PRÁCTICAS DE EMPRESA: DEPARTAMENTO DE MEDICINA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA Alumna: Paula Díez García Titulación: Licenciatura en Biotecnología (actualmente en 5º curso) Período de prácticas: 7 de junio – 30 de julio de 2010 Tutor: Dr. Rogelio González Sarmiento Objetivo: el objetivo principal de estas prácticas de empresa ha sido el de introducir al estudiante en el mundo laboral, darle a conocer cómo transcurre el trabajo diario en una laboratorio de investigación y diagnóstico, mostrando las diferentes técnicas empleadas en el mismo, así como la manera de emplear los conocimientos adquiridos en diferentes situaciones de experimentación. Por esta razón, el tutor de las prácticas, Dr.Rogelio González Sarmiento, me ofreció elegir entre el laboratorio 14 del Centro de Investigación del Cáncer y el laboratorio de diagnóstico situado en la facultad de Medicina, ambos bajo su tutela. Para poder efectuar la elección, pasé una semana en cada emplazamiento observando en qué trabajaban y qué técnicas utilizaban. LABORATORIO 14 DEL CIC Este laboratorio está especializado en el estudio de anomalías moleculares en cáncer de mama y ovario familiar y esporádico (genes BRCA1 y BRCA2), aunque también realizan estudios del cáncer colón-rectal hereditario (polipósico: APC, y no polipósico: MLH-I, MLHII y MSHII). Se encargan de analizar todas las muestras que reciben de distintos hospitales dentro de la región, así como de otros centros nacionales. El tiempo que estuve en este laboratorio me dediqué a conocer su funcionamiento: cómo llegan las muestras, se procesan, se analizan mediante PCR, heterodúplex, secuenciación…Todo ello de forma general. Las técnicas aprendidas fueron: - Preparación de geles de agarosa para PCR. - Preparación de heterodúplex: geles de acrilamida, montaje del soporte, carga de las muestras, desmontaje del mismo, tinción, secado, análisis. - PCR: carga de las muestras en los geles. LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO DE LA FACULTAD DE MEDICINA Después de pasar unos días en el laboratorio 14 me trasladé al laboratorio de diagnóstico molecular de la facultad de Medicina, especializado en el estudio de enfermedades raras, poco comunes, generalmente, de afección epidérmica. Decidí quedarme en este laboratorio principalmente por dos causas: a) El estudio de enfermedades raras me atrajo mucho más por diferentes razones: su propio carácter de “rara”, el hecho de que sean pocos los casos diagnosticados, supone un mayor reto a la hora de estudiarlos, no sólo por el poco conocimiento que existe sobre ellos, sino también por la oportunidad que aporta este laboratorio de dar resultados concluyentes a los pacientes. Asimismo, quedarme en ese laboratorio me ofrecía la posibilidad de conocer nuevas enfermedades, nuevas variaciones…cada enfermedad ofrecía la posibilidad de estar implicada por varios genes distintos, teniendo cada uno de ellos muchos exones, cada uno de los cuales había que analizar en busca de la alteración responsable de la enfermedad. En conclusión, este laboratorio suponía una visión más amplia y variada de los estudios de diagnóstico molecular. b) En segundo lugar, la razón que determinó que me decantase por este laboratorio fue el hecho de que podía tener una formación más personalizada, ya que prácticamente la responsable del diagnóstico, encargada de instruirme, tenía bajo su tutela apenas a dos personas más. Sin embargo, en el laboratorio 14 éramos varias las personas que estábamos realizando prácticas allí, con la consecuente dificultad de poder llegar a realizar un trabajo independiente. Dicho esto, procedo a exponer, ahora de forma más detallada, el trabajo realizado. HETERODÚPLEX El heterodúplex es una técnica consistente en analizar mediante gel de poliacrilamida las moléculas de DNA de doble cadena formadas por hibridación de cadenas sencillas complementarias. El procedimiento de la técnica consta de varios pasos: * Montaje de los cristales: se dispone de dos cristales, uno grande y otro más pequeño. Han de limpiarse con etanol y fijarse en qué borde está mejor (presenta menos alteraciones) antes de colocarlos para evitar futuras fugas del gel. Colocar los separadores entre ambos cristales y, una vez montados, situar las pinzas laterales. Colocar, finalmente, en el soporte (cada soporte tiene capacidad para dos geles). * Gel de poliacrilamida: H2O destilada + TBE 10X + TEMED + MD`+ FORMAMIDA + APS * Relleno de los cristales: una vez echado el APS la mezcla comienza a