MANUAL práctico de parasitología veterinaria

Manual Práctico de Parasitología Veterinaria Colección manuales uex - 69 (E.E.E.S.) Unidad de Parasitología. Dpto. de Sanidad Animal Fac. de Veterinaria. Universidad de Extremadura PORTADA ÍNDICE 69 ÍNDICE PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX 69 PORTADA (E.E.E.S.) Espacio Europeo Educación Superior ÍNDICE FRANCISCO J. SERRANO AGUILERA (COORD.) MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 2010 PORTADA ÍNDICE MANUAL práctico de parasitología veterinaria / Francisco Javier S errano Aguilera (Coord.). — Cáceres : Universidad de Extremadura, Servicio de Publicaciones, 2010 120 pp. ; 17 x 24 cm. – (Manuales UEX, ISSN 1135-870-X ; 69) ISBN 978-84-7723-910-9 1. Parasitología veterinaria. I. Serrano Aguilera, Francisco Javier. II. Tít. III. Universidad de Extremadura, Servicio de Publicaciones, ed. 576.89 La publicación del presente manual forma parte de las “Acciones para el Desarrollo del Espacio Europeo de Educación Superior en la Universidad de Extremadura Curso 2008/09” en el marco de la VI Convocatoria de Acciones para la Adaptación de la UEX al Espacio Europeo de Educación Superior (Proyectos Pilotos: modalidad A1) del Vicerrectorado de Docencia e Integración Europea y financiada por la Junta de Extremadura, el Ministerio de Educación y Ciencia y la Universidad de Extremadura. Cualquier forma de reproducción, distribución, comunicación pública o transformación de esta obra sólo puede ser realizada con la autorización de sus titulares, salvo excepción prevista por la ley. Diríjase a CEDRO (Centro Español de Derechos Reprográficos, www.cedro.org) si necesita fotocopiar o escanear algún fragmento de esta obra. © Los autores. © Universidad de Extremadura, para esta 1ª edición. Edita: Universidad de Extremadura. Servicio de Publicaciones C/ Caldereros, 2 - Planta 2ª. 10071 Cáceres (España) Tel. 927 257 041 ; Fax 927 257 046 E-mail: publicac@unex.es http://www.unex.es/publicaciones ISSN 1135-870-X ISBN 978-84-7723-910-9 Depósito Legal M-16.788-2010 Impreso en España - Printed in Spain Maquetación, fotomecánica e impresión: Dosgraphic, s.l. – 914 786 125 PORTADA ÍNDICE AUTORES Dr. Francisco Javier Serrano Aguilera Dra. Eva María Frontera Carrión Dr. Luis Carlos Gómez Nieto Dr. Miguel Ángel Habela Martínez-Estéllez Dr. Juan Enrique Pérez Martín Dr. David Reina Esojo Ldo. Rafael Calero Bernal Dr. Jesualdo Carcelén Rodríguez Ldo. Javier Fernández Cotrina Ldo. José Antonio Gamito Santos Dra. Virginia Iniesta Orozco Ldo. Francisco Javier Pariente Palomino Ldo. Isidro Suárez López Técnico. Esp. Lab. Manuel Gómez Blázquez Técnico Lab. Isabel Monroy Pérez Técnico Lab. Victoria Baz Agudo MANUALES UEX Técnico Lab. Pablo Pajares del Sol 7 PORTADA ÍNDICE PORTADA ÍNDICE PRÓLOGO La asignaturas que actualmente imparte nuestro grupo docente tienen un marcado carácter experimental y práctico, en el que son imprescindibles la adquisición de diversas competencias y destrezas prácticas por parte del alumno, que después deberán aplicar en su quehacer profesional. Sin embargo, estas competencias se basan con frecuencia en un conocimiento, que debido a las limitaciones de tiempo, no es posible adquirir previamente a la práctica que lo requiere. Esta dificultad, se dificultan aún más nuestra adaptación al Proceso de Bolonia, y su filosofía tendente a primar más la adquisición de habilidades que los conocimientos exhaustivos, lo que sin duda puede tener efectos positivos, pero también plantea retos docentes importantes. La dificultad para conjuntar conocimiento y práctica, requiere que los alumnos puedan acceder en tiempo real y de forma efectiva, a fuentes de información que puedan que faciliten la adquisición de las habilidades y destrezas que en ese momento están desarrollando, y que esta misma información le permita valorar la utilidad y alcance de la competencia que está adquiriendo. Por ejemplo, adquirir destreza para encontrar un parásito microscópico es difícil si no se dispone de una información básica sobre la morfología del parásito que va a identificar, y si esto es posible, será una competencia falta de interés y utilidad para el alumno, si carece de la información necesaria para comprender la relevancia y repercusiones de ese diagnóstico en su practica profesional. El manual está diseñado para que sea una fuente de consulta útil para los alumnos de las dos asignaturas troncales, antes citadas, así como para la asignatura optativa de Diagnóstico y Clínica de las Enfermedades Parasitarias, por la ventaja que supone tener la información unificada en materias tan relacionadas, así como por la economía de medios que lleva implícita. El manual se divide en tres partes principales. La primera está dedicada a la Parasitología, de mayor interés para los alumnos de la asignatura del mismo nombre, donde se describen los principales grupos taxonómicos de los parásitos y especies más representativas, con así abundantes fotografías y dibujos esquemáticos que revelen sus características morfológicas y biológicas principales. El objetivo principal de este capítulo es que el alumno sea capaz de identificar y reconocer la morfología de los principales parásitos, así como PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Una forma de proporcionar esta información adicional a las clases magistrales, cada vez más necesaria, la ofrecen sin dudas las llamadas nuevas tecnologías, pero en entornos como el laboratorio de prácticas, la consulta veterinaria o las prácticas de campo, no es la mejor opción. Una guía o manual de prácticas sigue siendo una fuente de información imprescindible e insustituible para el desarrollo de las mismas, especialmente, en asignaturas como la Parasitología y las Enfermedades Parasitarias, que requieren un abundante material iconográfico. 9 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… a sociarlos a unos hospedadores y vías de contagio concretos. La segunda parte, dedicada a las Enfermedades Parasitarias, recoge especialmente la metodología de tomas de muestras y técnicas diagnósticas que permitirán al alumno que éste sea capaz diagnosticar correctamente las enfermedades parasitarias. La parte final recoge material iconográfico y anexos de interés común para todos los alumnos. Por último, queremos agradecer al Vicerrectorado de Calidad y Formación Continua por su Plan de Adaptación de la UEx al Espacio Europeo de Educación Superior, que ha hecho posible la edición de este libro. Junio de 2009 MANUALES UEX Unidad de Parasitología Departamento de Sanidad Animal Facultad de Veterinaria Universidad de Extremadura 10 PORTADA ÍNDICE ÍNDICE GENERAL PRÓLOGO ÍN DI CE 9 I.PARASITOLOGÍA 13 Reino protozoa14 Reino animalia 21 Phylum Plathyhelmintes21 Phylum Nematoda31 Phylum Arthropoda40 II. T ÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO45 1. Toma de muestras y envío al laboratorio 46 2. Examen coprológico 47 3. Examen de sangre 56 4. Examen de tejido muscular 61 5. Examen de piel 64 6. Examen de vísceras 65 7. Examen de orina y secreciones 67 8. Realización y examen de biopsias 68 9. Diagnóstico inmunológico 70 III. LÁMINAS DE IDENTIFICACIÓN 75 IV. LÁMINAS DE LESIONES 81 ANEXO 1. TAXONOMÍA 89 ANEXO 2.PRINCIPALES GÉNEROS PARÁSITOS SEGÚN HOSPEDADORES Y LOCALIZACIONES ORGÁNICAS PORTADA ÍNDICE 103 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX I. PARASITOLOGÍA 13 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Euglenozoa Clase Kinetoplastea Orden Trypanosomatida Familia Trypanosomatidae Géneros Trypanosoma y Leishmania 3 4 2 Amastigote 1 Epimastigote Tripomastigote Promastigote Morfología en Trypanosomatidae 1) Nucleo; 2) Kinetoplasto; 3) Flagelo; 4) Membrana ondulante. Trypanosoma brucei (tripomastigote). MANUALES UEX 14 PORTADA Leishmania infantum (amastigote). ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Eimeriidae Géneros Eimeria, Isospora y Cystoisospora Micropilo esporocisto esporozoito Opérculo Cuerpo de Stieda Glóbulo refractil A gránulo polar residuo ooquístico residuo esporocístico Esporozoito MEROGONIA B Merozoito Microgameto GAMETOGONIA Macrogameto Ooquiste ESPOROGONIA MANUALES UEX Dibujo esquemático de los oquistes de Eimeria (A) e Isospora (B) y ciclo evolutivo del género Eimeria. Dibujo e imagen microscópica de oquistes esporulados de Eimeria sp. y Cystoisospora sp. esporulando. PORTADA ÍNDICE 15 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Cryptosporidiidae Género Cryptosporidium Infección endógena (autoinfección) merozoitos II esporozoito trofozoito microgamentos merozoitos I meronte I meronte II microgametocito macrogameto ooquiste ooquiste esporulado medio ambiente MANUALES UEX Ciclo de Cryptosporidium sp. Ooquistes de Cryptosporidium sp. (Heine). Ooquistes de Cryptosporidium sp. (Ziehl-Neelsen). 16 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Conoidasida Orden Eucoccidiorida Suborden Eimeriorina Familia Sarcocystidae Géneros Sarcocystis y Toxoplasma Suborden Adeleorina Familia Hepatozoidae Géneros Hepatozoon Hospedador definitivo Esporocistos libres Hospedador intermediario Ciclo evolutivo de Sarcocystis miescheriana. Quiste de Sarcocystis miescheriana (corte histológico teñido con hematoxilina-eosina). PORTADA Hepatozoon canis (gametocitos). MANUALES UEX 17 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Haemospororida Familia Plasmodiidae Géneros Plasmodium y Haemoproteus 11 22 33 44 55 66 77 88 MANUALES UEX Dibujo esquemático de algunas de las formas evolutivas del género Plasmodium en frotis sanguíneos: • Plasmodium malarie: trofozoito (1), esquizonte (2), esquizoitos y cuerpo residual dentro del eritrocito (3) y libres (4), gametocito ♀ (5) y ♂ (6). • Plasmodium falciparum: gametocito ♀ (7) y ♂ (8). Haemoproteus columbae (gametocito). Plasmodium sp. (varias formas evolutivas). 18 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Piroplasmorida Superfamilia Babesioidea Familia Babesiidae Género Babesia Babesia caballi (piroplasmas). Hospedador invertebrado (garrapata) Gametogonia Esporogonia intestino Zigoto Esporocineto Glándulas salivares Gametos Intestino Musculatura Epidermis T. Malpigi Hemolinfa Esporozoito Gametocitos Huevo Larva Merogonia Merozoito Ninfa MANUALES UEX Adulto Ciclo biológico de Babesia caballi. PORTADA 19 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO PROTOZOA SUBREINO BICILIATA Phylum Myzozoa Clase Aconoidasida Orden Piroplasmorida Superfamilia Babesioidea Familia Theileriidae Género Theileria Theileria annulata (piroplasmas). Merogonia linfocito eritrocito Glándulas salivares esporocineto Esporogonia merozoito cigoto intestino MANUALES UEX Gametogonia 20 Ciclo biológico de Theileria annulata. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Género Fasciola ci vo in pg ac ov cd oo ut gm h ce vd te vi • Aparato de fijación: ventosa oral (vo) ventosa ventral o acetábulo (ac). Aparato digestivo: Boca (rodeada por la vo), faringe muscular (no representada), esófago e intestinos ciegos ramificados (líneas negras). • Aparato reproductor masculino: 2 testículos (te) ramificados, conductos eferentes (ce), conducto deferente (cd), bolsa del cirro con vesícula seminal interna y cirro rodeado de glándulas prostáticas (ci) y poro genital (pg). • Aparato genital femenino: ovario (ov) ramificado, unido mediante un oviducto al ootipo (oo), rodeado de glándulas de Mehlis (gm) al que también desembocan las glándulas vitelógenas (vi) mediante conductos vitelógenos o viteloductos (vd) transversales, longitudinales y medios. Del ootipo parte el útero y metratermo (ut), repleto de huevos (h) que desemboca en el poro genital (pg) antes citado. MANUALES UEX Fasciola hepatica. Tinción con carmín acético y dibujo esquemático: 21 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Género Dicrocoelium vo pg ci ac te ov oo vi ut Dicrocoelium dendriticum. Dibujo esquemático y tinción con carmín acético: MANUALES UEX Se identifican fácilmente ventosa oral (vo), ventosa ventral o acetábulo (ac), testículos (te) ramificados, bolsa del cirro y cirro (ci), poro genital (pg), ovario (ov), ootipo (oo), glándulas vitelógenas (vi) y útero y repleto de huevos embrionados en su parte final (detalle). El aparato digestivo consta de boca, rodeada por la ventosa oral (vo), faringe muscular (engrosamiento visible bajo la vo), esófago y dos intestinos ciegos simples laterales que llegan hasta el tercio posterior (líneas verde azuladas). 