Posibilidades de la Espectrometría de Masas y del software

5/20/2013
Posibilidades de la
Espectrometría de Masas y
Espectrometría de
Bioinformática: una herramienta
Masas y del software
esencial en los laboratorios
de análisis estadístico actuales de investigación
Biomédica
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
Isidre Masana
Especialista Productes LC/MS
Agilent Technologies
Divisió Biociència i Anàlisi Químic
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría
de Masas más Utilizada en
Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis
Comparativos por Espectrometría de
Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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1
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Típicos Escenarios de Aplicación de las Técnicas de
LC/MS en Clínica y Toxicológia.
1B.- Perfilados masivos de un nº “ilimitado”/muy elevado de
compuestos sin* disponibilidad de patrones (* La confirmación y cuantificación
de positivos si requerirá la disponibilidad de patrones).
2.- Análisis Comparativos: Correlaciones entre composición y
propiedades de las poblaciones comparadas (enfermedades,
pacientes clasificados, origen,…); descubrimiento biomarcadores,…
3.- Identificación de picos cromatográficos desconocidos.
Típicas aplicaciones de TOF y Q-TOF (masa exacta)
BASE en investigación mediante MS (imprescindible en la no dirigida)
Laboratorios
1.- Cuantificación y Perfilado de Compuestos Diana.
1A.- Análisis de un nº “limitado” de fármacos, metabolitos, péptidos,
… con disponibilidad de patrones. Típica aplicación QqQ en MRM.
Investigación  ----  Rutina
En LC/MS el equipo “ideal” dependerá del “escenario central” de trabajo
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Ejemplo Instrumentación
MS:
Cromatografía
LC/MS-Q-TOF
Para poder ser detectadas
en MS las moléculas
necesitan ser ionizadas
MS
GC
HPLC: todo tipo analitos 
 GC: analitos volatilizables
CE: analitos iónicos
HPLC
MS: QTOF
JUAN
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4
2
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Importancia de la Masa Exacta en Investigación: Selectividad
Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta.
Exactitud
Masa (ppm)
165 ppm
10ppm
5 ppm
2 ppm
Nº posibles
fórmulas
empíricas
209
13
7
2
Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina
Tecnología
QUAD/TRAP
IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da
Clenbuterol S/N = 14
TOF /Q-TOF
Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
Rango extracción típico Cuadrupolo
LC/MS-TOF Agilent 6210
IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da
S/N = 102
Extraer IC con masa exacta es
la clave para Comparar/
Cuantificar RELATIVAMENTE
perfiles de muestras complejas
+/- 30ppm
El área específica de este pico se
utilizará en la cuantificación relativa
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría
de Masas más Utilizada en
Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis
Comparativos por Espectrometría de
Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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2 Tipos de Estudios Comparativos en Clínica:
Genéricos y Específicos
LC/MS-QqQ
GC/MS-QqQ
LC/MS-QTOF
GC/MS-QTOF
Comparación de
Perfiles Específicos
Comparación de
Perfiles Genéricos del
(metab./pépt. concretos)
Metabol/Prote-oma /…..
(metabolitos, péptidos,…
conocidos + desconocidos)
Se trabajará con MS
(QTOF/QqQ) en modo
MS/MS o en MS en
modo selectivo
Se trabajará con MS
(TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Validación
de Biomarcadores
Típico para
Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Cambios en ciclos
concretos del
metabolismo
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Comparativos de
Perfilado Genérico (típico p.e. en “Un-Targeted Metabolomics”)
Modo
MS
Align, Normalize,
Filtering, ANOVA,….
PCA
PCA
GC/MSD
Soft. Deconvolución: MFE
Extraer automáticamente la
información para cuantificar
relativamente MILES de
compuestos desconocidos
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Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass
Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la
Masa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la
Muestra
Espectros Deconvolucionados
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
MFE proporcionará para cada
analito deconvolucionado
• Masa Exacta y Tiempo ret. ID
• Intensidad señal  Cuantificar
TIC
IC’s
0
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
Buscar Correlaciones entre Grupos de
Complejos Datos Espectrales
Intensidad, Tr, Masa exacta
Modo
MS
Modo
MS/MS
Align, Normalize,
Filtering, ANOVA,….
PCA
GC/MSD
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Mass Profiler Profesional: Herramientas de
Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis
Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B)
• Estudios en función del tiempo, de condiciones
múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras
Proporciona Muy Potentes Herramientas
Estadísticas y de Visualización Comparación:
•
•
•
•
•
•
•
Filtrado simple (test de frecuencia)
Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)
Análisis de Componentes Principales (PCA)
Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos
(cromatogramas, espectros,…)
• Permite exportar la lista de iones precursores para
realizar MS/MS y confirmar la identificación de los
metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.
