Revista Salud Latina No.3. - Facultad de Ciencias de la Salud Dr

Summum- Desiderium - Sapientia
ISSN 1726-7196
EDICIÓN#003 ▪ JUNIO 2013
Salud
Latina
Revista Oficial de la Facultad
de Ciencias de la Salud
Dr. William C. Gorgas
Universidad Latina de Panamá
Facultad de Ciencias de la Salud Dr. William C. Gorgas
CONTENIDO
002
AUTORIDADES DE LA
UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMÁ
Ing. José Barrios Ng
PRESIDENTE DE LA JUNTA DIRECTIVA
Dr. Modaldo Tuñón
RECTOR
Prof. Francisco Isos
VICERRECTOR PARA SEDES DEL INTERIOR
Mgtra. Nadiya de Ungo
SECRETARIA GENERAL
Dr. Jorge Medrano
VICERRECTOR ACADÉMICO
CONTENIDO JUNIO 2013
04 Medicina
“Síndrome nefrótico”
X. Sarmiento
10
Epidemiología
“La sífilis congénita en nacidos en el
Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía 2007 - 2011”
M. Yau
17 Odontología
“Rehabilitación preprotésica”
A. Espinal
28
Tecnología Médica
“Determinación de plomo en sangre del personal expuesto”
C. Barrios
34 Biotecnología
“Caracterizaciòn molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis y
medición de la actividad biológica frente a S. frugiperda y S. exigua”
O. Serrano, N. Rosas, A. Sanchez, J. Villegas
44
54
64
84
93
101
“Construcción de un baculovirus recombinante con el gen CCV1 del
polidnavirus de Cotesia congregata”
S. Young, M. Rodríguez, M. Pérez, E. de Luna
“Estudio de la variabilidad genética de Leishmania panamensis mediante marcadores
moleculares generados vía AFLP”
J. Juliao, R. Lleonart
“Análisis de expresión de un gen de trealosa -6- fosfato sintetasa en variedades
de frijol común (Phaseolus vulgaris)”
S. Rodríguez, R. Rosas
“Obtención y aplicación de quitosano.”
G. Chong, B. Córdova, M. Correa, M. Cuevas, J. Delgado, A. Tristán
“Producción de antisuero murino contra veneno de Bothrops asper
y Porthidium lansbergii”
J. Young, M. Núñez, J. Juliao, T. Vial, C. Lyons, M. Urriola, O. Otero, O. Dupuy
Fisioterapia
“Gimnasia laboral aplicada a la disminución del estrés laboral y mejora del
desempeño en los colaboradores de Panasonic Latin America”
N. Fish
MENSAJE DE
EL EDITOR
EDITOR: Dr. Jorge Medrano
El trabajo científico y académico, al igual que la vida,
siempre transita por caminos nuevos e inacabados llenos de dificultades y sorpresas, que paradójicamente
son la razón y justificación para el esfuerzo del estudioso y pensador, que sueña, planea y busca nuevas
alternativas para lograr el conocimiento y contribuir
al progreso de la sociedad, de la ciencia y la cultura.
El niño, el estudiante, el profesional y el científico
se apoyan en la curiosidad observadora de todo lo
que los rodea, de fenómenos extraordinarios que piden una explicación, y de las formas en que los seres
humanos piensan, funcionan, se organizan y viven.
Curiosidad, observación, razonamiento, método, comunicación, perseverancia, creatividad, eliminación de prejuicios y, sobre todo, honestidad con uno mismo, y con los
demás, aceptación de nuestros límites, de los de otros y
del tiempo en que vivimos, pero con la imaginación puesta
en el futuro, tratando de dejar un mensaje, aunque sea muy
modesto, para que la humanidad pueda seguir avanzando.
Las revistas científicas son una declaración y un compromiso. Declaración de estar dispuestos a emprender un camino diferente al del simple comentario,
para perfeccionar el método de búsqueda de datos en el camino al mejor conocimiento, de las formas de decir, de pensar, de hacer, de organizarse, de
entender la materia, los fenómenos y la vida y el universo. Es un compromiso con una forma de vivir,
de disciplina, de reconocimiento a quienes nos precedieron, a los que conviven con nosotros y a todo lo
que nos rodea, y es una proyección hacia un futuro mejor.
Los miembros de nuestra Facultad, poco a poco, están
comenzando a dar pasos que tienen que iniciar con el “gateo”
de los estudiantes que se van formando para indagar, para
analizar mejor, para comunicar y escribir, de la mano de
otros compañeros y de docentes que comprenden que los
científicos no solo se dedican a estudiar la estructura de la
materia, o las reacciones, o lo que puede pesarse y medirse,
sino que también deben emprender los caminos enmaraña-
Créditos
dos del sentimiento, del pensamiento, de las percepciones,
porque ellas son parte muy importante de la vida humana,
para construir una sociedad donde todos aprendan a
valerse mejor por sí mismos, a ser menos dependientes, a administrar mejor las cosas y a escuchar, transmitir y convivir.
El mundo de hoy demanda estudiantes y docentes comprometidos con reducir las diferencias de oportunidades
para satisfacer las necesidades humanas, para aprender, y
para participar de los bienes y servicios que vamos incorporando al arsenal de beneficios que todos deben disfrutar.
La educación en general, la educación en ciencias de
salud, y la ciencia y la investigación no pueden utilizarse
para perpetuar elitismos discriminatorios que excluyen
a estudiantes que quedan en el camino y etiquetamos
de mediocres o desertores. También excluimos, muchas
veces sin querer, a muchos compañeros y estudiantes
porque tienen otra forma de pensar y actuar, o porque no
son de nuestro grupo, o porque su aspecto e incluso limitaciones nos llevan a pensar que es mejor dejarlos fuera.
La ciencia y la educación, el método y la divulgación
científica tienen que ayudar a que el debate de las ideas llegue a más y más gente, y por ello una revista es
como la primavera, que siempre están cargadas del verdor de la esperanza, de entusiasmo, cuyo mantenimiento depende de que nosotros aceptemos nuestra parte.
Gracias a los organizadores de la revista, y no importa si
está en papel, o en internet, y acepten todo lo que pueda
representar pasos hacia el progreso de la misma, de la
Facultad, de la Universidad Latina, de Panamá y del mundo.
Dr. Jorge Medrano
Decano de la Facultad de Ciencias de la Salud
Universidad Latina de Panamá
Comité Editorial
Dr. Jorge Medrano, Decano de la Facultad de Ciencias de la Salud.
Prof. Carlos Staff, Coordinador General.
Dr. Luis Coronado, Director de la Escuela de Medicina.
Dr. Eduardo Sierra, Director de la Escuela de Odontología.
Prof. Yovani Morales, Director de la Escuela de Farmacia.
Profra. Priscilla Jiménez, Directora de la Escuela de Tecnología Médica.
Profra. Modesta Haughton, Directora de la Escuela de Enfermería.
Profra. Yamileth Yuil, Directora de la Escuela de Fisioterapia.
Dr. Omar Dupuy, Director de la Escuela de Biotecnología.
Profra. Ariadna Españo de Ponce, Coordinación Académica Estudiantil.
Lic. Olmedo Otero, Asistente de Investigación del ICGES.
Lic. Joel Sánchez, Asistente de Investigación del IIBCB.
Lic. Wilder Rodriguez, Docente investigador del IIBCB.
Contacto
Tel.: (507)-207-6709
E-mail: omarielsag@yahoo.com
Salud Latina, Revista semestral, Junio 2013. Editor Responsable: Jorge Medrano. Número
de ISSN: 1726-7196. Domicilio
de la Publicación: Facultad de
Ciencias de la Salud Universidad Latina de Panamá, Calle
35, ave. Justo Arosemena, ciudad de Panamá, Rep. de Panamá.
El contedido de los artículos es
responsabilidad de los autores.
