Tesis Doctoral Noelia Foresi

La vitalidad se revela no solamente en la capacidad de
persistir sino en la de volver a empezar.
Francis Scott Fitzgerald
II
AGRADECIMIENTOS
- al Dr. Lorenzo Lamattina por enseñarme, acompañarme y darme la oportunidad de
realizar esta tesis.
- a la Dra. Claudia Casalongué por sus sugerencias y correcciones.
- a la Dra Natalia Correa por todo, por su companía, por compartir sus conocimientos,
por la gran ayuda en estos años.
- a la gente del Laboratorio 8, por la comprensión, por el buen ambiente de trabajo.
- al IIB y sus integrantes, por su generosidad
- al CONICET y a la Universidad Nacional de Mar del Plata.
- a las personas con la que colaboramos para que este trabajo pueda llevarse a cabo.
Dra. Graciela Salerno, Lic. Gonzalo Caló, Dr. Gustavo Parisi, Dr.Jerome Santolini, Dr.
Néstor Carrillo, Dra. Anabella Lodeyro y Lic.Martín Mayta.
- a Nico por estar siempre a mi lado y por la familia que estamos formando.
- a mi familia: mis hermanos, mamita, abuelas y a mi suegros
- a mis amigos de lejos y de cerca.
- a mi papá
III
___________________________________________________________Índice
ÍNDICE TEMÁTICO
RESUMEN
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
1. El óxido nítrico (NO). Propiedades físicas y químicas.
3
2. Biosíntesis de NO en animales y plantas
4
2.1. Biosíntesis de NO en animales.
4
2.2. Biosíntesis de NO en plantas.
4
2.2.1. Producción de NO a partir de L-arg.
4
2.2.2. Producción de NO a partir de NO2-.
5
2.2.3. Producción de NO a partir de poliaminas.
5
2.2.4. Producción de NO no enzimática.
5
3. Efectos biológicos del NO
6
3.1. Efectos biológicos del NO en animales.
6
3.2. Efectos biológicos del NO en plantas.
7
3.3. NO y estrés en plantas.
8
3.3.1. Estrés abiótico
9
Estrés hídrico.
9
Estrés salino.
9
Deficiencia de hierro.
9
Otros tipos de estreses abióticos.
10
3.3.2. Estrés biótico.
10
OBJETIVOS
12
RESULTADOS
CAPÍTULO I: Estudio de la estructura y secuencia de la
proteína Oxido Nítrico Sintasa de Ostreococcus tauri (OtNOS).
Análisis filogenético de OtNOS.
13
I.1. Estudio de la estructura y secuencia de la proteína OtNOS.
14
i
___________________________________________________________Índice
I.2. Análisis filogenético de la proteína OtNOS.
20
CAPÍTULO II: Estudio de las propiedades catalíticas y mecanismo
de acción de la proteína Oxido Nítrico Sintasa de Ostreococcus tauri (OtNOS)
expresada en forma recombinante.
28
II.1. Estudio de las propiedades catalíticas de OtNOS
29
II.2. Mecanismo de acción molecular de OtNOS.
34
II.3. Actividad de OtNOS expresada en bacterias E. coli.
37
CAPÍTULO III: Producción y función biológica del NO en
cultivos celulares de Ostreococcus tauri.
41
III.1. Producción de NO en cultivos celulares de O. tauri.
42
III.2. Función biológica del NO en cultivos celulares de O. tauri
46
CAPÍTULO IV: Transformación de Nicotiana tabacum
y Arabidopsis thaliana con el ADNc de OtNOS.
53
IV.1. Transformación de plantas de N. tabacum PH con
el vector pCHF3:OtNOS.
53
IV.2. Transformación de plantas de A. thaliana
con el vector pCHF3:OtNOS.
59
IV.3. Transformación de plantas de A. thaliana
con el vector pBI-PEC:OtNOS.
62
DISCUSIÓN GENERAL
73
MATERIALES Y MÉTODOS.
78
1. Material biológico.
78
1.1 Bacterias.
78
1.1.1. Escherichia coli.
78
1.1.2. Agrobacterium tumefaciens.
78
1.2. Plantas.
78
ii
_________________________________________________________Índice
1.3. Cultivo de Ostreococcus tauri.
78
2. Cebadores utilizados.
78
3. Construcciones realizadas.
79
3.1. pUC57OtNOS.
79
3.2. pET24bOtNOS.
80
3.3. pET15bOtNOSoxi.
80
3.4. pCHF3.
81
3.4.1 pCHF3:OtNOS.
81
3.5. pBI-PEC:GUS.
82
3.5.1. pBI-PEC:OtNOS.
82
4. Purificación de ADN plasmídico.
83
4.1. Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
83
4.2. Estimación de la concentración de ADN.
83
5. Transformación de bacterias.
83
5.1. Obtención de células electrocompetentes
y electroporación de A. tumefaciens.
83
5.1.1. Obtención de células electrocompetentes
de A. tumefaciens.
83
5.1.2. Electrotransformación de A. tumefaciens.
84
5.2. Obtención de células competentes y transformación
de E. coli.
84
5.2.1. Obtención de células CaCl2 competentes de E. coli.
84
5.2.2. Transformación de E. coli.
84
6. Expresión y purificación de proteínas en E. coli.
85
6.1. Expresión de OtNOS completa:
85
6.2. Expresión dominio oxi de OtNOS (OtNOSoxi).
85
7. Determinación de la actividad NOS.
86
7.1. El método de oxihemoglobina.
86
7.2. Formación de L-citrulina.
86
iii
___________________________________________________________Índice
7.3. Oxidación de NADPH.
87
8. Modelado por Homología.
87
9. Análisis filogenético.
88
10. Análisis estadísticos.
88
11. Números de Accesos.
88
12. Cuantificación de NO en cultivos de O. tauri y E. coli.
88
13. Análisis de la muerte celular en E. coli.
89
14. Extracción de ADN, ARN y proteína de O. tauri.
89
14.1. Extracción de ADN de O. tauri.
89
14.1.1 Verificación de la presencia del gen que codifican
para OtNOS en O. tauri.
89
14.2. Extracción de ARN de O. tauri.
90
14.3. Síntesis del ADN complementario (Retrotranscripción).
90
14.4. Amplificación de ADN complementario específico mediante PCR
90
14.5. Extracción de proteínas de O. tauri.
90
14.5.1. Separación de proteínas mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida.
91
14.5.2. Transferencia e inmunodetección de proteínas
en membranas de nitrocelulosa (Western Blot).
91
15. Generación de plantas transgénicas.
92
15.1. Transformación transiente de Nicotiana tabacum.
92
15.2. Crecimiento y transformación estable de las
plantas de Nicotiana tabacum.
92
15.2.2. Esterilización de las semillas de N. tabacum.
93
15.2.3. Cultivo de N. tabacum en macetas.
93
15.3. Crecimiento y transformación estable de las plantas.
de A. thaliana.
93
15.3.1. Crecimiento de A. thaliana.
93
iv
___________________________________________________________Índice
15.3.2. Transformación estable de A. thaliana.
94
15.3.3. Esterilización de las semillas de A. thaliana.
94
15.3.4. Selección de plantas transformantes de A. thaliana.
94
16. Análisis de las plantas transformadas.
95
16.1. Evaluación estadística
95
16.2. Extracción de ADN genómico a partir de tejido foliar.
95
16.3. Verificación de la presencia del transgén que codifican
para OtNOS en las plantas transformadas.
95
16.4. Verificación de la presencia de la proteína OtNOS
en las plantas transformadas.
95
16.4.1. Extracción de proteínas
96
16.5. Verificación mediante RT-PCR de la presencia
del transcripto del transgén que codifica para OtNOS.
96
16.5.1. Extracción de ARN.
96
16.5.2. Estimación de la concentración y el grado
de pureza del ARN.
96
16.5.3. Verificación de la integridad del ARN.
96
16.5.4. Tratamiento del ARN con nucleasas de ADN (ADNsa).
97
16.6. Cuantificación de nitritos.
97
17. PCR
97
18. TRABAJOS PRESENTADOS
98
19. REFERENCIAS BIBILIOGRÁFICAS
102
v
______________________________________________________Abreviaturas
ABREVIATURAS
ACE: elemento de control auto inhibitorio
AmpR: marcador de selección que confiere resistencia al antibiótico ampicilina
ATS: solución para Arabidopsis thaliana
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
CaM: calmodulina
CaMV: virus del mosaico del coliflor
cGMP: GMP cíclico
Col-0: Columbia 0
ADNsa: nucleasa de ADN
eNOS: Óxido Nítrico Sintasa endotelial
HGT: transferencia horizontal de genes
GSNO: nitrosoglutatión
GSNOR: nitrosoglutatión Reductasa
GUS: β-glucuronidasa
H4B: tetrahidrobiopterina
iNOS: oxido nítrico sintasa inducible
Intrón Cox 5c: intrón de la sub-unidad 5c de la citocromo c oxidasa de A.
thaliana
L-cit: L-citrulina
MS-0: medio Murashige-Skoog
MV: metil viológeno
NBT: azul de nitrotetrazolio
Ni-NOR: nitrito-NO reductasa
nNOS: Óxido Nítrico Sintasa neuronal
NO: óxido nítrico
NOHA: N-ω-hidroxi-L-arginina
NOS: óxido nítrico sintasa
NOS-like: actividad enzimática similar a NOS de mamíferos
NOSoxy: dominio oxigenasa de la Óxido Nítrico Sintasa
NOSred: dominio reductasa de la Óxido Nítrico Sintasa
NiNOR: nitrito NO reductasa
NR: nitrato reductasa
OtNOS: Óxido Nítrico Sintasa de Ostreococcus tauri
PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida
PEC: alelo corto del promotor del gen Hahb4 de girasol
PH: Petit Havana
vi
______________________________________________________Abreviaturas
pLac: promotor del gen lacZ
PM NR: nitrato reductasa unida a la membrana plasmática
PTGS: silenciamiento génico post-transcripcional
pUC ori: origen de replicación de la serie de vectores pUC
pVS1 ori: origen de replicación del tipo Col E1
ROS: especies reactivas del oxigeno
SA: ácido salicílico
SAR: respuesta sistémica adquirida
SNP: nitroprusiato de sodio
RNS: especies reactivas del nitrógeno
Rubisco: ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa
SMC: sitio de múltiple clonado
SN: sobrenadante
T-ADN: ADN de transferencia
tEF-1α: Factor de Elongación de N. tabacum
Ter 35S: terminador transcripcional del gen 35S del virus del mosaico del coliflor
Terminador NOS: señal de poliadenilación de la nopalina sintasa de A.
tumefaciens
THF: tetrahidrofolato
tRBCs: secuencia terminadora del gen de la sub-unidad menor de la Rubisco
TGS: silenciamiento génico transcripcional
WB: Western Blot
χ2: chi-cuadrado
X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido
vii
_________________________________________________________Resumen
RESUMEN
El óxido nítrico (NO) se consideró, durante mucho tiempo, sólo como un contaminante
ambiental. El descubrimiento en animales de la enzima que sintetiza NO, una Óxido
Nítrico Sintasa (NOS) y el papel del NO como molécula señal regulando diversos
procesos pato-fisiológicos, condujeron a estudiar sus efectos en plantas, incluyendo un
posible rol en la respuesta a diferentes tipos de estreses. Los análisis de los genomas
de plantas superiores no han revelado la presencia de genes homólogos a NOS
descriptos previamente en animales. Por lo tanto, aún se desconoce la identidad
génica de la actividad tipo NOS detectada en extractos vegetales. Sin embargo, luego
de la secuenciación del genoma de Ostreococcus tauri, un alga verde unicelular
marina perteneciente al reino Plantae, se encontró la primera secuencia con un alto
porcentaje de similitud a las NOS de animales, en un organismo fotosintético.
Mediante un análisis ‘in silico’ de la secuencia proteica de la NOS de O. tauri (OtNOS)
se predijo su estructura terciaria y cuaternaria, y su posible origen evolutivo. Se
demostró que la enzima OtNOS es una NOS genuina que comparte todas las
características estructurales presentes en las NOS animales. En conjunto, las
evidencias indican que O. tauri podría haber adquirido el gen OtNOS por un proceso
de transferencia horizontal. El estudio y caracterización de OtNOS recombinante
indican que es una enzima activa que presenta parámetros bioquímicos similares a las
enzimas NOS de animales. Los resultados indican que la enzima OtNOS y la
producción de NO participarían de la respuesta adaptativa de O. tauri a diferentes
intensidades de luz. Por otro lado, la expresión de OtNOS recombinante en E. coli
aumenta la tolerancia de la bacteria al estrés oxidativo.
La transformación de plantas de Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum con OtNOS
bajo el promotor fuerte de CaMV:35S mostró un cambio en el fenotipo de las plantas
transgénicas, acelerando la floración. Cuando la expresión de OtNOS estuvo bajo el
control de un promotor inducible por ABA, NaCl y sequía, las plantas transgénicas
presentaron un crecimiento normal sin estrés, y un mayor desarrollo radical en
condiciones de estrés abiótico generado por los inductores antes señalados.
Este trabajo de tesis presenta evidencias acerca del posible origen evolutivo y
funciones de la enzima NOS en organismos fotosintéticos, y confirma la participación
del NO en procesos esenciales de la fisiología de las plantas como el crecimiento y
desarrollo de las raíces.
1
_________________________________________________________Resumen
ABSTRACT
Nitric oxide (NO) has been considered as an environmental pollutant for a long time.
The discovery of the Nitric Oxide Synthase (NOS) enzyme, the biosynthetic NO
pathway in animals and its central role in a broad spectrum of patho-physiological
processes have led to develop studies on the NO effects in plants, including the
putative NO role/s in different types of stresses.
Analyses of higher plant genomes did not revealed the presence of genes with
homology to animal NOS. Therefore, it’s still unknown the nature of the NOS-like
activity described in plants. However, after sequencing the whole genome of the
marine unicellular algae Ostreococcus tauri belonging to the Plant Kingdom, it was
found the first NOS sequence with high similarity to animal NOS in a photosynthetic
organism.
In silico analysis of the structure of NOS from O. tauri (OtNOS) showed that it is a
genuine NOS and it shares almost identical features with animals NOS. Phylogenetic
studies suggest that the presence of OtNOS in O. tauri genome is due to horizontal
gene transfer. OtNOS recombinant was expressed in E. coli as a soluble active
enzyme and it showed biochemical parameters similar to animal NOS. The expression
of recombinant OtNOS in E. coli confers the bacteria higher tolerance to oxidative
stress. Results also indicate that the expression of OtNOS in O. tauri is associated to
the adaptive response of the algae to different light irradiance.
Transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum plants expressing OtNOS
under the control of the constitutive and strong promoter CaMV:35S exhibit a general
accelerated development and early flowering. When Arabidopsis plants were
transformed with OtNOS under the control of a stress inducible promoter, the
transgenic plants showed normal development without stress and increased root
growth under ABA, salinity and drought stress treatments.
This PhD thesis contributes to the understanding of the possible evolutionary origin and
functions of the NOS enzyme in photosynthetic organisms, and it confirms that NO is
involved in essential plant physiological processes like root growth and development.
2
_______________________________________________________Introducción
INTRODUCCIÓN GENERAL
1. El óxido nítrico (NO). Propiedades físicas y químicas
El NO, óxido de nitrógeno (II) o monóxido de nitrógeno es una molécula simple que
consiste en un átomo de oxigeno (O) unido a un átomo de nitrógeno (N) (Figura 1). Es
una de las 10 moléculas estables más pequeñas que se conocen. Es un radical
paramagnético, gaseoso, incoloro, de carga neutra, que posee gran afinidad hacia
metales de transición (Fe, Cu, Zn) siendo capaz de formar aductos con ellos. Debido a
que posee un electrón desapareado, tiene una gran reactividad química y reacciona
-
rápidamente con el radical superóxido (O2˙¯ ) para formar peroxinitrito (ONOO ) y
posteriormente ácido peroxinitroso (ONOOH), que luego se descompone y forma el
radical hidroxilo (OH˙¯ ) y NO2. Tanto el ONOO como el ONOOH, pueden dañar a las
células al ser capaces de oxidar grupos tioles presentes en lípidos, lipoproteínas y
ADN, entre otros (Wendehenne y col., 2001). El NO también puede reaccionar con O2
para formar varios óxidos de N y puede ser oxidado o reducido para formar las
especies nitrosonio (NO+) o nitroxilo (NO-) respectivamente, importantes intermediarios
en la química del NO (Gow e Ischiropoulos, 2001).
El NO es soluble tanto en ambientes hidrofóbicos como hidrofÍlicos, aunque
prefiere los primeros. Esta propiedad, junto a su alta difusividad en H2O (4.8 x105 cm2
s-1), le confiere la capacidad de atravesar fácilmente las membranas biológicas y en
consecuencia difundir extra e inter-celularmente con relativa facilidad. Su vida media
es corta (menos de un segundo) pero su gran reactividad química le confiere las
características de un potente efector biológico (Bruckdorfer, 2005).
Figura 1. Fórmulas y modelos moleculares del óxido nítrico.
http://quimicausc.blogspot.com.ar
3
_______________________________________________________Introducción
2. Biosíntesis de NO en animales y plantas.
2.1. Biosíntesis de NO en animales
En animales, la biosíntesis de NO es principalmente catalizada por la enzima NO
sintasa (NOS; EC 1.14.13.39). Existen tres isoformas de NOS: dos constitutivas, NOS
neuronal (nNOS) y NOS endotelial (eNOS) y una inducible (iNOS) (Alderton y col.
2001). Las enzimas NOS actúan como homodímeros catalizando la formación de Lcitrulina (L-cit) y NO a partir del sustrato L-arginina (L-arg) utilizando NADPH y O2
como cosustratos (Alderton y col., 2001). Además, requiere de los cofactores flavina
mononucleótidos (FMN), flavina adenina dinucleótido (FADH) y tetrahidrobiopterina
(H4B). Las NOS de animales poseen dos dominios: oxigenasa (conteniendo un centro
hemo) y reductasa (conteniendo sitios de unión para NADPH, FAD y FMN). Ambos
dominios están conectados por un sitio de unión a calmodulina (CaM) (Alderton y col.,
2001).
2.2. Biosíntesis de NO en plantas
En plantas, sin embargo, existen varias fuentes de producción de NO, enzimáticas y
no enzimáticas. La producción enzimática de NO en plantas podría dividirse de
acuerdo al sustrato: i) producción de NO a partir de L-arg ii) producción de NO a partir
de nitrito NO2 (iii) Producción de NO mediada por poliaminas (Figura. 2).
2.2.1. Producción de NO a partir de L-arginina.
La existencia de la actividad enzimática de tipo NOS en plantas (NOS-like) ha sido
inferida mediante el uso de anticuerpos anti-NOS de animales (Kuo y col., 1995, Sen y
Cheema 1995), detección de la actividad en extractos vegetales (Cueto y col., 1996,
Ribeiro y col., 1999, Caro y Puntarulo 1999., Simontacchi y col., 2004., Corpas y col.,
2009) y mediante el uso de inhibidores específicos (Cueto y col., 1996, Bright y col.,
2006, Valderrama y col., 2007). A nivel subcelular, NOS ha sido asociada a
peroxisomas (Barroso y col., 1999, Corpas y col., 2001), cloroplastos (Jasid y col.,
2006), mitocondrias (Kaiser y col. 2007) y citoplasma (Ribeiro y col. 1999). Sin
embargo, a pesar de los indicios sobre la existencia de NOS en plantas, aún no se ha
identificado el gen o la proteína responsable de dicha actividad. Dos trabajos acerca
de la identificación de la proteína NOS en plantas han sido retractados o fuertemente
4
_______________________________________________________Introducción
cuestionados (Klessig y col., 2004, Zemojtel y col., 2006) entendiéndose claramente
que es aún un tema sin resolver.
2.2.2. Producción de NO a partir de nitrito (NO2 ).
En plantas la enzima nitrato reductasa (NR, EC 1.6.6.2) es una fuente importante de
producción de NO a partir de nitrito NO2. Klepper (1990) descrbió que durante los
tratamientos con herbicidas, las plantas de soja mutantes en NR emitían menores
niveles de NO que las plantas salvajes. La capacidad de la NR de producir NO a partir
de nitrito y NADH se ensayó in vitro (Yamasaki y col., 1999, Rockel y col., 2002) e in
vivo (Rockel y col., 2002). Los ensayos indicaron que la producción de NO por la
enzima NR resulta importante cuando las plantas se someten a condiciones de anoxia
(Rockel y col., 2002). Otras enzimas también han mostrado capacidad de producir NO.
Stöhr y col. (2001) detectaron producción de NO dependiente de nitrito en extractos de
raíces de tabaco. La enzima responsable se encontraría unida a membrana plasmática
y se la designó como nitrito-NO reductasa (Ni-NOR) (Stöhr y col., 2001).
2.2.3. Producción de NO a partir de poliaminas
La participación de las poliaminas en la síntesis del NO es otro aspecto importante a
ser considerado. Incrementos en los niveles de ciertas poliaminas (espermina y
espermidina) inducen una liberación de NO en plántulas de A. thaliana. La producción
de NO se detectó en la zona de elongación de la raíz y en las hojas primarias,
especialmente en las venas y tricomas. Sin embargo la localización y el mecanismo de
esta vía aún no sido dilucidado (Tun y col., 2006)
2.2.4. Producción no-enzimática de NO
La producción no-enzimática de NO a partir de formas oxidadas del nitrógeno también
ocurre en plantas. Los pigmentos carotenoides son capaces de producir NO a partir de
NO2 -, en una reacción dependiente de la luz (Cooney y col. 1994).
Además, se observó la generación de NO a partir de nitrito en el apoplasto de
células de la aleurona bajo condiciones reductoras y a un pH de 5,5 (Bethke y col.,
2004). La contribución de las distintas fuentes de NO en plantas dependería de la
especie, célula o tejido involucrado, condiciones de crecimiento y desarrollo de las
plantas (Neill y col., 2003; Gupta y col., 2011).
5
_______________________________________________________Introducción
Por otra parte, el tipo de fuente de producción de NO, especie molecular
generada: NO· (radical libre sin carga), NO+ (ión nitrosonio), NO- (ión nitroxilo) y
localización subcelular podrían inducir una señal específica y desencadenar una
respuesta fisiológica definida en plantas.
?
Like
Figura 2. Síntesis enzimática de NO y algunas reacciones químicas que contribuyen con
el balance del NO en plantas. El NO se sintetiza a partir de L-arg por la actividad de la enzima
Óxido Nítrico Sintasa (NOS). El signo de pregunta (?) indica que la enzima no ha sido aún
identificada en plantas. El NO además puede ser producido a partir de nitrito catalizado por la
enzima nitrato reductasa (NR) o a partir de poliaminas. Una vez producido, el NO puede
-
interactuar con superóxido (O2˙¯ ), formar peroxinitrito (ONOO ) y nitrar residuos tirosina (TyrNO2). El NO es además capaz de S-nitrosilar residuos cisteína (Cys-NO) presentes en
proteínas. En presencia de oxígeno, el NO es oxidado a NO2, el cual reacciona con NO para
dar N2O3 (Corpas y col., 2011).
3. Efectos biológicos del NO
3.1. Efectos biológicos del NO en animales
El NO fue descubierto hace ya más de 200 años por John Priestley, pero recién hacia
fines del siglo XX, se demostró que es una molécula clave en los sistemas biológicos.
Furschgott y Zawadzki en 1980 descubrieron en animales que una sustancia formada
en el endotelio podía relajar el músculo liso y la llamó EDRF (factor relajante derivado
del endotelio).
6
_______________________________________________________Introducción
Intensas investigaciones se realizaron en todo el mundo hasta que en el año
1992, se presentó al NO como la molécula del año en la revista Science (Koshland,
1992). En 1998 Furschgott, Murad e Ignarro, quienes descubrieron y describieron la
actividad biológica del NO, fueron galardonados con el premio Nobel de Medicina.
El NO se ha descripto con funciones en varios procesos biológicos tales como,
por ejemplo mantener la presión sanguínea (Moncada y col., 1991), estimular las
defensas en el sistema inmune (Snyder y Bredt, 1992), regular la neurotransmisión
(Jeffrey y Snyder, 1995), entre otras numerosas funciones.
3.2. Efectos biológicos del NO en plantas
Durante mucho tiempo el NO se consideró como un producto de las descargas
eléctricas producidas en la atmósfera (Levine, 1984), y más recientemente un
componente de los gases de combustión y contaminante atmosférico (Bruckdorfer,
2005). Por lo tanto, la investigación sobre los efectos del NO en plantas se concentró
durante décadas en sus efectos tóxicos (Rowland y col., 1985; Leshem, 1988; Mc
Kersie y Leshem, 1994). El descubrimiento de efectos benéficos en modelos animales
condujo a numerosas investigaciones en plantas. Desde que se descubrió la relación
entre el NO y la germinación hasta ahora, se han descripto la acción del NO en
prácticamente todos los aspectos de la fisiología vegetal, convirtiendo al NO en una
fitohormona no convencional.
Entre sus principales efectos se pueden detallar:
•
Favorece la germinación. Semillas de lechuga que requieren luz para germinar
cuando son tratadas con dadores de NO, tales como el nitroprusiato de sodio
(SNP) y S-nitroso-N-acetilpenicilamina pueden germinar en oscuridad (Beligni y
Lamattina, 2000).
•
En granos de cebada regula la muerte celular programada dependiente de
ácido giberélico en la capa de aleurona, promoviendo la movilización de
reservas para alimentar al embrión (Beligni y col., 2002b).
•
Favorece la des-etiolación. Es decir incrementa los niveles de clorofila en
plantas que crecen en oscuridad (Beligni y Lamattina., 2000).
•
Promueve la cicatrización de heridas (Huang y col., 2004, París y col., 2007) a
través de una comunicación cruzada con las hormonas ácido jasmónico y ácido
salicílico.
7
_______________________________________________________Introducción
•
Permite el reconocimiento del polen por el estigma (Hiscock y col., 2007) y la
reorientación del tubo polínico (Prado y col., 2004).
•
En tomate a bajas concentraciones es un componente esencial en la cascada
de señales dirigida por auxinas que afecta la arquitectura radical y el desarrollo
de raíces adventicias (Pagnussat y col., 2002, 2004). También puede inducir el
desarrollo de raíces laterales (Correa-Aragunde y col., 2004).
•
En arveja, a bajas concentraciones promueve la expansión foliar, mientras que
la inhibe a elevadas concentraciones (Quiao y Fan., 2008).
•
En soja es requerido para el desarrollo de nódulos funcionales que permitan la
correcta fijación simbiótica de N2 (Leach y col., 2010)
•
Retrasa la senescencia de hojas (Leshem y col., 1998; Mishina y col., 2007) y
frutos (Duan y col., 2007), la maduración de frutos (Manjunatha y col., 2010) y
cuando es aplicado exógenamente reprime la floración (He y col., 2004). Este
último efecto es opuesto al del etileno y sugiere que el balance de ambos
gases sería clave en el establecimiento de la senescencia.