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Platforma Multi-ómica: GeneSpring IB / MPP 12.5
Cambios de expresión reflejados directamente en las rutas
Proyectos
Ensayos Expresión Génica/
Transcriptomica basados en:
Microarrays, NGS, q-PCR
Ensayos de Metabolómica/
Proteómica/ X-ómicas basados
en LC/MS, GC/MS, CE/MS
Nexo unión experimentos multi–
ómicos (p.e.transcriptomics/
metabolomics): Rutas Metabolicas
Importación Genérica
para equipos NO
Agilent: *.xls, *.xlsx,
*.TXT or * .CSV files
Enrichment Analysis on curated pathways and computationally – derived networks
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Ejemplo Clasificación Pacientes Cancer de Prostata:
Análisis de Componentes Principales (PCA) de metabolitos
significativamente alterados entre las 3 clases
A.-Electrospray Polaridad Positiva:
• Total metabolitos:
• Filtrados (25% lineas celulares) :
• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) :
p<0.005 Fold Change >2.0
B.- Electrospray Polaridad Negativa:
• Total metabolitos:
2288
• Filtrados (25% lineas celulares) :
863
• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) :
171
6747
3632
311
99.5% fiabilidad
Responden tratamiento
Benignos
A
B
Permite
predecir qué
pacientes NO
responderán
al tratamiento
Benignos
NO Responden
Responden tratamiento
NO Responden tratamiento
• 22Rv1, LNCaP and VCaP: androgen responsive (prostate cancer),
• DU145 and PC3: androgen non-responsive (prostate cancer)
• RWPE (benign).
1Cancer
Center, Medical College of Georgia,
Augusta, GA; 2Metabolomics Laboratory
Agilent Technologies, Santa Clara, CA,….
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Bases de Datos (PCD) y Bibliotecas de MS/MS (PCDL)
con Masa Exacta para Identificación y “Screenings”
Masivos por LC/MS-TOF/QTOF
Identificación y “Screenings”
Masivos para aplicaciones
forenses/toxicológicas,
seguridad alimentaria y
medioambiental, estudios
metabolómicos,…..
Accurate
Mass PCDBs
and MS/MS
PCDLs
Pesticide
PCD*
1,609
entries
Forensics/
Tox * PCD
7,360
entries
*Kits de aplicaciones disponibles
Forensics/Tox *
PCDL
7,360 entries plus
8,263 MS/MS
spectra for 2,720
compounds
Los TOF y QTOF facilitan
mucho la ampliación del
alcance del laboratorio
(nº compuestos a monitorizar).
METLIN
Metabolite
PCDL 64.092
entries plus
8,712 MS/MS
spectra for
2,286
metabolites
METLIN
Metabolite
PCDB
64.092
entries
Incluye
448 MS/MS de
lípidos
Incluye:
680 metabolitos con T.Ret.
31.011 lípidos
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Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la
Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por Malaria.
Ver en que rutas metabólicas
están involucrados los
metabolitos relevantes del estudio
diferencial y cómo cambian.
Rojo: Eritrocitos INFECTADOS
Azul: Eritrocitos NO INFECTADOS
Eritrocitos INFECTADOS // NO INFECTADOS
15-10m
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2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y
Específicos
LC/MS-QqQ
LC/MS-QTOF
Comparación de
Perfiles Genéricos del
Metaboloma
(metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS
(TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para
Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de
Perfiles Específicos
(metabolitos concretos)
Se trabajará con
QqQ/QTOF en modo
MS/MS o en MS
(QTOF/TOF) en modo
selectivo (masa exacta)
Típico para Validación*
de Biomarcadores
Cambios en ciclos
concretos del
metabolismo
*Se corroborarán los resultados de PCA
con perfiles específicos de un elevado
nº de individuos.
16-9m
Página
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16
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UntargetTarget Discovery by “Pathway to Database
Tool”: PMDC
Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent
“Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos
metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS con masa exacta y finas
ventanas de masa de extracción ):
• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés de: Wikipaths, BioCyc, KEGG…
• Elimina metabolitos redundantes.
• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:
• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)
LC-QqQ
GC-QqQ
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Predicción Automática de Clases:
Desarrollo del Modelo (lab. R&D)
Feature Extraction
 QC
Aplicación Automática Modelo via Scripting (QC lab)
Chemometric
Analysis
Acquisition
Feature
Extraction
MPP
MassHunter
(MH)
Modelo
Predictivo
Etapas:
1.-Se genera un modelo predictivo
(lab. I&D) mediante algoritmos de
predicción de clases (mediante
Acquisition
Feature
Extraction
SCP
Modelo
Report
_____________
_______
__________
__________
MassHunter (MH)
Feature
Extraction
SCP
Report
Modelo
Acquisition
_____________
_______
__________
__________
MassHunter (MH)
Acquisition
Feature
Extraction
SCP
Modelo
2.-El modelo predictivo generado se
aplica en laboratorios Control
Calidad (GC/MS Q/ QqQ/QTOF –
LC/MS TOF/QTOF/QqQ) para
clasificar nuevas muestras
automáticamente sin intervención
del usuario (mediante SCP: “Sample
Report
_____________
_______
__________
__________
MassHunter (MH)
Mass Profiler Profesional “MPP” a
partir de datos de Mass Hunter MH ):
– Partial Least Squares Discrimination
– Naïve Bayes
– Decision Tree
– Support Vector Machine
– Neural Network
SCP
Modelo
Acquisition
Lab. R&D
Class Predictor”).
Report
_____________
_______
__________
__________
MassHunter (MH)
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría
de Masas más Utilizada en
Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis
Comparativos por Espectrometría de
Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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Concepto y Aportaciones
de la Biología Integrada
• Dificultad : Extrema complejidad y variabilidad entre individuos
de los procesos biológicos:
• La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la
activación de otras vías alternativas.
• Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones
postraduccionales,…..
• Todas las –omicas acaban influenciándose unas a otras.
• ….
•
La Integración de datos experimentales de diferentes –ómicas permitirá:
• Reducir el ruido debido a la enorme variabilidad de las muestras biológicas.
• Validar los resultados experimentales a través de una coherente interpretación
biológica de los cambios de expresión observados entre distintas las distintas
poblaciones de individuos/ tratamientos/ enfermedades/…. comparadas en el estudio.
• Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores
requiere efectuarla con unos miles de individuos de cada población.
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El reto de la Biología
DNA
RNA
Protein
Metabolite
DNA
RNA
Protein
Metabolite
DNA
RNA
Protein
Metabolite
DNA
RNA
Protein
Metabolite
RNA
Protein
Metabolite
RNA
Protein
Metabolite
RNA
Protein
Metabolite
DNA
DNA
RNA
Protein
Metabolite
Protein
DNA
Protein
RNA
DNA
Protein
“-Omics”
Metabolite
RNA
Protein
Metabolite
Biological Processes
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El Concepto de Biología Integrada
Las rutas metabólicas constituyen el
nexo de unión entre distintas -ómicas
Gene A
R
HO
Gene A
R
R
Gene B
HO
Gene A
R
Gene B
Gene X
R
HO
R
Gene BGene X
Gene X
•
•
•
Identificar qué caminos están activos.
Reducir el ruido biológico (por variabilidad).
Sugerir experimentos de seguimiento.
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La visión de resultados de
disciplinas (/-ómicas) individuales
describe sólo una parte del cuadro.
La visión integrada de datos de
multiples fuentes (/-ómicas) ayuda a
una mejor interpretación de los
resultados en su contexto (/biológico).
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Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB:
Cambios expresión representados en las propias rutas
Gene Product
Data Overlay
Metabolite Data
Overlay
Enrichment Analysis on curated pathways and computationally
– derived networks
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría
de Masas más Utilizada en
Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis
Comparativos por Espectrometría de
Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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5/20/2013
Resumen.
• Los Estudios Metabolómicos basados en
Espectrometría de Masas y PCA son una
herramienta muy poderosa para el
Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores.
• La Espectrometría de Masas es una herramienta
clave en laboratorios -ómicos y clínicos para
Investigación Biomédica y Monitorización
Terapéutica de Drogas (TDM).
• La Metabolómica guiada por Rutas metabólicas
es una herramienta muy poderosa para estudios
de Nuevos Biomarcadores y de Toxicidad de
nuevos fármacos.
Para colaboraciones científicas o
servicios de análisis -ómicos,
Agilent le puede poner en contacto
con grupos de investigación /
laboratorios que disponen de todas
estas herramientas.
• Los enfoques multi -ómicos reducen el "ruido de
muestras biológicas" (debida a su gran diversidad).
• La Metabolómica puede ayudar mucho en la
evolución hacia una medicina Predictiva,
Preventiva, Personalizada y Participativa.
isidre_masana@agilent.com
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¿Preguntas?
www.metabolomics-lab.com
isidre_masana@agilent.com
Especialista de Productos LC/MS
Agilent Technologies
http://www.chem.agilent.com
customercare_spain@agilent.com
Tel. 901.11.6890
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