con un tiempo de clarificación de 60 min se obtienen extractos clarificados en un 80-85 %, mientras que en el caso de vega para obtener extractos con este porcentaje de clarificación se requiere de un tiempo de 120 min (Tabla 1). Análisis químico Contenido de carbohidratos totales. Por el método de antrona, el contenido de carbohidratos fue menor en vega y muy similar en montaña y lomerío. Pero, los resultados obtenidos en vega fueron más precisos que los de montaña y lomerío (Tabla 1) . Estos valores son bajos con respecto a los registrados para S. rebaudiana de la India (Tadhani & Subhash 2006), determinados por el mismo método, el cual muestra un valor del 35,2 %, resultado afectado posiblemente por la variación intraespecífica que puede haber entre individuos adicional a las condiciones climáticas, época de Los recolección del material entre otras. resultados del método fenol-sulfúrico son muy ho m ogéneos entre sí, con r especto a sus desviaciones estándar encontradas. Por el método Lane Eynon, los valores de carbohidratos totales también mostraron ser muy similares entre sí, alrededor de 22 % para extractos acuosos. Es de apreciar que la en bibliografía citada no existen reportes de datos obtenidos a partir de esta metodología, para cuantificar carbohidratos totales en S. rebaudiana. Con respecto a los métodos evaluados y registrados en la literatura, se puede observar que antrona y fenol-sulfúrico, basados en la formación de furfural, presentan diferencias considerables entre cada uno de los paisajes evaluados (Tabla 1). No obstante, el método de fenol sulfúrico presenta resultados con mayor precisión entre sí. Es de notar, que por antrona es crítico el tiempo de desarrollo de color dada la inestabilidad del complejo formado y el carácter fuertemente apolar de pH y grados Brix. Los extractos acuosos de S. rebaudiana de los tres paisajes tienen valores de pH 62 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 la antrona (Yemm & Willis 1954). Respecto de los otros dos métodos, la valoración por análisis de azúcares totales usando reactivo de Fehling (método de Lane Eynon) mostró valores similares entre sí, y más cercanos a los resultados obtenidos por el método de antrona. Sin embargo, se necesita buena habilidad para establecer el punto final durante la valoración en caliente, dada la interferencia que proporciona el color del extracto en la determinación del contenido de carbohidratos. observó que el 50 % de los jueces prefirieron la solución de sacarosa de 10 % como agente endulzante (Tabla 2). A partir de este porcentaje de sacarosa preferido por los encuestados y el poder edulcorante de la S. rebaudiana (López & Vargas 2005) se obtuvo una relación teórica, en la cual con 0,80 g de S. rebaudiana y 0,04 g de fracción glicosídica se endulzó 100 ml de agua, equivalentes a una solución acuosa de sacarosa al 10 % p/v. Prueba de ordenación. El extracto acuoso elaborado a partir de hoja de lomerío presentó un grado de dulzor mayor estadísticamente significativo con respecto a los extractos acuosos preparados con hojas de vega y montaña. De forma similar los extractos de vega y montaña no presentan diferencias significativas entre sí. El extracto de las hojas de lomerío fue para los jueces el más dulce (P < 0,05) con respecto a los otros dos (Tabla 3). La fracción glicosídica de la S. rebaudiana de mo n ta ñ a tiene e s tadísticame nt e un e f ecto significativo (P < 0,05) sobre las unidades de lomerío y vega, en cuanto a sus propiedades edulcorantes, mientras que entre los dos últimos la diferencia no es significativa (Tabla 4). Análisis proximal. El contenido de carbohidratos totales en las hojas de S. rebaudiana está alrededor del 50 % (Tabla 1). Un valor similar al reportado por Savita et al. (2004) de la S. rebaudiana de la India (52 %). Comparando con los datos del análisis proximal de S. rebaudiana de dos estudios de la India (Savita et al. 2004, Tadhani & Subhash 2006) se observa que la S. rebaudiana analizada en este trabajo tiene un contenido medio de proteína (10 a 20,42 %), similar al de vega, similar en grasa, menor para cenizas, y mucho menor para fibra. Como se ve hay una variación importante en el resultado del contenido de