Prohibida la reproducción parcial o total sin el permiso expreso de los editores.
Copyrights©Universidad
Latina de Panamá - Todos los
derechos
reservados
2013,
Panamá, Panamá.
MEDICINA
SALUDLATINA
04
“Síndrome nefrótico”
AUTOR: Xikzel Sarmiento
Universidad Latina de Panamá
SALUDLATINA
05
SALUDLATINA
06
SALUDLATINA
07
SALUDLATINA
08
SALUDLATINA
09
EPIDEMIOLOGÍA
SALUDLATINA
010
“La sífilis congénita en nacidos en el
Hospital Materno Infantil José Domingo De Obaldía 2007 2011”
AUTOR: Meiling Yau González1
1. Médico MINSA Chiriquí, Maestría en Epidemiología y salud de los
Trópicos en la Universidad Latina de Panamá, Facultad de Ciencias de la
Salud Dr. William C. Gorgas.
RESUMEN
Objetivo: Revisar los casos de sífilis congénita en nacidos en el hospital Materno Infantil José Domingo de
Obaldía (HMIJDO) en los años 20072011 para conocer la incidencia y factores que parecen estar asociados a
esta enfermedad. Materiales y Método: Se realizó un estudio descriptivo
retrospectivo longitudinal, se revisaron
57 expedientes de las madres cuyos
hijos nacieron con sífilis congénita en
el HMIJDO en los años 2007-2011 y se
procedió a estudiar las diferentes variables. Resultado: La tasa de incidencia de sífilis congénita en el HMIJDO
en los años 2007 al 2011 fueron: 0.3, 1.4,
1.9, 2.6, 1.0 por mil habitantes. El 87.6%
de las mujeres se encontraban en el
rango de edad de 15-29 años. El 38.6%
procedía de la comarca Ngäbe-Buglé.
87.8% de las mujeres tenían control
prenatal; 64% de las pacientes con control no se le consignó si se le mandó
la prueba de VDRL; hubo 66.6% pacientes
con
VDRL positivo de las
cuales a 66.6% de las pacientes se le
dio tratamiento y al resto no se le consignó si recibieron tratamiento. Conclusiones: hubo un aumento de la tasa de
incidencia de sífilis congénita del 2007
al 2010, y luego un descenso en el
2011. Palabras claves: sífilis congénita,
historia perinatal, VDRL, tratamiento.
ABSTRACT
Objective: To review cases of congenital syphilis in patients born at Jose
Domingo de Obaldía Materno-Infantil
Hospital from the
years 2007-2011
to determine the incidence and factors that appear to be associated with
this disease. Materials and Methods:
A longitudinal, descriptive study was
made. We reviewed 57 cases of mothers whose children were born with
congenital syphilis at José Domingo
de Obaldía Hospital from the years
2007-2011 and proceeded to study
the different variables. Results: The
incidence rates of congenital syphilis
in the HMIJDO from the years 2007
to 2011 were: 0.3, 1.4, 1.9, 2.6, and
1.0 per thousand inhabitants. 87.6%
of women were in the age range of
15-29 years. 38.6 % came from the
Ngäbe-Buglé comarca. 87.8 % of women had antenatal care. 64% patients
with antenatal care have no information
if VDRL test was made to them. There
were 66.6% of patients with a positive
VDRL of which 66.6% of these patients
were treated and the rest have no information if they received treatment. Conclusions: There was an increase in the
incidence rates of congenital syphilis
from 2007 to 2010, and then a decline
in 2011. Key words: congenital syphilis, perinatal history, VDRL, treatment
SALUDLATINA
011
INTRODUCCION
La sífilis congénita se produce cuando una mujer embarazada transmite a su hijo la sífilis
por vía transplacentaria o por lesiones en el canal de parto. El agente causal es el Treponema
pallidum. Las infecciones maternas no tratadas pueden causar la pérdida del feto hasta en
40% de los casos (con mayor frecuencia de mortinatos que de abortos, porque las lesiones
fetales son tardías), premadurez, muerte neonatal o sífilis congénita si el lactante sobrevive.
(13)
La ausencia de control prenatal, el tratamiento no adecuado son los factores
importantes en la adquisición de sífilis congénita. A pesar de haber métodos diagnóstico y un tratamiento económico aún se presentan casos en todo el mundo. En
América Latina y el Caribe para el año 2007 más de 164.000 niños nacieron con
sífilis congénita (SC). En Costa Rica, Colombia, Perú, Brasil, Paraguay, Uruguay y Argentina, la SC constituye un problema de salud pública por que se reportan más de
0,5 casos por 1.000 nacidos vivos. (12) En Panamá, la incidencia de sífilis congénita
en los años 1990 a 2009 se ha mantenido en tasas que oscilan entre 0.1 y 0.8 por
1000 nacimientos vivos. (7) En la provincia de Chiriquí las tasas en los años 2005 y
2010 oscilan entre 0 y 3.7 por 1000 nacidos vivos. (4)
Este trabajo tiene como propósito, conocer la incidencia y los factores asociados al nacimiento de niños con sífilis congénita en el Hospital Materno Infantil José
Domingo de Obaldía.
MATERIALES Y METODOS
Se realizó un estudio descriptivo retrospectivo longitudinal. Se revisaron 57 expedientes o archivos clínicos y la historia clínica perinatal de las madres cuyo hijos nacieron con sífilis congénita en el Hospital Materno Infantil José Domingo de
Obaldía de la provincia de Chiriquí, y se buscaron las variables de interés (número de
nacidos vivos en el HMIJDO, número de nacidos con sífilis congénita en el HMIJDO,
tasa de incidencia de sífilis congénita el HMIJDO, edad, estado civil, procedencia,
escolaridad, etnia, número de gestación y abortos, número de controles prenatales,
trimestre de inicio de control prenatal, número de VDRL enviados durante el control
prenatal, resultado del primer VDRL, resultado del segundo VDRL, tratamiento para
sífilis, tratamiento recibido por la pareja, tipo de parto, tratamiento recibido por la
madre, tratamiento recibido por niño ) se procedió a llenar una hoja de recolección
de datos realizada por el autor, luego se tabuló la información de forma manual y se
realizaron cuadros con el programa Excel.
RESULTADOS Y DISCUSION
La tasa de incidencia de sífilis congénita en el HMIJDO, estuvo en aumento desde el año 2007 al 2010 y luego descendió en el 2011
SALUDLATINA
012
La mayoría de las mujeres se encontraban en el rango de edad de 20-24 años
con 47.3%, seguido de 15-19 con 21% y de 25-29 con 19.3%. El 38.6% procedía de la
Comarca Ngäbe-Buglé y 28% de la mujeres procedían del distrito de David. 56%
de las pacientes eran de etnia no indígena y 44% eran indígenas. El 37% contaban
con estudios secundarios y 31.6% estudios primarios. 52.6% de las pacientes vivían
en unión estable. 54 % eran multigestas, de las cuales 14% habían tenido abortos
anteriores. 87.8% de las mujeres tenían control prenatal de las cuales 57.8% de las
pacientes ingresaron al control prenatal en el primer trimestre. 43.9 % tuvieron cinco
o más controles prenatales. A 64% de las pacientes con control no se les consignó
si se le envió la prueba de VDRL. Hubo 66.6% con VDRL positivo de las cuales
a 66.6% de las pacientes se le dio tratamiento y al resto no se le consignó si
recibieron tratamiento. El 100% de los expedientes no repitieron tratamiento de
pareja. El 96.5% de las mujeres tuvieron parto a término. 96.5% de las mujeres
recibieron como tratamiento penicilina y 96.5% de los recién nacidos recibieron este
mismo tratamiento.