•
Participa en la vía de señalización que controla el movimiento de los estomas
resultando fundamental en la regulación de la transpiración y el intercambio
gaseoso necesario para la fotosíntesis (García-Mata y Lamattina, 2001, 2003).
3.3. NO y estrés en plantas
La presencia de un electrón desapareado en la molécula del NO le confiere alta
reactividad y también es el origen de su dualidad en su efecto biológico.
A altas concentraciones, el NO es generalmente tóxico. Esto se debería a que
-
la combinación del mismo con pequeñas cantidades de anión O2˙¯ forma ONOO , un
potente oxidante que puede causar daños en lípidos, proteínas y ADN (Goldestein y
col., 2008). Sin embargo, durante la sobreproducción de ROS debido a un estrés, el
NO tendría una función protectora eliminando el exceso de ROS y frenando la
oxidación de lípidos mediada por radicales. Por ello, es posible que el NO participe en
el sistema antioxidante de las células (Beligni y Lamattina., 1999a).
Según lo expuesto, el NO posee diferentes reactividades bioquímicas para
explicar su habilidad de actuar como mediador de vías de señalización o según su
química ‘’per se” en funciones fisiológicas y en mecanismos de respuesta a
enfermedades.
8
_______________________________________________________Introducción
3.3.1. Estrés abiótico
Estrés hídrico
La sequía es uno de los factores más importantes que limitan la productividad de los
cultivos. Este estrés promueve la producción de NO (Gould y col., 2003). A su vez el
NO aplicado externamente a través de un dador químico como el nitro prusiato de
sodio (SNP) no sólo evita la pérdida de agua de las hojas, sino que también disminuye
las fugas de iones y la tasa de transpiración, e induce el cierre de los estomas,
aumentando con ello la tolerancia de las plantas al estrés hídrico (García-Mata y
Lamattina 2001). El cierre de los estomas inducido por NO sería a través de la
modulación del Ca2+ intracelular en las células de la guarda. Se ha informado que el
NO activa selectivamente canales intracelulares de Ca2+ en células de la guarda a
través de una vía de señalización dependiente de cGMP / cADPR (Garcia-Mata y col.,
2003). Además, el NO también participaría del mantenimiento del agua en hojas de
plántulas de trigo mediante la estimulación de la biosíntesis de ABA (Xing y col. 2004).
El NO tiene la capacidad de aliviar el daño oxidativo causado por el estrés
osmótico. Los niveles de anión O2˙¯ se reducen significativamente luego del
tratamiento con el dador SNP, en microsomas aislados de ejes embrionarios de soja
(Caro y Puntarulo., 1998).
Estrés salino
La participación del NO en la resistencia a estrés salino ha llamado mucho la atención
en los últimos años. La función del NO en la tolerancia a la salinidad, se demostró en
muchas especies de plantas. El pretratamiento SNP es capaz de proteger plántulas de
arroz, resultando en un mejor crecimiento y viabilidad de las plantas bajo condiciones
de estrés salino (Uchida y col., 2002). Las plantas mutantes de A. thaliana Atnoa con
niveles reducidos de NO endógeno son más sensible al estrés por salinidad que las
plantas salvaje (Guo y col., 2003; Zhao y col., 2007). El tratamiento con SNP de la
mutante Atnoa logró aliviar el daño oxidativo causado por el NaCl (Zhao y col., 2007).
El NO puede mejorar la tolerancia a la salinidad en las plantas mediante un
incremento en la expresión del antiportador Na+/H+ y la H+-ATPasa unidos a la
membrana citoplasmática, requeridos para la homeostasis de Na+ y la adquisición de
K+ (Quiao y Fan., 2008).
Deficiencia de hierro
9
_______________________________________________________Introducción
El hierro es un cofactor esencial involucrado en procesos vitales como la respiración,
fotosíntesis y fijación del nitrogeno (N). El NO posee una gran afinidad por el hierro y
es capaz de evitar los síntomas de clorosis, alteración de cloroplastos y déficit de
crecimientos observados durante la deficiencia del metal. Se ha hipotetizado que el
NO aumenta la bio-disponibilidad del metal dentro de la planta, convirtiéndose así en
una molécula clave en el sensado, homeostasis y disponibilidad del hierro por parte de
las plantas (Graziano y col., 2002).
Otros tipos de estreses abióticos.
El NO incrementa la supervivencia de plantas de tabaco expuestas a altas
temperaturas, probablemente disminuyendo los niveles altos de ROS causados por el
calor (Quiao y Fan, 2008). También participa en la aclimatación y tolerancia al frío a
través de la activación de genes de respuesta al frío y formación de fosfoesfingolípidos
(Cantrel y col., 2011).
El NO protege contra los efectos tóxicos de herbicidas como diquat, paraquat,
glifosatos y atrazina, disminuyendo la toxicidad a través de efectos protectores sobre
la membrana del cloroplasto, la pérdida de clorofila y aumentando las actividades de
las enzimas antioxidantes tales como superoxido dismutasa, peroxidasa y glutatión
reductasa (Beligni y Lamattina 1999b, Huang y col., 2002). Mackerness y col. (2001)
informaron que plantas de A. thaliana producen NO y ROS cuando se exponen a
radiación UV-B y también se observó un incremento en la actividad NOS de hipocótilos
de maíz luego de la radiación UV-B (Zhang y col., 2003). Los flavonoides son
compuestos que absorben UV-B y su concentración aumenta cuando las células
vegetales se irradian con dosis elevadas de UV-B. Se demostró que el NO y los
flavonoides son sistémicamente inducidos en las plántulas de maíz irradiadas con UVB (Tossi y col., 2012).
El NO también confiere tolerancia a metales pesados como Cu, As, Cd y Al.
Su efecto protector se debería a la reducción del estrés oxidativo causado por estos
metales y a una disminución de la acumulación de los mismos en el interior de las
plantas (Xiong y col., 2010).
3.3.2. Estrés biótico
El NO es producido en respuesta a patógenos biotróficos, necrotróficos y virus. Se
propone que el NO coordina un amplio rango de respuestas, desde la regulación de
genes de defensa como la producción de hormonas durante el desarrollo de la
10
_______________________________________________________Introducción
hipersensible (HR) (Asai y Yoshioka, 2009; Delledonne y col., 1998; Durner y col.,
1998, Shi y col., 2008). Durante la HR el NO tiene un rol en la señalización junto a los
ROS y el SA y participa en la muerte celular programada dando lugar a la
condensación de la cromatina y la fragmentación del ADN (Clarke y col., 2000).
El NO también participa en la señalización para la acumulación de fitoalexinas
(Able, 2003) y en la activación de la respuesta sistémica adquirida (SAR) induciendo la
producción de SA, necesaria para la activación de la proteína de defensa NPR-1
(Arasimowicz y Floryszak-Wieczorek, 2007).
Para inducir SAR, el NO sería transportado intra e intercelularmente en el
floema como nitroso glutatión (GSNO) (Durner y Klessig, 1999). Los cambios en los
estado redox que ocurren durante la SAR regulan la actividad biológica de NPR1. La
S-nitrosilación de NPR1 por GSNO induce la oligomerización de NPR1 y su
translocación al núcleo (Tada y col., 2008; Lindermayr y col., 2010).
A pesar de la gran cantidad de fenómenos biológicos regulados por NO, aún
quedan por responder varios aspectos sobre la naturaleza de sus fuentes y producción
en plantas.
11
_________________________________________________________Objetivos
Objetivo general:
Contribuir al conocimiento del origen evolutivo y funciones de la enzima Óxido Nítrico
Sintasa (NOS) en organismos fotosintéticos.
Objetivos particulares
1) A partir de la secuencia del gen y del ADNc correspondiente a la NOS del alga
unicelular O. tauri se propone clonar la secuencia del ADNc, secuenciarla y
caracterizar los diferentes dominios. Por otra parte realizar un estudio filogenético que
permita identificar el origen evolutivo de OtNOS.
Hipótesis 1: La secuencia génica correspondiente a OtNOS publicada en la
base de datos NCBI es correcta. El gen codifica para una proteína NOS y se expresa
en O. tauri.
2) Expresar la proteína OtNOS recombinante en E. coli y caracterizar su actividad.
Dado que esta secuencia aún no ha sido analizada y no se sabe si corresponde a una
NOS genuina, es de interés expresarla en forma recombinante y analizar sus
parámetros bioquímicos.
Hipótesis 2: El gen OtNOS codifica para una proteína NOS funcional en O.
tauri.
3) Estudiar las funciones biológicas de OtNOS en O. tauri.
Hipótesis 3: El NO generado a partir de OtNOS cumple funciones en el
metabolismo celular del alga.
4) Realizar construcciones con el ADNc de OtNOS bajo el control de un promotor
constitutivo y un promotor inducible por estrés para transformar plantas de Nicotiana
tabacum y Arabidopsis thaliana. Analizar la regulación de la producción de NO bajo
distintos tipos de estreses (salino e hídrico) y caracterizar los diferentes fenotipos que
se obtengan.
Hipótesis 4: La expresión regulada de OtNOS conferirá una cierta protección y
tolerancia a diferentes tipos de estrés en plantas genéticamente transformadas.
12
________________________________________________________Capítulo I
Introducción
En animales, se han identificado cuatro isoformas de proteínas NOS llamadas: NOS
neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS), NOS inducible (iNOS) y NOS mitocondrial
(similar a la iNOS). Todas ellas tienen una identidad de secuencia entre 50% y 60% y
poseen un dominio oxigenasa (NOSoxy) N-terminal y un dominio reductasa (NOSred)
C-terminal. El dominio NOSoxy contiene un grupo hemo, tipo citocromo P-450 y un
sitio de unión para el cofactor tetrahidrobiopterina (H4B). El dominio NOSred contiene
sitios de unión para NADPH, FAD y FMN y posee alta homología de secuencia con la
NADPH citocromo P-450 reductasa. Ambos dominios están conectados por un sitio de
unión a calmodulina (CaM) que se encuentra entre NOSoxi y NOSred. La extensión Nterminal es característica de cada NOS y determina su localización intracelular. En su
forma activa las NOS oxidan L-arg a L-cit y NO (Alderton y col., 2001).
En bacterias gram positivas se ha identificado la presencia de una NOS cuya
estructura está sólo constituida por el dominio oxigenasa. Dicha NOS recibiría los
electrones necesarios para la catálisis desde otras reductasas celulares (Crane y col.,
2010). Una excepción es la NOS encontrada en Sorangium celullosum la cual
presenta además del dominio NOSoxi, un dominio NOSred en el N terminal (Agapie y
col., 2009) (Figura 3).
Figura 3. Dominios y organización de las proteínas Oxido Nítrico Sintasas. Las proteínas NOS se
definen por la presencia de un dominio básico oxigenasa (azul) que une un grupo hemo y el cofactor H4B,
es el centro catalítico de la enzima. En la mayoría de las bacterias este dominio oxigenasa es la proteína
completa, y recibe los electrones de otras reductasas celulares. La única excepción conocida es la NOS
de Sorangium cellulosum (scNOS, centro), que tiene un dominio amino terminal reductasa (rojo). En los
metazoos (Metazoan NOS) la estructura es más compleja, desde el extremo amino al extremo carboxilo,
comprende un dominio de isotipo de orientación específica (amarillo), un sitio de unión a Zn (celeste), que
estabiliza el dominio oxigenasa (azul), un dominio de unión a calmodulina (CaM, negro) y un dominio
reductasa (rojo). El dominio reductasa de scNOS es homólogo a un dominio ferredoxina reductasa/
ferredoxina de fusión, mientras que el dominio reductasa de la NOS de metazoos es homólogo al dominio
reductasa del citocromo P450. Tanto scNOS y NOS de metazoos pueden recibir electrones desde
NADPH . Adaptada de Sudhamsu y Crane. (2009).
13
________________________________________________________Capítulo I
Resultados
I.1. Estudio de la estructura y secuencia de la proteína OtNOS.
El objetivo principal de este Capítulo es demostrar mediante el análisis de secuencia
primaria y de estructuras moleculares que el gen NOS encontrado en O. tauri (OtNOS)
presenta un alto porcentaje de homología con las NOS hasta el momento
caracterizadas.
La secuencia del ADN y ADNc correspondientes a OtNOS se obtuvo a partir de
la información del genoma completo de O. tauri publicado en 2006. La secuencia de
aminoácidos se predijo y anotó como una enzima NOS (Derelle y col., 2006). Para
identificar los dominios conservados en la secuencia primaria se utilizaron los
programas informáticos Interpro y PFAM. Se encontró que OtNOS contiene los
dominios característicos NOSoxy y NOSred (Sheta y col., 1994; Lowe y col., 1996).
Estos resultados también se apoyaron por la predicción de estructura terciaria
resultante de la asignación y uso de Hhpred y FFAS03. Se identificaron así, un
dominio NOSoxy (AP código 1d0c con una puntuación de -289,00, una puntuación de
menos de -9,5 lo cual es significativo) y un dominio NOSred (1tll código PDB con una
puntuación de -132,00).
La Figura 4a muestra el alineamiento entre las secuencias de aminoácidos de
la enzima OtNOS (Derrelle y col., 2006) y las enzimas eNOS, iNOS y nNOS humanas.
La similitud de secuencia entre los segmentos alineados de OtNOS y eNOS es del
44%, mientras que entre OtNOS e iNOS o nNOS es del 45%. En las secuencias
completas el porcentaje de similitud de OtNOS es de 41,6; 42,7 y 34,3% para eNOS,
iNOS y nNOS, respectivamente. Los sitios de unión del grupo hemo y cofactores H4B,
FMN, FAD, y NADPH están altamente conservados en todas la secuencias alineadas
(Figuras 4a y 4b). Los primeros 90 aminoácidos son diferentes con respecto a otras
NOS a excepción del sitio de unión a Zn el cual está presente en OtNOS y contiene un
motivo C-(x) 3-C (en el cual C es Cys y x es otro aminoácido). Este motivo es diferente
del motivo de unión a Zn presente en las NOS animales (Figuras 4a y 4b). OtNOS
presenta un sitio putativo de unión a CaM que no está totalmente conservado (Figuras
4a y 4b). Mediante un análisis de estructura con HHPred se observó que esta región
es similar a la región de unión a CaM de nNOS de Gallus gallus (AP código 2o60, Evalor. 0,0036) (Söding y col., 2005). En la Figura 4a se muestra que las regiones
involucradas en la
14
________________________________________________________Capítulo I
dimerización de proteínas NOS (I, II, III y IV) también se conservan en OtNOS (Bird y
col., 2002).
15
________________________________________________________Capítulo I
Figura 4. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de OtNOS y NOS de humanos.
a) Las secuencias OtNOS y NOS humana, eNOS, nNOS, iNOS se alinearon mediante los
programas ClustalX y GENEDOC. Las cajas negras indican los residuos conservados en las
cuatro secuencias; las cajas de color gris oscuro representan los residuos conservados en tres
secuencias, y de color gris claro representan los residuos conservados en dos secuencias. Los
aminoácidos que no comparten ninguna similitud no se sombrearon. Los sitios putativos de
unión a cofactores como el Zn, el hemo, H4B, CaM, FMN, FAD pirofosfato, FAD isoalloxazina,
NADPH ribosa, NADPH adenina, y el dominio C-terminal de NADPH se indican con su nombre.
Las regiones que participan en la dimerización (I, II, III y IV) están encuadradas. b)
Comparación en la arquitectura de los dominios de las diferentes NOS. Las enzimas NOS
eucariotas tienen una región de unión a Zn, un dominio NOSoxy que une un grupo hemo, Larg, y H4B, una región de unión a CaM, y un dominio NOSred con subdominios que unen FMN,
FAD y NAD. Las enzimas NOS bacterianas tienen sólo un dominio NOSoxy. El signo de
interrogación indica que el motivo de unión a Zn no se conserva por completo. H4B/THF
significa que aún no está claro a cual de los dos cofactores corresponde.
Se realizó una predicción de la estructura terciaria utilizando el programa
Modeller el cual predice un modelo estructural basándose en los mejores templados
de proteínas cristalizadas.
16
________________________________________________________Capítulo I
Figura 5. Predicción de la estructura terciaria de los dominios de OtNOS. a) Diagrama de
cintas del dominio OtNOSoxy según las coordenadas de la eNOS cristalizada de Bos taurus.
Se muestra magnificado el sitio catalítico que contiene el grupo hemo, H4B y L-arg. b)
Diagrama de cintas de la eNOS cristalizada de Bos taurus. c) Superposición de los residuos en
el sitio activo de OtNOS (verde) y eNOS (rojo). Las uniones por puentes de hidrógeno se
indican como líneas de puntos. d) Alineamiento estructural entre el modelo de OtNOSred
(verde) y el nNOSred de Rattus norvegicus (rojo). OtNOS tiene un bucle CD2A (contribuye a la
2+
dependencia de Ca
en la unión de CaM) más corto y carece de ACE (Elemento de Control
Auto Inhibitorio).
Las Figuras 5a y 5b muestran la estructura tridimensional del dominio
OtNOSoxy basado en las coordenadas de eNOSoxy de Bos taurus. Se evaluó la
calidad del modelo con PROSA II y dio lugar a un z-score de 29.06, lo cual indica que
es similar al dominio oxi de la NOS de Bos Taurus (Wiederstein y Sippl, 2007). Los
sitios de unión al sustrato en el dominio OtNOSoxy y eNOSoxy de B.taurus son
idénticos (Figuras 5a y 5b, inserciones). Además, los residuos que interactúan con el
sustrato L-arg, el cofactor H4B y grupo hemo están completamente conservados en la
secuencia OtNOS (Figura5c).
17
________________________________________________________Capítulo I
Las NOS pertenecen a la familia de proteínas hemo Cys-coordinados en el que
el ligando proximal al Fe del grupo hemo es un átomo de S de una Cys intrínseca
(Rousseau y col., 2005). En OtNOS, el grupo hemo es estabilizado por unión al átomo
de S de la Cys-125 (Figura 5c).
El sustrato L-arg por encima del átomo de Fe se estabiliza por la unión que
implica los aminoácidos Trp-301, Tyr-302 y Glu-306 que interactúan con el átomo de
nitrógeno terminal de la L-arg y un átomo de oxígeno terminal de guanidinio y
nitrógeno, respectivamente (Figura 5c). L-arg y H4B están unidos entre sí por uniones
puente de hidrogeno entre dos grupos de propianato del hemo. A su vez el H4B se
estabiliza por una interacción con el oxígeno del Trp-392 (Figura 5c).
La predicción de estructura para el dominio reductasa de OtNOS (OtNOSred)
también se conserva respecto a los dominios NOSred de animales.
La Figura 5d muestra la superposición de OtNOSred y nNOSred en Rattus
norvegicus. La Figura 5d indica dos diferencias principales entre los dominios;
OtNOSred no presenta el elemento de control auto inhibitorio (ACE) que bloquea el
flujo de electrones en ausencia de CAM, característico de la NOS constitutivas (eNOS
y nNOS) cuya actividad se regula por Ca2+. Esta diferencia se pone de manifiesto
también en la secuencia primaria (Figura 4a). El bucle CD2A contribuye a la regulación
de la actividad de NOS por Ca2+, y es más corto en aquellas NOS cuya actividad es
independiente de Ca2+. Dicho bucle también es más corto en OtNOS (Knudsen y col.,
2003). La secuencia OtNOS contiene el dominio oxigenasa y reductasa unidos por un
dominio de unión a CaM.
La predicción de la estructura dimérica de OtNOS indica que OtNOS es capaz
de dimerizar, tal como se describió para la eNOS de Bos taurus (Figura 6a y 6b).
18
________________________________________________________Capítulo I
Figura 6. Predicción de la estructura correspondiente al dímero de OtNOS. a) Diagrama
de la estructura dimérica de OtNOS según las coordenadas de eNOS de Bos Taurus
cristalizada. b) Diagrama de la estructura dimérica de eNOS de Bos taurus cristalizada.
O. lucimarinus, otra especie del género Ostreococcus, también contiene un gen
con alta homología a las NOS de animales; cuya expresión se validó por análisis de
ESTs (Lanier y col., 2008). Considerando que la secuencia NOS de O. lucimarinus
(OlNOS) sólo tiene un intrón (Lanier y col., 2008) y la predicción de la secuencia de
OtNOS (Derelle y col., 2006) contiene un segundo micro-intrón (41 nucleótidos), se
verificó si la secuencia OtNOS publicada corresponde a la OtNOS nativa o hay un
error en la secuencia OtNOS cargada en la base de datos (GenBank/EMBL, número
de acceso de OtNOS: CAL57731).
En consecuencia se preparó ADNc de O. tauri y mediante cebadores
específicos OtNOS2203Fw y OtNOS2537Rv (Materiales y Métodos, inciso 2, Tabla IV).
Se amplificó la región de interés. Los resultados de la secuenciación del ADNc
indicaron que existió un error de un nucleótido en la secuenciación del genoma de O.
tauri que cambió el marco de lectura del gen OtNOS. Durante la predicción del ADNc
de OtNOS, probablemente se consideró que correspondía a un intrón de 41
nucleótidos. Indicando que la predicción del segundo micro-intrón en la secuencia
OtNOS situado entre las regiones de unión de pirofosfato FAD y FAD isoalloxazina,
correspondientes a la posición de los aminoácidos 783 - 796, es incorrecta, resultando
dichos nucleótidos parte de la secuencia exónica (Figura 7a y 7b).
19
________________________________________________________Capítulo I
Figura 7. Identificación de un error en la secuencia publicada del gen OtNOS. a)
Alineamiento de la secuencia del ADNc de O. tauri amplificado con el cebador OtNOS2203Fw
(OtNOSsec)
y
la
secuencia
del
gen
OtNOS
correspondientemente
publicada
en
GenBank/EMBL, número de acceso de: CAL57731 indicada en la Figura como OtNOSpub. El
recuadro negro indica que el nucleótido G en la posición 2351 presente en OtNOSpub y no en
OtNOSsec. b) Alineamiento de las secuencia de aminoácidos provenientes de la traducción a
aminoácidos del producto de la secuenciación del ADNc de O. tauri (OtNOSsec), la secuencia
de aminoácidos publicada de OtNOS (OtNOSpub) y la secuencia de aminoácidos de la NOS de
O. lucimarinus (OlNOS). El recuadro negro indica la secuencia de aminoácidos deducida en
OtNOSsec y en OlNOS y ausente en la secuencia de OtNOS publicada GenBank/EMBL
(OtNOSpub).
Los siguientes estudios se realizaron con la enzima OtNOS cuya secuencia
corresponde a la publicada (Derelle y col., 2006; Foresi y col., 2010). El error en la
secuencia no compromete ningún dominio crítico de unión a cofactores.
I.2 Análisis filogenético de la proteína OtNOS.
Las proteínas homólogas a la NOS de mamíferos se encuentran en todos los reinos de
la vida (Figura 8). Las NOSs son muy abundantes en los organismos vivos. Sin
embargo, poco se sabe acerca de la evolución de esta gran familia de genes. El origen
20
________________________________________________________Capítulo I
evolutivo de la NOS en metazoos y los eventos responsables de la especialización
funcional y estructural de las diferentes isoformas siguen siendo una incógnita.
Los análisis genómicos y funcionales indican que el gen NOS están presente
en bacterias (Crane y col., 2010). La enzimas bacterianas son generalmente más
pequeñas que las formas encontradas en metazoos, ya que sólo tienen el dominio
oxigenasa, el cual es altamente homólogo al de mamíferos y utilizan reductasas
celulares inespecíficas para la producción de NO (Gusarov y col., 2008). Las funciones
biológicas de NOS en bacterias no están totalmente caracterizadas. Las NOSs
bacterianas se han encontrado en más de 20 géneros de bacterias, incluyendo
Bacillus, Staphylococcus y Deinococcus, Rhodococcus, Streptomyces y otras ( Wang y
col., 2007; Adak y col., 2002a; Cohen y Yamasaki, 2003; Cohen y col., 2005; Gusarov
y Nudler., 2005). Dichas formas procarióticas de NOS se han considerado como los
precursores de la NOS de metazoos que se originaron durante la evolución por la
fusión de un dominio oxigenasa a un dominio reductasa. Recientemente, se describió
una NOS de la bacteria Sorangium cellulosum la cual contiene un dominio reductasa
unido covalentemente, pero con una disposición diferente respecto a las encontrados
en metazoos, sugiriendo la ocurrencia de eventos evolutivos independientes en los
linajes procariotas y eucariotas (Agapie y col., 2009).
Dentro de los metazoos, las mayorías de las especies de invertebrados tienen
un único gen (Regulski y Tully, 1995; Yuda y col., 1996.; Nighorn y col., 1998; Luckhart
y Rosenberg, 1999; Davies, 2000; Imamura y col., 2002; Scheinker y col., 2005; Godoy
y col., 2006; Moroz y Kohn, 2007; Matsuo y col., 2008).
21
________________________________________________________Capítulo I
Figura 8. Árbol filogenético correspondiente a las NOS presentes en todos los Reinos de la
vida. Adaptada de Gusarov y col. (2007).
Este único gen presente en los invertebrados parece codificar una NOS constitutiva
similar a la NOS neuronal de mamíferos, lo que sugiere que una función sináptica
podría ser ancestral en la familia de la NOS.
Por otra parte, el gen NOS del insecto Bombyx mori se expresa en bajo nivel
en los tejidos larvales y está fuertemente inducido en los cuerpos grasos después de
la infección bacteriana (Imamura y col., 2002). La NOS del cnidario Striata discosoma
carece del elemento ACE responsable de la dependencia de Ca2+, típico de la NOS
constitutiva, en apoyo a los antiguos orígenes del comportamiento inducible de la
enzima (Moroz y Kohn, 2007).
22
________________________________________________________Capítulo I
En el Reino Protista, dos secuencia NOS han sido encontradas y
caracterizadas en Physarum polycephalum, las cuales presentan un 82% de identidad
entre si y corresponden a NOSs genuinas que se inducen durante la esporulación
(Golderer y col., 2001).
En este punto nos interesó conocer el posible origen evolutivo de la única
NOS encontrada hasta el momento en organismo fotosintéticos.
Se realizó una búsqueda mediante BLAST en la base de datos de proteínas
no redundantes disponible en GenBank para recolectar putativos homólogos del gen
OtNOS. Las secuencias recuperadas principalmente pertenecieron al super Reino
Eucariota y al Reino Animalia. Se encontraron pocas excepciones, tal como una NOS
en el protista (Amoebozoa) P. polycephalum, en la cianobacteria Synechococcus sp
(S. sp) y una secuencia altamente homóloga en el alga unicelular O. lucimarinus. La
Figura 9 muestra el árbol filogenético obtenido a partir de 1000 repeticiones de
máxima probabilidad. Los números cerca de los nodos internos en la Figura 9 indican
el apoyo relativo resultante de un test no paramétrico (bootstrap). Los nodos con
valores iniciales de menos del 40% se descartaron. El árbol se puede dividir en dos
partes principales. Un grupo principal contiene las tres isoformas NOS de organismos
vertebrados (rojo, Figura 9). El patrón de agrupamiento representa la diversificación
funcional de los tipos de NOS (eNOS, nNOS y la iNOS) (Figura 9). El segundo grupo
contiene las secuencias NOS de invertebrados (filo Placozoa, Cnidaria, Artrópodos y
Moluscos). En este grupo, también se encuentran representantes de las algas verdes
(O. tauri y O. lucimarinus), bacterias (S. sp), y Amoebozoa (P. polycephalum).