carbohidratos totales según el método aplicado. El método de fenolsulfúrico, parece ser el método más adecuado, ya que los reactivos y muestras son solubles en agua, lo que facilita la lectura espectrofotométrica. Se basa en una deshidratación en un medio fuertemente ácido de los azúcares, lo que garantiza su degradación total (mono o disacáridos) a furfural y es más estable el complejo formado, además se trabaja en frío (Moraes & Camargo 2001). Conclusiones Para las muestras obtenidas de las unidades de paisaje de montaña, lomerío y vega se obtuvieron rendimientos de la fracción glicosídica de 4,4, 6,5 y 5,1 %, respectivamente. Los extractos glicosídicos, en cualquiera de las proporciones evaluadas, fueron solubles en agua hasta por un periodo de 14 d a temperatura ambiente y luz natural. El carbón activado, usado como agente clarificante, se debe usar al 4 % para extractos acuosos de Stevia rebaudiana de las tres unidades de paisaje evaluadas. En tanto que, la clarificación se debe dejar mínimo 60 min, para lograr un valor de clarificación de 80-85 % (en el caso de extractos de muestras de montaña y lomerío) y de 120 min para el extracto de muestras de vega. El valor de pH de los extractos acuosos y el extracto glicosídico de las tres unidades de paisaje varió entre 6,4 y 6,6. En cuanto al valor de grados Brix varió entre 7 y 12, para los extractos acuosos, y entre 39,9 y 40,4 para el extracto glicosídico. La determinación de carbohidratos totales por el método de antrona reportó variación entre 7,2 y 16,1 %, por el método de fenol-sulfúrico entre 36,4 y 52,8 %, por el método de Lane Eynon entre 21,7 y Análisis fitoquímico preliminar. Las hojas de las muestras obtenidas en el paisaje de montaña, lomerío y vega contienen esteroles o triterpenoides, glicósidos cardíacos, saponinas, taninos y compuestos reductores. Con respecto al estudio realizado por Tadhani & Subhash (2006) en las hojas de S. rebaudiana de la India, es común el contenido de compuestos reductores, esteroles y triterpenos, glicósidos cardíacos, saponinas y taninos. Una posible interferencia en la prueba de taninos es la reducción del hierro (III) del FeCl3, sin embargo se ha reportado pres e ncia de c o mpue s tos fen ó li c os en S. rebaudiana de la India (Tadhani & Subhash 2006). Análisis sensorial Prueba de preferencia. En la prueba de preferencia se 63 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 Tabla 3. Análisis de varianza de la prueba sensorial para el extracto acuoso de las hojas de S. rebaudiana. Fuente de variación Tratamientos Jueces Residual Total Grados de libertad 2 29 58 89 Suma de cuadrados 31,76 43,82 22,91 98,49 Varianza estimada 15,88 1,51 0,40 17,78 F calculado F tabulado 40,19 3,83 3,158 [F(2,5; 5 %)] 1,402 [F(29,58; 5 %)] Nota: El 89,3 % de la varianza total es explicada por los tratamientos. Tabla 4. Análisis de varianza prueba sensorial para el extracto glicosídico de las hojas de S. rebaudiana. Fuente de variación Tratamientos Jueces Residual Total Grados de libertad 2 29 58 89 Suma de cuadrados 19,29 42,72 41,38 103,39 Varianza estimada 9,64 1,47 0,71 11,83 F calculado F tabulado 13,52 2,06 3,158 [F(2,5; 5 %)] 1,402 [F(29,58; 5 %)] Nota: El 81,5 % de la varianza total es explicada por los tratamientos. Asimismo, le agradecen al profesor Hernán García López su colaboración en el análisis sensorial. 22,2 % y por el método diferencial entre 46,8 a 58,5 %, para las tres unidades de paisaje evaluadas. El análisis fitoquímico preliminar de las hojas de las tres unidades evaluadas reportó presencia de: compuestos reductores, esteroles o triterpenos, glicósidos cardíacos, saponinas y taninos. El análisis proximal de hojas de las tres unidades agroecológicas evaluadas reporto los siguientes valores: humedad (3,16 a 10,35 %), proteína (14,22 a 15,59 %), extracto etéreo (2,03 a 2,7 %), cenizas (8,57 a 9,64 %), fibra (3,12 a 7,28 %). En la prueba de preferencia se observó que el 50 % de los jueces prefirieren concentraciones de sacarosa de 10 % como agente endulzante. El extracto acuoso elaborado a partir de hoja de lomerío presentó un grado de edulcoración mayor estadísticamente significativo con respecto a los extractos preparados con hoja de vega y montaña, mientras que en el extracto glicosídico de montaña tiene más dulzor con respecto a los extractos de lomerío y vega. Literatura citada Akinci, I., F. Ozdemir, A. Topuz, O. Kabas, M. Canakci. 