En este estudio, se observó que en el Hospital Materno Infantil José Domingo de Obaldía
la tasa de incidencia de sífilis congénita fue en aumento con una tasa de incidencia anual
en el 2007 de 0.3 x 1000 hasta 2.6x1000 en el 2010 coincidiendo con los datos del departamento de epidemiología del MINSA región de Chiriquí y con Ayala-Montoya y col., que
encontraron un aumento de la incidencia de 4 a 5 veces, siendo en el 2005 de 0.6x1000 y
en el 2008 de 3.2x 1000. Luego, descendió en el 2011 a 0.1x 1000 pudiendo tener como
explicación que en el año 2010 se efectuó una supervisión a nivel regional buscando las debilidades en los controles prenatales y se le hizo recomendaciones a los diferentes distritos.
En este estudió de observo que 87.6% de las pacientes correspondían a edades
entre 15 a 29 años y encontrándose la mayor cantidad de casos en el rango de
20-24 con 47.3%; en este mismo grupo se encontraba la tasa de incidencia por edad más
alta con 2.3x1000, observándose un alto porcentaje de adolescentes y jóvenes afectadas,
aproximándose a los resultados de Barba-Muñoz, que en su estudio las mujeres estaban el
rango de 16-36 años.
SALUDLATINA
013
El lugar de procedencia de la mayoría de los casos era de la Comarca Ngäbe- Buglé con 22 pacientes (38.6%) seguido el Distrito de David con 16 pacientes (28%), juntos suman un 66.6% de las afectadas. Sin embargo al calcular la tasa de incidencia
por distrito, se observó que la mayor tasa se encuentra en la Comarca con 4.5x1000,
seguido de Barú con 1.8x1000 y en cuarto lugar David con 1.3x1000. La Comarca
Ngäbe- Buglé es un lugar con poca accesibilidad a los servicios de salud, ni a laboratorios; en donde hay pobreza extrema, que propicia que las mujeres embarazadas
no tengan un adecuado control prenatal.
En cuanto el nivel de escolaridad, se observó que la mayoría de las pacientes 37% contaban con estudios secundarios, 31.6% contaban con estudios primarios. Coincidiendo con
Morales Sánchez A., que en su estudio 43.5% tenían estudios secundarios y 36.2 % contaban con estudios primarios. A pesar de que la mayoría de las pacientes (75.5%) tenían algún
nivel de alfabetización, presentaron infección por sífilis, esto nos indica que tener estudios
no implica conocimiento sobre la enfermedad y sus consecuencias.
Con respecto al estado civil, se observó que la mayoría de las mujeres estudiadas estaban en unión estable (52.6%), pudiendo estar esto asociado a la falta de
compromiso en la pareja y posible promiscuidad de las pacientes y/o sus parejas.
Con respecto a la gestación, la mayoría eran multigestas con 54% de las cuales 40% no
habían tenido abortos y 14% habían tenido abortos, 46% de las pacientes eran primigestas.
Esto nos indica, que debemos indagar a las pacientes por antecedentes de sífilis congénita
en sus embarazos anteriores e incluir a los abortos y óbitos de madres con VDRL positivo
como sífilis congénita.
Se observó que 87.8% de las pacientes estudiadas tuvieron control prenatal, de las
cuales 17.5 % inició control en el primer trimestre; 57.8% en el segundo trimestre. El 43.9%
de las pacientes acudió a cinco o más controles. Este resultado es contrario a la revisión bibliográfica (4) que indica que hay mayor riesgo de tener sífilis sin control prenatal, por lo que
se sospecha que hay debilidades en el control prenatal.
En cuanto si se le envió la prueba de VDRL, de las 50 pacientes con control prenatal, 32 pacientes, es decir 64%, no tenían consignados en sus expedientes si se
le envió VDRL. A 18 pacientes (correspondiente 36%) que se le envió la prueba de
VDRL, 12 resultaron positivas correspondiendo a 66.6% y cuatro negativas correspondiendo a 33.4%. De las 12 pacientes con VDRL positivo a 8 pacientes (66.6%) se
le consignó que se le dio tratamiento, en la hoja perinatal del resto de la paciente no
se constataba si recibió tratamiento.
SALUDLATINA
014
En ningún expediente de las 57 mujeres estudiadas, se consignó si se le dio
tratamiento a la pareja, nudo crítico en esta enfermedad ya que si las parejas no
fueron tratadas, estas pudieron volver a infectar a las mujeres que sí recibieron tratamiento. Estos resultados nos indican que hay faltas de datos importantes en los
expedientes clínicos, que nos hubiesen permitido saber si no se le está enviando la
prueba a las pacientes o no se les está tratando o ellas no se realizan las pruebas.
96.5% de las pacientes estudiadas, tuvieron parto a término y se les trató con
Penicilina. El inicio del tratamiento de la madre fue intrahospitalario, sin embargo no
se localiza a la pareja para hacerle la prueba de VDRL, que pudiera ser una alternativa para evitar reinfecciones.
En conclusión, hubo un aumento de la tasa de incidencia de sífilis congénita
del 2007 al 2010, y luego un descenso en el 2011. La gran mayoría de las pacientes
provenían de la comarca Ngäbe-Bugle y el distrito de David, hubo un déficit importante de información al no consignar datos importantes como el envio de la prueba
de VDRL y si se le dio tratamiento a la paciente y su pareja.
BIBLIOGRAFÍA:
• Ayala-Montoya, Hernández-Pérez , Murillo-Llanes , Daut-Leyva . Incidencia de
Sífilis Congénita en el Hospital General de Culiacán Dr. Bernardo J. Gastélum. 2011.
Archivos de Salud Sinaloa 5(1): 5-8. URL disponible en: http://www.Ibiomed.com
• Barba-Muñoz F. Tovar-Guzmán V.
Jiménez-Gauna F.
Sífilis Congénita,
Experiencia en Un Hospital Básico de Sonora.2010. Bol Clin Hosp Infant Edo Son
27(1): 41-47. URL disponible en: http:// www.Ibiomed.com
• Departamento
de
Salud
Pública
y
Epidemiología.
• Fauci A. Kasper DL.
Braunwald E. Editores. 2005.
Medicina Interna. 17 ed. México. Mcgraw-Hill Interamericana.
MINSA
Chiriquí.
Harrison: Principios de
• Heyman D. 2005. El control de las enfermedades transmisibles. 18 Edición.
Washington D.C.OPS
• Morales Sánchez A. Factores sociodemográficos maternos que predisponen
a la presencia de sífilis congénita en el neonato.2010.Enfermería Actual en Costa
Rica, Núm. 17. URL disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed
• MINSA Panamá. 2010. Plan Estratégico Nacional Multisectorial para la prevención de la transmisión materno infantil del VIH y Sífilis en Panamá 2009-2014.
URL disponible en: http://www.paho.org
SALUDLATINA
015
• Organización Mundial de la Salud. 2007. Estrategia Global para la prevención
y control de las Infecciones de Transmisión Sexual: 2006-2015. Ginebra. URL disponible en: http://www.who.int
• Organización Mundial de la Salud. 2004. Aspectos económicos y de programación de la prevención de la Sífilis Congénita. Bull World Health Organ vol.82 no.6
Ginebra. URL disponible en: http://www.scielosp.org
• OMS 2008. Eliminación de sífilis congénita en América Latina y el Caribe: marco de referencia para su implementación. Washington: OPS; 2005. URL disponible
en: http://www.paho.org/Spanish/AD/FCH/ AI/ EliminaSifilisLAC.pdf
• OMS. 2008. Eliminación Mundial de la Sífilis Congénita: fundamentos y estrategias de acción. URL disponible en : http://www.ops.com
• OPS. 2009. Iniciativa Regional para la Eliminación de la transmisión maternoinfantil del VIH y de la Sífilis Congénita en América Latina y el Caribe. URL Disponible en: http://www.ops.org.
• OPS. 2010. Guía Clínica para la Eliminación de la Transmisión Maternoinfantil
del VIH y de la Sífilis Congénita en América Latina y el Caribe. URL disponible en:
http:// www.ops.org.