22 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Trematoda Clase Digenea Géneros Paramphistomum y Schistosoma MANUALES UEX Paramphistomum cervi (dibujo esquemático y tinción con carmín acético). Schistosoma bovis (macho). PORTADA 23 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Ciclophyllidea Familia Taeniidae Subfamilia Taeniinae Género Taenia (= Taeniarhynchus, Multiceps, Hydatigera) Hospedador definitivo 2 1 3 Coenuro cerebralis (metacestodo) Anillo grávido A A 4 Huevo Hospedador intermediario 5 11 7 6 BB Ciclo biológico de Taenia multiceps. 14 8 9 MANUALES UEX 12 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Ganchos. Rostelo. Ventosa. Proglotis inmaduros. Canales excretores. Vagina. Ootipo. Ovario. Glándulas vitelógenas. Útero. Cirro. Conducto deferente. Testículos. Poro genital. Huevos. 10 14 15 C C Dibujo esquemático de Taenia sp. (A = escólex; B = proglotis maduro; C = proglotis grávido). 24 PORTADA 13 ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Doble corona de ganchos Forma de puñal árabe mango guarda hoja Escólex { Rostelo Ganchos Ventosas Cuello Estróbilo (proglótides inmaduros) Dibujo esquemático del extremo anterior de Taenia sp. A B C MANUALES UEX Esquema de las formas larvarias de Taenia (sensu lato): A) Cisticerco. B) Estrobilocerco. C) Coenuro. 25 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Escólex de Taenia sp. Proglotis maduros y grávidos de Taenia sp. MANUALES UEX Proglotis grávido de Taenia sp. repleto de huevos. 26 Cisticerco Taenia hydatígena (evaginado). PORTADA Cenuro de Taenia multiceps (detalle). ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Taeniidae Subfamilia Echinococcinae Género Echinococcus Echinococcus granulosus. Dibujo esquemático y tinción con carmín acético. El último anillo es grávido, con un útero sacciforme, a diferencia de otros ténidos. BB F. serrano © 2008 Dibujo esquemático de un metacestodo de Echinococcus granulosus (quiste hidatídico o Echinococcus hydatidosus) con dos vesículas hijas, cápsulas prolígeras (A) con protoescólices inviables y viables (B) y protoescólices libres, en los que se aprecia una corona, de ganchos con forma de puñal árabe. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX A A 27 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Anoplocephalidae Género Moniezia A glándulas interproglotídeas B Hospedador definitivo Hospedador intermediario (ácaro oribátido) Huevo Ciclo biológico de Moniezia sp. MANUALES UEX A = Moniezia expansa; B = Moniezia benedeni. 28 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA Dibujo esquemático de Davainea proglottina. Railletina tetragona (proglotis maduros). MANUALES UEX SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Davaineidae Género Davainea Género Railletina 29 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Plathyhelminthes Infraphylum Cercomeromorpha Clase Cestoidea Orden Cyclophyllidea Familia Dipylidiidae Género Dipylidium Hospedador definitivo Cápsula ovígera Adulto Ctenocephalides canis (Hospedador intermediario) Huevo Larva Ciclo biológico de Dipylidium caninum. D. caninum (anillos maduros). MANUALES UEX 30 PORTADA D. caninum (anillo grávido). ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Orden Rhabditida Suborden Strongylida Superfamilia Strongyloidea Familia Strongylidae Género Strongylus corona radiada A festones B cápsula bucal surco dorsal de la glándula esofágica C dientes esófago Strongylus vulgaris (A); S. equinus (B); S. edentatus (C) (vista lateral). espícula c. ventroventral c. lateroventral télamon c. anterolateral gubernáculo c. mediolateral c. posterolateral cloaca c. externodorsal bolsa copuladora c. dorsal costillas Esquema del extremo posterior de los machos del Suborden Strongylida. MANUALES UEX 31 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA MANUALES UEX SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Orden Rhabditida Suborden Strongylida Superfamilia Strongyloidea Familia Chabertiidae Géneros Oesophagostomum y Chabertia Oesophagostomum dentatum (extremo anterior). Chabertia ovina (extremo anterior). 32 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (~ Secernentea) Suborden Strongylida Superfamilia Ancylostomatoidea Familia Ancylostomatidae Géneros Ancylostoma, Uncinaria y Bunostomum Uncinaria stenocephala (extremo anterior). Bunostomum trigonocephalum (extremo anterior). MANUALES UEX Ancylostoma sp. (extremo anterior). 33 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Suborden Strongylida Infraorden Trichostrongylina Géneros Trichostrongylus, Teladorsagia, Haemonchus y Nematodirus L3 (filariforme) cutícula de la L2 muda cutícula de la L1 Hospedador L2 (rabditiforme) muda huevo L1 (rabditiforme) mórula eclosión Ciclo biológico general de los nematodos gastrointestinales del Suborden Strongylida. Ostertagia circumcincta (bolsa copuladora ♂). Haemonchus contortus (bolsa copuladora ♂). Nematodirus spathiger (bolsa copuladora ♂). MANUALES UEX Trichostrongylus retortaeformis (bolsa copuladora ♂). 34 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Chromadorea (= Secernentea) Suborden Strongylida Superfamilia Trichostrongyloidea Familia Dictyocaulidae: Género Dictyocaulus L3 L1 L2 Ciclo biológico de Dictyocaulus viviparus. Dictyocaulus viviparus (bolsa copuladora ♂). Superfamilia Metastrongyloidea Familia Metastrongylidae Género Metastrongylus Hospedador intermediario Hospedador definitivo Huevo larvado Ciclo biológico Metastrongylus apri. Hospedador definitivo Metastrongylus apri (extremo posterior). Hospedador intermediario L1 Familia Protostrongylidae Géneros Protostrongylus, Muellerius, Neostrongylus y Cystocaulus PORTADA Ciclo biológico Muellerius capillaris. ÍNDICE MANUALES UEX 35 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Ascaridida (= Ascaridomorpha) Superfamilia Ascaridoidea Familia Ascarididae Géneros Ascaris, Parascaris, Toxocara y Toxascaris Toxocara mystax (extremo anterior). Ascaris suum en intestino delgado de cerdo. MANUALES UEX Superfamilia Heterakoidea Familia Heterakidae Género Heterakis Familia Ascaridiidae Género Ascaridia 36 Heterakis sp. (extremo posterior). PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Oxyurida (= Oxyuridomorpha) Familia Oxyuridae Géneros Oxyuris, Enterobius, Passalurus y Skrjabinema Familia Heteroxynematidae Género Aspiculuris Aspiculuris tetraptera (extremo posterior ♀). Passarulus ambiguus (extremo anterior). Passarulus ambiguus (zona uterina ♀ y extremo posterior ♂). Passarulus ambiguus (huevo). MANUALES UEX 37 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA MANUALES UEX SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Orden Spirurida (= Spiruromorpha) Superfamilia Habronematoidea Géneros Habronema y Draschia Superfamilia Filarioidea Géneros Dirofilaria y Onchocerca Superfamilia Spiruroidea Géneros Gongylonema, Spirocerca y Ascarops Dirofilaria immitis (Microfilarias, L1). Gongylonema pulchrum (extremo anterior). Ascarops strongylina (extremo anterior). Ascarops strongylina (extremo posterior ♂). 38 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Nematoda Clase Enoplea (~ Adenophorea) Orden Trichinellida Superfamilia Trichinelloidea Géneros Trichuris, Capillaria y Trichinella Capillaria aerophila (detalle útero ♀). Trichuris skrjabini (Esófago glandular). músculo esquelético L1 madura Larvas emigrantes Ciclo biológico de Trichinella sp. PORTADA epitelio intestinal MANUALES UEX quiste 39 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Arachnida Subclase Acari Superorden Parasitiformes Orden Mesostigmata (= Gamasida). Género Dermanyssus Orden Metastigmata (= Ixodida) Familia Argasidae (Garrapatas blandas) Familia Ixodidae (Garrapatas duras) MANUALES UEX Hyalomma lusitanicum ♀ y ♂ (Ixodidae) (vista dorsal). Ornithodoros erraticus (Argasidae) (vistas dorsal y ventral). 40 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Arachnida Subclase Acari Superorden Acariformes Orden Astigmata (~ Sarcoptiformes) (Ácaros de la sarna) Orden Trombidiformes. Género Demodex (sarna demodécica) Sarcoptes scabiei suis. Psoroptes equi cunicui. Huevo de Sarcoptes scabiei suis. Demodex canis. MANUALES UEX 41 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Phthiraptera Subórdenes Anoplura, Amblycera, Ischnocera Orden Hemiptera Orden Siphonaptera Bovicola (~ Damalinia) caprae (Ischnocera). Haematopinus suis (Anoplura). Triatoma infestans (Hemiptera). Ctenocephalides canis (Siphonaptera). MANUALES UEX 42 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA REINO ANIMALIA SUBREINO BILATERIA Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Diptera Suborden Nematocera Suborden Brachycera (Tabanomorpha y Muscomorpha) Gasterophilus sp. (L3 en estómago de équido). Oestrus ovis (diferentes estadios larvarios). 2. Larvas 1 en esófago. 3. Larvas 3 en dorso de vacuno. 4. Pupas. MANUALES UEX 1. Imago. Fases del ciclo biológico de Hypoderma lineatum. PORTADA 43 ÍNDICE PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX II. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO 45 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 1. TOMA DE MUESTRAS Y ENVÍO AL LABORATORIO 1.1. Heces Se debe intentar siempre que la recogida de heces se realice directamente del recto del animal, para evitar así posibles contaminaciones por nematodos de vida libre que se encuentran en el medio ambiente, dificultando a veces el diagnóstico coprológico. Las heces se depositan en un frasco limpio con un algodón húmedo, o bien en bolsas herméticamente cerradas y en un ambiente de humedad. Si las heces están secas, no se pueden utilizar para diagnóstico, ya que los elementos de diseminación pueden estar deteriorados. Una vez realizada esta operación, se recomienda el envío rápido al laboratorio para su procesado. Es muy importante que los botes o bolsas estén debidamente etiquetados, completamente limpios, herméticamente cerrados y se les incorpore una anamnesis completa de la explotación y/o del animal objeto de estudio. 1.2. Sangre La sangre debe enviarse entera y/o con anticoagulante, conservándose refrigerada a 4 °C hasta su remisión al laboratorio. Al igual que las heces, debe mandarse debidamente identificada añadiéndose la correspondiente anamnesis. En la extracción se debe evitar por todos los medios que los eritrocitos se hemolicen, ya que en estos casos se dificulta en gran medida el diagnóstico de algunos parásitos intraeritrocitarios. También se puede enviar al laboratorio frotis sanguíneos fijados previamente con metanol u otro medio. Para diagnósticos serológicos se toma sangre entera y se espera hasta que se forme un coágulo, extrayéndose el suero sanguíneo y se procede a su congelación. También en los casos de sangre con anticoagulante se realiza una centrifugación, extrayéndose el plasma y conge lándose hasta el momento de su uso. MANUALES UEX 1.3. Vísceras y tejido muscular 46 Las vísceras deben remitirse debidamente identificadas al laboratorio, refrigeradas y en el menor tiempo posible, o bien en frascos con glicerina, creando un ambiente anaerobio que evite la putrefacción. En el caso del tejido muscular, la remisión debe hacerse debidamente identificada y con la muestra refrigerada. 1.4. Piel Primeramente se procede al raspado con bisturí en los bordes de las depilaciones hasta que brote un poquito de sangre. El material recogido, incluida la cuchilla de raspado, se PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA manda al laboratorio en bolsa de plástico, placa de Petri o frasco herméticamente cerrado e identificado. Sería conveniente el envío de dos raspados por animal para remitir muestra del mismo también al laboratorio de patología infecciosa. 2. EXAMEN COPROLÓGICO 2.1. Examen directo de heces frescas –– En un portaobjetos, sobre una gota de suero fisiológico templado (38-40 °C), se coloca una pequeña cantidad de heces, a ser posible tomada del centro de la masa fecal. –– Se mezclan perfectamente hasta conseguir una capa fina. La extensión debe tener un grado de transparencia suficiente para que un texto, colocado debajo del portaobjetos, se pueda leer sin dificultad. –– Se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio. –– Para una mejor visualización de protozoos móviles (trofozoitos de Giardia, Chilomastix, etc.) o sus quistes, alternativamente se puede poner una gota de lugol en el portaobjetos para hacer la extensión con las heces, así como otras técnicas de tinción (hematoxilina-cristal violeta, etcétera). Indicaciones Esta técnica permite reconocer cualquier elemento de diseminación de los parásitos, pero en caso de no observar ninguna forma parasitaria por este método, no debe descartarse la posibilidad de una parasitosis, ya que el tamaño de la muestra es tan pequeño que el resultado negativo no es excluyente. Sin embargo, no es sustituible por su sencillez, rapidez y fundamentalmente porque algunos parásitos no son evidenciables por otras técnicas, que en general son mucho más sensibles, siendo de especial utilidad para la detección de protozoos móviles. 