2004. Some physical and nutritional properties of Juniperus drupacea fruits. Journal of Food Engineering, 65:325–331. Anzaldúa-Morales, A. 1994. La evaluación sensorial de los alimentos en la teoría y la práctica. Acribia, S.A. Zaragoza. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). 1995. Official Methods of Analysis. Washington, D.C. Brandle, J. E. & P. G. Telmer. 2007. Steviol glycoside biosynthesis. Phytochemistry, 68:1855-1863. Carakostas, M. C., L. L. Curry, A. C. Boileau, D. J. Brusick. 2008. Overview: the history, technical function and safety of rebaudioside A, a naturally occurring steviol glycoside, for use in food and beverages. Food and Chemical Toxicology, 46:S1-S10 Evans, W. 1996. Trease and evans pharmacognosy. WB Saunders Company Limited. London. Geuns, J. 2003. Stevioside. Phytochemistry, 64:913-921. Ghosh, S., E. Subudhi, S. Nayak. 2008. Antimicrobial assay of Stevia rebaudiana Bertoni leaf extracts against 10 pathogens. International Journal Integrative Biology, 2:27-31. Goto, A. & E. Clemente. 1998. Influência do rebaudiosídeo A na solubillidade e no sabor do esteviosídeo. Ciência e tecnología do alimentos, 18:3-6. Hernandez, L. R., C. A. N. Catalan, C. M. Cerda-García-Rojas, P. Joseph-Nathan. 1996. Sesquiterpene lactones from Stevia vaga. Phytochemistry, 42:1369-1373. Jarma, A., T. Rengifo, T. Araméndiz-Tatis. 2006. Fisiología de estevia (Stevia rebaudiana) en función de la radiación en el Caribe colombiano. II. Análisis de crecimiento. Agronomía Colombiana, 24:38-47 López, F. & N. Vargas. 2005. Monografía Stevia rebaudiana Bertoni. MERCK. Tables for the Laboratory. Germany. Ref. 03-250104 180397. Moraes, E. & N. Camargo. 2001. Clarification of Stevia rebau- Agradecimientos Los autores desean expresar su más sincero agradecimiento a la Vicerrectoría de Investigaciones y posgrados de la Universidad de la Amazonia y al proyecto de investigación “Estudio de adaptabililidad y rendimiento de la Stevia Rebaudiana en cuatro zonas agroecológicas (montaña, piedemonte, lomerío y vega) en el Municipio de El Doncello – Caquetá, Colombia”, por apoyar la financiación del estudio. 64 Rodríguez-Pérez et al. / Momentos de Ciencia 7(1), 2010, pp: 57-65 Tecnología de los Alimentos, 20:5-9. Tadhani, M. B. & R. Subhash. 2006 Preliminary studies on Stevia rebaudiana leaves: proximal composition, mineral analysis and phytochemical screening. Journal of Medical Sciences, 6(3):321-326. Tadhani, M. B., V. H. Patel, R. Subas. 2007. In vitro antioxidant activities of Stevia rebaudiana leaves and callus. Journal of Food Composition and Analysis, 20:323-329. Torres-Valencia, J. M., C. M. Cerda-García-Rojas, L. U. Román, J. D. Hernández, P. Joseph-Nathan. 1998. Absolute configuration of longipinenyl epoxyangelates from three Stevia species. Phytochemistry, 49:2569-2572. Vanek, T., A. Nepoum, P. Valicek. 2001. Determination of stevioside in plant material and fruit teas. Journal of Food Composition and Analysis, 14:383-388. Yemm, E., & A. Willis. 1954. The Estimation of carbohydrates in plant extracts by Anthrone. Biochemical journal, 57:508514. diana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolitas. Acta scientiarum (Maringá), 23:1375-1380. Porto, J. M. & B. H. M. Andre. 2007. Different sweeteners in peach nectar: Ideal and equivalent sweetness. Food Research International, 40:1249-1253. Santos, M. & A. Pillimue. 2006. Valoración y formulación de un suplemento alimenticio para pollos en fase de iniciación a partir de hojas de morera (Morus alba), nacedero (Trichanthera gigantea), bore (Alocasia macrorrhiza) y tallo de caña forrajera (Saccharum spp). Trabajo de Grado. Programa Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá, Colombia). Savita, S.M., K. Sheela, S. Sunanda, A. G. Shankar, P. Ramakrishna. 2004. Stevia rebaudiana – A functional component for food industry. The Journal of Human Ecology, 15(4):261-264. Soto, A. & S. Del Val. 2002. Extracción de los principios edulcorantes de la Stevia rebaudiana. Revista de Ciencias Agrarias y 65