gelificar, por lo que hay que apurarse a la hora de verter la solución. Debe observarse si se producen pérdidas. Colocar el peine procurando que no queden burbujas. * Preparación de la muestra: la mezcla resultante consta de tampón de carga, que marca la zona por donde va corriendo la muestra, y ésta misma (procedente de PCR). La proporción de ambos es de: 1µL de tampón de carga por cada 0-5µL de muestra, 2µL de TC por cada 5-10µL…. A la hora de cargar las muestras se incluye también un marcador de tamaño y un control negativo (sin muestra). * Conexión: se introducen los geles en la cubeta y se añade buffer. Se deja corriendo durante varias horas hasta que el tampón de carga llegue a la zona baja del gel. * Desmontaje: se retiran las pinzas, cristales y separadores. Una vez separado el gel, se marca de tal manera que se reconozcan el pocillo donde se ha empezado a cargar y qué gel es (primero o segundo en cargar). * DNA Silver Staining Kit: conjunto de soluciones empleadas para el revelado de los heterodúplex formados. 1. Solución de fijación 2. Solución de tinción: de plata 3. Solución de revelado 4. Solución de paro Hay que intentar que no queden manchas de plata en el gel, así como que no quede muy oscuro para que la visualización de las bandas sea óptima. * Secado: cubrir los geles con plástico y colocar las pinzas. Secar en el horno durante un día, más o menos. MUTACIÓN HETEROCIGÓTICA (AG) INDIVIDUO NORMAL MUTACIÓN HOMOCIGÓTICA (AG) VISUALIZACIÓN GEL MARCADOR C (-) () () __ __ __ __ __ __ __ C(+)=NORMAL () HETEROC. () HOMOC. () __ __ __ __ __ __ Esta técnica no es válida para enfermedades homocigóticas recesivas, por lo que en estos casos es mejor enviar directamente a secuenciar la muestra de PCR. En heterocigosis deberían observarse 4 bandas, aunque suele ser difícil. GELES DE AGAROSA PARA PCR Normalmente se hacen al 2% para fragmentos de alrededor de 300Kb. A mayor tamaño de fragmento, menor % de agarosa. El gel es una mezcla de agarosa (se pesa en la balanza) y TBE0’5X (50 o 100mL dependiendo de la cubeta). El matraz donde se realiza la mezcla se cubre con film de plástico y se agujerea para evitar que estalle el recipiente dentro del microondas. Una vez la agarosa se haya fundido completamente, se añade bromuro de etidio o Sypro green (compuestos que se intercalan entre las bases del DNA) y se vierte en la cubeta previamente montada. Se ponen los peines y se espera a que polimerice. Una vez esto haya ocurrido, se retira el peine y se cargan las muestras de la PCR (4mL de muestra + una gota de tampón de carga). Al igual que en el heterodúplex, se carga también un marcador de tamaño, y un control negativo para confirmar que no ha habido contaminaciones. Una vez se han cargado todos los pocillos, se echa TBE hasta que el gel quede cubierto, se coloca la tapa teniendo especial cuidado en la correcta distribución de los polos negativo y positivo y se pone a correr a 140V durante unos 20 minutos. Controlar el avance del tampón de carga para saber cuándo parar. Seguidamente hacer una fotografía del gel para observar las bandas. De estos geles puede extraerse directamente una de las bandas para su análisis. Para ello, habría que eliminar la agarosa mediante un kit de extracción y luego usar el producto de PCR según el fin. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Se trata de una técnica de biología molecular desarrollada por Kary Mullis cuya finalidad es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo, es decir, se busca amplificarlo. La PCR se realiza en un termociclador con unas condiciones de temperatura adecuadas para cada fragmento que se desea amplificar. Para ello hay que preparar previamente la muestra. Todo el proceso se realiza en cámara de flujo laminar para evitar contaminaciones. Por esta misma razón todo el material que entra en la cámara ha de limpiarse con etanol. Muestras: - Master-Mix: contiene Taq polimerasa, tampón, MgCl2 y dNTPs - Agua libre de nucleasas - Oligos - DNA Por cada muestra hay que preparar un control negativo para asegurarse de que la muestra de DNA no está contaminada, ni tampoco el master-mix o los oligos. El DNA que se recibe (extraído a partir de sangre periférica) está muy concentrado, por lo que se hace una dilución 2:50 del stock. DIGESTIONES DEL PLÁSMIDO pGEMT + inserto El objetivo del experimento era conseguir insertar un fragmento de DNA determinado dentro del plásmido pGEMT. Participé en el proceso de la digestión, crecimiento en placas, realización de réplicas, extracción