2.2. Métodos de enriquecimiento (cualitativos) Este sistema se basa en lograr la concentración de los elementos de diseminación (huevos, larvas y quistes) por flotación en un líquido de mayor densidad que ellos. La densidad de los elementos de diseminación de los parásitos oscila generalmente entre 1,05 y 1,10. La densidad de las soluciones empleadas, no debe ser excesivamente alta para que no deformen los elementos parasitarios y para que no floten otras partículas sólidas presentes en las heces. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX 2.2.1. Flotación 47 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… a) Flotación en solución saturada de NaCl Probablemente sea la solución más empleada y la que ofrece más ventajas. Tiene una densidad de 1,18 y se prepara hirviendo una solución en exceso de sal común durante unos minutos. Se deja enfriar, se filtra y se ajusta a la densidad indicada. Técnica –– Se mezcla una pequeña cantidad de heces con solución saturada de NaCl en un vial de paredes rectas (Fig. 1, dibujo 1, 2 y 3). –– Con unas pinzas se disgregan perfectamente las heces (Fig. 1, dibujo 4). –– A continuación se agrega suficiente solución para que se forme un menisco convexo en la superficie del vial (Fig. 1, dibujo 5). –– Sobre este menisco convexo, se coloca un cubreobjetos con una superficie mínima de 18 × 18 mm, teniendo la precaución de evitar que se formen burbujas de aire en la superficie del líquido de flotación, o que floten porciones de heces sin disgregar (Fig. 1, dibujo 6). Si esto último resulta difícil de evitar, la suspensión de heces se puede realizar en otro recipiente y tras filtrarla mediante una doble gasa, se coloca en el vial mediante una pipeta Pasteur. 1 2 3 4 5 6 Figura 1. Secuencia para la realización de la técnica coprológica de flotación. MANUALES UEX –– Se esperan 45 minutos y se recoge el cubreobjetos, manteniéndolo en posición horizontal para que no se desprenda la gota de solución salina que queda adherida al mismo. Con un movimiento suave se coloca sobre un portaobjetos (Fig. 2) y se examina a 40x y 100x con el diafragma cerrado. Debe examinarse sin dilación, ya que la solución salina de la preparación se cristaliza por completo en pocos minutos. 48 –– Cuando se dispone de una centrífuga, la suspensión se puede centrifugar a 1.500 rpm durante 3 minutos. En los tubos de centrífuga se coloca un cubreobjetos de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Se recoge el cubreobjetos, se deposita sobre un porta y se observa al microscopio. Para la investigación de Giardia, Chilomastix, etc., se colorea la preparación con lugol. Este procedimiento, si bien es más rápido, es menos preciso que el anterior. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Figura 2. Colocación del cubre sobre el portaobjetos. Indicaciones Es la técnica más empleada en cualquier laboratorio de parasitología. Con ella se pueden observar la mayoría de los huevos y larvas de nematodos, los ooquistes de coccidios y algunos huevos de cestodos. Sin embargo, no flotan los huevos de trematodos, los cestodos seudofilideos, ni las larvas de nematodos pulmonares, para los que habría que utilizar soluciones de mayor densidad. b) Otras soluciones empleadas para métodos de flotación Solución al 33% de Sulfato de Zinc (densidad de 1,33), solución al 35% de Sulfato Magnésico (densidad de 1,28), solución de N2O3Na (densidad de 1,360), solución de sacarosa (densidad 1,2). Estas soluciones están recomendadas para el diagnóstico de las formas de diseminación de mayor densidad, como Fasciola hepática en rumiantes, Metastrongylus en cerdos, de Spirocerca lupi en el perro, etcétera. 2.2.2. Sedimentación Se trata de concentrar los posibles elementos de diseminación existentes en las heces por simple gravedad. Técnica –– Se pasa la suspensión a través de un tamiz (doble gasa) en una copa de 500 cc y se llena seguidamente de agua hasta aproximadamente 2,5 cm del borde. –– Añadir 2-3 gotas de Azul de Metileno o Verde Malaquita (opcional). Esto teñirá los restos vegetales, pero no los elementos de diseminación parasitarios, facilitando en gran medida su búsqueda al microscopio óptico. –– Se deja reposar 30-40 minutos. PORTADA MANUALES UEX –– Se mezclan varios gramos de heces con agua hasta que la disgregación sea completa. 49 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… –– Quitar el sobrenadante hasta la marca de 100 cc y volver a llenar con agua hasta el mismo nivel. –– Se repite el procedimiento hasta que el sobrenadante permanezca más o menos transparente (lo ideal es repetirlo 3 ó 4 veces). –– Para terminar este procedimiento, se elimina el sobrenadante y se examina el sedimento al microscopio. Para ello, se recogen al menos 9 gotas del sedimento con una pipeta Pasteur, las cuales se depositan en un portaobjetos y se les coloca un cubreobjetos, visualizándose al microscopio con el diafragma cerrado. También puede examinarse todo el sedimento restante a pocos aumentos en una placa de Petri, buscando en el esteromicroscopio (o un trichinelloscopio de pantalla) los huevos de Fasciola u otros elementos de diseminación de tamaño considerable. Indicaciones Se recomienda el método de sedimentación para el diagnóstico de quistes de amebas y ciliados, huevos de trematodos y de cestodos seudofilídeos, ya que por su elevado peso no se detectan por las técnicas usuales de flotación, anteriormente mencionadas. Esta técnica tiene la ventaja de recuperar todos los huevos de helmintos, larvas de nematodos, y quistes de protozoos en condiciones de viabilidad y sin distorsión; no obstante tiene el inconveniente de consumir excesivo tiempo y concentrar muy poco las formas parasitarias; de tal forma, que es más difícil visualizarlas. Los métodos de flotación y sedimentación son técnicas cualitativas de concentración que se complementan y se utilizan sistemáticamente ambas para el diagnóstico coprológico. 2.3. Coprocultivos o incubación de heces Se trata de mantener las heces en condiciones adecuadas de humedad, temperatura y oxigenación para que los elementos parasitarios evolucionen y alcancen estadios en que la identificación resulte más fácil y exacta, simulando las condiciones que se producen en el medio ambiente. 2.3.1. Esporulación de ooquistes de coccidios MANUALES UEX Para la identificación correcta de coccidios son necesarios ooquistes esporulados. Para que dicho proceso se desarrolle (esporulación-esporogonia) se procede como sigue: 50 –– En una placa de Petri, se mezclan las heces que contienen los ooquistes con una solución de dicromato potásico al 2%, el cual, además de dar humedad al medio, posee acción bactericida y fungicida. –– La placa se introduce en una estufa a temperatura adecuada (20-25 °C). –– Se ventilará a diario para proporcionar a los ooquistes el oxígeno necesario. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA –– Diariamente se podrán examinar por flotación los ooquistes para controlar el desarrollo de los esporozoitos. 2.3.2. Incubación de huevos de Strongylida En muchas parasitosis producidas por agentes pertenecientes al Orden Strongylida, el estudio de los huevos encontrados en las heces no es suficiente para determinar la familia y/o el género de los parásitos implicados, por falta de peculiaridades morfológicas y morfométricas diferenciadoras. En tales casos, las heces positivas se depositan en un medio que imite las condiciones medioambientales naturales, en las que los huevos embrionan (embriogénesis), eclosionan y experimentan una doble muda hasta alcanzar la fase o estadio de larva 3. Éstas tienen unas características morfológicas y morfométricas diferenciadoras entre géneros y especies. Técnica –– La muestra de heces de introduce en una placa de Petri y se le adiciona agua templada para proporcionarle humedad suficiente. –– Se lleva a una estufa (20-25 °C) durante 7-10 días. Si no se dispone de estufa, la embriogénesis también se producirá, pero dependiendo de la temperatura ambiental. A mayor temperatura, menor tiempo y viceversa. –– Cada día se controlará la humedad y se ventilará el coprocultivo durante unos minutos. –– Una vez transcurrido este tiempo, las heces se colocan en el aparato de Baermann para el aislamiento de las larvas y su posterior identificación (ver a continuación). 2.4. Método de Baermann para el aislamiento de larvas de nematodos en heces –– Las larvas son muy activas y presentan hidrotropismo positivo, migrando de las heces y sedimentándose en el fondo del tubo de goma conectado al embudo. –– A partir de 3-6 horas (tiempo máximo necesario 12-24 horas) se depositan sobre un vidrio de reloj las primeras gotas del sedimento, examinándose al estereomicroscopio. –– Con una pipeta se recogen algunas larvas y se depositan entre porta y cubre, examinándose a microscopía óptica. –– La muestra objeto de análisis se puede mezclar con una o dos gotas de lugol para fijar y colorear las larvas y hacer así más fácil su identificación. Si no disponemos de aparato Baermann, el aislamiento de las larvas se puede realizar en una copa de sedimentación llena de agua templada sobre la que depositaremos un colador PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Se monta el aparato de Baermann. El embudo se llena de agua templada y sobre ésta es depositada la muestra (sobre gasas y tamiz), de manera que se produzca un contacto suave entre las heces y agua. 51 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… y una gasa. Sobre ésta se deposita la muestra, de tal forma que las larvas migren hasta el fondo de la copa. Finalmente, con cuidado se retira el sobrenadante y se recogen las larvas del sedimento. 2.5. Examen cuantitativo (Método de McMaster) Sirve para realizar una estimación aproximada de la carga parasitaria, y por tanto se su posible significación clínica, a través del número de ooquistes, huevos o larvas por gramo de heces. La cámara de McMaster consta de dos compartimentos independientes y abiertos lateralmente que están cubiertos por un cubreobjetos. Cada compartimento tiene una altura de 0,15 cm y en el cubreobjetos tiene trazado un cuadrado de 1 cm de lado, dividido en calles para facilitar el contaje. Por tanto, el volumen que se examina de cada cámara es de 0,15 cc (volumen total de 0,3 cc). MANUALES UEX Su procedimiento es como sigue: 52 –– Suspender cuidadosamente 2 gramos de heces en solución saturada de NaCl hasta un volumen final de 60 ml (aproximadamente 58 ml). –– Filtrar la suspensión por una doble gasa, presionando finalmente sobre la malla. De esta forma, son eliminadas las partículas más groseras. –– Agitar suavemente la suspensión, para homogeneizarla perfectamente, con el objeto de distribuir uniformemente los elementos de diseminación. –– Inmediatamente, llenar con una pipeta los compartimentos de la cámara de McMaster, evitando que se formen burbujas de aire (Fig. 3). –– Colocar la cámara de McMaster en el microscopio, y dejarla reposar unos 5 minutos para que los elementos parasitarios floten y acumulen en la parte superior de la cámara. –– Enfocar a 40 aumentos (objetivo 4x) las líneas dibujadas en la parte superior de la cámara y centrar el campo en el extremo de la primera calle. Sin mover la cámara, cambiar el objetivo de 4x a 10x (100 aumentos) y ajustar el enfoque. No debe intentar enfocar la cámara a mayores aumentos, ni intentar enfocar su parte inferior, ya que podría romperla con el objetivo del microscopio. Sólo debe realizar ligeras correcciones de enfoque durante el recuento, tomando únicamente como referencia las líneas de la cámara. No intente enfocar partículas que vea borrosas cuando las líneas están bien enfocadas, ya que eso implica que están en un plano inferior de enfoque (y que por tanto no están en el parte superior de la cámara). –– Realizar el contaje siguiendo las calles o columnas marcadas en ambas cámaras. Como la suspensión de heces está en la relación 1 g en 30 cc (2 g en 60 cc), y se examina un volumen total de 0,3 cc, este contaje equivale al examen de 0,01 g de heces. Por tanto, la cantidad de elementos de diseminación por gramo de heces es la suma del contaje de ambos compartimentos multiplicado por 100. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Figura 3. Cámara McMaster. –– Si el número de huevos u ooquistes en cada calle es muy bajo, es conveniente repetir el contaje varias veces y obtener la media. Por el contrario si es muy alto y difícil de contar, se pueden contar una sola cámara, o sólo algunas calles, extrapolando el resultado a las calles restantes, o bien repetir el contaje diluyendo parte de la suspensión sobrante a un volumen apropiado según la intensidad de la infestación, y multiplicar el contaje final por ese factor de dilución (por ejemplo si diluimos la suspensión a examinar al 1/10, en contaje final se deberá multiplicar por 10). Si se requiere una mayor sensibilidad, un simple modificación consiste en duplicar el tamaño de la muestra de heces sin modificar el volumen final (4 g de heces en 56 ml de solución salina) por lo que el contaje de ambas cámaras se debe multiplicar por 50. Una ventaja adicional de esta modificación es que la suspensión de heces sobrante se puede emplear para rellenar unos viales con una pipeta Pasteur y realizar la técnica de flotación a partir del punto indicado en el dibujo 5 de la figura 1. Esto permite simplificar la rutina en el laboratorio, al aunar los primeros pasos de ambos métodos y poder realizar simultáneamente ambas PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Con este método, por tanto, el recuento mínimo es de 100 elementos de diseminación por gramo de heces. Esta sensibilidad suele ser suficiente en la práctica, dado que los contajes inferiores se corresponden a cargas parasitarias muy leves que no suelen tener significación clínica. 53 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… técnicas, con el consiguiente ahorro de tiempo. Además, la flotación realizada de esta forma es preferible, ya que se parte siempre de la misma cantidad de heces, y gracias al filtrado se evita que algunas heces no se disgregan fácilmente en el vial o queden partículas gruesas que floten y dificulten el examen del cubreobjetos. Para una mayor sensibilidad se ha descrito (FAO Animal Health Manual) otra modificación de este método cuantitativo con una sensibilidad de hasta 20 huevos/g heces, con la ventaja adicional de que tras la recogida y un procesamiento inicial, las muestras se pueden mantener refrigeradas a 4 °C hasta 1 semana sin que se altere el número de huevos en la muestra, lo que puede resultar conveniente cuando el número de muestras a procesar es muy alto. El procedimiento es como sigue: –– Pesar 4 g de heces y añadirle 56 ml de agua. –– Mezclar adecuadamente con una espátula y dejar reposar 30 minutos para su correcta homogeneización. –– Filtrar la mezcla a través de una gasa a un segundo vaso de precipitado e inmediatamente después verter 10 ml de esta solución a un tubo de centrifuga. –– Centrifugar 7 minutos a 1.200 rpm. –– Retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no remover el sedimento (en este paso se puede interrumpir el proceso, conservando estos tubos con el sedimento en el refrigerador, hasta 7 días). –– Añadir al sedimento 4 ml de una solución de flotación (solución salina sobresaturada + glucosa) mezclando cuidadosamente usando una pipeta Pasteur. –– Finalmente, rellenar la cámara McMaster evitando la formación de burbujas y dejar 3-5 minutos para permitir la flotación de todos los huevos. Se cuentan el total de huevos y el resultado se multiplica por 20. 2.6. Identificación de ooquistes de Cryptosporidium sp. MANUALES UEX Los ooquistes de Cryptosporidium son difíciles de identificar por su pequeño tamaño (próximo a 5 µm), falta de estructuras claramente visibles y su similitud con otros elementos normales de las heces, en especial las levaduras. 54 Existen varios métodos de tinción aceptables, pero es conveniente que vayan precedidos de un método de concentración, dado que pueden eliminarse en concentraciones muy bajas en enfermos leves o portadores. No obstante, por su rapidez, la tinción directa de las heces puede utilizarse como cuando se trata de comprobar si están implicados en las diarreas neonatales o diarreas de animales inmunodeprimidos. 2.6.1. Tinción por el Método de Heine –– Depositar una pequeña porción de heces sobre un porta y extender un poco. –– Teñir con fuchsina básica fenicada durante unos segundos. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA –– Eliminar el colorante sobrante y dejar secar. –– Observar a microscopía con objetivo de 40x o de inmersión (100x). 2.6.2. Tinción por el Método de Kinyoun modificado –– Realizar una extensión fina de heces en un portaobjetos. –– Dejar secar. –– Fijar a la llama durante unos 6 segundos. –– Fijar con metanol durante 5 minutos. Dejar secar. –– Teñir con fuchsina básica fenicada durante 10 minutos. –– Lavar con agua. –– Decolorar el exceso de fuchsina con alcohol-clorhídrico hasta que la parte más fina de la extensión sea transparente (aproximadamente 10 segundos). –– Lavar con agua para arrastrar el exceso de colorante. –– Teñir con una solución de verde malaquita al 5% durante 20-30 segundos. –– Lavar de nuevo con agua. –– Dejar secar y observar al microscopio óptico con el objetivo de inmersión. 2.6.3. Tinción por el Método de Ziehl-Neelsen modificado –– Extensión muy fina de heces en un portaobjetos. Dejar secar. –– Fijación con metanol o alcohol absoluto durante 5 minutos. Dejar secar. –– Teñir con fuchsina básica fenicada durante 60 minutos. –– Lavar con agua. –– Decolorar con ácido sulfúrico al 2% durante 10-15 segundos con el porta en agitación, o con alcohol clorhídrico hasta alcanzar una coloración pálida (de 5 a 10 segundos). –– Lavar con agua. –– Tinción de contraste con Verde Malaquita o Azul de Metileno al 5% durante 30 segundos. –– Lavar, secar y observar al microscopio. –– Extensión muy fina de heces en un portaobjetos. –– Dejar secar. –– Fijación con metanol o alcohol absoluto durante 5 minutos. –– Dejar secar. –– Teñir con Giemsa (3 gotas/litro de H2O) durante 25 a 30 minutos. –– Lavar con agua. –– Dejar secar. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX 2.6.4. Tinción con Giemsa 55 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Preparación de colorantes –– Fuchsina básica fenicada Fuchsina básica.............................................................................. Alcohol etílico al 95%................................................................... 1g 10 ml Mezclar con 5 ml de fenol (fundir los cristales previamente al “baño maría”) en 95 ml de agua destilada. –– Verde malaquita Verde malaquita............................................................................. Agua destilada................................................................................ 5g 100 ml 3. EXAMEN DE SANGRE 3.1. Técnicas para el diagnóstico de microfilarias 3.1.1. Examen en fresco Se deposita una gota de sangre fresca (con anticoagulante) entre porta y cubre, examinándose a microscopía con luz poco intensa. La existencia de microfilarias (larvas 1) es observada por los activos movimientos de éstas entre los elementos formes. Es una técnica fácil y que no requiere prácticamente material. Es importante observar varias preparaciones debido a la poca cantidad de sangre que es observada. La no observación de microfilarias no es excluyente, habiendo de recurrir a otros métodos más fiables (métodos de concentración). 3.1.2. Método del tubo microhematocrito Este método consiste en realizar un hematocrito con la muestra de sangre. Posteriormente se observa al microscopio óptico la zona del tubo microhematocrito situada entre los glóbulos blancos y plasma, localización donde se sitúan las microfilarias (Fig. 4). MANUALES UEX 3.1.3. Método de Knott 56 Se trata de un método de concentración de microfilarias. –– Se mezcla 1 ml de sangre con 9 ml de formalina al 2%. –– Centrifugación durante 8 minutos a 1.500 rpm. Posteriormente, se desecha el sobrenadante y se examina el sedimento al microscopio (adicionar una gota de colorante). PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA x100 Figura 4. Localización de las microfilarias en el tubo microhematocrito. 3.1.4. Método de filtración Es también un método de concentración de microfilarias, que consiste en: MANUALES UEX –– Se mezcla, agitando, 1 ml de sangre con 9 ml de formalina al 2% en una jeringa de 10-12 ml para lisar los eritrocitos. –– Se prepara la cámara de filtración, colocando sobre la rejilla metálica del portamembranas una membrana de policarbonato de 5 µm de diámetro de poro (Fig. 5). Sobre esta se coloca una arandela y la parte superior de la cámara, que se enrosca sobre el portamembranas. Figura 5. Cámara de filtración y membrana de policarbonato. PORTADA 57 ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… –– Se introduce el cono de la jeringa en la parte superior de la cámara de filtración y se inyecta despacio la solución lisada a través del filtro (si se atasca no se debe forzar la inyección de líquido, sino aspirar un poco, mezclar el lisado restante en un tubo apropiado con 10 ml de formalina, agitar nuevamente, y filtrarlo nuevamente, o en una segunda membrana). –– Enjuagar el filtro lentamente con 10-15 ml de agua para eliminar el exceso de células y detritus. –– Posteriormente, se desenrosca la cámara de filtración y se retira el filtro, colocándolo en un portaobjetos manteniendo el material filtrado hacia arriba. –– Teñir con una o dos gotas de colorante en el centro de la membrana y se coloca un cubreobjetos de tamaño apropiado sobre el filtro. Es conveniente esperar 30 segundos para obtener la máxima tinción. –– Finalmente, para visualizar las microfilarias teñidas, se observa la membrana al microscopio óptico a 100 aumentos. –– Si se observan microfilarias, deben diferenciarse por las características morfológicas y morfométricas que no se aprecian bien por este método, por lo que deben estudiarse mediante tinción en Giemsa o similar, previa concentración por el método de Knott si es necesario. Dado que algunas de estas características no son fáciles determinar, y varios autores señalan cierto solapamiento de tamaños entre las distintas especies de microfilarias, es interesante la tinción diferencial mediante el método de la fosfatasa ácida, ya que éste permite obtener una tinción diferencial de esta enzima en cada una de las microfilarias comunes en los cánidos. 3.1.5. Método de la fosfatasa ácida Reactivos Reactivo I Tampón acetato veronal de Michaelis o solución de Glicina-NaOH 50 mM pH = 10. Reactivo II (guardar a 4 °C, pues se mantiene estable algunas semanas) Naphtol AS-TR-phosphato.............................................................. N,N-dimetilformamida................................................................... 0,05 g 5 ml MANUALES UEX Reactivo III (Disolver en agua, calentándolo. Añadir HCl y enfriar. Guardar a 4 °C) 58 Pararosanilina................................................................................. Agua destilada................................................................................ HCl................................................................................................ 1g 20 ml 5 ml Reactivo IV (A 4 °C o temperatura ambiente) NaNO2........................................................................................... Agua destilada................................................................................ PORTADA ÍNDICE 4g 100 ml MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Reactivo V (Verde Metilo 1%; se mantiene a temperatura ambiente) Sol. a) Na2HPO4............................................................................ Agua destilada................................................................................ Sol. b) ácido cítrico. H2O.............................................................. Agua destilada................................................................................ Sol. de trabajo: a)........................................................................... b)........................................................................... Verde metilo................................................................................... 