t tt k − =

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
1. INTRODUCCIÓN HPLC
A. Objetivos
1. Familiarizarse con el equipo HPLC.
a. Sistemas de bombeo de disolventes. Flujos.
b. Válvula de inyección de la muestra
c. Conexiones de la columna.
d. Registrador, integrador, computadora (arranque, velocidad de la carta, threshold,
atenuación).
2. Obtener un buen cromatograma de una mezcla estándar y calcular los parámetros
cromatográficos más importantes.
B. Procedimiento
1. Encender el equipo. Identificar cada uno de los componentes del sistema HPLC:
sistema de bombeo, válvula de inyección de la muestra, columna, detector,
computadora. Verificar los disolventes que se utilizarán como fase móvil, degasificarlos
si es necesario, acondicionar la columna y colocar los siguientes parámetros iniciales:
a. Flujo: 1.0 mL/min.
b. Longitud de onda del detector: 254 nm.
2. Anotar las características de la columna cromatográfica:
Columna: __Phenomenex C18________
Longitud: ____50_______________ mm
Tamaño de partícula: _____5_____ µm
D.I.: _________60_______________ mm
Tamaño de poro: _______80_______ Å
3. Estabilizar el sistema durante 5-10 minutos en condiciones isocráticas 65/35
MeOH/H2O-HAcO1% (Fase 3). Inyectar una mezcla cafeína, ácido acetil salicílico
(AAS), ácido salicílico (AS). Realizar dos inyecciones.
4. Modificar la composición de la fase móvil a 45/55 MeOH/H2O-HAcO1% (Fase 2),
acondicionar la columna. Realizar dos inyecciones de la mezcla.
5. Modificar la composición de la fase móvil a 35/65 MeOH/H2O-HAcO1% (Fase 1),
acondicionar la columna. Realizar dos inyecciones de la mezcla.
6. Para cada inyección, completar los datos de la siguiente tabla:
Flujo 1.0 mL/min
FASE ____
INYECCIÓN ____
compuesto
tR(min)
w1/2
(min)
tR' (min)
Frente del
disolvente
(to)
Cafeina
AAS
AS
7. Concluir acerca de la variación de los tiempos de retención y anchos de pico obtenidos
en cada fase.
8. Calcular Rs entre cafeína/AAS y AAS/AS. Concluir acerca del efecto de la composición
de la fase móvil en la resolución.
9. Calcular k’, N y AEPT para cafeína, ácido acetil salicílico y ácido salicílico. Calcular α
entre cafeína/AAS y AAS/AS. Concluir acerca de cuál de estos parámetros se ve más
afectado por la composición de la fase móvil.
FÓRMULAS:
t −t
k = R o
to
,
⎛ t´
N = 16⎜ R
⎜ wbase
⎝
2
⎞
⎛ ´
⎟ = 5.54⎜ t R
⎟
⎜ w1 / 2
⎠
⎝
⎞
⎟
⎟
⎠
2
Lucía Hernández Garciadiego
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
α=
k i,+1
k i,
Rs =
=
t ´Ri +1
t ´Ri
AEPT =
L
N
∆t R
∆t R
= 1.177
1 / 2( wbase1 + wbase2 )
( w1 / 21 + w1 / 2 2 )
en donde tR es el tiempo de retención, to es el tiempo muerto, wbase es el ancho a la
base del pico, w1/2 es el ancho a la mitad de la altura.
Lucía Hernández Garciadiego