• Valderrama J. Zacarías F y Mazin R .2004. Sífilis materna y sífilis congénita en
América Latina: un problema grave de solución sencilla. Rev Panam Salud Pública.
16(3). URL disponible en: http://www.PAHO.org
SALUDLATINA
016
017
“Rehabilitación preprotésica”
Estudiante:
Adriana Lucía Espinal Jovel1
1.Universidad Latina de Panamá
CASO CLÍNICO UTILIZANDO LA MÉTODOLOGÍA ODONTOLOGÍA INTEGRAL
Aspectos Conceptuales y Metodológicos
La Escuela de Odontología de la Universidad Latina de Panamá, desarrolla a través de su programa académico la atención clínica, conceptual y metodológicamente, a través de la Odontología Integral, que
es ofrecida: a niños, adolescentes, adultos y tercera edad.
El estudiante durante sus nueve semestres de práctica clínica, desarrolla un alto nivel del conocimiento
del sistema estomatognático. A través de los ciclos, organizados en niveles de complejidad creciente,
se implementa la integralidad de las diversas especialidades odontológicas, las especialidades médicas
vinculadas a las patología de la cavidad bucal y de los aspectos sociales relacionados con el caso clínico.
La estrategia didáctica utiliza el método científico. integrando lo clínico y lo epidemiológico, es decir
la práctica de la Odontología Integral para devolver a nuestro paciente el estado de salud integral que
incluyen la función y estética.
En la formación de la práctica clínica se incluye el desarrollo de la capacidad de mantener la observación
periódica de las condiciones de la salud de su paciente, que se ubica dentro contexto ético que debe
ser transparente en todos sus componentes y se inscribe dentro de la formación de la responsabilidad
profesional de los tratantes.
Dr. Eduardo Sierra
Director de la Escuela de Odontología
Datos del Paciente
Edad: 53 años
Nacionalidad: Panameña
Sexo: Masculino
Historia Dental
•
Mastica de ambos lados
•
Retención de alimentos
•
Dolor dental nocturno en #46
•
Ha
recibido
atención
dental,
le
realizaron
endodoncia
retrógrada
en
manifiesta desagradarle el defecto óseo en dicha pieza.
•
Se le realizaron múltiple restauraciones, las cuales estéticamente no le agradan.
•
Factura de corona de #15
•
Exodoncia #34, por falta de espacio
•
Pérdida de varios dientes, por falta de higiene. No recuerda si fue por caries o problema periodontal.
#24,
ODONTOLOGÍA
SALUDLATINA
SALUDLATINA
018
Historia Médica
•
•
•
•
•
No padece enfermedades sistémicas
Ha sido hospitalizado por accidente de tránsito
Presenta leve parálisis facial derecha a consecuencia de cirugía de su infancia.
Presión Arterial 110/70mmHg
Tipaje: B-
Evaluación Extrabucal
•
•
•
•
•
•
Forma de la cara: Ovalada
Presenta simetría facial
Ojos almendrados
Cejas pobladas
Labios medianos
Nariz perfilada
• La línea media dental coincide con línea media craneofacial
• Presenta desviación de labio inferior derecho. Consecuencia de cirugía facial de la
infancia. Lo que se manifiesta como sonrisa asimétrica
• Muestra 1/3 superior y ligeramente 1/3 inferior dentales
• Perfil convexo
SALUDLATINA
019
Evaluación Intrabucal
•
•
•
•
Línea media dental no coincide
Frenillos DLF
Mucosa del paladar, glándulas salivales, carillo, piso de lengua DLF
Presencia de encías inflamadas, cálculo dental, diastemas y rotaciones dentales
anterosuperiores
• Relación Molar: No evaluable
• Relación Canina: Clase I de Angle
Perfil Derecho
• Relación Molar: No evaluable
• Relación Canina: Clase I de Angle
Perfil Izquierdo
SALUDLATINA
020
•
•
•
•
•
•
Forma de la arcada: Ovalada
Número de dientes: 14
Mesialización de #27, #17
Rotaciones # 12, #22
Microdoncia #18
Resto radicular #24
Examen Periodontal
Abundante cálculo supragingival y subgingival.
Sangrado al sondaje, presencia de bolsas con profundida de 4-6mm
Radiográficamente: pérdida ósea horizontal y vertical, cálculo subgingival.
Periodontograma
SALUDLATINA
021
Odontograma
•
•
•
•
Restauraciones en mal estado
Extracción indicada
Ausencia de dientes
Restauraciones en buen estado
Examen Funcional
Presenta:
•
•
•
•
•
•
Manipulación mandibular de mediana dificultad
Evaluación de flexión y extensión de cabeza/cuello: normales
Bruxismo nocturno
Oclusal superior e inferior normal
Guía anterior presente funcional
Guía canina presente funcional
Análisis de los Modelos
• Forma de la arcada superior ovoide
e inferior eliptica
• Número de dientes superiores 14 e
inferiores 14
• Migración de 17, 18, 27, 37, 38
• Piezas rotadas 12, 35, 44, 46, 48
• Facetas de desgaste: incisivos
superiores e inferiores
• Obturaciones: 18, 17, 15, 14, 27, 37,
35,34,46, 47, 48
• Relación molar no evaluable
• Relación canina Clase I
• Línea media coincide
SALUDLATINA
022
Análisis radiográfico
• Anomalías congénitas
Forma: #18, #28
Tamaño: microdoncia # 18, #28
• Signos de lesiones cariosa:
Recurrentes: 17, 46, 25, 27
• Signos de Lesiones periodontales:
Cresta osea: 38, 37, 35, 41, 42, 43,44,
45,46,47,48
Perdida ósea: 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46,
47.
Rarefacción periapical: 24
Presencia de cálculo: 37(M y D) 36(D)
47 (M y D), 48 (m y D)
• Hueso Maxilar y mandibular
Neumatización del Seno maxilar # 16 y
# 26
Análisis de Riesgo
SALUDLATINA
023
Diagnóstico
El paciente parcialmente edéntulo presenta:
• Periodontitis crónica generalizada Tipo III
• Caries Dental
• Alto riesgo cariogénico y periodontopático
Pronóstico
• Favorable
Plan de Tratamiento
Fase I
•
•
•
•
•
Profilaxis
RAR 1,2,3 y 4
Exodoncia # 18, 28, 38, 48, 24
Endodoncia # 15, #36
Restauraciones #17, 25, 27, 37, 35, 46, 47
SALUDLATINA
024
Fase II
• Movimiento Mesial de #25 (ortodoncia Preprotésica), cierre de espacios y
alineación de arcada superior.
• Distalización y levantamiento de # 37, alineación de arcada inferior
• Perno colado # 15
• Perno Prefabricado #46
• Corona Metal porcelana #15,#46
• Prótesis parcial fija 5 unidades dientes pilares ( # 23, 25 y 27).
• Prótesis parcial fija posterior de 3 unidades ( #35-37).
Fase III
• Control y mantenimiento
Fase IV
• Controles
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025
FOTOS EXTRAORALES
ANTES
DESPUES
SALUDLATINA
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FOTOS INTRAORALES
ANTES
DESPUES
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027
ANTES
DESPUES
Comentarios Finales
• El paciente muestra gran satisfacción por los resultados obtenidos y se encuentra motivado a seguir todas las indicaciones y sus citas periódicas de
mantenimiento y control.
• Se le realizará una resina en incisal del #21 para mejorar la estética de los incisivos anteriores.
• El paciente mantiene aparatología removible por un año para mantener el
cierre de diastemas y rotaciones dentales.
• El paciente canceló su tratamiento en un solo pago.