y PCR de las digestiones. Asimismo efectuamos un nuevo stock de células competentes. PCR cuantitativa (qPCR) La PCR cuantitativa permite detectar duplicaciones y deleciones de genes. La preparación de la muestra es similar, pero en este caso no se carga en geles, sino que se disponen en el aparato de qPCR mediante una placa que hay que diseñar previamente. Hay que incluir un control endógeno (p53,por ejemplo) y un DNA de referencia (DNA de otro paciente que se sabe con seguridad que no padece la enfermedad en estudio). Esta técnica requiere saber la cantidad exacta de DNA que se echa. Para determinarla se utiliza el NanoDrop, que permite determinar la concetración y, por tanto, la cantidad de DNA. GENES ESTUDIADOS p53: también llamado el "guardián del genoma", se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 (17p13) y codifica un factor de transcripción nuclear de 43.7 KDa. Su nombre hace referencia a su masa molecular aparente: corre como una proteína de 53 KDa. Resulta esencial para inducir la respuesta de la célula ante el daño del ADN, deteniendo el ciclo celular en caso de mutación. El gen p53 es un gen supresor tumoral que desempeña un papel importante en apoptosis y control del ciclo celular. Un p53 defectuoso podría permitir que las células anormales proliferen dando como resultado cáncer. LQT1: gen implicado en el síndrome QT-largo. Éste es un tipo de arritmia cardíaca caracterizada por alteraciones típicas del perfil electrocardiográfico. En la forma congénita o familiar es una enfermedad hereditaria asociada a elevado riesgo de muerte súbita. La mayoría de los enfermos son asintomáticos y son detectados accidentalmente en electrocardiogramas de rutina, por la historia familiar o después de sobrevivir a episodios de síncope o arritmia ventricular severa. LQT1 (KVLT1) codifica la subunidad α del canal de potasio. LQT2 (HERG) codifica la subunidad α del canal de potasio. LQT3 (SCN5A) codifica la subunidad α del canal de sodio. La importancia del examen genético radica en la precoz detección de la enfermedad que ayuda a definir el pronóstico y seleccionar los tratamientos más adecuados de acuerdo a las variantes genotípicas. En primer lugar se estudia LQT1, si no se hallan mutaciones, se estudian LQT2 y LQT3. El gen LQT1 suele presentar problemas de análisis en los exones 1a, 13, 14 y 15. Por ello suele complementarse la PCR con sustancias como DMSO o espermidina que permiten hacer gradientes y detectar mejor las bandas tras correr las muestras en el gel. BGN: gen de la distrofia muscular. FAM58A: gen del síndrome Star. Se caracteriza por presentar los pacientes ojos separados, deformaciones anogenitales y renal, sindactilia. Está próximo en el genoma a BGN, por lo que podrían estar relacionados. ANÁLISIS DE SECUENCIAS Ya sean secuencias obtenidas a partir de muestras mandadas directamente a secuenciar (caso del gen p53) o bien de aquéllas en las que se hayan observado anomalías en los heterodúplex. En ambos casos hay que analizar la secuencia base por base, tanto la secuenciada con el oligo forward, como con el reverse (es decir, dirección 5’3’,y 3’5’). Los oligos se añaden en las muestras antes de mandarlas al secuenciador. Se ha de realizar una vista preliminar de la secuencia: no tener en cuenta las primeras bases ni las últimas, descartar el ruido de fondo y localizar zonas con dos posibles bases o bien con cambios completos. La secuencia se compara con otra obtenida de una base de datos y correspondiente a la situación normal (no patogénica) del gen. Se pueden detectar polimorfismos, mutaciones patogénicas, mutaciones no identificadas todavía… CONCLUSIONES El desarrollo de las prácticas ha sido mejor de lo esperado. Además de aprender el manejo habitual de un laboratorio: materiales, técnicas, precauciones…he podido tener cierta independencia, lo que me ha acercado aún más al mundo laboral. Tras aprender las bases del funcionamiento del laboratorio se me asignaron tareas propias, con toda la responsabilidad que conlleva el análisis de muestras reales de pacientes. Por lo tanto puede concluir que la valoración de las prácticas ha sido muy positiva, tanto por lo aprendido durante las mismas como por el trato personal recibido, en primer lugar, por el tutor, como por los instructores y demás personal. Finalmente quiero añadir que gracias a estas prácticas me he animado a solicitar una beca de colaboración, ya que me ha inspirado un gran interés en el mundo de la investigación como un posible futuro profesional.