El análisis filogenético revela que la proteína OtNOS pertenece a un grupo
que incluye las NOS de cianobacterias y Amoebozoa como un grupo fuera de los
metazoos. Mientras que el patrón de agrupamiento entre estos organismos está bien
soportado, su inserción en el grupo que contiene otros representantes de metazoos
(color azul, Figura 9) no presenta el apoyo adecuado. Por lo tanto es difícil establecer
profundas relaciones evolutivas entre las enzimas NOS dentro de este cluster. El
estudió de la relación filogenética entre OtNOS y las secuencias conocidas de NOS
sugiere que OtNOS ha evolucionado de un pariente cercano de la NOS de los
animales. OtNOS aparece en un grupo bien soportado con Synechococcus sp y P.
polycephalum, un representante de las cianobacterias y Amoebozoa, respectivamente.
23
________________________________________________________Capítulo I
Un hallazgo interesante fue que el gen NOS sólo está presente en uno de los
13 genomas de Synechococcus que han sido completamente secuenciados hasta el
momento. De manera similar, una secuencia homóloga a la NOS de P. polycephalum
no se ha encontrado en el genoma de Dictyostelium discoideum una especie
estrechamente relacionada y completamente secuenciada (Messner y col., 2009).
Figura 9. Árbol filogenético de las secuencias aminoacídicas de NOS.
Representación
radial
del
árbol
filogenético.
Los
colores
indican
las
principales
divisiones taxonómicas: vertebrados (rojo), invertebrados (azul), plantas (verde), bacterias
(amarillo) y Amoebozoa (azul claro). El número de acceso de cada secuencia se indica al lado
del nombre de la especie. Los valores en las ramas indican el porcentaje de “bootstrap” por
encima del 40%.
Se estudió la posible transferencia horizontal (HGT) del gen OtNOS en
Ostreococcus para lo cual se analizó el porcentaje de G+C en el genoma de O. tauri y
se comparó con el porcentaje de G+C presentes en el gen OtNOS que se encuentra
en el cromosoma 17. También se analizó el contenido de G+C de los genes
adyacentes a OtNOS.
24
________________________________________________________Capítulo I
Se calcularon los porcentajes para dos genes NOS de P. policephalum (Figura
10). Los parámetros analizados no permitieron afirmar que se trató de un evento HGT.
En apoyo a la posible transferencia horizontal del gen OtNOS existe el antecedente de
que el gen NOS sólo esta en dos especies del genero Ostreococcus.
Figura 10. Contenido de G+C en OtNOS, en los genes adyacentes al gen OtNOS y en el
genoma de O. tauri. Como ejemplo de genes NOS que se postulan haber sido transferidos
horizontalmente se indican los porcentajes de G+C de dos genes NOS identificados en el
genoma de Physarum policephalum.
25
________________________________________________________Capítulo I
Discusión
En la primer parte del Capítulo I se demostró que la secuencia predicha
correspondiente a la proteína OtNOS (Derrelle y col., 2006) presenta alto porcentaje
de similitud con las proteínas NOS de animales. Contiene los dominios característicos
oxigenasa y reductasa unidos por un sitio de unión a CaM y conserva todos los sitios
de unión a cofactores encontrados en las NOS anteriormente estudiadas. Con algunas
excepciones que le confieren más interés para su estudio como por ejemplo, el sitio de
unión a CaM el cual está parcialmente conservado. La presencia de las cuatro
regiones implicadas en la interface de dimerización soporta la hipótesis de que la
forma activa de OtNOS es un dímero (Bird y col., 2002). El dímero del dominio
oxigenasa de OtNOS fue modelado y se asemeja al de la NOS de animales. El motivo
C-(x) 4-C de unión a Zn está conservado en las secuencias NOS y es necesario para
la estabilidad del dímero (Hemmens y col., 2000). El átomo de Zn está
tetrahedricamente coordinado a dos C de cada subunidad NOS. En OtNOS
encontramos en cambio, un motivo C-(x) 3-C. Un motivo C-(x) 3-C hasta ahora sólo ha
sido descrito en las proteínas OtNOS y OlNOS. Sin embargo, el dedo de Zn presente
en el dominio de la familia GATA de factores de transcripción es C-(x) 2-C (Aita y col.,
2000), y el dominio de dedo de Zn de la citocromo oxidasa es un motivo C-(x) 3-C
(Jaksch y col., 2001), indicando que el motivo C-(x) 3-C presente en OtNOS podría ser
funcional, unir Zn y estabilizar el dímero de OtNOS. Además, los aminoácidos P y R
que están presentes dentro del motivo (x) 3, entre los dos residuos de C en los
supuestos dominios de unión de Zn [C-(x) 3-C] de las NOSs de Ostreococcus, se
conservan entre la mayoría de las proteínas eNOS descritas hasta la fecha. No
obstante, tanto la dimerización de las subunidades OtNOS como la unión de Zn, aún
no se han verificado experimentalmente.
En la segunda parte de este Capítulo se estudió el posible origen evolutivo
de OtNOS, los resultados del análisis filogenético podrían sugerir que el gen NOS
puede ser móvil dentro de los diferentes organismos unicelulares como resultado de
HGT. HGT es considerado como una importante fuerza evolutiva que modula los
genomas eucariotas (Keeling y Palmer, 2008). En O. tauri, dos cromosomas (2 y 19)
son diferentes de los 18 restantes en términos de organización y contenido G + C. Se
ha sugerido que todo el cromosoma 19 puede haber sido derivado de una fuente
exógena por HGT (Derelle y col., 2006).
26
________________________________________________________Capítulo I
Un hallazgo interesante es que el gen NOS sólo está presente en Sy PCC
7335 uno de los 13 genomas de Synechococcus que han sido completamente
secuenciados hasta el momento. Los altos niveles de diversidad de genes y la eficacia
de eventos HGT se han postulado que pueden jugar papeles importantes en la
diversidad de la población costera en el género Synechococcus (Páleník y col., 2009).
Sy PCC 7335 parece ser un organismo unicelular inusual, ya que es la única
cianobacteria capaz de fijar N2 sin la formación de heterocistos (Bergman y col., 1997).
Será interesante estudiar el papel del NO dependiente de la actividad NOS en la cepa
Sy PCC 7335. Un homólogo al gen NOS de Sy PCC 7335 se encontró en la bacteria
de agua dulce Spirosoma linguale pero no así en otros organismos relacionados.
No se ha podido validar la HGT del gen OtNOS en O. tauri por ser un
organismo muy apto a la incorporación de nuevos genes y poseer un porcentaje de
G+C altamente variable en su genoma. Se ha encontrado en O. tauri una gran
cantidad de virus que modifican su genoma por la incorporación de nuevos genes. Un
último estudio indicó que estos prasinovirus son especie específico (Clerissi y col.,
2012). De todos modos, siendo que O. tauri comparte el ancestro con las plantas
superiores no puede ser descartado un acontecimiento de pérdida de genes como una
posible explicación de la ausencia de una NOS homóloga a OtNOS en las plantas
(Archibald, 2009). Tampoco puede descartarse que un evento HGT muy temprano
haya sido responsable de la presencia de OtNOS en el genoma de O. tauri y que
durante la evolución del genoma de O. tauri haya ocurrido una homogenización del
contenido de G+C en el cromosoma 17 que contiene el gen OtNOS.
Las diferentes estructuras de los genes NOS están presentes en organismos
terrestres y acuáticos. Sin embargo, actualmente no hay ninguna información para
establecer una correlación entre los hábitats, la presencia y la estructura de genes
NOS en diferentes organismos. Por lo tanto, sería muy interesante investigar las
fuerzas evolutivas que relacionan los nichos ecológicos con la evolución molecular de
la NOS y tratar de establecer, en la medida de lo posible alguna, correlación genómica
funcional.
27
________________________________________________________Capítulo II
Introducción
En su forma activa las NOS oxidan L-arg a L-cit y NO. En la Figura 11 se muestra un
modelo de la enzima NOS y su regulación.
Figura 11. Esquema de la estructura de la NOS y sus cofactores.
Los electrones (e-) son donados por el NADPH al dominio reductasa y vía FAD y FMN al
dominio oxigenasa donde interactúan con el Fe del grupo hemo y la H4B para generar L-cit y
NO a partir de L-arg y O2. La CaM funciona como un puente molecular entre ambos dominios
de la NOS permitiendo el paso de los electrones de las flavinas al Fe del grupo hemo.
Adaptada de Alderton y col. (2001).
En condiciones de baja disponibilidad de L-arg y/o H4B, las NOS también producen
O2˙¯ y NO, dando lugar a la producción de ONOO-, que es citotóxico y el responsable
de muchos efectos negativos del NO (Wendehenne y col., 2001).
El sustrato L-arg es convertido en NO y L-cit por medio de dos reacciones de
monooxigenación consecutivas (Figura 12) dentro del dominio NOSoxy de la NOS
(Alderton y col., 2001). El intermediario N-ω-hidroxi-L-arginina (NOHA) generalmente
se mantiene unido en el sitio activo durante la catálisis (Daff, 2010).
La reacción comienzan con la unión de un O2 al hemo ferroso (Fe+2) formado el
compuesto oxi-ferroso (Fe+2=O2). En el primer paso un sólo átomo de O2 se inserta en
el sustrato. Dos electrones originados de la des-hidrogenación del NADPH son
transportados a través de los co-factores FAD y FMN del dominio NOSred y pasan al
hemo en el dominio NOSoxy para activar al di-oxigeno del Fe+2=O2 y formar Fe+2=O2-2
este último compuesto se forma solo en presencia del sustrato L-arg. Alli los
electrones interactúan con el Fe del grupo hemo y el H4B en el sitio activo para
catalizar la reacción del O2 con L-arg, generándose L-cit y NO como productos finales.
28
________________________________________________________Capítulo II
El segundo paso de síntesis del NO requiere solo un electrón, pero también
involucra la activación del di-oxígeno (Griffith y Stuehr, 1995).
Aunque existe mucha incertidumbre sobre el mecanismo exacto de acción
molecular de NOS, hay bastante evidencia que apoya la formación de un complejo oxiferroso como agente mono-oxigenante, la reducción de este por un electrón de H4B y
liberación del NO de un complejo Fe ferroso-NO por reducción de un radical H4B (Daff,
2010).
Figura 12. Reacción catalizada por la enzima NOS. a) Esquema de transferencia de
electrones a través de los cofactores presentes en la enzima NOS. b) L-arg es convertida en Lcit en una reacción de 2 pasos: oxigenación de L-arg a NOHA, seguido de la oxigenación de
NOHA a L-cit y NO. La reacción requiere O2 y NADPH. Adaptada de Santolini (2011).
Resultados
II.1 Estudio de las propiedades catalíticas de la proteína OtNOS expresada en
forma recombinante.
La proteína recombinante OtNOS se expresó en E. coli y se detectó como una banda
de 119 kDa en un gel de SDS-PAGE 12% (Figura 13, calle 2), de acuerdo con la masa
molecular esperada según la secuencia de aminoácidos. No se detectó proteínas en
29
________________________________________________________Capítulo II
esta región del gel para las células de E. coli transformadas con el vector vacío (Figura
13, calle 1).
OtNOS se purificó mediante cromatografía utilizando una columna de ADP
agarosa, la cual retiene aquellas proteínas que tienen la capacidad de unir ADP. Esta
columna cromatográfica ha sido utilizada en la purificación de otras NOS debido a la
capacidad de estas proteinas de unir NADPH (Martasek y col. 1996).
La proteína purificada migró como una única banda en un gel de SDS-PAGE
(Figura 13a, calle 3) y exhibió inmunoreactividad con un anticuerpo anti-OtNOS (Figura
13b). Bajo las condiciones descriptas en Materiales y Métodos inciso 6,
aproximadamente 1,5 mg de proteína recombinante OtNOS se lograron purificar a
partir de 1 litro de cultivo de células E. coli BL21.
Figura 13. Expresión de OtNOS recombinante en E. coli. a) Se transformó E. coli BL21 con
el vector pET24b y pET24bOtNOS, se indujo la expresión con IPTG 0,5 mM durante 24 hs.
Calle 1) Extracto total proteico bacteriano de un cultivo transformado con el vector vacío
pET24b e inducido con IPTG; Calle 2) Extracto total proteico bacteriano de un cultivo
transformado con el vector pET24bOtNOS e inducido con IPTG; Calle 3) proteína purificada
mediante columna de ADP-agarosa. b) Western Blot correspondiente a la proteína purificada
mediante columna de ADP-agarosa e identificada con un anticuerpo especifico anti-OtNOS.
La actividad de la enzima OtNOS recombinante purificada se evaluó mediante
dos métodos: la producción de NO por el ensayo de la oxihemoglobina y la formación
de L-citrulina (Materiales y Métodos, incisos 7.1 y 7.2)
A partir de el ensayo de la oxihemoglobina, se observó una fase de producción
de NO (150 s de 0,49 +/- 0,03 µM NO.min-1), seguido por un largo período de lenta
liberación de NO (33% de la fase inicial). Un resultado similar se obtuvo por el método
de detección de L-cit (0,53 +/- 0,05 µM L-cit. min-1) en la reacción que contenía L-arg,
el cofactor H4B, CaM y OtNOS (Tabla 1).
30
________________________________________________________Capítulo II
Tabla 1. Actividad de OtNOS recombinante purificada.
La producción de NO se cuantificó mediante el ensayo de oxihemoglobina. La actividad se
cuantificó durante 3 min a 25º C con oxihemoglobina 20 µM, DTT 5mM, L-arg 100 µM, NADPH
1 mM, CaCl2 10 mM, CaM 10 µM, H4B 100 µM, 100 U/ml de catalasa y OtNOS 0,5 µM o iNOS
3
comercial 0,5 µM (Sigma Aldrich). La formación de [ H] L-cit se cuantificó durante 30 min en
3
6
una reacción con [ H] L-arg 1 µCi (1.10 cpm), L-arg 50 µM, NADPH 100 µM, CaCl2 2 mM,
CaM 10 µM, H4B 100 µM y OtNOS 0,5 µM o iNOS 0,5 µM.
Formación de
-1
Formación de
NO.min
%
L-cit.min-1
%
FAD, FMN
0,49 ± 0,03
100
0,53 ± 0,05
100
FAD, FMN, CaM
0,35 ± 0,01
71
0,37 ± 0,01
69
FAD, FMN, H4B
< 0,001
< 1,0
< 0,001
< 1,0
0,10 ± 0,10
20
< 0,01
< 1,0
0,59 ± 0,13
120
0,41 ± 0,14
77
OtNOS (cofactores omitidos)
OtNOS (en presencia del inhibidor)
L-NAME
iNOS (cofactores omitidos)
FAD, FMN
Los ensayos de actividad indican que la OtNOS recombinante contiene los
cofactores FAD y FMN dado que la enzima retiene su actividad sin la adición de los
mismos en la reacción, tal como fue descripto para eNOS bovina de origen
recombinante (Martasek y col., 1996). En ausencia de CaM, la OtNOS retiene más del
70% de la actividad. La formación de NO y L-cit no se detectó cuando se omitió H4B.
Así mismo se inhibió en un 80% por el análogo inactivo de L-arg, L-nitro arginina
metilester (L-NAME) (Tabla 1).
Los resultados obtenidos a partir de ensayos realizados con la iNOS comercial
fueron comparables a los obtenidos para OtNOS (Tabla 1).
Para validar la formación de L-cit se realizó una cromatografía de capa delgada
(Figura 14) e inequívocamente se demostró que estamos en presencia de una
actividad NOS genuina.
31
________________________________________________________Capítulo II
F
Figura 14: Detección de L-cit como producto de la actividad OtNOS. a) Cromatografía de
capa delgada (TLC) correspondiente a los productos de reacción en Tris-HCl 50mM pH 7.4 con
L-arg 50 µM, [ H] L-arg 1 µCi (1.10 cpm), NADPH 100 µM, FAD 10 µM, CaCl2 2 mM, CaM 10
3
6
µM y H4B 10 µM en un volumen final de 40 µl. La reacción enzimática se inició por la adición de
OtNOS 0,5 µM o H2O (control). Luego de 30 min a 25ºC, la reacción se detuvo con 40 µl de
acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, conteniendo EDTA 2 mM y EGTA 0,2 mM. Luego se sembró
en la resina Dowex AG 50W-X8 (la cual retiene L-arg). La L-cit se eluyó por centrifugación y
luego se separó por TLC. Los aminoácidos se tiñeron con ninhidrina (0,1 % etanol/ácido
acético, en una relación 5:1 v/v). Los aminoácidos sembrados como estándar correspondieron
a L-arg 0,2 mol, L-cit 0,2 mol y la mezcla de 0,1 mol de L-arg mas 0,1 mol de L-cit. Se estimó
el factor de retención (RF) correspondiendo para L-arg: 0,21 y L-cit: 0,59. b) Los aminoácidos
se removieron de las placas de TLC y la radioactividad se cuantificó por un contador de
3
3
centelleo líquido. Los valores se expresaron como la relación de [ H] L-cit / [ H] L-arg en la
reacción que contiene o no la enzima OtNOS.
La Km de OtNOS se estimó por dobles reciprocas mediante el ensayo de
oxihemoglobina y fue de 12 +/- 5 µM (Figura 15).
32
________________________________________________________Capítulo II
Figura 15: Gráfica de dobles reciprocas. La producción de NO se cuantificó mediante el
ensayo de oxihemoglobina. La reacción se realizó durante 3 min a 25ºC en presencia de
oxihemoglobina 20 µM, DTT 5mM, NADPH 1 mM, CaCl2 10 mM, CaM 10 µM, H4B 100 µM, 100
U/ml de catalasa y OtNOS 0,5 µM. El ensayo se repitió con diferentes concentraciones L-arg
(5, 50, 100 µM). Para cada concentración de L-arg se determinó la velocidad inicial de la
reacción y se graficaron las dobles reciprocas.
El NADPH es el dador inicial de electrones de NOS. Por lo tanto, el tercer
método que se utilizó para medir la actividad de OtNOS se basó en cuantificar la tasa
de oxidación de NADPH. Una oxidación basal de NADPH se detectó en ausencia de Larg (0,42 +/- 0,2 min-1) la cual se sustrajo en cada una de las mediciones. Una
oxidación basal similar fue descripta para las mediciones de nNOS y eNOS (Heinzel y
col., 1992; Martasek y col., 1996). En una reacción conteniendo L-arg y todos los
cofactores, OtNOS 0,5 µM oxida 1,36 +/- 0,18 mM NADPH min-1. Se espera una
relación de 1,5 NADPH oxidados por cada NO producido. Esta relación
estequiométrica es característica de las NOS (Santolini, 2011). En el caso de OtNOS
nosotros observamos una relación aproximada de 2,5 NADPH consumidos por cada
NO producido, esto podría corresponder a un parcial desacople de ambas reacciones.
La oxidación de NADPH por OtNOS fue completamente bloqueada en ausencia de
H4B y por la adición de L-NAME.
Se demostró que las enzimas NOSs pueden ser inhibida por una interacción
del NO con el grupo hemo, actuando como mecanismo autoregulatorio (Alderton y col.,
2001).
33
________________________________________________________Capítulo II
Es por ello que en la reacción también se agregó mioglobina la cual actúa
como un secuestrante de NO y esto evita la inhibición por producto de la actividad
NOS.
En nuestro caso la omisión de mioglobina en la mezcla de reacción inhibió
completamente la oxidación de NADPH.
II.2. Mecanismo de acción de OtNOS
Se analizó el mecanismo catalítico de OtNOS para lo cual se clonó el dominio oxi de
OtNOS (OtNOSoxi). Se generó una construcción de OtNOSoxi fusionado a una señal
de histidina y luego se realizó la expresión y detección mediante Western Blot. El
dominio OtNOSoxi se identificó con el anticuerpo específico anti-OtNOS (Figura 16). A
partir de 4 litros de cultivo se lograron purificar 40 mg de proteína con una pureza
superior al 80% mediante una columna de afinidad de Níquel (Materiales y Métodos,
inciso 6.2).
Figura 16: Expresión de OtNOSoxi recombinante en E. coli. Se transformó E. coli BL21 con
el vector pET15b y pET15bOtNOSoxi y se indujo la expresión con IPTG 1mM por 24 hs.
Western Blot correspondiente a la proteína OtNOSoxi identificada con el anticuerpo específico
anti-OtNOS. La masa molecular esperada del dominio OtNOSoxi, según la secuencia de
aminoácidos es de 53 kDa. Calle1) Extracto total proteico bacteriano de un cultivo transformado
con el vector vacío pET15b e inducida con IPTG. Calle 2) Extracto total proteico bacteriano de
un cultivo transformado con el vector pET15bOtNOSoxi e inducidas con IPTG.
34
________________________________________________________Capítulo II
Para analizar el mecanismo catalítico de OtNOS se analizaron los espectros de
absorción en el UV-visible. Los cambios en los picos de absorción corresponden a la
transición electrónica de los diferentes estados de energía del grupo hemo y son
indicativos del estado de oxidación y de la coordinación del Fe del grupo hemo.
El dominio OtNOSoxy mostró un pico de absorción centrado en 405 nm,
exhibiendo una mezcla de alto spin correspondiente al Fe del grupo hemo coordinado
por 5 ligandos y spin bajo correspondiente al Fe coordinado por 6 ligandos. La adición
de L-arg cambió el pico de absorción en 398 nm cambiando a alto el spin y tambien la
coordinación del Fe del grupo hemo. No se observó cambio significativo en el spin de
resonancia con el agregado de H4B. La banda α/β características de grupos hemo
oxidados se observa a los 540 nm (Figura 17a). Este mismo comportamiento fue
observado en NOS de expresión constitutiva de mamíferos (Chen y col., 1996).
El espectro de absorción de OtNOS reducida con ditionito de sodio es diferente
al de la mayoría de las NOS de mamíferos. OtNOS reducida presenta un pico
alrededor de 422 nm y una banda α/β con dos hombros (530/558) con una fuerte
banda en 558 nm, lo que podría sugerir una especie de spin bajo hexacoordinado. La
banda a 650 nm desaparece con la reducción con ditionito de sodio (Figura 17 b).
La adición de CO da lugar al bien descripto equilibrio p420/p450 (Gorren y
Mayer., 2007). El pico principal se encuentra en 421 nm, y corresponde a un complejo
penta coordinado FeIICO que ha perdido su ligando tiolato proximal. Un pico menor en
445 nm correspondió a las especies tiolato hexacoordinado de FeIICO. Este último
complejo se convierte en el complejo pentacordinado FeIICO rápidamente. La
reducción de OtNOS requiere una alta concentración de ditionito de sodio y gran
tiempo de equilibrio similar a lo que ha sido observado en eNOS (Figura 17 b) (Sorlie y
col., 2003).
La unión del NO es poco eficiente y de baja afinidad. Se induce la degradación
de OtNOSoxi probablemente por la S-nitrosilación del ligando proximal. En efecto, la
reducción de la fracción de OtNOSoxi-NO conduce a una especie pentacordinado FeII
NO (el NO se une fácilmente al complejo ferroso induciendo el desplazamiento del
equilibrio termodinámico y la captura de FeIINO). La huella espectral fue similar a las
de NOSs de mamíferos: FeIIINO exhibe un pico alrededor de 438 nm y una doble
banda α/β a 545/581 nm. La especie FeIINO exhibió un pico en 396 nm y una sola
banda de α/β alrededor de 570 nm. Sin embargo, en presencia de L-arg, el FeIIINO no
pudo ser visto y el pico se observó a 395 nm con un pico adicional a 374 nm (dato no
mostrado). La reducción por ditionito de sodio indujo la degradación de la proteína y
35
________________________________________________________Capítulo II
convirtió en una especie pentacordinada FeIINO (396 nm y una gran banda α/β en
570 nm) (Figura 17 c).
OtNOSoxi fue sensible a altas concentraciones de NO. Probablemente una Snitrosilación pueda alterar la integridad del grupo hemo.
Figura 17: Efecto de L-arg, H4B, CO y NO en el espectro de absorción de OtNOSoxi: a) Se
estudió la unión del sustrato L-arg y el cofactor H4B a OtNOSoxi mediante el cambio espectal
en UV-vis. Los espectros se realizaron después de dos ciclos de dilución / concentración de la
proteína solubilizada en tampon kPI 0,1 M pH 7,4, L-arg 10 mM y H4B 80 µM. b) Reducción de
OtNOSoxi por la unión de ditionito de sodio y CO. Se analizó el cambio espectral luego del
agregado de ditionito de sodio 5 mM, en dos ciclos de reducción (10mM final) y CO mediante
burbujeo en condiciones de anaerobiosis. c) Interacción de NO con OtNOSoxi. Se analizó el
cambio espectral de OtNOSoxi luego del agregado de NO y la reducción con ditionito de sodio
5 mM en condiciones de anaerobiosis.
36
________________________________________________________Capítulo II
II.3. Actividad de OtNOS expresada en bacterias E. coli.
El tercer objetivo de este Capítulo fue estudiar in vivo la actividad de OtNOS en E. coli
que expresan OtNOS recombinante.
La capacidad de producción de NO por parte de las células de E. coli
transformadas con OtNOS se midió mediante el agregado de sustrato L-arg, el cual se
añadió al momento de la inducción por isopropil tiogalactósido (IPTG). Luego, la
producción de NO se cuantificó durante un período de 120 min. Las bacterias se
preincubaron con la sonda 4-amino-5-metilamino-2',7'-difluorofluoresceina diacetato
(DAF-FM DA) durante 20 min y se cuantificó la fluorescencia en un fluorometro. Las
bacterias de E. coli transformadas con pET24b (vector vacío) o con el vector
pET24bOtNOS no produjeron una cantidad significativa de NO sin el agregado de Larg (Figura 18a y 18b). La adición de L-arg al medio de cultivo de células
transformadas con el vector vacío provocó una pequeña producción de NO
comparándolo sin el agregado de L-arg. Sin embargo, las bacterias que expresan
OtNOS recombinante produjeron hasta 2,5 veces más NO que las células control
(Figuras 18a y 18b). El enantiómero inactivo D-arg no indujo la formación de NO en
ningún cultivo analizado (Figura 18 b).
Gusarov y Nudler (2005) demostraron que el NO confiere citoprotección a
estrés oxidativo en bacterias. Para investigar la tolerancia al estrés oxidativo de las
bacterias que expresan OtNOS, se analizó la inducción de muerte celular por la
exposición a peróxido (H2O2.).