TECNOLOGÍA MÉDICA
SALUDLATINA
028
“Determinación de plomo en sangre del
personal expuesto”
AUTOR: Carroll S. Barrios C. 1
1.Universidad Latina de Panamá
RESUMEN
La intoxicación por plomo se considera hoy en día la exposición a metal más
común, debido a que tiene muchos usos,
las fuentes más frecuentes vienen de las
minas y del reciclado de materiales conteniendo plomo. Este metal es absorbido
por pulmones y del tracto gastrointestinal. El diagnóstico es difícil porque la sintomatología es multisistémica: astenia,
dolor abdominal, irritabilidad, náuseas,
vómitos, pérdida de peso, cefalea, anemia, entre otros. En este trabajo se ha
enfocado el estudio en la determinación
más rápida y precisa para conocer el nivel de intoxicación que tiene el paciente
mediante el sistema LeadCare. Los resultados mostraron que de un total de
50 muestras, 49 resultaron positivas, lo
que equivale a una incidencia del 98%.
Para los casos negativos solo resultó
un paciente, lo cual equivale a un 2%
de la población total. La mayoría de los
trabajadores de estos lugares donde
existe una gran exposición al plomo son
hombres, por lo que consideramos que
debido a su ocupación estos están más
propensos que las mujeres de tener altas concentraciones en sangre de este
metal. El hallazgo de una concentración
elevada de plomo en sangre, por muy
mínimo que sea, nos debe alertar y tomar
las medidas necesarias para evitar que
el nivel de riesgo aumente y tratar de reducirlo.
Palabras
clave:
Multisistémica,
exposición a metal, nivel de intoxicación.
ABSTRACT
Lead poisoning is considered today the
most common metal exposure because
it has many uses. The most frequent
sources come from mines and recycling
of materials containing lead. This metal
is absorbed by lung and gastrointestinal
tract. Diagnosis is difficult because the
symptoms are multi-systemic: asthenia,
abdominal pain, irritability, nausea, vomiting, weight loss, headache, anemia,
among others. This paper has focused
the study on the faster and more accurate determination to know the level of
intoxication that the patient has by the
Lead Care system. The results showed
that from a total of 50 samples, 49 were
positive, corresponding to an incidence
of 98%. For the negative cases, there was
only one patient, equivalent to 2% of the
total population. Most workers in these
places where there is a large exposure to
lead are men, so we believe that because
of their profession, they are more likely
to have high blood concentrations of
this metal than women. The finding of an
elevated blood lead concentration,
however minimal, must be a warning to
take the necessary measures to prevent
the increased risk level and try to reduce
it.
Key Words: Multisystemic, metal exposure, level of intoxication.
SALUDLATINA
029
INTRODUCCION
El plomo en el ser humano produce efectos, los cuales al ser determinados como trazas
o pequeñas cantidades de metales producen una variedad de efectos sistemáticos según
las cantidades absorbidas, las cuales pueden provenir del agua, alimentos, e incluso del aire,
provocando un aumento de muertes a causa de la intoxicación por plomo. Desde hace muchos años hemos observado que la utilización de Plomo en compuestos como gasolinas las
cuales provocan un ciclo no natural de este elemento y lo podemos comprobar al recordar
que este elemento es quemado en los motores de los automóviles, lo que genera las sales
de plomo que llegarán al ambiente y las partículas grandes precipitaran en el suelo o en la
superficie de aguas, las pequeñas partículas viajaran largas distancias a través del aire y permanecerán en la atmósfera. Parte de este plomo cae nuevamente sobre la tierra, luego de
el efecto natural de la lluvia produce un ciclo “no natural” del Plomo, el que daño al ser vivo.
La contaminación por plomo hoy en día se ha convertido en un tema mundial,
ya que esta no es solo causada por la gasolina que contiene este elemento sino
también por otras actividades realizadas por el hombre como por ejemplo la combustión del petróleo, procesos industriales y la combustión de residuos sólidos. En
este trabajo nos propusimos la determinación más rápida y precisa para conocer si
el paciente tiene intoxicación, incluso un leve aumento de plomo en la sangre, con
el sistema LeadCare.
MATERIALES Y METODOS
Se tomaron muestras de sangre obtenidas por medio de venipuntura, en ca-pilares o
tubos de colección de sangre con anticoagulante, como la heparina o el EDTA. Para la realización de este trabajo se utilizó un analizador y el sistema LeadCare. Se tomaron 50 µL
de sangre del tubo de colección. Se mezcló suavemente la sangre con el reactivo y se dejó
en reposo. Posteriormente se introdujo dentro de la mezcla el sensor del equipo, donde el
mango del sensor debió cubrirla completamente.
Se procedió con el analizador, y al cabo de los 180 s, el analizador mostró el resultado
del plomo en la sangre. La unidad de medida utilizada es µg/dl (microgramos de plomo por
decilitros de sangre entera).
RESULTADOS Y DISCUSION
En la siguiente tabla aparecen los pacientes clasificados por un aumento de la concentración de plomo en sangre.
SALUDLATINA
030
Figura 1: Resultados de valores positivos y negativos de contaminación con plomo en microgramos de plomo por decilitros de sangre entera (µg/dl).
En el siguiente gráfico se muestra el número de pacientes positivos y negativos, por encima de 10 µg/dl, y por debajo de 10 µg/dl, respectivamente. De esta forma de un total de
50 muestras, 49 resultaron positivas, lo que equivale a una incidencia del 98%. Solo resulto
un paciente negativo, lo cual equivale a un 2% de la población total (Figura 1, Figura 2).
Figura 2: Resultados de valores positivos y negativos de contaminación con plomo en microgramos de plomo por decilitros de sangre entera (µg/dl).
En la siguiente tabla y gráfico (Figura 3 y Figura 4) podemos apreciar de donde
provienen los pacientes, dividiéndolos según su procedencia, ya sean de Baterías
Nacionales o de Procesos y Análisis Metalúrgicos, 30 pacientes (representando el
60%) y 20 pacientes (representando 40%) respectivamente, de un universo de 50
muestras.
SALUDLATINA
031
Figura 3: Pacientes estudiados según la zona de procedencia.
Figura 4: Pacientes estudiados según la zona de procedencia.
CONCLUSIONES
Una vez culminado este trabajo de investigación, en el cual se ha determinado la
concentración de plomo en sangre de personal expuesto se concluye:
• En nuestro país la mayoría de los trabajadores expuestos, ya sea en fábricas
de baterías o en lugares donde se procesen metales, se obtiene una alta concentración de plomo en sangre lo cual puede desencadenar una intoxicación por plomo
y causar incluso la muerte.
• La mayoría de los trabajadores de estos lugares donde existe una gran exposición al plomo son hombres, por lo que consideramos que debido a su ocupación
están más propensos que las mujeres a presentar altas concentraciones de este
metal.
SALUDLATINA
032
• El hallazgo de una concentración elevada de plomo en sangre por muy mínimo
que sea nos debe alertar y tomar las medidas necesarias para evitar que el nivel de
riesgo aumente y tratar de reducirlo un poco.
• Consideramos que el primer paso para prevenir, curar o tratar una enfermedad
es identificarla y esto lo podemos hacer en solo 3 minutos acompañados de resultados confiables con el sistema LeadCare. Este sistema nos permite al detectar la
concentración de plomo en sangre prevenir graves perjuicios en el sistema nervioso
de los adultos y en el desarrollo de los niños.
RECOMENDACIONES:
• Una de las primeras y más importantes recomendaciones es la realización
del examen periódico de detección de plomo en sangre a todo personal expuesto,
porque de existir una elevación de la concentración de este metal, se podrá detectar
a tiempo y evitar una intoxicación por plomo e incluso la muerte.
• La información adecuada y precisa de cuáles son los riesgos a los que están expuestos los trabajadores es de mucha importancia, ya que muchos de ellos
desconocen que su ocupación tenga un nivel elevado de peligro.