28,396 g 1.000 ml 21,011 g 1.000 ml 77,1 ml 122,9 ml 2g Sustrato 20 ml de sol I 50 ml de agua destilada 4 ml de sol II Mezclar 3,2 ml de sol III y IV y añadir a lo anterior (estables a 4 °C más de 6 meses) y ajustar a pH 5 con sosa 0,1 N. Hacer justo antes de su uso. Metodología –– Se incuban las muestras utilizando el sustrato 1 h a 37 °C o 2 h a 25 °C. –– Lavar con agua destilada. –– Contratinción con sol V 2 ó 3 minutos (opcional). –– Deshidratar con alcohol etílico de 95°. –– Lavar en xileno y montar. •• Dirofilaria immitis tiene un tamaño medio de 308 × 7 µm (299 × 5-6,5), de movimientos no progresivos, que una vez fijadas y teñidas (hematoxilina) aparecen con el cuerpo extendido, con un estrecho extremo cefálico de 11,5 µm y un recto extremo caudal de 28 µm de media. Además, posee estriaciones cuticulares, evidenciables una vez teñidas con hematoxilina. Por la técnica histoquímica antes descrita se detecta la presencia de actividad de la fosfatasa ácida de forma concreta y marcada en poro anal y poro excretor (Fig. 6, dibujo 1). •• Dirofilaria repens aparece en el método de la fosfatasa ácida con una zona con coloración roja en el poro anal, si bien puede aparecer alguna coloración rojiza en el centro del cuerpo y otras zonas (Fig. 6, dibujo 2). •• Dipetalonema dracunculoides aparece con este método con una tinción intensa el poro anal y una zona superior del cuerpo, así como coloraciones de menor intensidad en otras zonas, como el poro excretor, espacio cefálico (Fig. 6, dibujo 3) y es de menor tamaño que las microfilarias de D. immitis. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Diferenciación de microfilarias 59 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Figura 6. Tinciones histoquímica de distintas especies de microfilarias por método fosfatasa ácida. 1 2 3 4 •• Las microfilarias de Dipetalonema reconditum son también más pequeñas y con movimientos de progresión rápida a intervalos, con un prominente gancho cefálico y un extremo anterior obtuso. Varios autores señalan solapamiento de tamaño con las de D. immitis, lo que hace interesante su tinción con esta técnica para demostrar la actividad de fosfatasa ácida prácticamente por todo el cuerpo (Fig. 6, dibujo 4), en tres o cuatro áreas extensas, o sólo en los dos tercios distales, con mayor intensidad en los poros anales y excretores. MANUALES UEX 3.2. Técnicas para el diagnóstico de protozoos hemáticos: frotis de sangre teñidos con Giemsa 60 –– Para realizar el frotis sanguíneo, se deposita una gota de ésta aproximadamente a 2 mm del extremo del porta. –– Se contacta con la gota el extremo de otro porta, dejando que se extienda la sangre a lo largo de la superficie de contacto. –– A continuación, se desliza rápidamente el porta formando un ángulo de 30-45°; con lo cual, se logra una extensión fina de sangre. –– Dejar secar y, a continuación, proceder a la fijación con metanol (durante aproximadamente 5 minutos) y tinción con Giemsa mediante técnicas de tinción hematológicas rápidas (Panóptico rápido, Diff-Quick, etcétera). PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 4. EXAMEN DE TEJIDO MUSCULAR 4.1. Triquineloscopia o trichinelloscopia Esta técnica diagnóstica consiste en una inspección microscópica de tejido muscular para la búsqueda de larvas 1 de Trichinella spp. enquistadas. El Reglamento 2075/2005 de la Comisión Europea obliga a tomar muestras en cerdos domésticos de los pilares del diafragma, concretamente de la zona de transición muscular y tendinosa del mismo, debiendo tomar 28 muestras del tamaño de un grano de avena por cada pilar del diafragma. Cuando no se disponga de los dos pilares, se pueden tomar 56 muestras de diferentes zonas de ese único pilar. Para el caso de jabalíes, las muestras se tomarán de cada uno de los pilares del diafragma, en la zona de transición entre la parte muscular y la tendinosa y, además, de los maseteros, de los músculos de la parte inferior de la pierna, de los músculos intercostales y de los músculos de la lengua, hasta un total de 6 muestras por individuo. En estos animales, además del número de trozos de carne de diafragma a examinar comentado anteriormente, se analizarán 7 trozos de cada uno de los 4 músculos restantes, lo que hacen un total de 84 trozos a examinar. Se debe procurar que los cortes, en todos los casos, vayan dirigidos en el sentido de las fibras musculares. Posteriormente, se comprimen los trozos de tejido muscular entre las dos placas compresoras y se observa detenidamente en el estereomicroscopio, que permita un aumento mínimo de 30 a 40 veces. El examen de las muestras deberá ser cuidadoso y durará un mínimo de 6 minutos por trichinelloscopia. Además, un veterinario no deberá examinar en el trichinelloscopio más de 840 trozos por día. En este Reglamento, se expone que este método debe ser sustituido por otro más fiable antes del 31 de diciembre de 2009. 4.2. Digestión artificial (pépsica) para el diagnóstico de Trichinella spp. En la actualidad, el método oficial es la digestión de muestras colectivas con utilización de agitador magnético (digestión artificial pépsica). La digestión artificial es, sin duda, un método de mayor sensibilidad que la trichinelloscopia. El fundamento de la digestión pépsica es simular el proceso fisiológico al que es sometida la carne en el estómago de un animal, y su objetivo es liberar las larvas musculares de Trichinella spp. enquistadas en el tejido muscular. Como resultado se obtiene un líquido de digestión en el que se encuentran las larvas en suspensión. Este método, acorde con el Reglamento 2075/2005, se basa fundamentalmente en una digestión en el agitador magnético, en el cuál se coloca un vaso de precipitado con las siguientes proporciones de reactivos (para 100 g de carne): PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX La legislación actual en España, según el Reglamento 2075/2005 de la Comisión Europea, establece que se deben emplear de 1 a 5 gramos de tejido muscular por cerdo sacrificado, según su sistema de producción. En jabalíes, se deben digerir 5 g por animal. Al igual que la trichinelloscopia, el músculo de elección son los pilares del diafragma. 61 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… – Agua a 46-48 °C.......................................................................... – Pepsina de 2000 U/g. FIP (1:10.000 NF)..................................... – Ácido clorhídrico al 25%............................................................ 2l 10 g 16 ml Este vaso de precipitado debe permanecer en el agitador magnético unos 30 minutos. Posteriormente, se filtra el líquido de digestión a través de un tamiz colocado sobre un embudo de decantación. Este tamiz debe tener una malla de 180 micrómetros de diámetro de poro y un diámetro exterior de 11 cm. Tras otros 30 minutos, se pasan 40 mililitros a un nuevo embudo de decantación, de menor tamaño, dejando precipitar 10 minutos. Tras este tiempo se retiran 30 mililitros de sobrenadante y los 10 mililitros restantes de sedimento se vierten en una placa de Petri junto con 10 mililitros de agua que se utilizan para enjuagar la pared de este segundo embudo de decantación. Este filtrado se observa al estereomicroscopio con un aumento de 15 a 20 veces. En caso de observar algo sospechoso de confundirse con parásitos, deberán aplicarse aumentos superiores, de entre 60 y 100 veces. El Reglamento CE 2075/2005 establece unos métodos equivalentes de detección de Trichinella spp. que son: 1. Método de digestión de muestras colectivas con asistencia mecánica/técnica de sedimentación. 2. Método de digestión de muestras colectivas con asistencia mecánica técnica de aislamiento por filtración. 3. Método de digestión automática para muestras colectivas de hasta 35 g. No obstante, no será necesario investigar la presencia de este nematodo en la carne de cerdos domésticos que hayan sido sometidas a un tratamiento de congelación regulado en el Reglamento 2075/2005, ni que procedan de explotación o región declarada libre de Trichinella spp. 4.3. Digestión artificial (trípsica) para el diagnóstico de Sarcocystis spp. MANUALES UEX En el diagnóstico de Sarcocystis spp. se sigue el método de Erber (1977) modificado a posteriori por nosotros a raíz de la experiencia adquirida a través de un gran número de digestiones de musculatura esquelética, corazón e incluso cerebro; ya que, en todas estas estructuras pueden albergarse los quistes producidos por este protozoo parásito. 62 La técnica se basa en una digestión trípsica muy suave, simulando la digestión que se produce en el duodeno de los hospedadores, ya que la tripsina producida en el páncreas se vierte al duodeno y no al estómago. De esta forma, los quistes de Sarcocystis spp. quedan libres de las fibras musculares o tejidos en los que se alojen, para que puedan ser observados al microscopio. El material necesario para llevar a cabo la técnica es el siguiente: •• Picadora eléctrica. •• Báscula digital. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA •• •• •• •• Recipiente de al menos 500 ml de capacidad con tapadera. 10 gramos de muestra problema. 0,13 gramos de tripsina. 50 ml de PBS. Esta solución tampón debe tener un pH básico o neutro, con lo que debe oscilar entre un pH de 7 a 7,2 (ajustar si el pH resultante es diferente). Los componentes necesarios son: NaCl............................................................................................... 8,77 g Na2HPO4.2H2O.............................................................................. 1,37 g NaH2PO4.H2O................................................................................ 0,318 g H2O destilada................................................................................. 1.000 ml •• •• •• •• •• •• •• •• Agitador orbital. Embudo. Gasa o filtro de 600-700 micrómetros. Tubo de centrífuga de 50 ml con tapadera. Centrífuga. Pipetas Pasteur. Portas y cubres. Microscopio óptico. 1. El primer paso consiste en preparar la muestra que vamos a digerir, para lo cual, procedemos a triturar aproximadamente 10 gramos (pesados con anterioridad en la báscula) del tejido muscular o nervioso que queremos someter a estudio. A estos 10 gramos de muestra, le añadimos 0,13 gramos de tripsina y 50 ml de PBS en el recipiente con tapadera, y lo homogeneizamos adecuadamente. 2. Una vez hecho todo lo anterior, en los casos de musculatura esquelética y corazón, se procede a incubar la mezcla a 22 °C en agitación suave (100 rpm) durante 8 minutos en el agitador orbital (simulando las condiciones de la digestión en el hospedador). En el caso del cerebro, se procede a simple agitación manual durante sólo 4 minutos. En caso de no disponer de incubador o centrífuga refrigerada, la incubación puede realizarse a temperatura ambiente. 3. Pasados los 8 minutos de digestión, se filtra el contenido de la digestión través de una gasa de 600-700 micrómetros (aproximadamente doble gasa) y embudo, pasando el material filtrado al tubo de centrífuga de 50 ml con tapadera. Es conveniente presionar la gasa una vez filtrado el líquido, para exprimir el jugo e incrementar el número de los posibles quistes de Sarcocystis spp. 4. El líquido de digestión resultante del filtrado se centrifuga a 1.000 rpm durante 10 minutos a una temperatura baja (entre 1 y 3 °C) para detener la digestión de la muestra ya que los quistes son muy lábiles y se rompen con facilidad. Finalmente, se elimina el sobrenadante PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Los pasos a seguir son los siguientes: 63 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… y se van tomando pequeñas gotas del sedimento con una pipeta Pasteur para observarlas (colocadas entre portaobjetos y cubreobjetos) al microscopio óptico. La observación al microscopio debemos realizarla con el diafragma cerrado en busca de quistes septados completos o zoítos libres. 5. EXAMEN DE PIEL La identificación de los parásitos existentes en la piel, puede verificarse a simple vista tras su recogida con pinzas o simple cepillado (piojos, pulgas, garrapatas, etc.), o bien tener que recurrir a exámenes microscópicos después de un procesamiento en el laboratorio de la muestra obtenida por el raspado. 