La Figura 18c muestra que las bacterias transformadas con el vector vacío
poseen un índice mayor de muerte celular (30%) luego del tratamiento con H2O2. Sin
embargo, las bacterias que expresan OtNOS presentan una mayor viabilidad que las
bacterias transformadas con el vector vacío, aún sin el tratamiento con H2O2. La
proporción de muerte celular en las bacterias que expresan OtNOS es similar entre las
tratadas y no tratadas con H2O2. Indicando que la protección por NO es independiente
de H2O2 en células de E. coli. Como se muestra en la Figura 18d, las células
transformadas con OtNOS presentaron mayores niveles de NO comparadas con las
células controles. De todos modos, se midieron altos niveles de NO luego del
tratamiento con H2O2, en ambas cepas transformadas con el vector vacío y con
OtNOS, sugiriendo que el H2O2 promueve la producción de NO independientemente de
la presencia de OtNOS recombinante.
37
________________________________________________________Capítulo II
Figura 18. Producción de NO y tolerancia a H2O2 en bacterias E. coli que expresan
OtNOS recombinante. a) Los cultivos de E. coli se indujeron con IPTG en presencia o
ausencia de 1 mM de L-Arg. La fluorescencia se determinó en un fluorómetro utilizando la
sonda DAF-FM DA. Los datos se expresan como unidades arbitrarias por minutos con respecto
a E. coli transformada con el vector vacío pET24b. Se muestra un gráfico representativo de tres
experimentos independientes. b) Cultivos de E. coli inducidos con IPTG (que expresan OtNOS
o transformados con un vector pET24b vacío) se trataron con 1 mM de L-arg o D-arg. La
fluorescencia se determinó en presencia de DAF-FM DA durante un período de 2 hs. Los datos
son expresados como número de veces, respecto al control. Letras diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras de error indican el
error estándar (n = 3). c) Los cultivos de E. coli se trataron con H2O2 30 mM durante 30 min en
presencia de L-Arg 1mM. La muerte celular se determinó usando la sonda Sytox Green. Los
valores se expresan como aumento de número veces con respecto al control. El asterisco
indica diferencia estadísticamente significativa entre el tratamiento con H2O2 y el control (test
de t, p <0,05). Las barras de error indican el error estándar (n = 5). d) El contenido de nitritos,
como medida indirecta de NO se cuantificó con el reactivo de Griess, el NO espontáneamente
se oxida a nitrito y este se acumula intra e intercelularmente. Letras diferentes indican
diferencia estadísticamente significativa (ANOVA, P <0,05). Las barras de error indican SE (n =
3).
38
________________________________________________________Capítulo II
Discusión
La proteína OtNOS recombinante producida en E. coli correspondió a una proteína
soluble y funcional, con una actividad enzimática similar a la iNOS de macrófagos de
ratón (Tabla 1; Stuehr y col., 1991). El valor de Km para L-arg de Ot NOS es de 12 +/5 µM, el cual está dentro del rango de Km de las enzimas NOS previamente
caracterizadas (1 a 22 µM) (Bredt y Snyder, 1990; Stuehr y col., 1991; Roman y col.,
1995; Gerber y col., 1997). No podemos afirmar si la enzima OtNOS es activa
catalíticamente como un monómero o dímero. Algunos estudios indican que las eNOS
en animales pueden ser activas en forma de monómero (Bredt y Snyder, 1990; Mayer
y col., 1991), mientras que iNOS de macrófagos sólo es activa como un dímero
(Stuehr y col., 1991). La presencia de una proteína del tamaño esperado del dímero
OtNOSoxi en la Figura 16 indicaría una gran estabilidad de esta estructura cuaternaria
de OtNOS. Sumado a esto la presencia de todos los sitios involucrados en la
dimerización discutidos en el Capítulo 1, confirmarían la hipótesis de una estructura
dimérica para OtNOS.
La capacidad de unir CaM es muy importante en las enzimas NOS, dado que
forma parte de su regulación catalítica. Por ejemplo, la iNOS de Macrófagos une CaM,
incluso a muy bajas concentraciones de Ca2+. Por lo tanto, la actividad de la iNOS es
Ca2+/CaM independiente (Mayer y Hemmens., 1997; Aoyagi y col., 2003). Por el
contrario, la eNOS y nNOS cuyas actividades son reguladas por Ca2+ unen el complejo
Ca2+/CaM cuando los niveles de Ca2+ son significativamente altos. Es por ello que
estas enzimas son Ca2+/CaM dependientes. Los resultados obtenidos a partir de la
medición de actividad y en el Capítulo 1 sobre la acción del segmento ACE que
bloquea el flujo de electrones en ausencia de CAM y no está presente en OtNOS,
sugieren que la actividad de la OtNOS es principalmente Ca2+/CaM independiente. En
apoyo de este supuesto el segmento ACE tampoco esta presente en la iNOS y si está
presente en la nNOS y eNOS (Salerno y col., 1997).
El cofactor H4B se describió como esencial en la actividad de todas las NOS
estudiadas en animales hasta el momento (Alderton y col., 1996). OtNOS mostró una
dependencia total de H4B, ya que en ausencia de este cofactor no mostró actividad
detectable para ninguno de los métodos utilizados. Cuando se analizó el mecanismo
molecular no se observó un cambio significativo en el espectro correspondiente al
estado oxidativo del Fe del grupo hemo de OtNOS luego del agregado de H4B
probablemente, debido a una baja afinidad por el cofactor H4B.
39
________________________________________________________Capítulo II
La proteína eNOS bovina expresada en E. coli no tiene modificaciones posttraduccionales que se encuentran en la enzima nativa y es libre de H4B (RodríguezCrespo y col., 1996). En presencia de H4B, eNOS tiene un máximo de absorción en
400 nm que se desplaza a 395 nm cuando el sustrato L-arg es agregado. eNOS libre
de H4B es completamente inactiva, pero la actividad catalítica se recupera cuando H4B
es agregado a la reacción. Es de particular interés el hallazgo que muestra que eNOS
libre de H4B existe en un equilibrio monómero-dímero muy similar a lo observado
cuando la proteína es reconstituida con la adición de H4B. Los resultados establecen
que el H4B influye en el entorno del hemo y estabiliza la proteína con respecto a la
pérdida del hemo, pero no se requiere para la formación de dímero (Rodriguez-Crespo
y col., 1996).
Los resultados observados para el mecanismo catalítico de OtNOS se
corresponden con los observados en eNOS, sin embargo lo que es mucho mas
interesante es que el dominio reductasa es similar a una iNOS y su actividad es
mayormente Ca2+/CaM independiente. En conclusión, nuestros datos indicarían que
OtNOS es una quimera entre los dominios reductasa y oxidasa de una NOS inducible
y una NOS constitutiva, respectivamente.
En la última parte de este Capítulo analizamos in vivo la actividad de OtNOS.
La expresión de OtNOS en E. coli generó un incremento en los niveles de NO en las
bacterias. Se ha demostrado que el NO producido por las NOS bacterianas se
requiere para mantener una tasa normal de crecimiento al principio de la fase
estacionaria (Gusarov y col., 2008).
La adición de H2O2 indujo un aumento en la producción de NO en E. coli
transformadas con el vector vacío, sin embargo, este aumento de NO basal no logró
proteger las células contra los efectos nocivos del H2O2. Dado que E. coli carece de
NOS, la producción de NO después del tratamiento con H2O2 podría ser debido a la
capacidad de ciertas NR para reducir nitritos a NO. La producción de NO por cultivos
de E. coli ya ha sido informada previamente (Hutchings y col, 2000.; Corker y Poole,
2003). Por otra parte, el H2O2 es capaz de generar NO por vía no enzimatica a partir
de L-arg o D-arg (Nagase y col., 1997; Gotte y col., 2002). En E. coli se describieron
un conjunto complejo de 80 proteínas inducibles reguladas por un factor
transcripcional llamado regulador redox SoxR frente a las respuestas a H2O2 y O2˙¯
(Greenberg y col., 1990; Liochev y col., 1994). Curiosamente en E. coli, el regulador
SoxR se encontró que puede ser inducido por NO y conferir resistencia bacteriana a
macrófagos múrinos (Nunoshiba y col., 1993).
Los resultados permitieron concluir que OtNOS es activa en E. coli y sugieren
que E. coli presenta todos los cofactores necesarios para la actividad de OtNOS.
40
_______________________________________________________Capítulo III
Introducción
O. tauri es un alga verde unicelular marina del clado Prasinophyceae que pertenece al
grupo Chlorophyta del Reino Plantae y es un componente esencial de fitoplancton.
Prasinophyceaes divergió tempranamente a partir de Chlorophyta y, en consecuencia
del linaje verde (Bhattacharya y Medlin, 1998). O. tauri tiene una posición clave en el
árbol filogenético de la vida eucariótica siendo un modelo potencialmente importante
para diferenciar entre los procesos que son comunes a todos los eucariotas. O. tauri
es la célula eucariota más pequeña de vida libre descripta hasta el momento. Posee
un diámetro de no más de 1 µm. Por otra parte, O. tauri tiene un mínimo de
organización celular, con un núcleo, un cloroplasto, y una mitocondria (Figura19)
(Piganeau y col., 2006). Posee un pequeño genoma de 12,5 Mb completamente
secuenciado y conocido (Derelle y col., 2006; Keeling, 2007). Tres diferentes ecotipos
o especies potenciales de Ostreococcus se han definido en base a su adaptación a la
intensidad de la luz. O. lucimarinus está adaptado a altas intensidades de luz y
corresponde a una cepa aislada de la superficie del océano. El segundo ecotipo
(RCC809) se definió como sensible a la luz e incluye la cepa aislada a los 100 metros
de profundidad en la columna de agua. El tercer ecotipo (O. tauri) corresponde a la
cepa aislada a partir de una laguna costera y se puede considerar como luzpolivalente (Six y col., 2007, 2008). Análisis comparativos de diferentes ecotipos de
Ostreococcus sp ayudarían a comprender la colonización de diferentes nichos por los
eucariotas unicelulares.
Figura 19: O. tauri. a) Imagen de microscopía electrónica correspondiente a O. tauri. b)
Imagen en dos dimensiones de una crioelectro- tomografía de O. tauri. N (núcleo), M
(mitocondria), G (aparato de golgi) C (cloroplasto). c) Predicción de la estructura interna en tres
dimensiones de O. tauri. Adaptada de Koning y col. (2009).
41
_______________________________________________________Capítulo III
Resultados
III.1. Producción de NO en cultivos celulares de Ostreococcus tauri.
Para analizar si O. tauri produce NO en vivo, se incubaron suspensiones celulares con
el fluoróforo específico de NO, DAF-FM DA. La producción de NO se midió durante 60
min con o sin el agregado de L-arg.
La Figura 20a muestra que, dentro de los primeros 30 min, L-arg induce la
producción de NO de una manera dosis dependiente (L-arg 0,5 a 5 mM), alcanzando
la máxima producción de NO a una concentración de L-arg 5 mM (8 veces de
inducción). Los inhibidores de la NOS de mamíferos L-NAME, G-monometil L-arginina
(L-NMMA), y NG-nitro-L-arginina (L-NNA) se utilizaron para confirmar la fuente de
producción de NO en las células de O. tauri tratadas con L-arg. La Figura 20b muestra
que los inhibidores de NOS y el secuestrante de NO, cPTIO redujeron los niveles de
NO luego del tratamiento con L-arg. Por otra parte, el antagonista de CaM
trifluoperazina diclorhidrato (TFP) causó una reducción del 30% en la producción de
NO y este resultado se correlacionó con la actividad de la proteína purificada OtNOS
medida en ausencia de CaM (Tabla 1, Capítulo 2).
42
_______________________________________________________Capítulo III
Figura 20. Producción de NO en O. tauri. a) La fluorescencia emitida por las células O. tauri
(crecidas a 100 µmol.m .s de irradiancia de luz) se determinó usando la sonda DAF-FM DA
-2
-1
en presencia de diferentes concentraciones de L-arg. Los datos se expresan en veces con
respecto al control (unidades arbitrarias por minuto). Recuadro: gráfico representativo de tres
experimentos independientes. La flecha indica el punto utilizado para el cálculo de la
producción de NO. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (test de
t, p <0,05). Las barras corresponden al error estándar (n = 3). b) La fluorescencia se determinó
en un cultivo de células de O. tauri tratado con L-arg 5mM, en presencia y ausencia de los
inhibidores de la NOS, L-NAME 10 mM, L-NMMA 10 mM, y L-NNA 10 mM, el secuestrante
específico de NO, CPTIO 20 µM, o el antagonista de CaM, TFP 100 µM. Los datos se expresan
como veces respecto al control (unidades arbitrarias por minuto). Letras diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras corresponden al error
estándar (n = 3). c) Células de O. tauri tratados o no con L-arg 5mM durante 20 min en
presencia de DAF-FM DA. La producción de NO se visualizó mediante un microscopio de
flourescencia (panel superior). El panel inferior corresponde a el campo claro de cada una de
las imágenes (Materiales y Metodós, inciso 12). Barra = 50 µm.
43
_______________________________________________________Capítulo III
El análisis de microscopía de fluorescencia mostró que la sonda DAF-FM DA
(excitación 495 nm, emisión 515 nm) incremento la emisión de fluorescencia cuando
las células se trataron con L-arg 5 mM comparando con el control (Figura 20c).
También se observó fluorescencia roja, como autofluorescencia de la clorofila (Figura
20c).
Por otra parte, el análogo inactivo de L-arg (D-arg) no fue capaz de inducir una
respuesta como la observada para L-arg. El cPTIO redujo parcialmente los niveles de
NO inducidos por L-arg corroborando por microscopía la cuantificación estimada con el
fluorómetro (Figura 21).
Figura 21. Producción de NO en O. tauri. Células de O. tauri tratadas con L-arg 5mM, D-Arg
5mM, CPTIO 20 µM y L-arg + cPTIO durante 20 min en presencia de DAF-FM DA. La
producción de NO se visualizó mediante un microscopio de flourescencia (panel superior). El
panel inferior corresponde a el campo claro de cada una del las imágenes. Barra = 50 µm.
Con el objetivo de corroborar la fuente de producción de NO, se analizó el
efecto del tungstato sódico, un inhibidor inespecífico de la enzima NR, sobre la
producción de NO inducida con L-arg.
44
_______________________________________________________Capítulo III
Figura 22: Producción de NO en un cultivo de O. tauri pre-tratado con tungstato sódico.
La fluorescencia se determinó con la sonda DAF-FM DA en un cultivo de células pre-tratadas
durante 15 min con diferentes concentraciones de tungstato sódico y luego tratadas o no con
L-arg 5 mM. Los datos se expresan como número de veces respecto al control y corresponden
a unidades arbitrarias por minuto. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras corresponden al error estándar (n = 3).
La Figura 22 muestra que el tungstato sódico en ningúna de las
concentraciones probadas inhibió la producción de NO inducida por L-arg. Este
resultado es otra evidencia que la fluorescencia detectada luego del agregado de L-arg
correspondería a una actividad de tipo NOS y no a una actividad de NR.
Se analizó la presencia y expresión del gen OtNOS mediante ensayos de PCR
y RT-PCR. La Figuras 23a y 23b muestran la presencia del gen OtNOS en O. tauri y
su expresión en condiciones basales ya que se detecta el ARN mensajero
correspondiente (Figura 23b). Este resultado se corresponde con la detección de
actividad NOS en estas condiciones.
45
_______________________________________________________Capítulo III
Figura 23: Producto de amplificación del gen OtNOS a partir de ADN genómico y del
ADNc por RT-PCR de O. tauri. a) Amplificación de ADN genómico de O .tauri. Calle 1) ADN
genómico de O. tauri amplificado con los cebadores OtNOS632Fw y OtNOS632Rv (tamaño de
amplificación esperado 632 pb. Calle 2) Control (-), control de reactivos. Calle 3) ADN
genómico de Anabaena 7120 amplificado con los cebadores OtNOS632Fw y OtNOS632Rv.
Calle 4) Control (+), ADN genómico de O. tauri amplificado con los cebadores Ot18SrFw y
Ot18SrRv para el gen del ARNr 18S (tamaño de amplificación esperado 149 pb). b) Producto
de amplificación del ARN de O. tauri por RT-PCR. Calle 1) RT-PCR amplificado con los
cebadores OtNOS2203Fw y OtNOS2537Rv (tamaño de amplificación esperado 334 pb). Las
secuencias de los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 2, inciso 2 en Materiales y
Métodos.
III.2. Función biológica del NO en cultivos celulares de Ostreococcus tauri.
Se analizó la producción de NO dependiente de L-arg en las distintas fases del cultivo
y diferentes condiciones de irradiación de luz en cultivos de O. tauri.
La Figura 24a muestra que la producción de NO fue mayor en la fase de
crecimiento exponencial y rápidamente cayó al comienzo de la fase estacionaria. El
cambio de radiación de luz de 40 µmol.m-2.s-1 a 100 µmol.m-2.s-1 provocó un aumento
en la producción de NO, tanto en presencia como en ausencia de L-arg (Figura 24b).
Mediante Western Blot utilizando un anticuerpo comercial anti-iNOS se observó que la
adición de L-arg no modificó el nivel de la proteína OtNOS, mientras que el cambio de
baja a alta irradiación indujo un aumento del 30% de OtNOS (Figura 24c). La
especificidad
del
anticuerpo
anti-iNOS
contra
OtNOS
se
confirmó
por
inmunoprecipitación (Figura 25).
46
_______________________________________________________Capítulo III
Figura 24. En O. tauri la producción de NO depende de la irradiación de luz y la fase de
crecimiento. a) O. tauri se cultivó con una irradiación de 40 µmol.m .s . El crecimiento del
-2
-1
cultivo se determinó midiendo la densidad óptica a 660 nm. La producción de NO se determinó
utilizando DAF-FM DA con o sin la adición de L-arg 5 mM. Los asteriscos indican una diferencia
estadísticamente significativa (test de t, p <0,05). Las barras corresponden al error estándar (n
= 3). b) Células de O. tauri crecidas a 40 µmol.m .s de irradiación de luz durante 10 días
-2
-1
fueron sometidas a una irradiación de 100 µmol.m .s durante 24 hs. La producción de NO se
-2
-1
determinó en presencia o ausencia de L-arg 5 mM usando DAF-FM DA. Los datos se expresan
como número de veces (unidades arbitrarias por minuto) con respecto al control. Los asteriscos
indican una diferencia estadísticamente significativa (test de t, p <0,05). Las barras
corresponden al error estándar (n = 3). c) Análisis de la expresión de OtNOS en un cultivo de 2,
5 y 10 días de crecimiento a una irradiación de luz de 40 µmol.m .s y luego de un cambio a
-2
-1
100 µmol.m .s por 3 días. En otro experimento, un cultivo de 10 días irradiado con 100
-2
µmol.m .s
-2
-1
-1
se trató con o sin L-arg durante 1 h. La proteína OtNOS se detectó con un
anticuerpo comercial anti-iNOS. Se incluyó como control de la carga de proteínas la banda
correspondiente a RuBisCo (RbcL). La cuantificación relativa de la OtNOS y rbcL se realizó con
el programa Image J y se muestra en el gráfico de barras. d) Células de O. tauri crecidas a 40
µmol.m .s se transfirieron a 400 µmol.m .s durante 1 h y luego se las regresó a 40 µmol.m
-2
2
-1
-2
-1
-
-1
.s durante 18 h. La producción de NO se analizó utilizando la sonda fluorescente DAF-FM
DA. Los datos se expresan como número de veces (unidades arbitrarias por minuto) con
respecto a las células cultivadas a 40 µmol.m .s . Letras diferentes indican diferencias
-2
-1
estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras corresponden al error estándar (n
= 3).
47
_______________________________________________________Capítulo III
La exposición de organismos fotosintéticos a una intensidad de irradiación de
luz fotoinhibitoria resulta en un estrés oxidativo debido al desequilibrio entre la energía
de la luz absorbida y el máximo de energía que puede ser utilizado en la fotosíntesis.
Se analizó la producción de NO en un cultivo de O. tauri sometido a una
irradiación fotoinhibitoria (cambio de 40 a 400 µmol.m-2.s-1). Un aumento significativo y
repentino en la radiación de luz provoca en O. tauri una fotoinhibición la cual es
reversible (Six y col., 2009). La Figura 24d muestra que la producción de NO en
cultivos celulares de O. tauri expuestas a 400 µmol.m-2.s-1 es 1,75 veces en
comparación con el cultivo que se mantuvo a 40 µmol.m-2.s-1. La producción de NO
alcanzó niveles casi basales cuando el cultivo se retornó a las condiciones controles
40 µmol.m-2.s-1 durante 18 hs (Figura 24d).
Figura 25. Inmmunoprecipitación de la proteína OtNOS utilizando el anticuerpo anti OtNOS. Los extractos de proteína totales de O. tauri fueron incubadas en ausencia (-) o
presencia (+) del anticuerpo anti-OtNOS durante 18 hs. Las proteínas OtNOS acopladas al
anticuerpo anti-OtNOS se inmunoprecipitaron utilizando una matriz de proteína A-Sepharosa.
La fracción sobrenadante (SN) se recuperó. La presencia de OtNOS en el SN se analizó luego
por Western Blot (WB) utilizando el anticuerpo anti-iNOS. La subunidad mayor de la RuBisCo
(RbcL) se utilizó como control de carga, teñida con Ponceau.
Se analizó el efecto del agente oxidante Metilviologeno (MV) o Paraquat, en la
producción de NO en O. tauri. Estos compuestos son utilizados normalmente en
agronomía como herbicidas. Ellos causan un exceso en la producción de ROS, dentro
de los cloroplastos, sometiendo a la planta a un estrés oxidativo severo. En algunos
estudios en algas se ha usado este herbicida para simular un estrés severo por luz. A
partir de estas evidencias decidimos estudiar el efecto del MV sobre la producción de
NO y ROS en O. tauri.
48
_______________________________________________________Capítulo III
Figura 26. Producción de NO y H2O2 en células de O. tauri tratados con Metilviologeno
(MV). a) La fluorescencia correspondiente al NO se determinó con la sonda fluorescente DAFFM DA en un cultivo de O. tauri tratado por 1 h en luz con diferentes concentraciones de MV.
La fluorescencia correspondiente al H2O2 se determinó con la sonda fluorescente 2',7'dichlorodihydrofluoresceina diacetato (H2DCF DA) en un cultivo de O. tauri tratado por 2 hs en
luz bajo las mismas concentraciones de MV. Los datos se expresan como número de veces
(unidades arbitrarias por minuto) con respecto a las células sin tratar. Letras diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras corresponden al error
estándar (n = 3). b) Se analizó la fuente de producción de NO inducida por MV en cultivos de
O. tauri con los inhibidores L-NAME 10 mM y tungstato sódico 100 µM. Los datos se expresan
como número de veces (unidades arbitrarias por minuto) con respecto a las células sin tratar.
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las
barras corresponden al error estándar (n = 3).
En la Figura 26a, se observa que el MV indujo la producción de NO y H2O2, de manera
dosis dependiente. Se evaluó la fuente de producción de NO, inducida por MV para la
cual se midió la producción de NO en presencia del inhibidor especifico de NOS, LNAME, el inhibidor no logró inhibir el efecto del MV indicando que una fuente de
producción de NO diferente a la NOS estaría involucrada (Figura 26b). El genoma de
O. tauri presenta un gen con alta porcentaje homología al gen de la NR encontrada en
algas y plantas superiores (GenBank/EMBL, número de acceso de NR: CAL56049.1).
49
_______________________________________________________Capítulo III
NR es capaz de producir NO a partir de nitrito, y podría ser la fuente enzimática
involucrada en la producción de NO frente a un fuerte estrés foto-oxidativo.
La Figura 26b muestra que el tungstato sódico inhibió la producción de NO
inducida por MV.
Discusión
O. tauri mostró un alto nivel de producción de NO durante la fase de crecimiento
exponencial del cultivo. Dicha producción de NO puede aumentar mediante la adición
exógena de L-arg. Varios estudios demuestran que la disponibilidad de L-arg es un
factor importante en la producción de NO en animales (El-Gayar y col., 2003; Lee y
col., 2003). La disponibilidad endógena de L-arg puede ser regulada por (1) aumento
en la síntesis de “novo” de L-arg, (2) aumento en el transporte a través de la
membrana celular, y (3) la reducción de la actividad de arginasas (Hallemeesch y col.,
2002; Flores y col., 2008). Varios informes confirman que las microalgas excretan
aminoácidos libres al medio (Martin-Jézequel y col., 1988; Penteado y col., 2009).
Nuestros resultados demuestran que el aumento de la concentración de L-arg en el
medio de cultivo incrementa la producción de NO en O. tauri. Esto podría estar
relacionado con el desarrollo y la ecología de las floraciones de algas en el picofitoplancton (Mayali y Azam., 2004; Tillmann y col., 2004). El NO podría participar en
diferentes niveles durante las sucesiones de las floraciones algales. La expresión de
proteínas relacionadas con la muerte celular en la diatomea marina Skeletonema
costatum es inducida por el NO, alta irradiación, y compuestos fotoinhibitorios (Chung
y col., 2008). Vardi y col. (2006) demostraron que, en diatomeas marinas, los
aldehídos promueven la producción de grandes cantidades de NO (a través de una
actividad NOS) y la correspondiente muerte celular. Vardi y col. (2008) también
demostraron que un alto nivel de la producción de NO fue el responsable de la
reducción del crecimiento y el deterioro de la eficiencia fotosintética de la diatomea
Phaeodactylum tricornutum.
Varias líneas de evidencia indican que incrementos en los niveles de NO están
estrechamente relacionados con la regulación de las floraciones de algas. Por lo tanto,
una producción de NO dependiente de L-arg durante el ciclo de vida de O. tauri y la
liberación de aminoácidos durante dichas floraciones podrían tener un impacto
potencial en el ciclo del N en los océanos (Morel, 2008).
Los organismos marinos fotosintéticos enfrentan cambios en el medio ambiente
tales como los cambios de luz y temperatura. La irradiación de un organismo
fotosintético con intensidad de luz fotoinhibitoria provoca la fotoinactivación del
50
_______________________________________________________Capítulo III
fotosistema II (PSII) y genera una respuesta de estrés oxidativo que puede dañar
biomoléculas. Como resultado de la fotoinactivación en O. tauri, la proteína D1 del PSII
se degrada y se reemplaza a través de la síntesis de “novo” de D1 y el montaje del
PSII (Six y col., 2009). En plantas superiores el NO es un potente antioxidante que ha
demostrado proteger del daño fotooxidativo generado por herbicidas a los lípidos,
proteínas incluyendo la proteína D1, y ácidos nucleicos (Beligni y Lamattina., 2002a).
La inducción de la producción de NO en O. tauri tras la exposición a una
intensidad fotoinhibitoria de luz permitiría reducir el daño oxidativo y promover la
protección y/o reparación del aparato fotosintético.
Por lo tanto, tenemos dos efectos posibles y opuestos del NO. Uno estaría
relacionado con la inhibición del crecimiento, el deterioro de la actividad fotosintética y
a la posible muerte celular durante las floraciones algales, tal como se ha descripto en
Diatomeas. El otro se refiere a la capacidad antioxidante del NO y su efecto protector
sobre las proteínas cloroplásticas asociadas a la fotosíntesis y al sostenimiento de los
niveles de clorofila, cuando el organismo esta sometido a un fuerte estrés oxidativo.