SALUDLATINA
033
BIOTECNOLOGÍA
SALUDLATINA
034
“Caracterización molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus
thuringiensis y medición de la actividad biológica frente a
S. frugiperda y S. exigua”
AUTORES:
1
Universidad
O. Serrano1,2, N. Rosas2, A. Sanchez2, J. Villegas2
Latina
de
Panamá,
Politécnico Nacional, México, COJUCIP.
2
Centro
de
Biotecnología
Genómica-Instituto
SALUDLATINA
035
Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua
Son plagas del orden de los lepidópteros de gran interés agrícola debido a que sus larvas afectan gran
variedad de cultivos ocasionando pérdidas económicas cuantiosas en la agricultura.
RESUMEN
Para el control de plagas en los últimos años se han
buscado controladores biológicos que sean económicamente rentables, debido a que los métodos de control
que existen son insecticidas de origen químico con nefastas consecuencias para el ambiente. En este trabajo,
se realizó la caracterización molecular y bioquímica de
cinco cepas de Bacillus thuringiensis, del noreste de
México para determinar su toxicidad frente a Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua, plagas causantes
de grandes pérdidas a la agricultura mundial. Las cepas,
identificadas como RT15, RT32, RT35 y RN51 y RBT se les
realizó la extracción de los cristales después de cultivarse
en un medio a base de melaza. Por un sistema bifásico
de polietilenglicol y buffer amortiguador de fosfatos,
se recuperó un anillo intermedio rico en cristales, y por
una electroforesis SDS PAGE se observó el tamaño de
las proteínas. Los cristales solubilizados se sometieron a
un tratamiento con tripsina. La detección de los genes
cry 1, 2 y 9 se realizó lisando las células con lisozima y
posteriormente, se aplicó el método de extracción por
octanol-cloroformo. El producto se amplificó mediante
PCR. Los ensayos biológicos realizados sobre las dos
especies de insectos lepidópteros procedieron a partir
de un pie de cría con dietas artificiales suplementadas,
donde el extracto obtenido de las cepas de B. thuringiensis se mezcló con la dieta y fue cuantificada la cantidad de larvas muertas. De los resultados se obtuvo una
variación considerable en la respuesta biológica, siendo
S. frugiperda mucho más resistente que S. exigua. La
cepa con mayor actividad insecticida fue la cepa RBT,
la cual fue la única que poseía los 3 genes cry estudiados. Los cristales mostraron diferencias en su suceptibilidad a la tripsina. De esta forma una variación en dicha suceptibilidad pudo haber ocasionado la variación
de toxicidad entre ambas especies de lepidópteros.
ABSTRACT
In recent years, insect pest control has been focused on the search of economically profitable biological control agents due to the chemicals , because
the existing control methods are chemical insecticides
which cause severe damages. In this paper, five strains
of Bacillus thuringiensis isolates from Northeastern Mexico were analyzed through molecular and biochemical
characterization and toxic activity against Spodoptera
frugiperda and Spodoptera exigua. Such pests causing
great losses to world agriculture. Crystals produced by
the strains, identified as RT15, RT32, RT35 and RN51 and
RBT were grown in a molasses-based medium and produced crystals proteins. Such crystals were recovered
using a biphasic system containing polyethylene glycol
and phosphate buffer. After strong agitation an intermediate ring rich in crystals was obtained. Recovered
crystals were electrophoresed to determine the size of
proteins. Solubilized crystals were subjected to a trypsin
treatment. Cells were lysed with lysozyme and sbujected
to DNA extraction by the method of octanol-chloroform.
The product was amplified by PCR to detect the cry 1,
2 and 9 genes. Bioassays carried out on two lepidopteran insect species reared on artificial diets. The extract obtained from B. thuringiensis isolates, was mixed
with the diet. Mortality of exposed larvae was recorded. Results indicated variation in biological response,
S. frugiperda seems to be more resistant than S. exigua. The isolate with higher insecticidal activity was
RBT, which is the only one that possesses the 3 cry
genes studied. Crystals showed differences in suceptibility to trypsin action. Such variation may caused
differences in toxicity between both lepidopterans.
SALUDLATINA
036
INTRODUCCION
Los agricultores necesitan poder controlar las plagas que día a día atacan sus sembradíos
provocando pérdidas económicas considerables. Los métodos para el control de plagas
en su gran mayoría son insecticidas de origen químico, los cuales si bien controlan los insectos plagas acarrean otra serie de inconvenientes como la contaminación de las aguas,
el deterioro de la fauna de insectos benéficos y los perjudiciales, muchas de las trazas de
estos productos en los alimentos podrían afectar la salud de quienes los consumen. Por
esto es importante la búsqueda de nuevos controladores biológicos que sean económicamente rentables, no perjudiciales a la salud humana o animal, que tengan alta especificidad de base no química y posean una alta eficiencia. En este trabajo, se realizó la caracterización molecular y bioquímica de cinco cepas de Bacillus thuringiensis, proveniente
del noreste de México para determinar su toxicidad frente a Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua, dos plagas que causan grandes pérdidas a la agricultura a nivel mundial.
MATERIALES Y METODOS
Se tomaron cinco cepas de Bacillus thuringiensis del cepario del Laboratorio de Biotecnología Ambiental, del Centro de Biotecnología Genómica, identificadas como RT15,
RT32, RT35 y RN51 y RBT. Como controles positivos se utilizaron las cepas de colección 4L1
y HD133. Se inoculó cada una de las cepas en 10 mL de caldo nutritivo y se incubaron a
28°C en agitación. A las 48 h se tomó una alícuota, con la que se realizó un frotis y posterior tinción de Gram, observando la morfología de cada una de las cepas en estudio.
Para la extracción de los cristales, a partir de un cultivo puro de las cepas de estudio se tomaron asadas y se inocularon en 50 mL de caldo triptosa fosfato (CTP). Se colocaron en agitación durante 18 h a 200 rpm a 30°C. Pasado este tiempo se tomó 1 mL y se
inoculó en 100 mL de medio a base de melaza. Se monitorearon los cultivos hasta el tercer día hasta apreciar alrededor de un 80% de esporulación. Después, el cultivo fue centrifugado a 10000 rpm por 30 min. Se tomó y pesó la biomasa obtenida, la cual fue tratada con lactosa al 5% y acetona durante 30 min en agitación. Se lavó el filtrado a través
de filtros de papel Whatman # 1 con acetona, repitiendo este paso tres veces. El producto se dejó secar y fue macerado con un mortero hasta obtener un polvo fino.
Para la determinación del peso de las proteínas cry se cultivaron las bacterias en caldo nutritivo en agitación constante (200 rpm) a 28ºC durante 72 h. Posteriormente, la biomasa fue separada por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min.
SALUDLATINA
037
El proceso se repitió dos veces y finalmente la pastilla colectada se resuspendió en 5
mL de agua destilada. A través de un sistema bifásico de Polietilenglicol y buffer amortiguador de fosfato 2 M, se recuperó un anillo intermedio rico en cristales. Este proceso
de agitación vigorosa, centrifugado a 3000 rpm durante 2 min y lavados con agua destilada se repitió de 3 a 4 veces. Al final se recobró el anillo con una pipeta Pasteur y se observó al microscopio de contraste de fase para corroborar la purificación de los cristales.
De los cristales se tomó una alicuota de 200 mg/mL a la que se le agregaron
volúmenes iguales de DTT y β mercaptoetanol. Se colocó a 100°C por 5 min para desnaturalizar las proteínas y se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
PAGE al 10% (Tabla 1) para observar el tamaño de las proteínas. Esta corrida se realizó
a 60 V durante 1 h hasta observar el frente de corrida. Luego se incrementó el voltaje a
100 V por aproximadamente 3 h o hasta que el frente de corrida desapareciera del gel.
Para determinar la solubilidad de los cristales, se tomaron 15 de los cristales
que habían sido previamente purificados por el método bifásico y se mezclaron con
15 mL de buffer (50 mmol/L de CAPS y 10 mmol/L de EDTA). Se incubaron por 2 h a
37°C a diferentes pH que oscilaron desde 8.5 hasta 12.5. Pasado el tiempo, se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min. Se recuperó el sobrenadante y se midió la longitud de onda a 596 nm en un espectrofotómetro utilizando el método de Bradford.