5.1. Investigación microscópica para el diagnóstico de ácaros: raspado de piel Toma de muestra El raspado debe realizarse de las zonas enfermas o sospechosas de la piel, a ser posible de las regiones últimamente atacadas o bien de los límites entre zonas sanas y enfermas. Después de cortar con las tijeras el pelo o la lana, conviene eliminar las costras o escaras más gruesas y superficiales antes de realizar el raspado. Se raspa con la ayuda de un bisturí, haciéndolo profundamente hasta que se produzca una leve hemorragia. Este material se recogerá en una placa de Petri u otro recipiente de boca ancha, para asegurarse que nada del material raspado se pierda. El material debe tomarse, a ser posible, de distintos lugares y en cantidad suficiente. Remisión de la muestra El raspado debe mandarse al laboratorio en la placa de Petri o el recipiente utilizado para la recolección, cerrado e identificado adecuadamente, junto con la hoja de bisturí empleada. MANUALES UEX Tratamiento de la muestra: aclarado en KOH al 5-10% 64 El raspado se coloca en un vidrio de reloj y se añade potasa para ayudar a la disgregación y aclarado de las costras y restos de la piel, y así poder visualizar más fácilmente los posibles ácaros (huevos, formas larvarias y/o adultas) al estereomicroscopio. Mediante una pipeta Pasteur, algunos ejemplares deben trasladarse a un portaobjetos para su observación microscópica e identificación morfológica. En el caso de posible sarna por Octodectes cynotis (sarna auricular), la muestra se tomará con un bastoncillo de algodón de los pabellones auditivos afectados. La mayoría de los ácaros de la sarna se diagnostican con la ayuda del estereomicroscopio. No obstante, ante la dificultad que entraña el diagnóstico de la sarna ocasionada por PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Demodex spp., el material del raspado se aclarará directamente sobre el portaobjetos y se observará también al microscopio óptico (con los objetivos de 4x o 10x) para la observación de estos ácaros. Una vez realizada la mezcla, se calienta a la llama del mechero al mismo tiempo que se disgregan y rompen las escaras y costras con la hoja del bisturí. Posteriormente, se observa al estereomicroscopio y finalmente se recogen con una pipeta Pasteur una porción de la muestra conteniendo ácaros para identificarlos a mayores aumentos al microscopio. 5.2. Miasis Para conocer la especie causante de la miasis, se deben recoger las larvas III y enviarlas a un laboratorio especializado para su identificación. Para ello debemos extraer las larvas con unas pinzas de la herida y meterlas en un recipiente que permita la entrada de aire, ya que son aerobias, y enviarlas en condiciones de refrigeración si van a estar expuestas a altas temperaturas. 6. EXAMEN DE VÍSCERAS Mediante ella pretendemos hallar formas parasitarias adultas, larvarias o elementos de diseminación de los parásitos en su localización orgánica. 6.1. Investigación de parásitos intestinales –– Se procede a la apertura de distintos tramos, tanto del intestino grueso como el delgado. Además de esto, se realiza un lavado de la mucosa intestinal filtrándose el contenido y recogiéndose en recipientes adecuados. –– El material anterior se visualiza al estereomicroscopio, y posteriormente se realiza la identificación del parásito y contaje. 6.2. Investigación de parásitos en abomaso y estómago de monocavitarios –– Se procede a la apertura de la víscera por su curvatura mayor y se observa sobre la mucosa la presencia de parásitos adultos o formas larvarias. –– Posteriormente, se realiza un lavado de dicha mucosa, procediéndose del mismo modo que en el apartado 6.1. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX –– Hay casos clínicos en los que es necesario realizar un raspado de la capa mucosa intestinal, e investigar la posible presencia de formas parasitarias al microscopio (Por ejemplo, los coccidios). 65 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 6.3. Investigación de parásitos en pulmón –– Se lleva a cabo la apertura del aparato respiratorio, comenzando por tráquea, posteriormente bronquios grandes, medianos y bronquiolos, hasta llegar a la parte apical del pulmón, tratando de evidenciar nematodos broncopulmonares en ese recorrido. –– Así mismo, se realiza un raspado con un cubreobjetos sobre el parénquima pulmonar y luz bronquial, se coloca sobre un portaobjetos y se examina al microscopio para hallar larvas de nematodos, fáciles de evidenciar, en caso de positividad, por sus activos movimientos. –– Para aislar 3 ó 4 larvas de diferentes parásitos pulmonares puede procederse a la digestión pépsica del órgano (o parte proporcional del mismo) siguiendo el método descrito en el apartado 4.2. 6.4. Investigación de parásitos en hígado –– Observación y palpación de la víscera. –– Recoger con la ayuda de una jeringuilla el líquido biliar, previamente homogeneizado, para posteriormente examinar varias gotas de éste al microscopio óptico y poder visualizar elementos de diseminación de los parásitos hepáticos. –– Abrir los canalículos biliares y presionar para que salgan los distintos parásitos. –– Recogida de los mismos e identificación al microscopio. –– Al igual que en pulmón se pueden aislar larvas parasitarias en el hígado mediante digestión pépsica del órgano. 6.5. Investigación de parásitos en corazón –– Apertura de la víscera según necropsia reglada. –– Visualización directa de las formas parasitarias adultas y jóvenes de Dirofilaria immitis en carnívoros. Además de lo anterior, se realiza una observación de la arteria pulmonar, donde también se localiza este nematodo. 6.6. Investigación de formas larvarias de la familia Taeniidae MANUALES UEX Cisticerco 66 –– Observación directa en su localización habitual (hepatoperitoneo o musculatura). R ecogida del material sospechoso y visualización al estereomicroscopio. Coenuro –– Apertura de la cavidad craneana y observación de la superficie encefálica. Posteriormente, se identifica la forma parásita del mismo modo que en el caso anterior. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Estos dos parásitos pueden comprimirse e incluirse en un recipiente con formol al 10% con el fin de obtener preparaciones permanentes. Posteriormente, se incluirían en una cadena de montaje de cestodos (adultos o este tipo de formas larvarias), la cual incluye: 1. Inclusión en alcohol de 70°. 2. Tinción con Carmín acético durante 24 horas (fórmula magistral). 3. Decoloración con alcohol-clorhídrico (hasta que se visualicen adecuadamente las estructuras del parásito). 4. Pases de 5 minutos por una cadena ascendente de alcoholes (70°, 80°, 90°, 90°, alcohol absoluto y xileno). 5. Montaje en portaobjetos con bálsamo de Canadá o “Eukitt”. Quiste hidatídico –– Observación macroscópica del quiste en los distintos órganos donde es frecuente su presencia (hígado, pulmón, riñón, corazón). –– Punción de la membrana quística con la ayuda de una jeringuilla para la extracción del líquido hidatídico. –– Rotura de la membrana quística y raspado de la arenilla hidatídica con un cubreobjetos. –– Todo el material anteriormente recogido se lleva al microscopio donde: •• Si hay existencia de protoescólex es un quiste fértil. •• Si no hay protoescólex es un quiste infértil. Finalmente, en el caso de que sea FÉRTIL, la preparación se colorea con una gota de violeta de Genciana, y: •• Si los protoescólex se tiñen, son no viables. •• Si los protoescólex no se tiñen, son viables. Las formas larvarias de Taeniidae spp. pueden conservarse en formol al 10% o en alcoholformol (10% de formalina al 35%-40% y 90% de alcohol de 70°). Por otra parte, los protoescólex procedentes del quiste hidatídico se conservan en formol al 5%. 7.1. Orina La vejiga urinaria de los carnívoros es asiento del nematodo Capillaria plica, aunque más raramente se puede encontrar en los riñones y pelvis renal otro nematodo denominado Dioctophyma renale. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX 7. EXAMEN DE ORINA Y SECRECIONES 67 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Los huevos de ambos nematodos parásitos son evidenciables en orina. Para ello, se deja sedimentar en una copa de base acuminada (o tubo de ensayo), o bien se realiza una centrifugación rápida, observando en ambos casos el sedimento al microscopio óptico, tal y como se hace en las técnicas de coprología. 7.2. Secreciones vaginal, uterina y prepucial La obtención de este material biológico está justificado en orden a la búsqueda de distintas especies del género Trichomonas y Trypanosoma equiperdum. Las secreciones son obtenidas mediante el lavado con solución fisiológica templada de cloruro sódico, o bien mediante cucharilla. El producto resultante conviene mantenerlo a refrigeración (no inferior a 5 °C), ya que si se produce la desecación, los protozoos se conservan vivos poco tiempo (menos de 24 horas). El estudio de las secreciones se lleva a cabo a través del microscopio óptico y mediante cultivos. 7.3. Secreción nasal El estudio de la secreción nasal está indicado en pequeños rumiantes y cánidos que presentan un abundante flujo nasal, para la búsqueda de larvas de Oestrus spp. en ovejas y cabras, y huevos de Linguatula serrata en perros (este último caso clínico es de muy escasa frecuencia). El examen se realiza directamente al microscopio, teniendo en ocasiones que mezclar el exudado con ácido acético. 7.4. Saliva Se toman muestras de saliva en el caso de la evidencia en la mucosa de la boca y faringe de palomas y pavos de Trichomonas gallinae. El diagnóstico debe realizarse lo más rápidamente posible, ya que se deterioran con prontitud, haciéndose frotis a partir de buche, boca y faringe, siendo fácil la investigación por el movimiento vivaz del parásito. MANUALES UEX 8. REALIZACIÓN Y EXAMEN DE BIOPSIAS 68 En este apartado estudiamos diferentes técnicas de obtención de muestras sobre el animal vivo para el diagnóstico de posibles parasitosis. Va sobre todo encaminado al diagnóstico de leishmaniosis canina y de theileriosis (fase linfocítica), ambas de elevada presentación en nuestro entorno. Se fundamentan en la obtención de tejido procedente de ganglio linfático, médula ósea y piel. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 8.1. Biopsia ganglionar En concreto, se trata de una biopsia de aspiración, ya que se obtienen muestras de un órgano de consistencia elevada, teniéndose que dislacerar el tejido para obtener una pequeña muestra celular. Va encaminada al diagnóstico de las formas viscerales de leishmaniosis y fase linfoide de la theileriosis. Técnica –– Los dos posibles ganglios para la toma de muestras más importantes son el poplíteo (en el perro situado en la cara flexora de la articulación de la rodilla, muy superficial y sobre el músculo gastronemio) y el preescapular sobre la articulación del encuentro. –– Rasurar la zona de intervención y desinfectar. –– Fijar el ganglio perfectamente con una mano, intentando que la piel quede bien tensa. –– La aguja o trocar que se emplee podrá ser de diferentes calibres en función del volumen del ganglio, la cual se introduce mediante un acto rápido y se coloca aproximadamente en el centro de la masa ganglionar. –– Dislacerar el tejido mediante movimientos rotacionales y laterales. –– Conectar la jeringa (estéril y de amplio volumen; de 5 a 10 ml) y aspirar con el émbolo al máximo. –– Por último, sólo queda extraer mediante un movimiento rápido el conjunto aguja-jeringa en la que quedará alojada las suficientes células para posteriormente realizar el frotis y tinción por métodos hematológicos usuales. 8.2. Biopsia medular Se trata de otra biopsia de aspiración, que da mejores resultados para el diagnóstico de la leishmaniosis visceral. Las agujas a emplear (trocar) son de tipo Salah. Es preciso elegir para la punción un hueso que contenga médula hematopoyética activa (roja). Si por error, la punción recae sobre médula grasa (amarilla), la muestra obtenida contará solamente de grasa y algunas gotas de sangre. –– Colocar al animal en decúbito lateral derecho, con la extremidad izquierda sobre el costillar, para así poder evidenciar el esternón. También puede realizarse sobre la cresta ilíaca. –– Cortar el pelo, afeitar y desinfectar la zona a intervenir, que suele ser la 2ª-3ª esternebra o la cresta ilíaca, la cual se anestesia localmente por infiltración en zonas subcutáneas próximas del periostio, el cual es muy sensible. –– Desinfectar de nuevo la zona e insertar la aguja hasta alcanzar el hueso. –– Retirar el fijador o mandril, conectar la jeringa y retirar el émbolo bruscamente. Brotará en pequeño chorro fragmentos de médula ósea con algo de sangre. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Técnica 69 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 8.3. Biopsia de piel Va encaminada a la detección de leishmaniosis cutánea, onchocercosis, etcétera. Podrá realizarse con bisturí para obtener una pequeña porción de tejido (Onchocercosis) o con la punta de una aguja tomando la muestra de la base de la úlcera. 9. DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO En la actualidad muchas de las enfermedades parasitarias son diagnosticadas gracias a la utilización de técnicas que ponen de manifiesto la existencia de respuesta inmunológica (anticuerpos específicos) en sangre frente a los agentes extraños. Los parásitos generan desde las primeras semanas una fuerte respuesta de anticuerpos que pueden ser puestas de manifiesto mediante estas técnicas de inmunodiagnóstico. La detección precoz de las infecciones parasitarias a través de dichos métodos, se muestra como una de las medidas de control más efectivas, ya que posibilita una mayor efectividad terapéutica de los medicamentos empleados, al ser utilizados en fases precoces de la infección. También se consigue una mejor monitorización del proceso parasitario a través del análisis de las respuestas inmunológicas, ya que la evidencia de la efectividad terapéutica se ve reflejada en un descenso de la cantidad de anticuerpos en sangre como consecuencia de la muerte de los parásitos. Existen diferentes métodos de inmunodiagnóstico, entre los que se encuentra la técnica inmunoenzimática micro-ELISA indirecto de dobles anticuerpos, que ha demostrado ser una de las más eficaces y fiables en multitud de estudios seroepidemiológicos, permitiendo en diferentes países el conocimiento de la distribución de las parasitosis y de su prevalencia. Su realización sólo requiere de una pequeña muestra de sangre del animal sospechoso para su análisis en el laboratorio. 9.1. ELISA indirecto MANUALES UEX Mediante la técnica ELISA indirecto se determinan diferentes tipos y subtipos de inmunoglobulinas (anticuerpos) producidas frente a distintos antígenos del parásito (Fig. 7). 70 Así, el antígeno soluble empleado en dicha técnica puede ser la totalidad de las proteínas del parásito (proteína total del parásito), determinadas fracciones del mismo o diferentes proteínas recombinantes obtenidas por ingeniería genética. Tras tapizar las placas con el antígeno parasitario a la concentración deseada, a cada pocillo se le añaden 100 µl del fluido problema, diluido a la concentración adecuada en buffer carbonato, PBS u otra solución de pH apropiado, según el tipo de antígeno. Dichas PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA diluciones son seleccionadas durante la estandarización de la técnica, y tras la titulación del nivel de anticuerpos de distintos sueros positivos y negativos (controles) que permiten, en cada caso, la obtención de la mejor y mayor diferenciación entre valores de reactividad positivos y negativos. Tras la incubación a 37 °C durante 30 minutos y posterior lavado, se añaden 100 µl del conjugado anti-especie de elección en cada caso (anti-inmunoglobulina marcada con peroxidasa); y a la concentración idónea previamente determinada. Se somete a una nueva incubación de 30 minutos a 37 °C, y después a un nuevo lavado para eliminar las inmunoglobulinas que no hayan reaccionado con el complejo antígeno-anticuerpo. Posteriormente, se añaden 100 µl de substrato cromógeno a cada pocillo. Dicho substrato, en presencia de peroxidasa, tomará una coloración que variará según el substrato usado (TMB, OPD, ABTS, etcétera) con una intensidad proporcional a la cantidad de anticuerpos fijados al antígeno. Este substrato se elabora como máximo quince minutos antes de ser utilizado, debido a la poca estabilidad del preparado. La reacción enzimática debe leerse cuando el control positivo alcanza una DO idónea, generalmente al cabo de unos 10-30 minutos de incubación a temperatura ambiente. La reacción puede pararse añadiendo a cada pocillo 50 µl de H2SO4 3N. La lectura se realiza en un espectrofotómetro a la longitud de onda determinada según el sustrato utilizado (A490, A450, etc.) en un lector de placas de ELISA después de haber observado a simple vista si existen errores o coloraciones anormales. Figura 7. Placa de ELISA con pocillos de distinta coloración, en función de la seroreactividad frente a Leishmania infantum. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Para comprobar que todos los pasos de la técnica han sido realizados correctamente, es necesario reservar unos pocillos en cada placa para realizar los controles de conjugado, positivos y negativos (Fig. 7). 71 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Para el control del conjugado, se utilizan pocillos sin suero problema, siendo éste sustituido por PBS 1x con Tween-20 y continuando los demás pasos rutinariamente. Este control nos puede dar información sobre errores de procedimiento tales como procesos de lavado inadecuado o reactivos en mal estado. Como control positivo (introducido en cuatro pocillos) se utiliza un suero conocido obtenido de un animal infectado por el parásito. Como control negativo, se utiliza el suero de un animal sano y libre de la infección por el parásito, introduciéndose ambos en varios pocillos. Las muestras se realizan por duplicado o triplicado por el mismo motivo. La correcta realización de la técnica queda garantizada por la repetitividad mostrada por estos controles tras la lectura de las placas. Es importante señalar que la seropositividad de un animal sospechoso, implica que tiene anticuerpos específicos contra un parásito, y que por tanto ha tenido algún contacto con éste, pero no necesariamente refleja una infección actual, y en caso de existir, puede ser independiente de que se manifieste o no la enfermedad, o de gravedad de la misma. La interpretación correcta de la seropositividad y su intensidad depende en extremo del tipo de parásito, su prevalencia, su ciclo biológico y la interacción con el sistema inmune del hospedador que se deriva del mismo. Así, en enfermedades como la leishmaniosis, será además necesario el análisis en profundidad del paciente, para comprobar a qué estado de enfermedad se corresponde el diagnóstico serológico positivo, que puede variar desde el asintomático u oligosintomático al claramente patente, con daños orgánicos severos que imposibiliten su recuperación total. 9.2. Inmunofluorescencia indirecta La técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) es una prueba inmunológica de carácter diagnóstico que se utiliza para la detección de anticuerpos específicos frente a parásitos, bacterias, virus, etc. Estos anticuerpos son producidos por el individuo tras su contacto con un determinado microorganismo. Entre estos agentes podemos destacar algunos parásitos como Leishmania infantum y piroplásmidos, tales como Theileria spp. y Babesia spp. en los que esta técnica es muy útil. MANUALES UEX Esta técnica es básicamente similar a la del ELISA indirecto, en la que el conjugado no está marcado con una enzima, sino con una sustancia fluorescente que detecta el inmunocomplejo resultante de la unión Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac). Podremos constatar la existencia de esta reacción mediante un microscopio de epifluorescencia. 72 Los pasos a seguir para realizar esta prueba son: –– En primer lugar, debemos preparar una serie de diluciones, que varían normalmente entre 1/40 y 1/1.280, con la ayuda de una solución tampón fosfato (PBS) de pH neutro o ligeramente básico (compuesta por agua bidestilada, NaCl, NaH2PO4.2H2O y Na2HPO4.2H2O) y añadiendo posteriormente el suero o plasma problema. PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA –– Enfrentaremos estas diluciones al antígeno correspondiente que tendremos fijado en un portaobjetos con acetona y conservado en congelación. –– Incubaremos durante 30 minutos a temperatura ambiente para favorecer así la unión entre el antígeno y el anticuerpo. –– Posteriormente, realizaremos tres lavados de los portaobjetos de cinco minutos cada uno a 37 °C con la solución PBS. De esta manera, se eliminarán restos de suero o plasma y antígeno sobrante. –– Después añadiremos el conjugado e incubaremos 30 minutos más a temperatura ambiente para que, de esta manera, se realice la fijación con el inmunocomplejo (si lo hubiera). –– Seguidamente, haremos otros tres lavados de cinco minutos cada uno con PBS a 37 °C, eliminándose así el exceso de conjugado que no se ha unido de forma específica al inmunocomplejo. –– Tras estos pasos, añadiremos sobre el portaobjetos una pequeña cantidad de Glicerina tamponada con PBS (pH = 7,2) y pondremos un cubreobjetos encima. Por último, se observarán los portaobjetos en el microscopio de epifluorescencia para realizar la lectura de las muestras. MANUALES UEX Para comprobar que la prueba ha sido realizada correctamente, se utilizan dos controles testados previamente. Uno de ellos negativo y el otro positivo. Además, estos sueros se utilizan como referencia para la determinación del título del resto de las muestras. Figura 8. Resultado positivo mediante IFI de un caballo frente a Theileria equi. PORTADA ÍNDICE 73 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… MANUALES UEX En la Unidad de Parasitología de nuestra Facultad se aplica este tipo de diagnóstico principalmente para la detección de anticuerpos frente a Theileria equi y Babesia caballi en équidos, T. annulata y B. bigemina en bóvidos y B. ovis en pequeños rumiantes. También se utiliza para la detección de Leishmania infantum en cánidos. 74 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX III. LÁMINAS DE IDENTIFICACIÓN 75 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Ooquistes de Cryptosporidium sp. (tinción de Heine). Ooquistes de Cryptosporidium sp. (tinción de Ziehl-Neelsen). 1 2 Quiste de Balantidium coli (1) y ooquiste de Eimeriidae sp. (2). Huevos de Dicrocoelium dendriticum. Huevos de Fasciola hepatica y D. dendriticum. MANUALES UEX Ooquistes de Eimeria sp. 76 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Cápsulas ovígeras de Dipylidium caninum. Huevos de Taeniidae sp. 3 2 3 2 1 1 Huevos de Moniezia benedeni (1), Strongylida sp. (2) y Nematodirus sp. (3). Larva 1 de Dictyocaulus viviparus. Larva 1 de Muellerius capillaris. MANUALES UEX Huevos de Moniezia benedeni (1), Strongylida sp. (2) y ooquistes de Eimeriidae sp. (3). PORTADA ÍNDICE 77 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Huevo de Passalurus ambiguus. Huevo de Trichuris vulpis. Huevo de Capillaria plica (en orina). Huevo de Ascaris suum. MANUALES UEX 1 78 2 Huevos de Toxascaris leonina (1) y Toxocara canis (2). PORTADA Huevo de Ascaridia galli. ÍNDICE Babesia canis (piroplasmas). Theileria annulata (piroplasmas). Haemoproteus columbae (gametocitos). Hepatozoon canis (gametocitos). Larva 1 de Dirofilaria immitis (microfilaria). Leishmania infantum (promastigotes y amastigotes). PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 79 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Sarcocystis miescheriana. Trichinella spiralis. Psoroptes equi cuniculi. Sarcoptes scabiei suis. Ctenocephalides canis (Siphonaptera). MANUALES UEX Demodex canis. 80 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX IV. LÁMINAS DE LESIONES 81 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Perro afectado de Leishmaniosis. Cultivo celular de Leishmania sp. Bazo de un perro con Leishmaniosis. Lesiones dérmicas por Leishmaniosis. Coccidiosis hepática en conejo. Coccidiosis intestinal en cordero (hiperplasia de placas de Peyer). 82 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Pseudoquiste de Toxoplasma gondii. Quistes de Sarcocystis gigantea en esófago ovino. Hígado de un cabrito de 3 meses con fasciolosis aguda (Fasciola hepatica). Hepatitis hemorrágica traumática. Moniezia spp. (Cestoda) en intestino de cordero. PORTADA MANUALES UEX Diarrea en cordero y lesiones entéricas e hipertrofia de la cadena ganglionar causadas por Cryptosporidium spp. 83 ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Adultos de Taenia sp. en intestino de perro. Nódulos en intestino de jabalí causados por Macracanthorhynchus hirudinaceus. M. hirudinaceus en la mucosa del intestino de un porcino. Quistes hidatídicos en pulmón de cerdo (Echinococcus granulosus). Quiste hidatídico en hígado de cerdo. Cisticercosis hepatoperitoneal por Taenia pisiformis en una liebre. 