Este comportamiento dual hace referencia a la naturaleza química del NO y a su
versatilidad en procesos biológicos.
Una pregunta que aún queda por responder es cual sería el cofactor utilizado
por la NOS de O. tauri en reemplazo de H4B, dado que este organismo carece de las
enzimas involucradas en la biosíntesis de este H4B. En animales, el H4B es sintetizado
a partir de GTP mediante tres reacciones enzimáticas (GTP ciclohidrolasa I, 6-piruvoiltetrahidropterina sintasa, y sepiapterina reductasa) (Thony y col., 2000). O. tauri
carece de estas tres enzimas. Se ha postulado que las NOS bacterianas son capaces
de utilizar otro cofactor llamado tetrahidrofolato (THF) (Adak y col., 2002b).
En la Figura 27 se muestran las estructuras químicas de H4B y THF.
Figura
27:
Estructura
química
de
los
cofactores
tetrahidrobiopterina
(H4B)
y
tetrahidrofolato (THF)
51
_______________________________________________________Capítulo III
O. tauri sintetiza THF y por lo tanto, puede ser que el THF sustituya al H4B en la
síntesis de NO (Figura 28). No existen aún evidencias que confirmen o retracten esta
hipótesis.
,
Figura 28. Biosíntesis de Folatos
Diagrama de las enzimas y compuestos involucrados en la biosíntesis de folatos. En verde se
indican las enzimas presentes en O. tauri. Los recuadros rojos indican la ruta de biosíntesis de
H4B y de THF. Según la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html).
52
_______________________________________________________Capítulo IV
Introducción
Tras descubrir los importantes roles del NO en plantas, muchos investigadores
comenzaron a buscar la presencia de una enzima NOS en plantas. Esta búsqueda ha
sido larga, complicada e infructuosa, ya que la identidad de esta proteína permanece
aún oculta. Aunque los proyectos genómicos no han arrojaron una secuencia con
suficiente homología a la NOS de animales, varios candidatos se han analizados.
Inicialmente, se describió en tabaco una proteína tipo NOS, inducible por patógenos,
identificada como una variante de la proteína P del complejo glicina decarboxilasa de
mitocondria. Sin embargo, no se pudo reproducir su actividad de manera confiable y el
trabajo tuvo que ser retractado (Gas y col., 2009). Más tarde, a través de una
búsqueda de mutantes de A. thaliana deficientes en la acumulación de NO en la raíz,
se identificó el gen AtNOS1 que codifica para una proteína con homología de
secuencia a una NOS hipotética del caracol Helix pomatia y que reacciona con
anticuerpos anti-NOS de mamífero. Aunque ninguna de las dos proteínas presentó
similitud a las NOS animales típicas, cuando se sobre-expresaron en E. coli produjeron
un aumento de la síntesis de NO dependiente de L-arg. Sumado a esto, la evidencia
de que plantas sin AtNOS1 tuvieron menor actividad NOS y menos NO, reforzó la idea
de que era una verdadera NOS (Guo y col., 2003). Sin embargo, varios grupos
demostraron recientemente que esta proteína no es una NOS per se, sino una
GTPasa y estaría asociada de manera indirecta a la acumulación de NO (Zemojtel y
col., 2006; Moreau y col., 2010). Por esta razón AtNOS1 fue renombrada como
AtNOA1 o simplemente NOA (proteína asociada a NO).
Dado que la producción de NO dependiente de una actividad NOS en plantas
aún no está caracterizada, resultó de interés estudiar el comportamiento de plantas
superiores que expresen el gen OtNOS que proviene de otro organismo fotosintético.
Resultados
IV.1. Transformación de Nicotiana tabacum con el vector pCHF3:OtNOS
El primer objetivo del Capítulo fue realizar construcciones con OtNOS bajo el control
de un promotor constitutivo para transformar plantas de N. tabacum (Petit Havana) y
analizar en ellas la producción de NO.
53
_______________________________________________________Capítulo IV
La transformación de las plantas con OtNOS y el análisis se realizó en
colaboración con el Lic. Martin Mayta, la Dra. Anabella Lodeyro y el Dr. Néstor Carrillo
del IBR, Universidad Nacional de Rosario, Argentina.
Las plantas de N. tabacum PH (NtPH) se transformaron con la cepa de A.
tumefaciens
GV3101:pMP90
transformada
con
el
vector
pCHF3:OtNOS.
La
nomenclatura utilizada para las líneas transgénicas que expresan OtNOS citosólica es
NtC (por N. tabacum citosólica), seguido de un número que indica los diferentes
eventos de transformación.
Como resultado de la transformación, se generaron 8 brotes transgénicos T0
independientes. Las plantas T0 mostraron un fenotipo de floración muy temprana con
respecto a las plantas control NtPH (Figura 29a). Esto se observó desde la etapa de
enraizamiento en caja Magenta, donde produjeron meristema de inflorescencia (Figura
29b). Como consecuencia, varias plantas no sobrevivieron la rusticación y murieron al
poco tiempo de ser transplantadas en tierra. Por ello es que a partir de los 8 brotes
que luego produjeron raíz verdadera, sólo 4 sobrevivieron y se extrajo tejido foliar para
realizar los ensayos. Luego de 3,5 meses se cosecharon las semillas T1.
Figura 29. Plantas de N. tabacum PH transformadas con OtNOS. a) Fotografía de las
plantas T0 transformados con el vector pCHF3:OtNOS rusticados y creciendo en tierra. Las
plantas transgénicas florecieron con un crecimiento vegetativo mucho menor que las plantas
controles N. tabacum PH (NtPH). b) Brote transgénico en etapa de enraizamiento en caja
Magenta. El asterisco indica la aparición temprana de un meristema de inflorescencia (ver
recuadro amarillo).
Se realizó la extracción de ADN genómico, para detectar la presencia del
transgén OtNOS mediante PCR en las plantas T0 y líneas NtC5, NtC6, NtC7 y NtC8
(según se indica en Materiales y Métodos inciso 16.2). Las muestras de ADN fueron
separadas por electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % (p/v) para verificar la calidad
de la extracción. Las condiciones de la reacción de PCR se describen en Materiales y
54
_______________________________________________________Capítulo IV
Métodos. Los cebadores utilizados fueron OtNOS632Fw y OtNOS632Rv para
amplificar una secuencia interna de 632 pb.
Se incluyó un control negativo de PCR sin el agregado de templado y un
control de amplificaciones inespecíficas empleando el ADN genómico de una planta N.
tabacum PH sin transformar (control). En el control positivo el templado utilizado fue el
plásmido pCHF3:OtNOS utilizado para transformar y que posee la secuencia
codificante de OtNOS bajo control del promotor 35S del CaMV.
Figura 30. Presencia del transgén en plantas de N. tabacum PH transformadas con
pCHF3:OtNOS. Electroforesis en gel de agarosa al 2 % (p/v) para verificar mediante PCR la
presencia del transgén OtNOS en las plantas T0. Se incluyó un control positivo (+) para el cual
se utilizó el vector pCHF3:OtNOS y uno negativo (-) en el cual no se puso ADN. Los cebadores
utilizados corresponden a OtNOS632Fw y OtNOS632Rv cuyas secuencias se indican en la
Tabla IV inciso 2 en Materiales y Métodos.
En la Figura 30 se observa que el fragmento del transgén de 632 pb se detectó
en cada una de las líneas analizadas y en los controles negativos no se detectó ningún
producto de amplificación.
Determinación de la expresión de OtNOS en las plantas transgénicas.
A partir de tejido foliar de las líneas NtC3, NtC5 y NtC6 se prepararon extractos de
proteínas totales. Las proteínas se analizaron por SDS-PAGE, electrotransferencia e
inmunodetección con anticuerpos comerciales anti-iNOS con el fin de analizar los
niveles de proteína OtNOS.
No se detectaron niveles de OtNOS en ninguna de las plantas analizadas (dato
no mostrado). Se utilizó entonces un anticuerpo anti-OtNOS diseñado a partir de un
péptido (RPQTPGTNDGPRIWC) presente en la secuencia OtNOS. Nuevamente no se
evidenció la presencia de la proteína en ninguna de las líneas transgénicas analizadas
(dato no mostrado).
55
_______________________________________________________Capítulo IV
Debido a los resultados obtenidos se decidió evaluar mediante RT-PCR la
presencia del transcripto OtNOS en las mismas plantas.
Se extrajo ARN a partir de plantas NtPH sin transformar y de las plantas
transgénicas T0. Mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % (p/v) se determinó
la integridad del ARN total (Figura 31a). Los cebadores utilizados en la reacción de
PCR fueron los mismos que los utilizados para analizar la presencia del gen OtNOS en
las plantas transgénicas.
Se incluyó el control negativo de PCR utilizando los mismos reactivos pero sin
el agregado del templado y como control positivo se amplificó el gen OtNOS clonado
en el plásmido pCHF3:OtNOS. Como control de contaminación con ADN genómico se
realizaron reacciones de PCR a partir de muestras de ARN total de las líneas NtC5 y
NtC6. Como control interno de la amplificación se usaron cebadores para el transcripto
del gen tEF-1α (Factor de Elongación de N. tabacum).
Figura 31. Análisis de la expresión del transgén OtNOS por RT-PCR en líneas
transgénicas de NtPH. a) Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % (p/v) para determinar la
integridad del ARN extraído de las plantas T0 de tabaco transformadas con pCHF3OtNOS. Se
sembró 1 µg de cada muestra. b) Electroforesis en gel de agarosa al 2 % (p/v) de los productos
de RT-PCR obtenidos a partir de ARN total proveniente de las líneas NtC5, NtC6, NtC7, NtC8.
Los cebadores utilizados corresponden a OtNOS632Fw y OtNOS632Rv para amplificar el gen
OtNOS y como control interno se utilizaron los cebadores Fw-tEF-α y Rv-tEF-α cuyas
secuencias se muestran en Tabla IV, inciso 2 en Materiales y Métodos.
En la reacción de PCR con los cebadores específicos para OtNOS se obtuvo
un producto de 632 pb en todas las líneas transgénicas y en el control positivo, pero
en el control NtPH, en los controles de contaminación con ADN genómico y en el
control negativo no se obtuvo amplificación. La PCR con los cebadores para el control
interno tEF-1α generó un producto del tamaño esperado (100 pb) en todas las líneas
incluyendo el control NtPH. Por lo tanto el transgén OtNOS se expresó a nivel
transcripcional en todas las líneas analizadas.
56
_______________________________________________________Capítulo IV
Se realizó la estimación de los niveles endógenos de NO a partir de la
cuantificación de nitritos provenientes del tejido foliar de las líneas NtC5, NtC5, NtC6,
NtC7, NtC8 y NtPH. Se prepararon extractos según se indica en Materiales y Métodos
inciso 16.6. Se cuantificó mediante el reactivo de Griess la concentración de nitritos
como medida indirecta de los niveles de NO en las plantas. Sin embargo, no se
detectaron diferencia estadísticamente significativa entre las líneas analizadas y el
control NtPH (dato no mostrado).
Análisis de segregación en la primera generación de las plantas NtPH
transgénicas.
Para estimar el número de loci en que se integró el T-ADN, se sembraron semillas T1
esterilizadas en placas de Petri con MS-0 con Kanamicina y se cultivaron en fitotrón.
Se asumió que si la proporción de segregación KanR: KanS es 3:1, entonces el T-ADN
se insertó en un solo sitio del genoma vegetal (Murgia y col., 2004). El recuento de
plántulas resistentes y sensibles al antibiótico se realizó alrededor de los 30 días
después de la siembra. La segregación 3:1 del gen marcador se evaluó
estadísticamente por análisis χ2 con un nivel de significación de 0,05.
NtC5
NtC6
NtC7
NtC8
χ2 observado
Nº Pántulas
Línea
T0
(segregación 3:1)
Total
191
243
217
252
R
Kan
139
217
167
187
Kan
52
26
50
65
¿χ observado <χ
2
(χ 0,05 = 3,84)
2
2
S
0,43
26,81
0,39
0,08
SI
NO
SI
SI
0,05?
Nº sitios
de inserción
del T-ADN
1
>1
1
1
Tabla II. Análisis de la segregación del gen de resistencia a Kanamicna en las plántulas T1.
Para cada línea se indica el número total de plántulas que germinaron y cuántas fueron o no
resistentes a Kanamicina.
Las líneas NtC5, NtC7 y NtC8 segregaron con una relación 3:1 (Tabla II), sin
embargo, la línea NtC6 no cumplió con la hipótesis de segregación 3:1 del gen de
resistencia a Kanamicina, lo que implica que posee más de una inserción del T-ADN
en su genoma.
Transformación transiente de plantas de N tabacum PH con el gen OtNOS.
57
_______________________________________________________Capítulo IV
Dado que no se logró detectar la proteína OtNOS en las plantas transgénicas y a que
existen evidencias de un incremento en la estabilidad de las enzimas NOS en
presencia del cofactor H4B (Klatt y col., 1995; Tzeng y col., 1995) sumado al hecho de
que las plantas superiores al igual que O. tauri carecen de las enzimas involucradas
en la biosíntesis de H4B. Se decidió expresar transientemente el gen OtNOS en NtPH
en presencia del cofactor H4B. Para ello se realizó la coinfiltración con A. tumefaciens
transformado con el vector pCHF3:OtNOS y el cofactor H4B de acuerdo a la
metodología estándar ( Materiales y Métodos, inciso 15.1).
Con el objeto de identificar si las plantas agroinfiltradas expresaron el transgén
OtNOS, se analizó la presencia del transcripto en el tejido foliar mediante RT-PCR. Se
extrajo ARN a partir de plantas transformadas con el vector vacío pCHF3 y con el
vector pCHF3:OtNOS en presencia o ausencia del agregado exógeno del cofactor
H4B.
Figura 32. Análisis de la expresión del transgén OtNOS por RT-PCR en plantas NtPH
transformadas de manera transientes. a) Electroforesis en gel de agarosa 1 % (p/v) para
determinar la integridad del ARN extraído de las plantas NtPH agroinfiltradas. La nomenclatura
utilizada corresponde a pCHF3:OtNOS para plantas NtPH agoinfiltradas con A. tumefaciens
transformado con el vector anteriormente mencionado; pCHF3:OtNOS /H4B, plantas NtPH
coinfiltradas con A. tumefaciens transformado con el vector pCHF3:OtNOS y con el cofactor
H4B y pCHF3, plantas NtPH agroinfiltradas con A. tumefaciens transformado con el vector
vacío pCHF3. Las extracciones de ARN se realizaron luego de 1 y 3 días de realizada la
agroinfiltración. b) Electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) de los productos de RT-PCR
obtenidos a partir de ARN de plantas NtPH agroinfiltradas como se detalla anteriormente. Los
cebadores utilizados corresponden a OtNOS632Fw y OtNOS632Rv cuyas secuencias se
muestran en la Tabla IV inciso 2 en Materiales y Métodos.
La figura 32b muestra el resultado de RT-PCR. Se observa el producto de
amplificación tanto en presencia como en ausencia de H4B. Los resultados indican que
58
_______________________________________________________Capítulo IV
el transcripto OtNOS está presente en las plantas agroinfiltradas, indicando que el gen
se estaría expresando correctamente.
Nuevamente se extrajo proteínas de cada una de las plantas y se realizó un
Western Blot, utilizando el anticuerpo específico anti-OtNOS y el anticuerpo comercial
anti-iNOS. En ninguno de los dos casos analizados se logró detectar la proteína (dato
no mostrado), sugiriendo que el H4B no logró estabilizar la proteína o mejorar su
detección en nuestras condiciones experimentales.
IV.2. Transformación de plantas de A. thaliana con el vector pCHF3:OtNOS.
Con la intención de estudiar la expresión de OtNOS en el sistema experimental
modelo de A. thaliana, un total de 6 plantas T0 ecotipo Col-0 y 12 plantas Col-0 rdr6 se
transformaron mediante la técnica de “floral dip” (Clough y Bent, 1998), con la cepa de
A. tumefaciens GV3101:pMP90 que posee el vector pCHF3:OtNOS.
Se utilizaron plantas Col-0 rdr6, pues permiten obtener niveles más altos de
expresión de los transgenes (Butaye y col., 2004) ya que son deficientes en el
silenciamiento posttranscripcional (PTGS) (Luo y col., 2007). Luego de 4 semanas se
cosecharon las semillas T1, según las condiciones de crecimiento descriptas en
Materiales y Métodos inciso 15.3.2.
La nomenclatura utilizada para las líneas transgénicas de A. thaliana que
expresan OtNOS en citosol de manera constitutiva fue AtC (por A. thaliana y
citosólica), seguido de un número que indica diferentes eventos de transformación o
líneas.
Selección de plantas transgénicas A. thaliana por resistencia a Kanamicina
Se plaquearon entre 150 y 300 semillas T1 estériles por placa de Petri en MS-0
suplementado con Kanamicina 50 µg/ml. Las plántulas transformadas que expresaron
el gen NPTII resistieron la presencia de Kanamicina y desarrollaron las primeras hojas
verdaderas. Sin embargo, las semillas sin transformar germinaron y quedaron en el
estadio de dos cotiledones completamente cloróticos sin llegar a desarrollar hojas
verdaderas. Luego de 3 semanas, cada una de las plantas T1 resistentes a
Kanamicina (KanR) se transfirieron a tierra.
59
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 33: Floración en líneas de A. thaliana transformadas con pCHF3OtNOS. Fotografía
de algunas líneas de A. thaliana Col-0 rdr6 transformadas con el vector pCHF3:OtNOS. La
floración fue más rápida en las plantas transgénicas (OtNOS) que en las control (rdr6 wt). AtC1,
AtC5, AtC8, AtC13, AtC17, AtC20, AtC23: distintas líneas de A. thaliana transformadas con
OtNOS. rdr6 WT corresponde a las plantas de A. thaliana deficientes en silenciamiento (sin
transformar).
Las plantas transformadas con el pCHF3:OtNOS mostraron un fenotipo de
floración temprana (Figura 33) aunque mucho menos pronunciado que las plantas
NtPH transformadas con OtNOS (Figura 29). También se observó que algunas plantas
produjeron silicuas pequeñas, sin semillas (dato no mostrado).
Análisis de la presencia del transgén de OtNOS en la generación T1 de A.
thaliana Col-0 rdr6 transformadas con el pCHF3:OtNOS.
Se realizó la extracción de ADN genómico, según se indica en Materiales y Métodos
inciso 16.2, para detectar la presencia del transgén de OtNOS mediante PCR en las
plantas AtC1, AtC5, AtC8, AtC13, AtC17, AtC20 y AtC23 de la generación T1.
Se incluyó un control negativo sin el agregado de ADN templado y un control
de bandas inespecíficas empleando ADN genómico de una planta Col-0 rdr6. En el
control positivo el templado utilizado fue el plásmido pCHF3:OtNOS.
60
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 34. Presencia del transgén OtNOS en plantas de A. thaliana transformadas con
pCHF3:OtNOS. Electroforesis en gel de agarosa al 2 % (p/v) para verificar mediante PCR la
presencia del transgén OtNOS en las en las líneas AtC de la generación T1. Se incluyó un
control positivo (+) para el cual se utilizó el vector pCHF3:OtNOS y uno negativo (-) en el cual
no se puso ADN. Los cebadores utilizados corresponden a OtNOS632Fw y OtNOS632Rv
cuyas secuencias se muestran en la Tabla IV, inciso 2 en Materiales y Métodos.
Los productos de amplificación se analizaron en gel de agarosa al 2 % (p/v). Se
obtuvo una amplificación del tamaño esperado de 632 pb para cada una de las líneas
analizadas lo que demuestra la presencia del transgén OtNOS. Las plantas Col-0 rdr6
no evidencian la presencia de dicho amplicón (Figura 34).
Análisis de segregación del gen OtNOS en la generación T2 de las plantas
transgénicas.
Las líneas T1 evidenciaron la presencia del transgén OtNOS se autopolinizaron y se
cosecharon las semillas T2. Éstas se germinaron en MS-0 en presencia de
Kanamicina para determinar la segregación de la resistencia al antibiótico. La
segregación 3:1 del gen marcador se evaluó estadísticamente por análisis χ2 con un
nivel de significación de 0,05.
Línea
T1
χ2 observado
Nº Pántulas
R
S
AtC1
AtC5
AtC8
AtC13
AtC20
Total
116
155
78
34
110
Kan
90
118
69
26
79
Kan
26
37
9
8
31
AtC23
127
0
127
(segregación 3:1)
0,41
0,14
8,14
0,15
0,43
_
¿χ observado <χ
2
2
(χ
2
0,05
= 3,84)
SI
SI
NO
SI
SI
_
0,05?
Nº sitios
de inserción
del T-ADN
1
1
>1
1
1
_
Tabla III. Análisis de segregación de la característica KanR en las plántulas de las líneas de
A. thaliana Col-0 rdr6 que expresan OtNOS. Para cada línea se indica el número total de
plántulas que germinaron y cuántas fueron o no resistentes a Kanamicina.
61
_______________________________________________________Capítulo IV
La línea AtC17 no dío semillas y por lo tanto no se pudo utilizar para este
análisis. Se aceptó la hipótesis de segregación 3:1 para las líneas AtC1, AtC5, AtC13 y
AtC20 pero no para la línea AtC8. La línea AtC8 evidenció una segregación 15:1, que
corresponde a la presencia del T-ADN en dos loci (el valor de χ2 observado para
segregación 15:1 fue de 3,42). La progenie de la planta AtC23 resultó ser totalmente
sensible a Kananamicina. Dado que la misma dio positiva para el transgén OtNOS, se
interpreta que haya ocurrido un silenciamiento génico transcripcional (Elmayan y col.,
1996). La Tabla III presenta un resumen del análisis de segregación de las líneas
transformadas de A. thaliana en la generación T2.
Determinación de la presencia de la proteína OtNOS en la generación T2 de las
plantas transgénicas.
Para identificar las plantas que expresan la proteína de interés, a partir de tejido foliar
de las líneas AtC1, AtC5, AtC8 y AtC13 se prepararon extractos proteicos y se
analizaron por SDS-PAGE y Western Blot con anticuerpos anti-OtNOS .
Figura 35. Análisis de expresión de la proteína OtNOS en A. thaliana mediante Western
Blot. Se obtuvieron extractos de proteínas provenientes de las diferentes líneas de A. thaliana
transformada pCHF3:OtNOS. Como control positivo se utilizó la proteína OtNOSoxi expresada
en forma recombinante en E. coli. La proteína fue reconocida mediante Western Blot con el
anticuerpo específico anti-OtNOS. El tamaño esperado del dominio OtNOSoxi según la
secuencia de aminoácidos es de 53 kDa. En las plantas transgénicas se espera un producto de
119 kDa correspondiente a la proteína OtNOS completa.
La Figura 35 muestra que el anticuerpo anti-OtNOS identificó a la proteína
recombinante OtNOSoxi expresada en E. coli. Sin embargo no se logró detectar la
proteína OtNOS en ninguna de las líneas de plantas transgénicas.
IV.3. Transformación de A .thaliana con el vector pBI-PEC:OtNOS.
62
_______________________________________________________Capítulo IV
Dado que las plantas transgénicas de NtPH y A. thaliana que expresaron OtNOS bajo
el control del promotor CaMV:35S mostraron un fenotipo de floración temprana, se
decidió realizar la sobreexpresión a partir de un vector de expresión en plantas que
tenga un promotor inducible. Ello se logró utilizando el vector pBI-PEC:GUS diseñado
por Cabello y col. (2007). Este vector permite clonar el gen de interés bajo un promotor
inducible por NaCl, ABA y sequía. Este es el promotor PEC del gen Hahb4 de girasol.
Este vector fue gentilmente cedido por la Dra. Raquel Chan de la Universidad
Nacional del Litoral (UNL), Santa Fe, Argentina.
Se realizó una construcción en la cual se clonó el gen OtNOS (pBIPEC:OtNOS) bajo el control del promotor PEC (Materiales y Métodos, inciso 3.5.1).
Se transformaron seis plantas Col-0 rdr6 y seis plantas Col-0 con las cepas de
A. tumefaciens GV3101:pMP90 que posee el vector pBI-PEC:OtNOS, mediante la
técnica de “floral dip” (Clough y Bent, 1998), cuando aún tenían las inflorescencias
secundarias inmaduras y una altura entre 1 y 10 cm. Luego de 4 semanas se
cosecharon las semillas T1. Nuevamente se utilizaron plantas Col-0 rdr6, pues
permiten obtener niveles más altos de expresión de los transgenes (Butaye y col.,
2004)
La nomenclatura utilizada para las líneas transgénicas de A. thaliana que
expresan OtNOS en citosol de manera inducible es rdr6 o Col-0 seguido de un número
que indica los diferentes eventos de transformación o líneas.
Selección de plantas transformadas por resistencia al antibiótico Kanamicina y
análisis del transcripto OtNOS en las plantas transformadas con el vector pBIPEC:OtNOS luego de la inducción con NaCl y ABA.
Con el objeto de identificar las líneas que expresan el transgén OtNOS, se decidió
comprobar la presencia del transcripto en A. thaliana luego de la inducción.
Las plantas se crecieron en medio ATS-agar en presencia de Kanamicina por 5
días, luego se transfirieron durante 5 días mas a los tratamientos NaCl 100 mM y ABA
10 µM. Se extrajo ARN de plantas Col-0 rdr6 transformadas con el vector vacío pCHF3
y de las plantas Col-0 rdr6 transformadas con el vector pBI-PEC:OtNOS.
Se amplificó el gen OtNOS mediante RT-PCR, los cebadores utilizados en la
PCR fueron los mismos que se utilizaron para determinar la presencia del gen OtNOS
en el resto de las plantas transgénicas.
63
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 36. Análisis de la expresión del transgén OtNOS por RT-PCR en líneas de A.
thaliana transformadas con pBI-PEC:OtNOS. a) Electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v)
de los productos de RT-PCR obtenidos a partir de ARN de A. thaliana Col-0 rdr6 transformada
con pBI-PEC:OtNOS. Las líneas rdr6(1), rdr6(2), rdr6(3), rdr6(4), rdr6(6), rdr6(7) corresponden
a los diferentes eventos de transformación con el vector pBI-PEC:OtNOS, el control rdr6pCHF3
corresponde a A. thaliana Col-0 rdr6 transformada con el vector pCHF3. Las plantas se trataron
con NaCl 100mM y ABA 10µM durante 5 días. b) Como control interno se amplificó el gen de
Actina. Los cebadores utilizados corresponden a OtNOS632Fw / OtNOS632Rv y ActinaFw(At) /
ActinaRv(At) cuyas secuencias se indican en la Tabla IV en Materiales y Métodos, inciso 2.