Los cristales solubilizados se sometieron a un tratamiento con tripsina
durante 2 h a 37°C. Luego se corrieron en una electroforesis SDS PAGE al
10% con las características antes descritas y se observó el patrón de bandas.
La detección de los genes cry 1, 2 y 9 se realizó a partir de los cultivos bacterianos crecidos en caldo nutritivo. Para la extracción de ADN se lisaron las células con lisozima y posteriormente, se aplicó el método de extracción por octanol-cloroformo. Luego, se procedió
realizar una electroforesis en gel de agarosa al 1% para corroborar la extracción. Una vez
constatado la integridad del ADN extraído se procedió a realizar la amplificación mediante la técnica de PCR del ADN extraído de las distintas cepas de Bacilus thuringiensis usando cebadores específicos para los genes cry1, cry2 y cry9.
Los ensayos biológicos se realizaron sobre dos especies de insectos lepidópteros: Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua. Ambas plagas de interés agrícola a nivel mundial. Estos insectos fueron criados a partir del pie de cría ya existente en el Insectario del Laboratorio
de Biotecnología Ambiental. Los adultos se depositaron en recipientes forrados con bolsas
de polietileno que servirían de soporte para que las hembras ovopositaran. Todo el proceso
de cría se realizó con dietas suplementadas y debidamente preparadas en el laboratorio.
SALUDLATINA
038
Para la realización de los bioensayos se utilizaron larvas neonatas de 1 a 2 días de nacidas
tanto de S. frugiperda como de S. exigua, donde el extracto obtenido de las cepas de B. thuringiensis se mezcló con la dieta antes descrita en concentraciones de 50 y 500 μg. Los bioensayos
se realizaron con cada cepa por triplicado con muestras de 25 individuos cada uno para ambas
concentraciones. Se realizaron dos controles negativos de 50 individuos donde se colocaba solamente la dieta sin el extracto. A la semana se observó y cuantificó la cantidad de larvas muertas.
RESULTADOS Y DISCUSION
Análisis de los pesos moleculares de las toxinas cry :
Del análisis de determinación de los tamaños proteicos se encontraron proteínas purificadas de las cepas de B. thuringiensis con un peso que oscilaban entre 46-140 kDa, Figura 1. En dependencia de la cepa estudiada se pudo observar
una variación con respecto a la cantidad de bandas presentes en cada una de ellas.
Figura 1. Carril 1. Marcador masas, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32, carril 5.
RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15, carril 8. RBT.
SALUDLATINA
039
Determinación de la solubilidad :
En el caso del porcentaje de solubilidad de los cristales proteicos, no hubo una marcada diferencia ya que todas las cepas mostraron
una solubilidad total en un rango de pH alrededor de 11.5 a 12. (Figura 2)
Figura 2. Solubilidad (%) de cristales de las cepas nativas, como de referencia,
expuestas a pH alcalino.
Perfil Molecular: cry 1, cry 2 y cry 9:
Los resultados obtenidos de las amplificaciones por PCR mostraron que los genes para
cry 1 estaban presentes solo en la cepa RBT, lo cual también pudo observarse para las cepas de
referencias 4L1 y HD133. Además, en la cepa RT15 se constató una débil presencia de este gen
(Figura 3). Para corroborar esto se re-amplificó una banda con las características de cry 1, pero
como producto se obtuvieron varias bandas de menores pesos moleculares, antes no vistas,
lo que nos indicó una amplificación inespecífica. Estos resultados no fueron concluyentes.
De la amplificación realizada para determinar la presencia del gen de cry 2 se pudo
observar que estaba presente en todas las cepas, excepto en la cepa RT 32 (Figura 4).
La amplificación para cry 9 reveló que la cepa de referencia HD133 y la cepa RBT poseen dicho gen, siendo éste el menos frecuente en las cepas estudiadas (Figura 5).
SALUDLATINA
040
Figura 3. Carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril
4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35,
carril 7. RT15, RBT.
Figura 4. Carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril
4. RT32, carril 5. RN51, carril 6. RT35,
carril 7. RT15, RBT.
Figura 5. Carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2. 4L1, carril 3. HD133, carril 4. RT32,
carril 5. RN51, carril 6. RT35, carril 7. RT15,
RBT
Bioensayos:
En los bioensayos se observó la cantidad de larvas muertas al cabo de una semana. De las cepas estudiadas la cepa que mostró una mayor actividad insecticida frente
a S. exigua fue la cepa RBT donde la mortalidad fue de 93% para la concentración mayor y 88% para la menor. Estos resultados son comparables a los mostrados por la cepa
de referencia HD133, donde la mortalidad a una concentración de 500 μg/mL fue de
un 97.3 % y 81.3% a una concentración de 50 μg/mL. (Figura 6). La cepa RT 32 manifestó
cierta actividad, lo mismo que la cepa de referencia 4L1, aunque esta actividad insecticida fue menor. La actividad más baja la manifestaron las cepas RT15, RN51 y RT 35.
Figura 6
SALUDLATINA
041
Por otro lado, los resultados variaron significativamente para S. frugiperda. (Figura 7). Aunque estos dos lepidópteros están emparentados, la mayoría de las cepas revelaron poca efectividad al obtenerse valores de mortalidad muy por debajo de los obtenidos para S. exigua. Las cepas RT15 y RN51 no causaron mortalidad, comparados con
las cepas de referencia 4L1 y HD133 con resultados mucho más favorables. Solo de las
cepas estudiadas, RBT mostró resultados con cierta actividad insecticida importante.
Figura 7
CONCLUSIONES
1.
Aunque ambas especies de lepidópteros están filogenéticamente muy emparentadas los resultados con respecto a la toxicidad frente a las cepas varió de
forma considerable, siendo S. frugiperda mucho más resistente que S. exigua.
do
2.
La cepa con mayor
esta también la única
actividad insecticida fue la cepa
que poseía los 3 genes cry
RBT, sienestudiados.
3. La solubilidad de todos los cristales purificados de las diferentes cepas osciló en un ran-
go de pH entre 11.5 a 12. Al no existir diferencias de solubilidad importantes se puede descartar que este sea uno de los factores en la variación de la toxicidad entre la misma especie.
4.
La digestión con tripsina mostró la fragmentación de las proteínas la cual es necesaria para la activación de las toxinas. Todos los cristales estudiados fueron susceptibles a la acción de las proteasas.
SALUDLATINA
042
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SALUDLATINA
043
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SALUDLATINA
BIOTECNOLOGÍA
044
“Construcción de un baculovirus
recombinante con el gen CCV1 del
polidnavirus de Cotesia congregata”
AUTORES:
Stephany Young Yusty1, Miguel A. Pérez Rodríguez2,
Erick de Luna Santillana2, Mario A. Rodríguez Pérez2
1
Universidad Latina de Panamá, 2Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología
Genómica, Tamaulipas, México.
SALUDLATINA
045
LOS POLIDNAVIRUS (PDVS)
Se encuentran en las avispas endoparasitoides que,las cuales los inyectan en el cuerpo
de larvas hospederas durante la ovoposición. Un producto génico del PDV de la avispa
endoparasitoide Cotesia congregata, es la proteína CcV1.
