Tax. molecular 2011-B

TAXONOMÍA MOLECULAR
MOLECULAR
TAXONOMÍA
Microbiología General
Área Micología
Dra. Alicia Luque
CEREMIC
Taxonomía clásica
Carecen de reproducibilidad: los caracteres fenotípicos
pueden variar con las condiciones ambientales.
PLEOMORFISMO
Debido al bajo poder discriminatorio y a la frecuente
incongruencia de los datos morfológicos y fisiológicos el
sistema diagnóstico se hace bastante complicado.
Taxonomía molecular
Se han desarrollado un gran número de técnicas
moleculares para la identificación de hongos
filamentosos y levaduras debido a:
Rapidez y grado de simplicidad de las habilidades
requeridas.
Sensibilidad.
Reproductibilidad.
Taxonomía molecular
Los sistema de clasificación de levaduras y hongos
filamentosos, en la actualidad se basan en establecer las
diferencias existentes entre algunas de las moléculas de
estos organismos:
composición de la pared celular (HPLC, cromatografía de
intercambio iónico)
clasificación de quinonas de la cadena de transporte
electrónico (cromatografía, HPLC, espectroscopia)
comparación de patrones electroforéticos de enzimas
varios métodos basados en la comparación del DNA.
Taxonomía molecular
•Caracterización de ácidos nucleicos.
El estudio del DNA de los hongos se complica por el hecho de que
estas poseen un genoma complejo, consistente en DNA nuclear
(nDNA), DNA mitocondrial (mtDNA) y en algunos casos DNA
plasmídico.
Hibridación DNA/DNA
porcentaje G+C
Métodos actuales son:
restricción del ADN mitocondrial
polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR
(RAPD-PCR)
electroforesis de campo pulsante
amplificación y restricción del DNA ribosomal
secuenciación de genes nucleares y mitocondriales
RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Características del ADN mitocondrial
Estructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtDNA está
compensada por la gran complejidad estructural de algunas regiones
intergénicas y también por la presencia de intrones (contribuyen en gran
manera a incrementar las diferencias inter- e intraespecíficas existentes en los
genomas mitocondriales )
Restricción del ADN mitocondrial
Digestión del mtDNA con endonucleasas
de restricción, que nos permitan
generar polimorfismos en el tamaño de
los fragmentos (RFLP).
RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Análisis de los resultados
RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL
Ventajas y desventajas de la técnica.
Ventajas:
1.- Repetitiva en cualquier circunstancia. El patrón de restricción
no cambia a menos que cambie la secuencia del mtDNA que
reconoce el enzima de restricción.
2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del
género que estemos estudiando. Es una ventaja cuando
tenemos gran variabilidad entre cepas de la misma especie y
queremos discriminar entre ellas (patrón de cepa). A veces no se
puede distinguir entre cepas de la misma especie, entonces nos
sirve para identificar nuevos aislados de esa especie (patrón de
especie).
Desventajas:
1.- Se necesita DNA de gran calidad, libre de restos celulares,
proteínas y RNA. Requiere un proceso de extracción de DNA, el
cual puede no ser necesario utilizando otras técnicas de
tipificación molecular.
2.- Diferentes niveles de discriminación dependiendo del
género que estemos estudiando.
POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR
AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)
Utilizando un único cebador de secuencia arbitraria y corta
(normalmente de 10-12 pb) y una baja temperatura de hibridación,
que produce polimorfismo entre los patrones del DNA amplificado.
POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR
AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)
Ventajas
1.- La mayor ventaja es que no necesitamos ninguna información previa del
organismo de que se trata, ya que sirve para cualquier organismo. Tampoco
necesitamos conocer la secuencia del DNA que vamos a amplificar.
2.- Es una técnica muy sencilla y rápida.
3.- Requiere cantidades muy pequeñas de DNA, y tampoco es necesario
que la calidad del DNA sea muy buena, aunque esto último afecta a la
reproducibilidad.
4.- Es un marcador molecular muy bueno, ya que el cambio en un solo
nucleotido puede significar la unión o no del cebador, y por tanto la
presencia o no de una banda en el producto de amplificación.
Inconvenientes
1.- Presenta un gran inconveniente: su reproducibilidad no siempre es la
adecuada, siendo los patrones, en muchos casos, dependientes no sólo de las
condiciones de amplificación sino de las condiciones del laboratorio donde se
realicen.
Actualmente es muy empleada, aunque se suele utilizar junto con otras técnicas
de tipado más reproducibles para comparar los resultados.
AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL
Están presentes en todos los organismos celulares y por tanto
comparten un origen evolutivo común. Las comparaciones del rDNA, han
demostrado su utilidad para valorar la relación tanto entre organismos
alejados como entre organismos próximos.
IGS NT 5S NT ET
S
S
S
18S
ITS 1 5.8S ITS 2
26S
ETS IGS
Esquema de los diferentes componentes que constituyen cada unidad de DNA ribosomal.
IGS: intergenic spacer; NTS: non-transcribed spacer; 5S: gen del RNA ribosomal 5S; ETS:
external transcribed spacer; 18S: gen del RNA ribosomal 18S; ITS1: internal transcribed
spacer 1; 5.8S: gen del RNA ribosomal 5.8S; ITS2: internal transcribed spacer 2; 26S:
gen del RNA ribosomal 26S.
Amplificación de diferentes zonas del complejo ribosomal por PCR
Restricción del producto de amplificación
AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL
Ventajas:
1.- Técnica universal: utilidad para comparar cualquier levadura u hongo
filamentoso, el nivel de resolución dependerá del grupo estudiado y de los
enzimas utilizados.
2.- PCR - RFLPs rápidos, fáciles y reproducibles. Se pueden crear
bases de datos de utilización general.
Inconvenientes:
1.- La comparación del tamaño de los RFLPs de la región ITS-5.8S RNA
con los patrones de las cepas de referencia, puede ser complicada debido a
las escasas diferencias que pueden existir entre los patrones obtenidos para
especies próximas (diferencias en pocos pares de bases no son apreciables
en una electroforesis). A veces se necesita utilizar alguna otra técnica para
confirmar la identificación.
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
Caracterización del DNA cromosómico: separación de los cromosomas
intactos mediante electroforesis en campo pulsante en gel de agarosa La
electroforesis en campo pulsante se ideó para separar fragmentos de DNA de
elevado tamaño molecular. La alternancia en la dirección del campo eléctrico
producida entre pares de electrodos, hace posible que los cromosomas de
levaduras y hongos filamentosos se vayan orientando según cambia la dirección del
campo eléctrico, y se muevan, en función de su tamaño, a diferentes velocidades a
través de los poros del gel de agarosa.
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
El análisis de los cariotipos electroforéticos nos permite estimar
número y tamaño de los cromosomas al compararlos con los
marcadores de peso molecular.
Los polimorfismos en el número y tamaño de los cromosomas son
comunes en hongos filamentosos y levaduras, no solo entre distintas
especies, sino entre cepas de la misma especie
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
Ventajas:
.- Podemos detectar traslocaciones y variaciones en el número de
cromosomas.
.- Fotografía del número y tamaño real de los cromosomas. No se genera
polimorfismo, sino que se observa el existente.
.- Elevada variabilidad, por lo que es un buen marcador molecular para
establecer diferencias entre levaduras u hongos filamentosos a muy
diferentes niveles.
Inconvenientes:
.- Sistemas electroforéticos y material de trabajo muy caro.
.- Protocolo largo y delicado.
.- Probar varias condiciones para resolver completamente los
cromosomas con diferentes tamaños. Condiciones de electroforesis
largas y complicadas.
.- Solo se pueden resolver cromosomas relativamente pequeños (20 Mb).
MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE LA PCR
Dermatofitos
PCR y PCR-RFLP usando como blanco el gen
de la Quitina Sintasa I (CHSI)
PCR-fingerprinting
Fusarium
21226
5000
4900
2000
1900
1500
947
831
564
PCR-fingerprinting con (GACA)4.
Calles: M, marcador de PM; 1-5
F. oxysporum; 6 F. proliferatum, 7
F. oxysporum; 8 F. oxysporum; 9 F.
proliferatum; F. verticillioides.
PCR-fingerprinting
Fusarium
21226
5000
4900
2000
1500
1300
947
831
PCR-fingerprinting de 9 especies de
Fusarium Calles: M, marcadorI; 1-4 F.
oxysporum; 5 F culmorum; 6 F.
tricinctum; 7 F. anthophilum; 8 F.
graminearum; 9 F. graminearum .
Taxonomía molecular
El empleo de técnicas moleculares en complemento
con métodos fenotípicos, es necesario para los
aislamientos atípicos o dificultosos
Se puede obtener otra información : relaciones
filogenéticas, estudios epidemiológicos, emplearse como
métodos de referencia para la identificación a nivel de
especie, etc.