Las Figuras 36a y 36b indican que la valoración semicuantitativa por PCR
evidenció un aumento en los niveles de los transcriptos de OtNOS inducidos por el
tratamiento con NaCl en la mayoría de las líneas analizadas. En el caso de el
tratamiento con ABA se observó un incremento en los niveles de los transcriptos
OtNOS en las líneas rdr6(3), rdr6(4), rdr6(6).
Fenotipo de plantas transgénicas de A. thaliana transformadas con pBIPEC:OtNOS luego de la inducción con NaCl.
Con el objeto de analizar si existió un cambio en el fenotipo de las plantas
transgénicas luego de la inducción del gen OtNOS se analizó el área foliar de las
plantas luego del tratamiento con NaCl 100 mM.
64
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 37. Efecto del NaCl sobre el área foliar de plantas de A. thaliana transformadas
con pBI-PEC: OtNOS. Fotografía de plantas A. thaliana Col-0 rdr6 transformadas con el vector
pBI-PEC:OtNOS denominadas rdr6OtNOS(6) y rdr6OtNOS(7). Como control se usaron plantas
transformadas con el vector pCHF3 denominadas rdr6pCHF3. Crecidas en medio MS-Agar por
5 días y luego transferidas a NaCl 100 mM por 5 días más. Barra de escala = 2 cm. En las fotos
se muestra la cuantificación del área foliar promedio de cada planta para cada tratamiento. La
cuantificación se realizó con el Programa Image J. Las barras corresponden al error estándar.
El asterisco indica una diferencia estadísticamente (test de t, p <0,05). En el panel superior se
muestra la línea rdr6OtNOS(6) y en el panel inferior la línea rdr6OtNOS(7).
La Figura 37 muestra que las líneas rdr6OtNOS(6) y rdr6OtNOS(7)
evidenciaron un mayor desarrollo foliar luego del tratamiento con NaCl comparado con
las plantas transformadas con el vector pCHF3.
Dado que un mayor desarrollo foliar podría corresponder a un mayor
crecimiento radical, se analizó el fenotipo de las raíces de las plantas transgénicas
luego de la inducción del gen OtNOS con NaCl.
65
_______________________________________________________Capítulo IV
La longitud de la raíz primaria y la densidad de raíces laterales determinan la
arquitectura radical (Malamy y Benfey, 1997). Los procesos que afectan a la
arquitectura general del sistema de la raíz son: (1) la división celular en el meristema
de raíz primaria que permite el crecimiento continuo mediante la adición de nuevas
células, la formación y elongación de raíces laterales lo que aumenta la capacidad
exploratoria del sistema radical (Lopez-Bucio y col., 2003).
Los parámetros analizados correspondieron al largo de la raíz primaria,
número y largo de raíces laterales.
Figura 38: Fenotipo de raíces de plántulas de A. thaliana transformadas con el vector
pBI-PEC: OtNOS y tratadas con NaCl. a) Fotografía de plantas de A. thaliana rdr6OtNOS(6) y
plantas control rdr6pCHF3. Las plantas se crecieron en medio MS-Agar por 5 días y luego se
transfirieron a un medio MS-Agar con NaCl 100 mM por 5 días más. En el panel superior se
muestran las plantas crecidas en medio MS y en el panel inferior las plantas transferidas a
NaCl. Barra de escala = 1 cm. b) En el panel superior se muestra la cuantificación del número
de raíces laterales para los tratamientos anteriormente indicados. Las líneas utilizadas fueron
A. thaliana Col-0 rdr6 transformadas con el vector pBI-PEC:OtNOS: líneas rdr6OtNOS(6) y
rdr6OtNOS(7). A. thaliana Col-0 transformadas con el vector pBI-PEC:OtNOS denominadas:
líneas Col0OtNOS(1) y Col0OtNOS(2). A. thaliana de ambos genotipos transformadas con el
vector pCHF3 como control. En el panel inferior se muestra la cuantificación de la longitud de
raíces primarias de A. thaliana sometidas a los tratamientos anteriormente indicados. Letras
diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras
corresponden al desvío estándar.
66
_______________________________________________________Capítulo IV
Las Figuras 38a y 38b muestran que el tratamiento con NaCl 100mM indujo
una inhibición de la raíces laterales y de la raíz primaria correspondiendo con lo
descripto en plantas de A. thaliana sometidas a esta concentración de NaCl (Mitler y
col., 2006).
Las plantas transgénicas mostraron una menor inhibición de el sistema radical
comparado con las plantas controles. Esta tendencia fue más evidente en las líneas
transgénicas de genotipo Col-0 rdr6, las cuales son deficientes en silenciamiento
postranscripcional, esto podría indicar una mayor expresión del transgén OtNOS en
estas líneas. Se cuantificó también el largo de las raíces laterales pero no se
observaron diferencias estadísticas significativas en ninguna de las líneas analizadas
(dato no mostrado).
Fenotipo de plantas transgénicas de A. thaliana transformadas con pBIPEC:OtNOS luego de la inducción con ABA.
Dado que se observó la inducción del transgén OtNOS con ABA (Figura 36), se
analizó el fenotipo de las raíces del las plantas transgénicas luego de la inducción con
ABA 10µM. Se utilizaron la líneas transgénica de A. thaliana genotipo Col-0 rdr6 ya
que mostraron diferencias significativas en los parámetros anteriormente analizados.
67
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 39: Fenotipo de raíces de plántulas A. thaliana transformadas con el vector pBIPEC:OtNOS y tratadas con ABA. a) Fotografía de plántulas de A. thaliana Col0rdr6 (6) y
plantas control rdr6 pCHF3. Las plantas se crecieron en medio ATS-Agar por 5 días y luego se
transfirieron a medio ATS-Agar con ABA 10 µM durante otros 5 días más. En el panel superior
se muestran las plántulas crecidas en medio ATS y en el panel inferior las plántulas
transferidas a medio ATS con ABA 10 µM. Barra de escala= 1cm. b) En el panel superior se
muestra la cuantificación del largo promedio de las raíces laterales crecidas en medio ATSAgar por 5 días y luego transferidas al tratamiento ABA 10 µM. Líneas rdr6OtNOS (3),
rdr6OtNOS (4), rdr6OtNOS (6), rdr6OtNOS (7) y rdr6pCHF3 como control. En el panel inferior
se muestra la cuantificación del número de raíces laterales por planta de A. thaliana sometidas
al tratamiento anteriormente indicado. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente
significativas (ANOVA, P <0,05). Las barras corresponden al desvío estándar.
Se observó una diferencia significativa en el número y largo de las raíces
laterales luego del tratamiento con ABA 10 µM en la mayoría de las líneas analizadas.
La Figura 39b muestra que el ABA indujo un drástico descenso del número de las
raíces laterales en las plantas que no expresan OtNOS como ya ha sido informado
anteriormente (DeSmet y col., 2007; Dongliang y col., 2009). Sin embargo en la
mayoría de las líneas transgénicas se observa que la reducción del número de las
raices laterales es menor al de las plantas controles luego del tratamiento con ABA
(Figuras 39b). Por otro lado, se observa un aumento significativo en la longitud de las
raíces laterales luego del la inducción con ABA en las líneas transgénicas (Figura
39a).
68
_______________________________________________________Capítulo IV
Cuantificación de los niveles de nitritos en las plantas transformadas con el
vector pBI-PEC:OtNOS .
A partir de tejido foliar de las líneas Col0OtNOS(1), Col0OtNOS(2), rdr6OtNOS(6) y
rdr6OtNOS(7) se prepararon extractos según se indica en Materiales y Métodos inciso
16.6 y se cuantificó mediante el reactivo de Griess la concentración de nitritos como
medida indirecta de los niveles de NO en las plantas.
Figura 40. Cuantificación de nitritos en plantas transgénicas. La cuantificación de nitritos
se realizó con el reactivo de Griess en plántulas crecidas en medio ATS-Agar por 5 días y
luego transferidas a medio ATS-Agar con ABA 10 µM por 5 días más. Las líneas analizadas
correspondieron a Col0OtNOS(1), Col0OtNOS(2), rdr6OtNOS(6), rdr6OtNOS(7) y Col0pCHF3.
La Figura 40 muestra que el ABA indujo un incremento en los niveles de nitritos
de 4 veces aproximadamente en las plantas transformadas con el vector vacío pCHF3.
En las plantas transgénicas los niveles cuantificados fueron mayores para todas las
líneas analizadas. Resta por analizar los niveles de nitritos en plantas genotipo Col-0
rdr6 transformadas con el vector pCHF3.
Efecto de la sequía en las plantas transgénicas.
Dado que el NO ejerce un efecto protector frente a la sequía (Tian y col., 2006) y
además el promotor PEC se induce por estrés hídrico (Dezar y col., 2005) se evaluó el
comportamiento de las plantas transgénicas sometidas a estrés por sequía.
69
_______________________________________________________Capítulo IV
Figura 41. Efecto de la sequía en plantas de A. thaliana genotipo Col-0 rdr6
transformadas con pBI-PEC:OtNOS. Las plántulas se crecieron durante 3 semanas en un
sustrato de perlita/vermiculita/tierra con riego normal. En el panel superior se muestran las
plántulas luego de 8 días de suspendido el riego. En el panel inferior se muestran las plántulas
luego de 10 de días de riego suspendido más 10 días de recuperación con riego normal.
La Figura 41 muestra que las líneas rdr6OtNOS(6) y rdr6OtNOS(7) presentaron
mayor tolerancia a la sequía. La línea rdr6OtNOS(6) mostró un porcentaje de
supervivencia del 33 %, la línea rdr6OtNOS(7) el porcentaje fue del 10%, sin embargo
la línea rdr6OtNOS(2) mostró una supervivencia del 0% al igual que las plantas control
rdr6pCHF3 luego del estrés. Este resultado se corresponde con los mostrados en la
Figura 36, la línea rdr6OtNOS(2) no mostró expresión del transgén luego de los
tratamientos con ABA y NaCl, si bien los niveles de transcriptos mostrados provienen
de una RT-PCR no cuantitativa.
70
_______________________________________________________Capítulo IV
Discusión
En el presente Capítulo se demostró que las plantas transformadas con el gen OtNOS
bajo un promotor CaMV:35S presentaron un fenotipo de floración temprana, si bien no
se pudo conocer las causas de dicho fenotipo, el mismo se contradice con el fenotipo
descripto por He y col. (2004). En ese trabajo, se informó que el NO reprime la
transición floral en A. thaliana. Las plantas tratadas con NO, así como una
sobreproducción de NO en la mutante (nox1), mostraron una floración tardía, mientras
que un mutante que produce menos NO (Atnoa1) florece mas temprano que las
plantas salvajes (He y col., 2004).
La plantas transgénicas CaMV:35SOtNOS podrían presentar un silenciamiento
postrancripcional de algún gen endógeno y el fenotipo observado podría estar
relacionado con este tipo de silenciamiento. Estudios previos indicaron que en general
plantas transgénicas que sobreexpresan un transgén bajo un promotor CaMV:35S,
podían evidenciar diferentes tipos de silenciamientos (Stam y col., 1997). Estos se
clasifican en silenciamiento transcripcional y silenciamiento postranscripcional de
genes endógenos. En el primer caso corresponde a la inserción del transgén en un
promotor o en un gen endógeno impidiendo la expresión del gen modificado. Por otra
parte, el silenciamiento postrancripcional se refiere al silenciamiento de genes por
homología de secuencia, cuando existe una muy alta expresión del transgén. Se ha
postulado el rol de los ARNs complementarios (ARNc) sintetizados en plantas por ARN
polimerasas dependientes de ARN presentes en el citoplasma (RdARN). Estas
RdARN sintetizan pequeños ARN a partir de ARN como templado y estos pequeños
ARN podrían hibridar y las dobles cadenas de ARN serían degradadas por ARNasas
específicas. Estas plantas transgénicas presentan el mismo fenotipo de plantas
mutantes en el gen silenciado. Un ejemplo particular se da en plantas de tabaco
transgénicas que sobreexpresan el gen NR (Nitrato Reductasa) bajo un promotor
CaMV:35S cuyo fenotipo es el opuesto al esperado con plantas más pequeñas y
cloróticas. Los autores sugieren que este fenotipo se debe a un silenciamiento del gen
endógeno de la NR (Dorlhac de Borne y col., 1994).
Por otra parte, las plantas de A. thaliana Col-0 rdr6 que se transformaron con el
vector pBI-PEC:OtNOS, luego de la inducción con ABA o NaCl desarrollaron un mayor
sistema radical, lo cual podría aportar una mayor tolerancia a situaciones de estrés. El
comportamiento de dichas plantas a nivel radical también se correspondió con un
mayor desarrollo de la parte aérea.
71
_______________________________________________________Capítulo IV
En este sentido, Correa Aragunde y col. (2007) y Gouvea y col. (1997),
describieron que el NO proporcionado a través SNP promovió el desarrollo de raíces
laterales en plantas de tomate y maíz.
Otras evidencias indicaron que el SNP disminuyó el efecto inhibitorio del ABA
sobre la densidad de raíces laterales sugiriendo que el NO actúa río abajo del ABA.
(Sivananthan, 2006).
El NO producido por la sobreexpresión de OtNOS podría secuestar los ROS
generados durante el estrés como ha sido previamente demostrado por Caro y
Puntarulo (1998). Durante la sobreproducción de ROS debido a un estrés, el NO
tendría una función protectora eliminando el exceso de ROS y frenando la oxidación
de lípidos mediada por radicales (Beligni y Lamattina, 1999a). El pretratamiento de
plántulas de Lupinus luteus con SNP produce una reducción efectiva de los daños
producidos por estrés abiótico sobre el crecimiento y morfología de la raíz y el efecto
protector del NO sobre las raíces estresadas puede ser debido a la estimulación de la
actividad de SOD y/o al secuestro directo del anión O2˙¯ por parte del NO (Kopyra y
col., 2003).
En un trabajo recientemente publicado se demostró que plantas transgénicas
de A. thaliana que sobrexpresaron la enzima nNOS de rata en forma constitutiva bajo
el promotor CaMV:35S, presentaron mayor resistencia a sequía y salinidad. La mayor
tolerancia se adjudicó a cambios en parámetros fisiológicos incluyendo una reducción
en la tasa de pérdida de agua, una menor apertura estomática, y una alteración en los
niveles prolina y malondialdehído (Shi y col., 2012).
En su conjunto, estos resultados mostrarían que, además del efecto del NO de
promover el cierre de los estomas, previniendo la perdida de agua en condiciones de
estrés hídrico (Garcia Mata y Lamattina., 2001), el NO podría actuar a nivel de la
regulación de la homeostasis redox.
Las plantas transgénicas generadas durante esta tesis permitirán abordar el
estudio de los mecanismos del NO involucrados en la respuesta a estrés por sequía y
salinidad, debido a que las plantas transgénicas presentan una regulación de
expresión controlada por estos tipos de estreses ambientales.
72
___________________________________________________Discusión General
DISCUSIÓN GENERAL
Las funciones del NO se han diversificado y especializado durante la evolución con la
aparición de organismos pluricelulares. Es probable que el NO se haya ido
involucrando progresivamente en la señalización inter e intracelular.
En bacterias además de ser el NO un producto del metabolismo del N (Zumft y
col., 1993), el NO es también generado por procesos oxidativos a partir del aminoácido
L-arg y mediante la actividad de la enzima NOS. Las bacterias presentan una NOS
truncada, con un dominio oxidasa que es capaz de producir NO (Crane y col., 2010).
En eucariontes, las NOS adquirieron un dominio reductasa y un sitio de unión a
CaM alcanzando una mayor eficiencia y sofisticación de la regulación de la actividad
enzimática, ya que pueden ser activadas por aumento de los niveles de Ca2+ (Alderton
y col., 2001). OtNOS posee un sitio de unión a CaM, el cual no es muy conservado
respecto a las NOS estudiadas en animales y posee una dependencia parcial de CaM.
Mediante un análisis filogenético se determinó que OtNOS se encuentra en el mismo
grupo que la NOS de Synechococcus sp y P. polycephalum.
Por otra parte, un análisis ‘in sílico’ de la secuencia NOS de Synechococcus sp
(SyNOS) se observó que conserva los dos dominios oxigenasa y reductasa
característicos de las NOS de mamíferos, pero carece del sitio de unión a CaM
(Correa-Aragunde, comunicación personal). A su vez, la proteína NOS de P.
polycephalum muestra una actividad independiente de Ca2+/CaM (Golderer y col.,
2001). Todos estos datos podrían estar indicando cuando las NOS adquirieron el sitio
de unión a CaM a lo largo de la evolución biológica. Las formas de NOS que presentan
una regulación por Ca2+/CaM se encuentran en organismos pluricelulares complejos
demostrando la aparición de estructuras más sofisticadas de NOS en organismos más
evolucionados (relación estructura/función). Otra evidencia en el mismo sentido es la
proteína NOS en Sorangium celullosum, la cual es la primera NOS bacteriana
conocida hasta el momento que presenta un dominio reductasa fusionado a un
dominio oxidasa. Al igual que todas las NOS bacterianas anteriormente analizadas
carece del sitio de unión a CaM (Agapie y col., 2009).
La función del NO en mamíferos está relacionada con la señalización
intercelular. La primera NOS que se identificó fue encontrada en el tejido neuronal y
corresponde a nNOS, la eNOS fue la tercera identificada. Se clasificaron originalmente
como de expresión constitutiva y Ca2+ sensibles, pero ahora se sabe que están
presentes en muchos tipos de células diferentes y que la expresión está regulada por
determinadas condiciones fisiológicas (Alderton y col., 2001).
73
___________________________________________________Discusión General
Concentraciones fisiológicas de Ca2+ regulan la unión de CaM a nNOS y eNOS,
iniciando así la transferencia de electrones desde las flavinas al grupo hemo. No
ocurre lo mismo con la iNOS en la que la CaM se mantiene fuertemente unida
resultando en una isoforma insensible a Ca2+ y actuando como una subunidad de esta
isoforma (Alderton y col., 2001). iNOS es expresada en macrófagos los cuales
producen altos niveles de NO que resultan citotóxicos para bacterias y para las células
que lo producen. La expresión de iNOS depende de la exposición de las células a
citoquinas y productos bacterianos (Stuehr y col., 1991).
Puede concluirse entonces que O. tauri es un organismo eucariota unicelular
muy sencillo, con un solo cloroplasto y una sola mitocondria y posee una NOS con un
sitio de unión a CaM. Esto confirma que en las NOS estudiadas hasta el momento, la
adquisición de un sitio de unión a CaM corrrespondería a organismos eucariotas.
La producción de NO dependiente de NOS puede regularse por sí mismo,
modulando el NO la expresión y la actividad de la NOS. Específicamente, se ha
demostrado que el NO desempeña un papel importante en la retroalimentación
negativa en eNOS. Este proceso ocurre mediante la S-nitrosilación de eNOS que
inhibe reversiblemente su actividad en las células endoteliales vasculares. Este
mecanismo de regulación puede ser importante ya que está modulado por las
condiciones redox celulares y por lo tanto puede proporcionar una explicación para
asociar el "estrés oxidativo" y la disfunción endotelial (Alderton y col., 2001).
OtNOS muestra una fuerte inhibición por NO. Estos resultados podrían estar
indicando una auto-regulación de la actividad por un proceso de S-nitrosilación tal
como ha sido caracterizado para eNOS. Será interesante investigar este punto en el
futuro.
En bacterias, las NOS están relacionadas con la regulación del estrés
oxidativo. Por ejemplo, se sabe que la NOS de Bacillus subtilis está relacionada con la
resistencia de las bacterias al estrés oxidativo generado por H2O2, o algunos
antibióticos como la ampicilina (Gusarov y col., 2009). Nuestras evidencias indican que
OtNOS se induce en O. tauri en respuesta a un incremento en la intensidad de luz y
esta inducción de NO vía NOS podría estar involucrada en la protección del alga frente
a un estrés fotoxidativo o en procesos de desarrollo regulados por luz. En un estudio
previo se ha demostrado que la luz controla el desarrollo del hongo Phycomyces
blakesleeanus (Maier y col., 2001). La inhibición de la biosíntesis de H4B inhibe la
fotomorfogénesis en el hongo.
74
___________________________________________________Discusión General
Se ha demostrado que la luz induce la producción y emisión de NO en el
mismo orden de magnitud que la formación de L-cit a partir de L-arg. El dador de NO
SNP puede sustituir el efecto de la luz sobre el desarrollo del hongo y los inhibidores
de NOS reprimirlos, sugiriendo que una NOS está implicada en el desarrollo y en la
señalización por luz en este hongo (Maier y col., 2001).
Por otro lado se ha encontrado que la radiación UV-B induce la producción de
NO en el alga Chlorella pyrenoidosa. El agregado de SNP fue capaz de prevenir la
pérdida de clorofila mediada por UV-B. Además, las suspensiones de algas irradiadas
por UV-B aumentaron la actividad de las enzimas antioxidantes catalasa y superóxido
dismutasa. El UV-B también mostró ser un potente inductor de la producción de NO el
cual, conjuntamente con las actividades antioxidantes, logró proteger el alga contra el
daño oxidativo (Chen y col., 2003). Por lo tanto, el conjunto de estos resultados
muestra que el NO puede estar involucrado tanto en la regulación de los procesos del
desarrollo como en la defensa antioxidante de O. tauri.
El NO ha surgido como una molécula clave implicada en muchos procesos
fisiológicos en las planta. Si bien no se ha encontrado en plantas superiores ningún
gen, ADNc o proteína con homología de secuencia a las NOS animales, numerosos
estudios provenientes de diferentes laboratorios demuestran una producción de NO
dependiente de una actividad tipo NOS en plantas. En esta tesis se transformaron
plantas de A. thaliana y N. tabacum con el gen OtNOS para estudiar su
comportamiento
en
situaciones
de
estrés.
Las
plantas
transgénicas
que
sobreexpresan OtNOS bajo un promotor inducible muestran mayor desarrollo radical y
tolerancia a estrés salino. En la mutante Atnoa1 con niveles reducidos de NO la
germinación y tasa de supervivencia se reduce en presencia de sal. Plantas mutantes
Atnoa1 mostraron mayores niveles de H2O2 que las plantas salvajes en estrés salino y
el tratamiento con SNP revirtió la sensibilidad a la sal (Zhao y col., 2007). Nuestros
resultados se encuentran en el mismo sentido que las respuestas de las mutantes
Atnoa1 al estrés salino. Por lo tanto, los resultados de esta tesis proporcionan una
nueva línea de evidencia indicando que la producción de NO se asocia con tolerancia
a la salinidad en A. thaliana.
La acumulación de ABA y el estrés oxidativo son dos respuestas comunes de
las plantas al estrés ambiental y objeto de intensos estudios. Zhao y col. (2001)
analizaron los efectos de los ROS y el NO en la síntesis de ABA en puntas de raíces
de plántulas de trigo (Triticum aestivum) bajo estrés por sequía. Las raíces fueron
sometidas a estrés hídrico por evaporación y las actividades de producción de O2˙¯ y
75
___________________________________________________Discusión General
la actividad tipo NOS aumentaron después del tratamiento. La acumulación de ABA
por sequía se bloqueó con el inhibidor de la NOS (L-NAME) sugiriendo que los ROS y
el NO pueden ser las señales primarias que la planta percibe en la condición de
sequía y tal vez otros estreses abióticos.
El conocimiento sobre el NO y su papel en el crecimiento de raíces y los
procesos de desarrollo de las plantas se ha incrementado en los últimos años
(Pagnussat y Lamattina, 2002; Correa y col., 2007). El aumento transitorio de la
concentración de NO demostró estar involucrado en el desarrollo de raíces inducida
por auxinas (Pagnussat y col., 2002). Los autores sugieren que el NO podría mediar la
respuesta a auxina en este proceso. Mas recientemente, se ha demostrado que el NO
S-nitrosila el receptor de auxina TIR1 y regula la señalización disparada por auxinas,
especialmente la activación de genes que responden a auxinas (Terrile y col., 2012).
Finalmente, los estudios sobre la expresión del transgén OtNOS en plantas
indicaron cambios en las respuestas del desarrollo tal como el crecimiento de raíces
laterales, además de una mayor tolerancia al estrés salino. Aún restan por estudiar los
mecanismos moleculares que operan río abajo del NO en la regulación de los
procesos fisiológicos.
En conclusión, el conjunto de las evidencias que se describen en esta tesis
permitieron evaluar las hipótesis planteadas en los objetivos.
Hipótesis 1: La secuencia génica correspondiente a OtNOS publicada en la
base de datos NCBI codifica para una proteína NOS y se expresa en O. tauri.
Mediante la secuenciación del ADNc correspondiente a OtNOS encontramos
un error de un nucleótido en la secuencia publicada en NCBI. Sin embargo, el error no
implicó ningún dominio crítico de unión a cofactores y la proteína heteróloga se
expresó correctamente.
Hipótesis 2: El gen OtNOS codifica para una proteína NOS funcional en O.
tauri.
Los análisis de secuencia y estructura mostraron que OtNOS presenta una
similitud del 45% con las NOS humanas, todos los sitios de unión a cofactores se
encuentran conservados y el dominio catalítico mostró ser idéntico a eNOS de Bos
turus. La proteína OtNOS recombinante mostró parámetros bioquímicos similares a las
enzimas NOS animales en cuanto a actividad, Km y dependencia de cofactores.
76
___________________________________________________Discusión General
Por otra parte los análisis del mecanismo catalítico indicaron que OtNOS
conserva las características de formación de un compuesto oxido ferroso en el grupo
hemo al igual que todas las NOS estudiadas.
Hipótesis 3: El NO generado a partir de OtNOS cumple funciones en el
metabolismo celular del alga.
Se observó una producción de NO dependiente de L-arg en el cultivo de O.
tauri. Esta producción de NO dependiente de L-arg fue bloqueada por los inhibidores
de NOS animales, indicando la presencia de una actividad tipo NOS en O. tauri. Los
resultados mostraron que la producción de NO a través de OtNOS estaría involucrada
en procesos de adaptación de O. tauri a diferentes intensidades de luz.
Hipótesis 4: La expresión regulada de OtNOS conferirá una cierta protección y
tolerancia a diferentes tipos de estreses en plantas genéticamente transformadas.
Las plantas transformadas con el vector pBI-PEC:OtNOS mostraron mayor
desarrollo del sistema radical y mayor tolerancia al estrés salino. Por otra parte cuando
estas plantas fueron inducidas con ABA lograron evadir el efecto inhibitorio de la
hormona sobre el desarrollo de las raíces laterales. Se observó que las plantas
transgénicas mostraron una mayor supervivencia luego de ser sometidas a estrés
hídrico.
Perspectivas.
Continuar con los estudios del mecanismo catalítico de OtNOS, centrados
principalmente en el análisis de la función del cofactor THF reemplazando el cofactor
H4B ausente en Ostreococcus y plantas superiores.
Profundizar los estudios sobre la función fisiológica del NO y de OtNOS en O. tauri
mediante el silenciamiento génico de OtNOS.
Estudiar en profundidad los procesos que involucran el NO en respuestas al estrés
hídrico y salino en A. thaliana y N. tabacum utilizando las herramientas generadas
como las plantas transgénicas que expresan OtNOS bajo un promotor inducible por los
estreses mencionados.