84 PORTADA ÍNDICE Coenuro de Taenia multiceps en cerebro de oveja (Coenuro cerebralis). Adultos de Dirofilaria immitis en el corazón de un perro. Adultos de Ascaridia galli en el intestino de una gallina. Adultos de Ascarops strongylina en la mucosa gástrica de un cerdo. Lesiones hepáticas en un lechón, causadas por la migración larvaria de Ascaris suum (“Manchas de leche”). Nódulos en pared gástrica de un perro con adultos de Spirocerca lupi. PORTADA MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 85 ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 86 Adultos de Dictyocaulus filaria en vías respiratorias altas de ovino. Lesiones pulmonares en cerdo causadas por Metastrongylus spp. Sarna psoróptica ovina (Psoroptes ovis). Sarna sarcóptica ovina (Sarcoptes scabiei var. ovis). Hiperqueratosis generalizada en sarna sarcóptica porcina (Sarcoptes scabiei var. suis). Sarna demodécica en perro: alopecia, descamación y ulceración de la dermis (Demodex canis). PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Sarna demodécica generalizada (fase pustulosa). Hembras de Ixodes ricinus en una cabra montesa. Descarga nasal en una oveja por oestrosis (Oestrus ovis). PORTADA Edema submandibular (“papo”) en un ovino causada por Haemonchus contortus. ÍNDICE MANUALES UEX Ictericia en la conjuntiva, edema subcutáneo, y hemoglobinuria intensa en un équido con piroplasmosis por Theileria equi. 87 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Miasis cutánea prepucial en ovino (Wohlfahrtia magnífica). Miasis cutánea vulvar en ovino (Wohlfahrtia magnífica). Conejo con lesiones por Psoroptes sp. Miasis cavitaria por Oestrus ovis. Infestación por Rhipicephalus bursa en un toro. MANUALES UEX Miasis cutánea furuncular en perro. 88 PORTADA ÍNDICE ANEXO 1. TAXONOMÍA INTRODUCCIÓN La clasificación taxonómica de los parásitos está cambiando considerablemente en las últimos años gracias al desarrollo de la biología molecular y los estudios ultraestructurales, que han permitido conocer mucho mejor la filogenia de los eucariotas. Los protozoos o protistas no se consideran ya una rama separada ni de organismos celulares autotróficos como las algas o los cromistas, ni de los clásicos reinos Animalia, Fungi y Plantae. No hay un consenso sobre la clasificación concreta de los grandes gruEukaryota pos taxonómicos, pero en cualquier caso se Amoebozoa aceptan diversos grupos, de los que surgen Archaeplastida formas de vida heterótrofa, autotrófica o mixta, Plantae y en algunos, ramas evolutivas multicelulares Chromalveolata en diversos momentos. PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX Excavata Así por ejemplo, en los seis grupos princiOpisthokonta pales (equivalentes a reinos) de la clasificación Animalia de Adl et al. (2005) que se muestran en el cua dro siguiente, hay protozoos en todos ellos, Fungi junto a seres multicelulares y protistas no conRhizaria siderados como protozoos. Así por ejemplo, Clasificación, según Adl et al. (2005), de los el protozoo parásito Toxoplasma gondii tiene grandes grupos de eucariotas (en azul) mosun ancestro común más cercano con un alcortrando la ubicación en ellos de los clásicos noque o una diatomea, que con otros proreinos de seres multicelulares (en rojo). tozoos parásitos como Entamoeba histolytica, o Leishmania infantum, a su vez más emparentada con las algas verdes unicelulares (Euglena spp.) que con todos los anteriores. En otras palabras, el reino Protozoa es parafilético, ya que se excluye a ciertos descendientes protozoos. No obstante, siguiendo a Cavalier-Smith seguiremos considerándolo un reino independiente, aunque sin olvidar que, en puridad, tal reino no existe, al menos desde un punto de vista filogenético. 89 MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 90 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 91 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 92 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 93 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 94 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 95 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 96 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 97 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 98 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 99 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 100 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA 101 PORTADA ÍNDICE MANUALES UEX F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… 102 PORTADA ÍNDICE ANEXO 2. PRINCIPALES GÉNEROS PARÁSITOS SEGÚN HOSPEDADORES Y LOCALIZACIONES ORGÁNICAS RUMIANTES PORTADA Teladorsagia Strongyloides Trichostrongylus Trichuris HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus Cysticercus APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Cystocaulus Dictyocaulus Muellerius Neostongylus ÍNDICE MANUALES UEX APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Trematodos Paramphistomum Cestodos Avitellina Moniezia Stilesia Thysaniezia Nematodos Bunostomun Capillaria Chabertia Cooperia Gongylonema Haemonchus Nematodirus Neoascaris Oesophagostomun 103 F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Protostrongylus Artrópodos Insectos Oestrus APARATO UROGENITAL Protozoos Tritrichomonas SANGRE Protozoos Babesia Theileria Trypanosoma MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma Cestodos Cysticercus SISTEMA NERVIOSO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma Neospora Cestodos Coenuro MANUALES UEX SACO CONJUNTIVAL Nematodos Thelazia PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Onchocerca Parafilaria Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Chorioptes Demodex Psoroptes Sarcoptes Dermanyssus Ixódidos Boophilus Dermacentor Haemaphysalis Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haematopinus Linognathus Ischnoceros Damalinia (Bovicola) Columbicola Goniodes Dípteros Calliphora Culex Haematobia Hyppobosca Hypoderma Lucillia Melophagus Sarcophaga Simulium Stomoxys Wohlfahrtia 104 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA ÉQUIDOS APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Cestodos Anoplocephala Paranoplocephala Nematodos Cyathostomun Cylicocylus Draschia Habronema Oxyuris Parascaris Strongyloides Strongylus Trichostrongylus Triodontophorus Artrópodos Gasterophilus APARATO UROGENITAL Protozoos Trypanosoma SANGRE Protozoos Babesia Theileria Trypanosoma MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Nematodos Trichinella SACO CONJUNTIVAL Nematodos Thelazia APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Dictyocaulus Artrópodos Insectos Rhinoestrus PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Habronema Onchocerca Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Chorioptes Demodex Psoroptes Sarcoptes MANUALES UEX CAVIDAD ABDOMINAL Nematodos Setaria HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus 105 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Dípteros Culicoides Hypoderma Hyppobosca Musca Sarcophaga Stomoxys Wohlfahrtia MANUALES UEX Ixódidos Dermacentor Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Haemaphysalis Insectos Anopluros Haematopinus Ischnoceros Damalinia Sifonápteros Ctenocephalides Pulex 106 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA PORCINOS HÍGADO Trematodos Dicrocoelium Fasciola Cestodos Echinococcus Cysticercus APARATO RESPIRATORIO Cestodos Echinococcus Nematodos Metastrongylus APARATO UROGENITAL Nematodos Stephanurus SANGRE Protozoos Babesia MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Cestodos Cysticercus Nematodos Trichinella PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Demodex Sarcoptes Argásidos Ornithodoros Ixódidos Boophilus Dermacentor Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haematopinus Sifonápteros Pulex Ctenocephalides MANUALES UEX APARATO DIGESTIVO Protozoos Balantidium Eimeria Cryptosporidium Isospora Cestodos Diphyllobothrium Nematodos Ascaris Ascarops Globocephalus Gongylonema Hyostrongylus Oesophagostomun Physocephalus Simondsia Strongyloides Trichuris Acantocéfalos Macracanthorhynchus 107 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… CARNÍVOROS MANUALES UEX APARATO DIGESTIVO Protozoos Cystoisospora Giardia Sarcocystis Toxoplasma Neospora Entamoeba Trematodos Alaria Plagiorchis Cestodos Diphyllobothrium Diplopylidium Dipylidium Echinococcus Joyeuxiella Mesocestoides Multiceps Taenia Nematodos Ancylostoma Capillaria Physaloptera Spirocerca Strongyloides Toxascaris Toxocara Trichuris Uncinaria APARATO RESPIRATORIO Nematodos Capillaria Aelustrongylus APARATO UROGENITAL Nematodos Capillaria Dioctophyma SANGRE Protozoos Babesia Nematodos Dirofilaria Dipetalonema SISTEMA MONONUCLEAR FAGOCÍTICO Protozoos Hepatozoon Leishmania MÚSCULO Nematodos Trichinella PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Nematodos Dipetalonema Dirofilaria Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Cheylletiella Demodex Notoedres Otodectes Sarcoptes Ixódidos Rhipicephalus 108 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Dípteros Calliphora Lucillia Sarcophaga Wohlfahrtia MANUALES UEX Insectos Anopluros Linognathus Ischnoceros Trichodectes Sifonápteros Ctenocephalides Pulex 109 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… AVES APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Hexamita Histomonas Isospora Tetratrichomonas Trichomonas Cestodos Amoebotaenia Choanotaenia Davainea Railletina Nematodos Amidostomun Ascaridia Capillaria Epomidiostomun Heterakis Tetrameres Trichostrongylus APARATO RESPIRATORIO Protozoos Cryptosporidium Nematodos Cyathostoma Syngamus Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Cytodites Gamásidos Sternostoma APARATO UROGENITAL Trematodos Prosthogonimus SANGRE Protozoos Haemoproteus Leucocytozoon Plasmodium MANUALES UEX HÍGADO Protozoos Histomonas 110 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA Insectos Ischnoceros Columbicola Menacanthus Gonicotes Gonioides Lipeurus Menopon Hemípteros Cimex Sifonápteros Ceratophylus Echidnophaga MANUALES UEX PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Knemidocoptes Laminosioptes Gamásidos Dermanyssus Ornithonyssus Argásidos Argas Ixódidos Haemaphysalis Hyalomma Ixodes 111 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… LAGOMORFOS APARATO DIGESTIVO Protozoos Cryptosporidium Eimeria Encephalitozoon Giardia Cestodos Andrya Cyttotaenia Hymenolepis Mosgovoyia Nematodos Capillaria Graphidium Nematodirus Passarulus Strongyloides Trichostrongylus Trichuris MANUALES UEX HÍGADO Protozoos Eimeria Trematodos Fasciola Dicrocoelium Cestodos Echinococcus Cysticercus Nematodos Capillaria APARATO UROGENITAL Nematodos Capillaria MÚSCULO Protozoos Sarcocystis Toxoplasma PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Artrópodos Arácnidos Ácaros de la sarna Notoedres Psoroptes Sarcoptes Cheyletiella Gamásidos Ornithonyssus Ixódidos Haemaphysalis Hyalomma Ixodes Rhipicephalus Insectos Anopluros Haemodipsus Sifonápteros Spilopsyllus Echidnophaga Xenopsylla APARATO RESPIRATORIO Nematodos Protostrongylus 112 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA PECES APARATO DIGESTIVO Protozoos Ceratomyxa Eimeria Entamoeba Glugea Hexamita Trematodos Diplostomun Cestodos Bothriocephalus Khawia Eubothrium Nematodos Capillaria Acantocéfalos Echinorhynchus Acanthocephalus MÚSCULO, TEJIDO CONECTIVO Y CARTÍLAGO Protozoos Ceratomyxa Glugea Henneguya Myxosoma Pleistophora Sphaerospora CAVIDAD CORPORAL Cestodos Diphyllobotrium Ligula Nematodos Anisakidae Philometra MANUALES UEX SISTEMA VASCULAR Y AGALLAS Protozoos Cryptobia Nosema Pleistophora Henneguya Haemogregarina Myxosoma Chilodonella Trichodina Tripanoplasma Trypanosoma Trematodos Sanguinicola Nematodos Philometra 113 PORTADA ÍNDICE F. J. SERRANO, E. Mª. FRONTERA, L. C. GÓMEZ, M. Á. HABELA, J. E. PÉREZ, D. REINA… Monogeneos Benedenia Dactylogirus Gyrodactylus Trematodos Cryptocotyle Moluscos Unionidae Anélidos Piscicola Artrópodos Crustáceos Argulus Ergasilus Lernaea MANUALES UEX PIEL Y TEJIDO SUBCUTÁNEO Protozoos Amyloodinium Ceratomyxa Chilodonella Costia (Ichtyobodo) Cryptocarion Dermocystidium Epistylis Glugea Henneguya Ichthyophtrius Kudoa (Cloromyxum) Oodinium Pleistophora Sphaerospora Trichodina 114 PORTADA ÍNDICE MANUAL PRÁCTICO DE PARASITOLOGÍA VETERINARIA ABEJAS APARATO DIGESTIVO Protozoos Malpighamoeba MANUALES UEX APARATO RESPIRATORIO Artrópodos Arácnidos Acarapis ECTOPARÁSITOS Artrópodos Arácnidos Varroa Insectos Dípteros Braula Senotainia 115 PORTADA ÍNDICE 69

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