77
_________________________________________________Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material biológico.
1.1 Bacterias.
1.1.1. Escherichia coli.
Para propósitos de clonado y obtención de plásmidos, se utilizó la cepa DH5α DE3 (Life Technologies), Para expresión de proteínas recombinantes, se utilizó la
cepa Bl21-codon plus (DE3)-RIL (genotipo F- ompT hsds (rB- mB-) dcm + Tet
R
gal
R
(DE3) endA Hte (argU ileY lleuW Cam )) adquirido en Novagen.
1.1.2. Agrobacterium tumefaciens.
Para transformar plantas de A. thaliana, y N. tabacum, se empleó la cepa GV
3101 pMP90 (Koncz y Schell, 1986), con resistencia a los antibióticos rifampicina
(codificación genómica) y gentamicina (codificada por el plasmido pMP90).
1.2. Plantas.
En el presente estudio se utilizaron las siguientes especies:
A. thaliana ecotipo Columbia (Col 0). A. thaliana, ecotipo Columbia, deficientes en
silenciamiento transcripcional rdr6 (Luo y col., 2007). Nicotiana Tabacum ecotipo Petit
Havana. Todas ellas fueron cedidas por el Dr. Nestor Carrillo. IBR, Universidad
Nacional de Rosario, Argentina
1.3. Cultivo de Ostreococcus tauri.
El cultivo de O. tauri (cepa OTTH 0595) fue adquirido de la Colección de
Cultivos de Roscoff (Station Biologique, Roscoff, Francia), y se cultivaron en
Erlenmeyers conteniendo medio K (Keller y col, 1987.) A 18 ºC bajo fotoperiodo 12 h:
12 h (luz: oscuridad). Los últimos fueron optimizados en colaboración con la Dra
Graciela Salerno y el Lic. Gonzalo Caló. FIBA, Mar del Plata. Los experimentos con luz
se llevaron a cabo con irradiaciones que van desde 40 a 400 µmoles. m-2. s-1.
2. Cebadores utilizados.
En la Tabla IV se muestra las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como
cebadores en el presente trabajo, la finalidad que tuvieron y características
particulares de alguno de ellos.
78
_________________________________________________Materiales y Métodos
Tabla IV. Lista oligonucleótidos.
Secuencia
Finalidad
Observación
OtNOS662 Fw
Nombre
GCTGGGCGCCGGAAAAGAC
OtNOS2674Rv
GCGCCGGCCGAAACTCAAC
OtNOSNdeIFw
GGAATTCCCATATGGCGAGCGTTGGCTCGGGCGCGACC
NdeI
OtNOSXho RV
CCGCCTCGAGAGCATCCTTTGCGCGAGGCAGAAGGGAGCC
OtNOS632 Fw
CTACACCATGCGGTTGTTTG
PCR/ control de
transformación
PCR/ control de
transformación
Amplificación
dominio oxi
Amplificación
dominio oxi
RT-PCR
OtNOS632 Rv
CCCTGTGAAGAGTCGAAAGC
RT-PCR
OtNOS2203Fw
CTTGTTCCGAAGAGTGATGCG
OtNOS2537Rv
GAGCTTGAGACGGAATAATAGC
OtNOSXbaIPCFw
GTCTAGAGGATCCCCGATGGCGAGCGTTG
control de
secuenciación
control de
secuenciación
PCR/RT-PCR
XbaI
OtNOSSacIPCRv
CGAGCTCTCACGGCGACGACAAGCACAAC
PCR/Rt-PCR
SacI
Fw tEF-1α
TTCAGGAGCATGCGTCAAACTG
Control interno gen
de Nicotiana
tabacum
Rv tEF-1α
TCTTCTTCTGAGCAGCCTTGGT
Actina Fw(At)
AATCTCCGGCGACTTGACAG
Actina Rv (At)
AAACCCTCGTAGATTGGCACA
XhoI
Control interno gen
de A. thaliana.
3. Construcciones realizadas.
3.1. pUC57OtNOS.
Este vector fue diseñado por la empresa Gen Script Corporation a pedido del
Dr. Lamattina. Contiene la secuencia codificante de la OtNOS clonada en el sitio
EcoRV del sitio de múltiple clonado (SMC) del pUC57 (entre BamHI y XbaI), a la cual
se le mutó un sitio interno BamHI para facilitar luego su clonado y se agregaron 5
bases protectoras antes de su ATG inicial.
Esquema del vector pUC57+OtNOS. Representación de las diferentes secuencias del vector,
identificadas por colores. AmpR: marcador de selección que confiere resistencia al antibiótico
ampicilina. pUC ori: origen de replicación de la serie de vectores pUC. LacZ: subunidad α de la
β-galactosidasa. OtNOS: secuencia codificante de la NOS de O. tauri. El número central indica
el tamaño del plásmido en pares de bases.
79
_________________________________________________Materiales y Métodos
3.2. pET24bOtNOS.
El vector pET-24b (Novagen) posee una secuencia N-terminal que codifica
para tag T7. El marcador de selección es la Kanamicina. En este vector se clonó la
secuencia completa del ADNc de OtNOS utilizando las enzimas de restricción BamHI y
SacI (Promega). El fragmento se obtuvo a partir del vector pUC57+OtNOS, digerido
con las mismas enzimas.
Esquema del vector pET24b. Representación de las diferentes secuencias del vector,
identificadas por colores. KanR: marcador de selección que confiere resistencia al antibiótico
Kanamicina. Promotor T7 y terminador T7. El número central indica el tamaño del plásmido en
pares de bases.
3.3. pET15bOtNOSoxi.
El vector pET-15b (Novagen) posee una secuencia C-terminal que codifica
para un tag de histidina. El marcador de selección es la ampicilina. En este vector se
clonó la secuencia del dominio oxi de OtNOS incluyendo el sitio de unión a CaM del
ADNc de OtNOS utilizando las enzimas de restricción NdeI y XhoI en fase con la señal
de histidina. Se diseñaron cebadores específicos que permitieron amplificar la
secuencia del dominio OtNOSoxi, a estos oligonucleótidos se les adicionó los sitios de
restricción correspondientes OtNOSNdeIFW y OtNOSXhoIRv.
80
_________________________________________________Materiales y Métodos
Esquema del vector pET15b. Representación de las diferentes secuencias del vector. Ap:
marcador de selección que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. En negrita se indican
los sitios restricción para el clonado en fase con la señal de histidina. El número central indica
el tamaño del plásmido en pares de bases
3.4. pCHF3.
Es un vector binario apto para transformación de plantas por medio de A.
tumefaciens. Posee un marcador de resistencia a espectinomicina para selección en
bacterias y el gen NPTII que otorga resistencia a Kanamicina dentro del T-ADN en
plantas. Contiene el promotor CaMV:35S y la secuencia terminadora del gen de la
subunidad menor de la Rubisco (tRBCs) para la expresión constitutiva de genes en
plantas. Cedido gentilmente por el Dr. Eduardo Zabaleta.
Esquema del plásmido pCHF3. Representación de las diferentes secuencias del vector,
identificadas por colores. Se muestran en gris algunos sitios reconocidos por enzimas de
restricción relevantes. Los números entre paréntesis indican la posición de los mismos. En
celeste se muestra el sitio tRBCs y en verde el promotor CaMV.
3.4.1 pCHF3:OtNOS.
81
_________________________________________________Materiales y Métodos
Vector construido al clonar la secuencia de OtNOS entre los sitios BamHI y
XbaI del pCHF3. El fragmento se obtuvo a partir del vector pUC57+OtNOS, digerido
con las enzimas anteriormente mencionadas. Este plásmido se utilizó para la
transformación de plantas y permite la expresión de OtNOS en el citosol, de manera
constitutiva.
3.5. pBI-PEC:GUS.
Es un derivado del vector binario pBI101.3 y fue diseñado por Cabello y
colaboradores (2007). Contiene el gen de la enzima β-glucuronidasa (GUS) de E. coli,
como gen reportero, bajo control transcripcional del alelo corto del promotor del gen
Hahb4 de girasol (PEC). Este promotor es inducible por estrés hídrico, estrés salino,
ABA (Dezar y col., 2005), etileno (Manavella y col., 2006), metil-jasmonato, daño
mecánico (Manavella y col., 2008a) y oscuridad (Manavella y col., 2008b). Este vector
posee además el intrón de la sub-unidad 5c de la citocromo c oxidasa de A. thaliana.
Este vector fue cedido por la Dra. Raquel Chan. Universidad Nacional del Litoral,
Argentina
Esquema del plásmido pBI-PEC:GUS. Se detallan los principales sitios reconocidos por
enzimas de restricción. Posee dos genes que confieren KanR, uno para su uso en plantas, que
se detalla en el mapa (NPTII) y otro para selección del vector en bacterias (no mostrado) fuera
del T-ADN.
3.5.1. pBI-PEC: OtNOS.
Vector construido al clonar la secuencia de OtNOS entre los sitios XbaI y SacI
del pBI-PEC en reemplazo del gen GUS. Se diseñaron cebadores específicos que
permitieron amplificar la secuencia de OtNOS. A estos oligos se les adicionó los sitios
82
_________________________________________________Materiales y Métodos
de restricción correspondientes (OtNOSXbaIPCFw y OtNOSSACIPCFw). Este plásmido
se utilizó para la transformación de plantas y permite la expresión de OtNOS en el
citosol y es inducible por estrés hídrico, estrés salino, ABA, etileno, metil-jasmonato,
daño mecánico y oscuridad.
4. Purificación de ADN plasmídico.
Se utilizaron dos métodos distintos para obtener ADN plasmídico. El método de lísis
alcalina se utilizó para obtener ADN para reacciones de PCR y digestiones con
enzimas de restricción durante la búsqueda de colonias transformadas con los
plásmidos recombinantes de interés. Para la preparación de vectores para clonados se
utilizó un sistema comercial.
Para la lisis alcalina se utilizó el protocolo descrito por Maniatis y col. (2001). En la
purificación de ADN plasmídico de A. tumefaciens se utilizó el protocolo descripto para
el método de lisis alcalina “Midiprep” según Sambrook y col. (2001).
4.1. Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
Se empleó una cuba de inmersión horizontal con tampón de corrida 1X TAE
(40 mM Tris acetato, pH 8, 1 mM EDTA) a 80 mA. A las muestras se les agregó
solución colorante para ácidos nucleicos 10X [0,4 % (p/v) azul de bromofenol, 0,1 %
(p/v) xilencianol y 50 % (v/v) glicerol] y fueron sembradas en geles de agarosa
preparado en tampón 1X TAE y suplementado con una dilución 1:25000 de Saber safe
(Invitrogen). La concentración de agarosa varió entre 0,8 y 2% (p/v) según el tamaño
de los fragmentos que se deseaba separar. El ADN se visualizó por fluorescencia con
un transiluminador luz azul.
4.2. Estimación de la concentración de ADN.
Las muestras se separaron por electroforesis y se estimó la concentración por
comparación de la intensidad de las bandas con las del ADN del fago λ digerido con la
enzima Hind III que genera cantidades conocidas de fragmentos de distintos tamaños.
5. Transformación de bacterias.
5.1. Obtención de células electrocompetentes y electroporación de A.
tumefaciens
5.1.1. Obtención de células electrocompetentes de A. tumefaciens.
83
_________________________________________________Materiales y Métodos
Se cultivó un preinoculo de A. tumefaciens GV3101:pMP90 en 2 ml de medio
de cultivo 2YT (16 g/l extracto de peptona, 10 g/l extracto de levadura y 5 g/l NaCl)
suplementado con gentamicina 50 µg/ml y rifampicina100 µg/ml durante 24 h a 29°C
bajo agitación constante.
El preinóculo fue diluído en 100 ml del mismo medio en un Erlenmeyer de 500
ml. Se lo cultivó hasta alcanzar una DO600 entre 0,4 y 0,6. El cultivo fue transferido a
tubos de centrífuga, incubado 10 min en hielo y centrifugado por 15 min a 4000 g y
4°C. Se realizaron 4 lavados del sedimento celular adicionando en cada caso 20 ml,
10 ml, 10 ml y 1 ml de glicerol frío 10 % (v/v), resuspendiéndolo con vortex y
centrifugándolo 15 min a 4000 g y 4°C. Finalmente las células se resuspendieron en 1
ml de glicerol frío 10 % (v/v), se fraccionó en alícuotas de 40 µl y se congelaron a 80°C.
5.1.2. Electrotransformación de A. tumefaciens.
Se mezclaron como máximo 40ng de ADN con 50 µl de bacterias competentes.
La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm (BIO-RAD) fría, y a
continuación se aplicaron 2,5 kV empleando el electroporador E. coli pulser (BIORAD).
Inmediatamente se agregaron 600 ul de medio LB a la cubeta. Se mezcló por
inversión y se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Por último, las bacterias se
plaquearon en medio LB con el antibiótico adecuado. La conservación de las cepas
transformadas de E. coli y A. tumefaciens a largo plazo fueron guardadas a -80°C con
una concentración final de glicerol del 20 % (v/v).
5.2. Obtención de células competentes y transformación de E. coli.
5.2.1. Obtención de células por CaCl2 competentes de E. coli.
Se cultivó un preinoculo de E. coli en 2 ml de medio de cultivo LB durante 24 h
a 37°C bajo agitación constante. El preinóculo se diluyo en 100 ml del mismo medio en
un Erlenmeyer de 500 ml. Se lo cultivó hasta alcanzar una DO600 entre 0,4 y 0,6. El
cultivo se transfirió a tubos de centrífuga, y se centrifugó por 10 min a 5000 g y 4°C.
Se resuspendió en 2,5 ml de CaCl2 0,1 M con 15% (v/v) glicerol frío, se fraccionó en
alícuotas de 200 µl y se congelaron a -80°C. Cada una sirve para realizar una
transformación.
5.2.2 .Transformación de E. coli.
Se mezcló el plásmido deseado en 100 µl de CaCl2 0.1M en tubos eppendorf
de 1,5 ml y se agregó 200 µl de células competentes. Luego se incubó durante 30 min
en hielo. Se realizó un shock por 2 min a 42ºC, rápidamente se agregó 700 µl de
84
_________________________________________________Materiales y Métodos
medio LB y se incubó por 30 min a 37ºC. Finalmente, se plaqueó en placas de LB agar
con el antibiótico adecuado (Hanahan y col., 2003).
6. Expresión y purificación de proteínas en E. coli.
6.1. Expresión de OtNOS completa:
En Erlenmeyers conteniendo 1 litro de LB modificado (20 g de extracto de
levadura, 10 g de bactotriptona, 2,65 g de KH2PO4, 4,33 g de Na2HPO4, y 4 ml de
glicerol) y Kanamicina (50 mg/ml) se creció 1 ml de cultivo y se agitó a 190 rpm a
30ºC. La expresión de la proteína recombinante se indujo a un DO600 = 0,6 mediante
la adición de 0.5 mM IPTG.
Se añadieron los precursores del grupo hemo y de
flavinas, ácido aminolevulínico 450 µM y riboflavina 3 µM en el momento de la
inducción (List y col., 1996).
Las células se recogieron después de 40 h de inducción y se resuspendieron
en 30 ml de tampón (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, de DTT 1 mM, 10% [v/v]
glicerol, PMSF 1 mM, 5 mg / ml de leupeptina, y pepstatina 5 mg/ml).
El cultivo inicial se lisó por sonicación mediante pulsos (seis ciclos de 20 s).
Los restos celulares se eliminaron por centrifugación, y el sobrenadante se aplicó a
una columna de 1 ml de 2,5-ADP-4B agarosa equilibrada en tampón B (Tris-HCl 50
mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, 10% (v/v) de glicerol, y NaCl 100 mM). La
columna se lavó extensamente con 10 volúmenes de tampón B y finalmente con
tampón B y NaCl 500 mM. La proteína se eluyó con tampón B, NaCl 500 mM y 2'-AMP
25 mM. Las proteínas se cuantificaron mediante la técnica de Bradford (Kruger y col.,
2002).
6.2. Expresión dominio oxi de OtNOS.
Erlenmeyers conteniendo 4 litros de LB modificado (20 g de extracto de
levadura, 10 g de bactotriptona, 2,65 g de KH2PO4, 4,33 g de Na2HPO4, y 4 ml de
glicerol) y ampicilina 100 mg/ml) se inocularon con 1 ml de cultivo y se agitó a 190 rpm
a 37ºC. La expresión de la proteína recombinante se indujo a un DO600 = 1 mediante
la adición de IPTG 1 mM a 25ºC durante toda la noche. El precursor del grupo hemo,
ácido aminolevulínico 500 mM se añadió al momento de la inducción. Las células se
centrifugaron durante 20 min a 4ºC a 6000 rpm después de 18 hs de inducción y se
resuspendieron en 200 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM,
NaCl 150 mM, PMSF 1 mM, 1 mg / ml de lisozima, D-Nasa 50 U/ml). El producto de la
lisis se sometió a una prensa francesa, en el cual 8,5 ml de extracto se sometieron a 1
bar de presión. Luego se centrífugó a 4ºC durante 45 min a 16000 rpm y se recuperó
85
_________________________________________________Materiales y Métodos
el sobrenadante. Se realizó una precipitación con sulfato de amonio durante 30 min y
se aplicó la siguiente relación:
M (sulfato de amonio) (g)=0,331 x V (en ml de lisado).
Se centrifugó a 16.000 rpm durante 30 min a 4 °C, el sedimento se resuspendió
en tampón de unión Tris-HCl 0,1 M, pH 8-9, 10% de glicerol, NaCl 0,25M, PMSF 1mM.
El sobrenadante se cargó en una columna de Niquel ProBond (Invitrogen)
previamente lavada con tampón de unión más imidazol 10 mM (tampón A). La
columna se lavó con 10 volúmenes de tampón A. La proteína unida se eluyó con
tampón de unión que contenía 200 mM de imidazol. Las distintas fracciones de la
columna se agruparon y se concentraron utilizando Centriprep (Millipore, Bedford, MA)
con centrifugaciones a 5000 rpm. Los concentrados de proteínas se dializaron a 4º C
frente a 2 litros de tampón KPi 0,1M pH 8-9, que contiene 10% (v/v) de glicerol, NaCl
0,25M, PMSF 1mM y DTT 3mM. Después de un cambio de tampón durante la noche,
se verificó el contenido de hemo y la pureza de la proteína por SDS-PAGE y la
proteína se almacenó a -80 ° C.
Todos los espectros de UV-visible se registraron a temperatura ambiente en un
Uvikon XL (Secomam Ales, Francia).
7. Determinación de la actividad NOS.
7.1. El método de oxihemoglobina.
Se realizó según lo descrito por Ghafourifar y col. (2005). La hemoglobina fue
completamente reducida a oxihemoglobina con ditionito de sodio. La concentración de
oxihemoglobina en la solución se determinó usando el coeficiente de extinción molar
131 mM-1cm-1 a 415 nm. Una reacción de 500 µl que contiene oxihemoglobina 20 mM,
HEPES-NaOH 7,5 mM pH 7,5, DTT 5 mM, L-arg 100 mM, NADPH 1mM, CaCl2 10
mM, CaM 10mM, H4B 100 µM, y catalasa 100 U/ml. La reacción fue iniciada por el
agregado de la proteína purificada OtNOS 0,5 mM. La conversión de oxihemoglobina
a metahemoglobina se analizó en un espectrofotómetro (Ultrospec 1100 Pro,
Amersham Biosciences) por barrido entre 380 y 450 nm. Un coeficiente de extinción
de 100 mM-1cm-1 entre el pico a 401 nm y el valle a 420 nm se utilizó para cuantificar la
producción de NO.
7.2. Formación de L-citrulina.
86
_________________________________________________Materiales y Métodos
La formación de L-cit se determinó según Bredt y Snyder (1990). Las
reacciones enzimáticas se llevaron a cabo a 25ºC en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4,
conteniendo L-arg 100 mM, 1 mCi [3H] Arg (40 a 70 Ci / mmol; Perkin-Elmer), NADPH
100 mM, FAD 10 mM, CaCl2 2mM, CaM 1mg, y 100 µM de H4B en un volumen final de
40 µl. Las reacciones enzimáticas se iniciaron mediante la adición de OtNOS 0,5 mM y
finalizaron después de 30 min mediante la adición de 400 ml de acetato sódico 20 mM,
pH 5,5, conteniendo L-citrulina 1 mM, EDTA 2 mM y EGTA 0,2 mM (tampón de
corte). Las muestras se aplicaron a columnas con 1 ml Dowex AG50W-X8, forma Na+
(Bio-Rad), previamente equilibrada con tampón de corte. La L-cit se eluyó con 2 ml de
agua destilada. Alícuotas de 0,5 ml del eluído se disolvieron en 10 ml de líquido
centelleo, y se midió la radiactividad en un contador Beckman LS 3801 en un sistema
de centelleo líquido. La formación de L-citrulina se verificó mediante cromatografía en
capa delgada.
7.3. Oxidación del NADPH.
La oxidación de NADPH se cuantificó en un volumen de 500 µl conteniendo
OtNOS 0,5 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, DTT 5 mM, L-arg 100 mM, NADPH 0,5 mM,
CaCl2 10mM, CaM 10 mM, H4B 10 µM, y 100 unidades/ml de catalasa. La tasa de
disminución de la absorbancia en 340 nm se evaluó durante 10 min a 25º C utilizando
un espectrofotómetro (Ultrospec 1100 Pro, Amersham Biosciences). Un coeficiente de
extinción de 6,22 µM-1cm-1 en 340 nm se utilizó para calcular la tasa de oxidación de
NADPH.
8. Modelado de estructuras por homología.
Los modelos estructurales se construyeron con el programa de MODELERv 9.5 (Sali y
Blundell., 1993) utilizando ClustalX y FFAS03 derivados. La plantilla se seleccionó con
FFAS03 y correspondió a la estructura cristalina de la región de NOSoxy Bos taurus
eNOS y de la región NOSred de nNOS de Rattus norvegicus (Jaroszewski y col.,
2005). El modelo se validó utilizando un programa de PROSA II (Wiederstein y Sippl,
2007), y las cifras se extrajeron utilizando el programa Web Lab ViewerLite 3,20
(Molecular Simulations). La superposición estructural de OtNOS y B. taurus eNOS se
realizó con el programa Superpose (Maiti y col., 2004). OtNOS y las secuencias de
NOS de humanos fueron alineados utilizando el programa ClustalX (versión 1.81;
Thompson y col., 1997) y se editó con el programa GENEDOC (versión 2.5.010). Las
secuencias de proteína con similitud a OtNOS (E-valor <1.102110) se recuperaron
87
_________________________________________________Materiales y Métodos
utilizando BLAST y la base de datos no redundante de GenBank. El programa CDHIT
se utilizó para eliminar todo el intercambio de secuencias > 90% de identidad (Huang y
col., 2010). Las secuencias fueron alineadas con ClustalX y editadas con el programa
GENEDOC. La organización del dominio oxi se analizó con InterPro (Hunter y col.,
2009) y PFAM (Finn y col., 2008).
9. Análisis filogenético de OtNOS.
El análisis filogenético se realizó con PHYML (Guindon y Gascuel, 2003). El mejor
modelo evolutivo para la inferencia filogenética se estimó utilizando ModelTest
(Posada y Crandall, 1998). Un “bootstrapping” no paramétrico (1000 repeticiones) se
utilizó para evaluar el apoyo de las ramificaciones del árbol. El programa de iTool
(Letunic
y
Bork,
2007)
se
utilizó
para
mostrar
los
árboles
filogenéticos
(http://itol.embl.de/).
10. Análisis estadísticos.
Los resultados se expresaron como error y desvío estándar. Los análisis estadísticos
se realizados con Sigma Stat (Jandel Scientific), se realizó también un análisis de
varianza para comparaciones múltiples (ANOVA) y un test de t para la comparación
entre pares.
11. Números de Accesos.
Las
secuencias
de aminoácidos
utilizadas
en este trabajo se encuentran
GenBank/EMBL con los siguientes números de accesos: O. tauri NOS (CAL57731),
eNOS (NP_000594), nNOS (NP_000611), iNOS (AAI30284) y Spirosoma linguale
NOS (YP_003391026). Las estructuras cristalizadas utilizadas en este trabajo se
encuentran en Protein Data Bank (www.rcsb.org) según los siguientes códigos: R.
norvegicus nNOSred (1tll) y B. taurus eNOSoxy (1fop).
12. Cuantificación de NO en cultivos de O. tauri y E. coli.
Los cultivos O. tauri se crecieron en Erlenmeyers con medio K (Keller y col, 1987) a
18º C bajo fotoperíodo 12 h: 12 h (luz: oscuridad).Los experimentos con luz se llevaron
88
a cabo con irradiaciones que van desde 40 a 400 µmol.m-2.s-1. El contenido de NO en
E. coli o en O. tauri se cuantificó utilizando la sonda fluorescencia DAF-FM DA
_________________________________________________Materiales y Métodos
(Invitrogen). DAF-FM DA 10µM se añadió al medio de cultivo 20 min antes de la
medición. La producción de NO fue iniciada por la adición del sustrato L-arg. La
intensidad de fluorescencia (excitación de 480 nm, emisión de 525 nm) se midió
utilizando un lector de placas de fluorescencia (Fluoroskan Ascent, Thermo Electron) o
visualizada en un microscopio invertido de fluorescencia (Nikon Eclipse TI). La
formación de NO en E. coli también se midió utilizando reactivo Griess para la
medición de nitrito como según Xu y col. (2000).
13. Análisis de la muerte celular en E. coli.
Los cultivos de E. coli se incubaron con H2O2 30 mM durante 30 min. Las células se
tiñeron con el colorante nuclear Sytox Green (Molecular Proves) el cual es
impermeable a la membrana de células vivas. Las células se incubaron durante 10 min
en oscuridad a temperatura ambiente y luego se lavaron con 1,5 volúmenes de medio
LB fresco. La intensidad de fluorescencia (excitación 480 nm; emisión 525 nm) se
midió utilizando un lector de placas de fluorescencia (Fluoroskan Ascent, Thermo
Electron).
14. Extracción de ADN, ARN y proteína de Ostreococcus tauri.
14.1. Extracción de ADN de O. tauri.
Se precipitaron 50 ml de cultivo de O. tauri y se descartó el sobrenadante, se
trtituró el precipitado utilizando un pilón para tubos de microcentrífuga. Se adicionó a
cada tubo 400 µl de solución de extracción Tris-HCl 200 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM,
EDTA 25 mM y SDS 0,5% (p/v) y el homogenato fue resuspendido con vortex por 5 s.
El extracto se centrifugó a 13000 g y 4ºC durante 2 min. Se transfirieron 300 µl del
sobrenadante a un tubo nuevo y se le adicionaron 300 µl de isopropanol frío. Se
mezclaron los contenidos por inversión suave seguida de 2 min de incubación a
temperatura ambiente. Después se centrifugó a 13.000 g a 4º C por 5 min. Se
descartó el sobrenadante y al sedimento se le agregaron 400 µl de etanol 70 % (v/v).
Se resuspendió el sedimento en vortex por 5 min. Posteriormente se centrifugó a
13.000 g por 1 min. Este lavado remueve impurezas que acompañan al ADN. El
lavado se repitió una vez más y a continuación el precipitado fue secado a temperatura
ambiente y se resuspendió en 100 µl de agua mili-Q estéril.
89
14.1.1. Verificación de la presencia del gen que codifica para OtNOS en O.
tauri.
_________________________________________________Materiales y Métodos
El ADN genómico previamente extraído se calentó a 95° C durante 5 min en
termobloque y luego se colocó rápidamente en hielo. Para cada reacción de PCR se
utilizó 1 µl de la suspensión de ADN genómico y se utilizaron los cebadores
OtNOS632Fw y OtNOS632Rv.
14.2. Extracción de ARN de O. tauri.
Para la extracción de ARN a partir de O. tauri se utilizó el Kit ARNeasy
(Qiagen), aplicando el protocolo diseñado para purificación de ARN total de cultivos
celulares de plantas y hongos filamentosos. Es esencial usar la cantidad correcta de
material de partida a fin de obtener un óptimo rendimiento y pureza. Se precipitaron
100 ml de cultivo de O. tauri. Se resuspendió en 450 µM de tampón RLT (Qiagen), y
se continuó con el protocolo descripto en el manual de ARNeasy
14.3. Síntesis del ADN complementario (Retrotranscripción).
En un tubo de microcentrífuga se agregaron 2 pmoles de cebador oligo (dT)
comercial, 12 µl del ARN tratado con ADNasa y 1 µl de mezcla de dNTPs a una
concentración de 2,5 mM cada uno, resultando un volumen final de 13 µl. Se incubó
durante 5 min a 65°C e inmediatamente después se colocó en hielo, durante al menos
1 min. Luego se agregaron 4 µl de First Strand Tampón 5X (Invitrogen), 1 µl 0,1 M
DTT, 1 µl de inhibidor de ARNsa (Invitrogen) y 0,5 µl de transcriptasa reversa
SuperScript III (200 unidades/µl) (Invitrogen). Posteriormente se incubó por 60 min a
55°C. La reacción se detuvo por incubación a 70° C durante 15 min.
14.4. Amplificación de ADN complementario específico mediante PCR.
Se utilizaron los cebadores OtNOS2203Fw y OtNOS2537Rv para amplificar el
cADN de OtNOS (Tabla IV). Para cada reacción se utilizó 1 µl de la muestra de cADN,
1,25 U de Taq ADN polimerasa Go Taq™ (Promega), 0,2 µM de cada cebador, 0,2
mM de cada dNTP, MgCl2 2 mM, y tampón 1X provisto por el fabricante de la enzima,
en un volumen final de 25 µl. El ARN genómico previamente extraído se calentó a 95°
C durante 5 min en termobloque y se colocó rápidamente en hielo. Para cada reacción
de PCR se utilizó 1 µl de la suspensión de ADN.
14.5. Extracción de proteína de O. tauri.
90
Se precipitaron 2 ml de un cultivo de O. tauri por centrifugación. Se descartó el
sobrenadante. A los precipitados se les adicionó solución de siembra Tris-HCl 60 mM
pH 6,8, ditiotreitol (DTT) 500 mM, SDS 2 % (p/v), glicerol 10 % (v/v), azul de
_________________________________________________Materiales y Métodos
bromofenol 25 µg/ml. Se los desnaturalizó durante 5 min a 100°C en un termobloque y
luego se los congeló en nitrógeno liquido. Se realizaron 3 ciclos de cambios de
temperatura. El homogenato se centrifugó a 4°C y 10000 rpm durante 5 min. Se
recuperó el sobrenadante de los tubos.
14.5.1.
Separación
de
proteínas
mediante
electroforesis
en
gel
de
poliacrilamida, SDS-PAGE.
Las muestras se corrieron en geles de concentración de 5 % (p/v) acrilamida
5%/ bisacrilamida 0,13 % en una solución de Tris-HCl 0,12 M, pH 6,8, SDS 0,1 % (p/v)
y en geles de separación de 12 % (p/v) acrilamida 15% /bisacrilamida 0,4% en TrisHCl 0,75 M pH 8, SDS 0,1 % (p/v), persulfato amónico 0,1 % y Temed 0,05%. Las
electroforesis fueron desarrolladas a una intensidad constante de 20-25 mA con
tampón de corrida Tris-HCl 25 mM, glicina 0,2 M pH 8,3, EDTA 1 mM y SDS 0,05 %
(p/v). Los géles fueron teñidos con azul de Coomassie R-250 0,2 % (p/v) en etanol:
ácido acético: agua (50:10:40) durante 1 h.
14.5.2. Transferencia e inmunodetección de proteínas en membranas de
nitrocelulosa por Western Blot.
Las proteínas separadas electroforéticamente en geles de poliacrilamida fueron
electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa en una cuba de transferencia (Transblot, Bio-Rad). La transferencia se llevó a cabo en una solución conteniendo Tris-HCl
20 mM, glicina 150 mM, pH 8,0, SDS 0,02 % (p/v) y metanol 20 % (v/v), durante 1 h
con agitación, a una intensidad constante de 100 volt y a 4°C. Una vez completada la
transferencia, la membrana fue bloqueada con solución PBS/leche Na2HPO4 80 mM ,
NaH2PO4 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y leche descremada 5 % (p/v). Se realizaron 4
lavados de 15 min cada uno, con agitación. A continuación se incubó la membrana
durante 2 h con el anticuerpo primario (IgG de conejo anti-iNOS de macrófago murino,
Sigma Aldrich nº N7782 o IgG de conejo anti-OtNOS, Gen Script) diluidos 1:1000 en
12 ml de solución PBS/leche. Después se realizaron 4 lavados de 15 min con solución
de bloqueo y posteriormente la membrana se incubó durante 1 h con el anticuerpo
secundario Immun-StartTM (BioRad) anti IgG de conejo conjugado a la enzima
fosfatasa alcalina (dilución 1:5000). Luego se realizaron 4 lavados de 15 min con
solución PBS/leche y un lavado de 10 min con una solución conteniendo Tris-HCl 100
91
mM pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM. Finalmente, la membrana fue sumergida en
una solución de igual composición con el agregado de 5-bromo-4-cloro-3- indolilfosfato (BCIP) 0,01 % (p/v) y azul de nitrotetrazolio (NBT) 0,01 % (p/v) e incubada en
oscuridad a 37° C hasta el desarrollo de color.
_________________________________________________Materiales y Métodos
15. Generación de plantas transgénicas.
15.1. Transformación transiente de Nicotiana tabacum.
Se cultivó un preinóculo de la cepa GV3101:pMP90 de A. tumefaciens
transformada con el plásmido de interés en 2 ml de medio 2YT suplementado con 100
µg/ml de rifampicina, 50 µg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de cloranfenicol durante 12 h
a 28°C bajo agitación contante. Se realizó una dilución 1/100 del cultivo saturado en
10 ml de 10 mM 2YT–MES (pH 5,6) suplementado con acetosiringona 20 µM y con las
mismas concentraciones de antibióticos del paso anterior con agitación a 28°C hasta
alcanzar un DO600 de 1-2. El cultivo fue centrifugado a 1000 g durante 20 min a 25°C.
Luego se resuspendió en una solución MES 10 mM pH 5,6, MgCl2 10 mM y
acetosiringona 100 µM llevando a una DO600 final de 0,2–0,5.
Se dejó 2 a 3 h a 25°C sin agitación y luego se infiltraron hojas de N.
benthamiana con esa solución. Luego de 1 y 3 días en la cámara de crecimiento se
cosecharon las hojas para su análisis. Para las plantas co infiltradas con H4B 100µM,
se agregó el cofactor a la solución de agroinfiltración anteriormente mencionada.
15.2. Crecimiento y transformación estable de las plantas de Nicotiana
tabacum.
La transformación de plantas de N. tabacum se realizó siguiendo el método
descrito por Gallois y Marinho (1995). Se cultivó un preinóculo de la cepa
GV3101:pMP90 de A. tumefaciens transformada con el plásmido de interés en 2 ml
de medio 2YT suplementado con 100 µg/ml de rifampicina, 50 µg/ml de gentamicina y
80 µg/ml de espectinomicina durante 12 h a 28–30°C bajo agitación constante. Se
realizó una dilución 1/100 del cultivo saturado en 10 ml de medio 2YT suplementado
con las mismas concentraciones de antibióticos del paso anterior, bajo agitación a 28–
30°C hasta DO600 de 1. Se colocaron 2,5 ml del cultivo en una caja de Petri con 50 ml
de medio líquido (MS-0) Murashige-Skoog (1962).
Se usaron plántulas de N. tabacum cultivar Petit Havana (PH) SR1 de 6 a 8 semanas
crecidas en cajas Magenta con MS-0, agar 0,8 % (p/v). Se cortaron sus hojas, se
descartó la nervadura central y se obtuvieron fragmentos de aproximadamente 1,2 cm
de lado. Los cortes se realizaron sobre papel de filtro estéril mojado sobre medio MS-0
92
líquido. Los fragmentos de hojas fueron transferidos a la caja de Petri con el A.
tumefaciens y se incubaron por 20 min.
_________________________________________________Materiales y Métodos
Los fragmentos se removieron y escurridos sobre papel de filtro y transferidos a
caja de Petri con MS-10 (MS-0 suplementado con 0,1 mg/ml de kinetina y 0,1 mg/ml
de auxina), agar 0,8 % (p/v), apoyando la parte superior de la hoja sobre el medio. Se
colocaron entre 8 y 10 trozos de hoja por placa.
El control de regeneración consistió en fragmentos de hoja sin inocular
incubados en MS-10, agar 0,8 % (p/v) y el control de selección en trozos de hoja sin
inocular incubados en MS-10, agar 0,8 % (p/v) con Kanamicina 100 µg/ml. Los trozos
de hojas se cultivaron a 25°C durante 3 días en oscuridad. Después se transfirieron los
fragmentos a placas con medio MS-10, agar 0,8 % (p/v) suplementado con
Kanamicina 100 µg/ml y trifamox 300 µg/ml. Se cultivó durante una semana y luego los
trozos de hojas fueron transferidos a placas con medio MS-10, 0,8 % (p/v) agar
suplementado con Kanamicina 100 µg/ml y cefotaxime 300 µg/ml. Se cultivaron
durante 4 a 6 semanas a 25° C y 16 h de luz, realizándose transferencias a nuevas
placas con idéntico medio cada una semana.
Cuando se formaron vástagos de 1–2 cm de longitud, fueron transferidos a
cajas Magenta con MS-0, agar 0,8 % (p/v) y Kanamicina 100 µg/ml. Los vástagos que
formaron raíces fueron posteriormente transferidos a tierra.
15.2.2. Esterilización de las semillas de N. tabacum.
Se trabajó en condiciones de esterilidad en flujo laminar horizontal. Las
semillas se incubaron durante 15 min en Tween 20 0,05 % (v/v), hipoclorito de sodio
comercial 1,5 % (v/v). Luego se descartó el sobrenadante y se realizaron 4 lavados
sucesivos con agua destilada estéril.
15.2.3. Cultivo de N. tabacum en macetas.
Las plantas de tabaco se cultivaron individualmente en macetas de plástico de
13 cm de diámetro con tierra en cámara de cultivo con fotoperíodo de día largo (16 h
de luz y 8 h de oscuridad), una temperatura de 29°C/23°C durante el ciclo
luz/oscuridad, 150 µE/m2s de intensidad de luz y una humedad de 90 % durante el
período de oscuridad y 40 % durante el período de luz. Las plantas se regaron con
agua cada 2-3 días.
93
15.3. Crecimiento y transformación estable de las plantas de Arabidopsis
thaliana.
15.3.1. Crecimiento de A. thaliana.
_________________________________________________Materiales y Métodos
Las semillas se sembraron por dispersión sobre potes con tierra orgánica,
previa estratificación de las mismas a 4ºC por 2-4 días en oscuridad. El sustrato se
humedeció con agua por capilaridad desde una bandeja. Luego los potes fueron
cubiertos con “film” plástico durante 15 días. Se realizaron riegos con agua cada 4
días. Las plantas se mantuvieron en cámara de cultivo con un flujo de luz de 130-150
µE/m2s, en un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (día largo). La
temperatura de crecimiento fue de 22°C/18°C durante el ciclo luz/oscuridad y la
humedad se mantuvo en 80 %.
15.3.2. Transformación estable de A. thaliana.
Se empleó la técnica de “floral dip” (Clough y Bent, 1998) para transformar los
ecotipos Columbia 0 (Col-0) y Col-0 rdr6 (Luo y col., 2007) de A. thaliana. La cepa
GV3101:pMP90 de A. tumefaciens transformada con el plásmido de interés fue crecida
en 250 ml de medio 2YT suplementado con rifampicina100 µg/ml, gentamicina 50
µg/ml y espectinomicina100 µg/ml hasta DO600 mayor a 2. El cultivo se centrifugó a
5000 g durante 10 min a 25°C y resuspendido en 500 ml de medio de infiltración
sacarosa 5 % (p/v) y Silwet L-77 0,02 % (v/v). Las inflorescencias de las plantas de A.
thaliana (regadas el día anterior) se sumergieron en la suspensión de bacterias
durante 30 s. Las plantas se mantuvieron en cámara de cultivo en posición horizontal
sobre bandejas cubiertas con papel absorbente para retener la humedad luego de la
inoculación y mantenerlas en oscuridad.
Luego de 24 h se volvieron a la posición vertical y a las condiciones normales
de crecimiento hasta el momento de la cosecha de las semillas (entre 3 y 4 semanas).
15.3.3. Esterilización de las semillas de A. thaliana.
Se trabajó en condiciones de esterilidad en flujo laminar horizontal. Las
semillas se incubaron durante 15 min en solución de Tween 20 0,05 % (v/v) y
hipoclorito de sodio 30 % (v/v). Luego se hizo se lavó las semillas 6 veces con agua.
15.3.4. Selección de plantas transformantes de A. thaliana.
Para seleccionar las plantas transformadas y resistentes a Kanamicina, las
semillas estériles fueron dispersadas en placas de Petri con medio MS-0 al medio sin
94
sacarosa con agar 0,8 % (p/v) (0,5X MS-0) y Kanamicina 100 µg/ml A los 10 días las
plantas fueron transferidas a potes con tierra orgánica en cámara de cultivo.
Las plántulas para los tratamientos con NaCl 100mM y ABA 10 µM se
crecieron en medio ATS con KNO3 5 mM; Ca (NO3)2 2 mM; MgSO4.7H2O 2mM; KPO4
_________________________________________________Materiales y Métodos
2,5 mM; H3BO3 70 µM; y los micronutrientes: MnCl2 14 µM; ZnSO4 1 µM; CuSO4 0,5
µM; Na2MoO4 0,2 µM; NaCl 10 µM; CaCl2 0,01 µM; y Fe-EDTA 50 µM.
16. Análisis de las plantas transformadas.
16.1. Evaluación estadística.
La segregación 3:1 del gen marcador seleccionable NPTII, que confiere
resistencia a Kanamicina, fue evaluada estadísticamente por análisis de chi-cuadrado
(χ2). Los tests se realizaron con un nivel de significación de 0,05 (Murgia y col., 2004).
16.2. Extracción de ADN genómico a partir de tejido foliar.
Se pulverizaron 2-3 discos de hoja de 1cm de diámetro de cada planta de N.
tabacum o 1-2 hojas (según el tamaño) de cada planta de A. thaliana utilizando un
pilón para tubos de microcentrífuga con nitrógeno líquido en cantidad necesaria. Se
adicionó a cada tubo 400 µl de solución de extracción Tris-HCl 200 mM (pH=7,5), NaCl
250 mM, EDTA 25 mM, y SDS 0,5% (p/v) y el homogenato fue resuspendido con
vortex por 5 s. Luego fue centrifugado a 13000 g y 4ºC por 2 min. Se transfirieron 300
µl del sobrenadante a un tubo nuevo y se le adicionaron 300 µl de isopropanol frío. Se
mezclaron los contenidos por inversión suave seguida de 2 min de incubación a
temperatura ambiente. Después se centrifugó a 13.000 g y 4ºC por 5 min. Se descartó
el sobrenadante y al sedimento se le agregó 400 µl de etanol 70 % (v/v). Se
resuspendió el sedimento en vortex por 5 min. Posteriormente se centrifugó a 13.000 g
por 1 min. El lavado se repitió una vez más y a continuación el sedimento se secó a
temperatura ambiente para ser resuspendido en 100 µl de agua mili-Q estéril a 4ºC.
Finalmente se hizo una centrifugación a temperatura ambiente durante 2 min y
se transfirieron 90 µl a un tubo nuevo. Se usaron 1-2 µl de esta preparación en un
volumen final de reacción de PCR de 20 µl.
16.3. Verificación de la presencia del transgén que codifica para OtNOS en las
plantas transformadas.
El ADN genómico previamente extraído se calentó a 95° C durante 5 min en
termobloque y luego colocado rápidamente en hielo. Para cada reacción se utilizó 1 µl
95
de la suspensión de ADN genómico. Para analizar los productos se efectuó una
separación electroforética en un gel de agarosa al 1% (p/v) y las muestras fueron
teñidas con Saber Safe (Invitrogen).
16.4. Verificación de la presencia de la proteína OtNOS en las plantas
transformadas.
_________________________________________________Materiales y Métodos
16.4.1. Extracción de proteínas.
Las muestras de tejido foliar fresco o congelado fueron pulverizadas utilizando
un pilón para tubos de microcentrífuga con nitrógeno líquido en cantidad necesaria.
Luego se adicionó solución de homogenización con la siguiente composición: Tris-HCl
50 mM pH 8, MgCl2 1mM, EDTA 3mM, fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) 1mM,
dtiotreitol (DTT) 1mM, agregando 2 ml de la solución por g de tejido fresco. El
homogenato fue centrifugado a 4°C y 5000 g durante 2 min. Se recuperó el
sobrenadante de los tubos para ser analizado por electroforesis en gel de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Según las condiciones
descriptas en los incisos 14.5.1 y 14.5.2.
16.5. Verificación mediante RT-PCR de la presencia del transcripto del
transgén que codifica para OtNOS.
16.5.1. Extracción de ARN.
Se maceraron 100 mg de tejido foliar de cada planta con nitrógeno liquido en
mortero. Luego se agregó 0,8 ml de TRIzol (Invitrogen) y se centrifugó a 12000 g y 4°C
por 10 min. El homogenato fue transferido a un nuevo tubo, en el cual se agregaron
400 µl de cloroformo. Se invirtió vigorosamente durante 15 s. Se centrifugó a 12000 g
y 4°C durante 15 min. La fase superior fue transferida a nuevo tubo, se le agregaron
dos volúmenes de isopropanol y se incubó por 30 min a 25°C. Posteriormente se
centrifugó a 12000 g y 4°C durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Después se
agregó 1 ml de etanol frío 70 % (v/v) y se agitó. Se centrifugó a 7500 g y 4°C durante 5
min y se descartó el sobrenadante. El lavado con etanol 70 % (v/v) fue repetido. El
sedimento fue secado dejando el tubo abierto a 25° C durante 5–10 min. Finalmente
se resuspendió en 40 µl de H2O mili-Q previamente tratada con dietil pirocarbonato
(DEPC).
16.5.2. Estimación de la concentración y el grado de pureza del ARN.
Se midió absorvancia a 260 nm en un espectrofotómetro Ultrospec en cubeta
de cuarzo para estimar la concentración de ARN total. La relación entre las
absorvancia en 260 y 280 nm se determinó para descartar la contaminación con
96
proteínas. Una muestra relativamente pura presentó una relación cercana a 2. Se
midió también la relación entre las absorvancias en 260 y 230 nm para comprobar la
ausencia de contaminación con compuestos orgánicos como fenol. Un valor cercano a
2 indica una muestra relativamente pura.
16.5.3. Verificación de la integridad del ARN.
_________________________________________________Materiales y Métodos
El grado de integridad del ARN se determinó mediante electroforesis en gel de
agarosa 1,5 % (p/v). Previo a la siembra, las muestras se calentaron a 65° C durante 5
min y llevadas inmediatamente a hielo. Se sembró 1 µg de cada una, agregándosele
solución colorante para ácidos nucleicos (Saber safe). Se utilizó agarosa al 1,5 %
(p/v), preparada en tampón 1X TAE.
16.5.4. Tratamiento del ARN con nucleasas de ADN (ADNsa).
El tratamiento del ARN total con ADNasa permite degradar el ADN genómico
contaminante que no se ha podido eliminar completamente durante la extracción del
ARN. Se añadieron en un tubo de microcentrífuga 4 µg de ARN total, 2 µl de tampón
ADNasa (Promega), 1 µl de ADNasa (Promega) y una cantidad suficiente de H2O miliQ previamente tratada con DEPC para un volumen final de 20 µl. Se incubó 30 min a
37°C. Luego se agregó 1 µl de ADNasa Stop Solution (Promega) y se incubó por 10
min a 65° C. Se realizó la síntesis del ADN complementario y la amplificación del ADN
complementario especifico mediante PCR según lo descripto en los puntos 14.3 y
14.4.
16.6. Cuantificación de nitritos.
La cuantificación de nitritos se realizó con el reactivo de Griess (Sun y col.,
2003). Para lo cual se procesaron 5 plántulas de A. thaliana o 100 mg de tejido de
hojas de N. tabacum. Las muestras de tejido foliar fresco o congelado se pulverizaron
utilizando un pilón para tubos de microcentrífuga con nitrógeno líquido en cantidad
necesaria. Luego se adicionó solución de homogenización de la siguiente
composición: Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y NaCl 10 mM agregando 2 ml de la solución por
g de tejido fresco. El homogenato se centrifugó a 4°C y 5000 g durante 2 min. Se
recuperó el sobrenadante de los tubos. Se realizó la cuantificación de proteínas
mediante el reactivo de Bradford según Kruger (2002) y luego se relativizó la cantidad
de Nitritos cuantificados por miligramos de proteínas.
17. PCR
97
En líneas generales la reacción en cadena de la Taq ADN polimerasa se realizó con
las condiciones estandarizadas. Es decir la solución de reacción provista por el
vendedor MgCL2 1,5mM, dNTPs 0,5 mM de cada uno, cebadores 0,25 µM de cada
uno y unidades de ADN taq polimerasa de acuerdo a lo sugerido por el proovedor. Las
reacciones se realizaron en un termociclador Mastercycler (Eppendorf).
Para las reacciones de PCR realizadas para analizar colonias de bacterias se
utilizó Taq polimerasa (Invitrogen), para los productos de PCR que se clonaron se
_________________________________________________Materiales y Métodos
utilizó Pfu (Promega), la cual posee capacidad de control de calidad y reduce la
probabilidad de introducir un error durante la amplificación.
98
_________________________________________________Trabajos presentados
TRABAJOS PRESENTADOS
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Foresi N, Correa-Aragunde N, Parisi G, Caló G, Salerno G y Lamattina L (2010)
Characterization of a Nitric Oxide Synthase (NOS) from the plant kingdom: The NO
generation from the green algae Ostreococcus tauri is light irradiance- and growth
phase dependent. Plant cell 22:3816–3830.
CAPÍTULOS DE LIBRO
Foresi N, Tonón C, Gonorazky G, Lamattina L, Laxalt AM, Casalongué CA.
Extracellular ATP and Nitric Oxide Impact on Cell Viability in Tomato Suspension Cells.
Nova Publishers (2010) 13.
CONGRESOS NACIONALES
Laxalt A, Tonón C, Foresi N, Casalongué C,A Lamattina L (2006) Extracellular ATP
induces NO production in tobacco and tomato cultured cells. XLII Reunión Anual de la
Sociedad Argentina de Investigaciones en Bioquímica y Biología Molecular. Rosario,
Santa Fe, Argentina.
99
Foresi N, Casalongué C, Lamattina L, Laxalt A (2007) Extracellular ATP (eATP)
activates phospholipid signalling in tomato cell suspensions. XLIII Reunión Anual de la
Sociedad Argentina de Investigaciones en Bioquímica y Biología Molecular. Mar del
Plata, Buenos Aires, Argentina.
_________________________________________________Trabajos presentados
Foresi N, Sueldo D, Casalongué C, Lamattina L, Laxalt A (2008) Extracellular ATP
(eATP) induces Phosphatidic Acid and Nitric Oxide in tomato cell suspensions. XXV
Reunión Argentina de Fisiología Vegetal. Rosario, Buenos Aires, Argentina.
Sueldo D, Foresi N, Casalongué C, Lamattina L, Laxalt A (2008) Extracellular ATP
(eATP)-signalling in plants: role of Phopholipase, Ca2+ and NO. XLIV Reunión Anual de
la Sociedad Argentina de Investigaciones en Bioquímica y Biología Molecular. Villa
Carlos Paz, Córdoba, Argentina.
Foresi
N,
Correa-Aragunde
N,
Casalongué
C,
Lamattina
L
(2009)
First
characterization of a Nitric Oxide Synthase from the plant kingdom. XLV Reunión Anual
de la Sociedad Argentina de Investigaciones en Bioquímica y Biología Molecular, San
Miguel de Tucumán, Argentina.
Foresi N, Correa-Aragunde N, Calo G, Salerno G, Lamattina L (2010) Nitric oxide
generation by the unicellular marine green alga Ostreococcus tauri. XLVI Reunión
Anual de la Sociedad Argentina de Investigaciones en Bioquímica y Biología
Molecular, Puerto Madryn, Argentina.
Correa-Aragunde N, Foresi N, Lamattina L (2010) Nitric oxide and auxin regulates
ascorbate peroxidase 1 activity through nitrosylation. Reunión Anual de la Sociedad
Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular. Potrero de los Funes,
San Luis, Argentina.
Foresi N, Correa-Aragunde N, Lamattina L (2011) ¿Es posible expresar una Óxido
Nítrico Sintasa activa en plantas? Biólogos en red. Mar del Plata, Buenos Aires,
Argentina.
Foresi N, Mayta M, Lodeyro A, Casalongué C, Carrillo N, Lamattina L (2012)
Sobreexpresión de Óxido Nítrico Sintasa de Ostreococcus tauri (OtNOS) en
100
Arabidopsis y tabaco. Comportamiento de las plantas transgénicas frente a estrés.
XXIX Reunión Argentina de Fisiología Vegetal. Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina
CONGRESOS INTERNACIONALES
_________________________________________________Trabajos presentados
Foresi N, Correa-Aragunde N, Lamattina L (2010) Characterization of a Nitric Oxide
Synthase from a member of plant kingdom, the algae Ostreococcus tauri. XXXIX
Reunión Anual de la Sociedad Brasileira de Bioquímica e Biología Molecular, Foz de
Iguazú, Brasil.
Correa-Aragunde N, Foresi N, Lamattina L (2010) Auxin partially inhibits APX1
activity through denitrosylation leading to hydrogen peroxidase accumulation and
lateral root formation in Arabidopsis. The 7th International Conference on the
Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide. Edinburgh,
Scotland.
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