RESUMEN
La utilización de los baculovirus como bioinsecticidas se ve favorecida con la inserción de genes
foráneos en el genoma, incrementando con ello su patogenicidad y virulencia. Estos genes usualmente codifican para proteínas que interfieren con el metabolismo y metamorfosis de los insectos, tales como toxinas
y enzimas. Una alternativa es la introducción de genes
con efectos inmunosupresores, como los codificados
en los genomas de los polidnavirus. Los polidnavirus
(PDVs) están en las avispas endoparasitoides, que inyectan en el cuerpo de larvas hospederas durante el
depósito de los huevos de las avispas. Un producto
génico del PDV de la avispa endoparasitoide Cotesia congregata, es la proteína CcV1. La CcV1 inhibe
la función de los hemocitos de las larvas durante la
parasitosis, mediante su interacción con la hemolina,
la cual es a su vez una proteína del sistema inmune
de la larva. Como parte de este trabajo, el ADNc del
gen CcV1 del PDV de C. congregata fue insertado en
el genoma del baculovirus de Autographa californica
(AcMNPV). Para este fin, se construyeron dos vectores
de transferencia en los que se insertó el gen CcV1, uno
bajo el promotor de la proteína p10 (denominado
pAcUW21-V1) y otro bajo el promotor de la proteína
polihedrina (denominado pVL1392-V1). La cotransfección se llevó a cabo en células de Spodoptera frugiperda (línea celular Sf9), utilizando el ADN linearizado del
AcMNPV y los mencionados vectores recombinantes.
Los nuevos virus recombinantes fueron denominados Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1, respectivamente. Las
células Sf9 infectadas con estos virus mostraron cambios morfológicos como la pérdida de adherencia, el
aumento en el tamaño celular, la lisis celular y en algunos casos, la presencia de cuerpos de oclusión en
su interior. El potencial de estos baculovirus está por
ser determinado mediante bioensayos con larvas de
diferentes estadios de Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Eureoma loftini, entre
otras especies. Estas especies de insectos son considerados plagas de gran importancia agrícola, ya que
ocasionan enormes pérdidas económicas anualmente.
ABSTRACT
The use of baculoviruses as biological insecticides is enhanced with the insertion of
foreign genes in its genome, and it increases their
pathogenicity and virulence. Such genes usuall
y encode proteins that interfere with the metabolism and metamorphosis of insects, such as
toxins and enzymes. An alternative is the introduction of genes with immunosuppressive effects, such as those encoded in the genomes of
polidnavirus. The polidnavirus (PDVs) are in the endoparasitoid wasps, which are injected into the host
larvae during oviposition. The CcV1 protein, a gene
product of the PDV endoparasitoid wasp Cotesia congregata, is associated with inhibition of the
function of the hemocytes during larval parasitism, through its interaction with the hemolin, a
protein of the larvae immune system. In the present study, the CcV1 gene product of the PDV of the
parasitic wasp C. congregata was cloned into the
genome of the Autographa californica baculovirus
(AcMNPV). For this purpose two transfer vectors with the CcV1 gene were constructed, one
under control of p10 protein promoter (named
pAcUW21-V1) and polyhedrin protein promoter
(named pVL1392-V1). Cotransfection was carried out
on cells of Spodoptera frugiperda (Sf9 cell line) using
linearized AcMNPV DNA and the recombinant vectors afore mentioned. The new recombinant viruses
were named Ab-pp10-V1 and Ac-pPolh-V1, respectively. The Sf9 cells infected with these viruses showed
morphological changes including loss of adhesion,
increased cell size, lysis, and in some cases, the presence of occlusion bodies. The potential of these baculovirus will be determined by bioassays with different stages of insect´s larvae such as Spodoptera
frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis,
Eureoma loftini, and others. These insect species are
considered important agricultural pests because
they are causing great economical losses every year.
SALUDLATINA
046
INTRODUCCION
La elevada cantidad de plagas que amenazan con reducir la producción agrícola, la
baja disponibilidad de insecticidas químicos efectivos y la contaminación del medio ambiente han contribuido a la implementación de programas de control biológico mediante
el uso de bioinsecticidas (Inceoglu et al., 2001). Con respecto a esto, los baculovirus representan una buena alternativa como agentes de control de insectos. Uno de los atributos más importantes de este agente es que presentan especificidad de hospedero, característica que hace que tengan la propiedad de infectar un número limitado de especies,
siendo ésta la principal bondad, al no ejercer acción tóxica contra insectos benéficos.
Sin embargo, los baculovirus silvestres presentan la desventaja de poseer una baja
velocidad para matar a sus hospederos. Es por esto, que se utilizan numerosas técnicas de ingeniería genética para incrementar su patogenicidad, mediante la incorporación de genes exógenos, los cuales codifican para toxinas u enzimas que potencian su
acción (Harrison y Bonning, 2001). Actualmente, no se tienen reportes de la construcción de baculovirus recombinantes con el gen CcV1 del polidnavirus de Cotesia congregata para su uso como bioinsecticida. Esta construcción podría potenciar la eficacia y virulencia del baculovirus silvestre, ofreciendo una posibilidad de mejora en los
programas de control biológico. En este trabajo , nos propusimos como objetivos construir un baculovirus recombinante de Autographa californica (AcMNPV) que contenga el gen CcV1 del PDV de Cotesia congregata y evaluar su utilidad como bioinsecticida. Para ello, se desarrollaron dos vectores recombinantes de transferencia específicos
para baculovirus y dos baculovirus recombinantes de Autographa californica (AcMNPV)
con el gen CcV1 y se evaluó el efecto in vitro de los baculovirus sobre la línea celular Sf9.
MATERIALES Y METODOS
Confirmación de la Identidad del gen CcV1 :
El ADNc del gen CcV1 de Cotesia congregata se obtuvo de un clon recombinante construido en el vector pBluescriptK (Instituto de Biología del Centro Nacional de Investigación
Científica en Demokritos en Atenas, Grecia y el Institut de Recherche sur la Biologie de Insecte,
CNRS, Francia). El plasmido recombinante fue propagado en células de Escherichia coli incubadas durante 24 h a 37°C y con agitación a 150 rpm en LB líquido suplementado con ampicilina (10 mg/mL). La extracción de ADN plasmídico se realizó mediante una mini-preparación
por lisis alcalina. Los oligonucleótidos denominados CcV1-B y CcV2-SK fueron utilizados en
la amplificación de dicho gen bajo condiciones de PCR (MJ Research®). La secuenciación del
gen CcV1 se realizó en un secuenciador semiautomático Li-Cor® DNA Analyzer siguiendo el
protocolo del estuche comercial Sequi Therm Excel II Sequencing (Figura 1).
SALUDLATINA
047
Figura 1.Oligonucleótidos para amplificación del gen CcV1 agregando los sitios de
restricción BglII, SphI y KpnI.
Vectores de Transferencia Recombinantes pAcUW21-V1 y pVL1392-V1 :
Para este fin se construyeron dos vectores de transferencia en los que se insertó el gen CcV1, uno bajo el promotor de la proteína p10 (denominado pAcUW21V1) y otro bajo el promotor de la proteína polihedrina (denominado pVL1392-V1).
La ligación de estos fragmentos utilizó una proporción aproximada inserto/vector de 1:3, por lo que se usaron 50 ng de ADN del inserto y 150 ng de ADN del vector.
La ligación resultante fue utilizada para transformar células calcio competentes de E.
coli.
Purificación de los Vectores de Transferencia pAcUW21-V1 y pVL1392-V1 :
Los vectores recombinantes se obtuvieron por mini-preparación de ADN plasmídico. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1.0% y el producto fue visualizado. Las bandas de los plásmidos se cortaron, y se colocaron en una columna de purificación de ADN (AMBION®- Catálogo No#AM10065) para su elución. Se
centrifugó a 13000 rpm durante 5 min. El producto resultante se filtró a 45 μm (Phenomenex®). El ADN resultante fue utilizado para llevar a cabo las co-trasfecciones.
Cultivo de la Línea Celular Sf9 de Spodoptera frugiperda :
Se utilizaron células Sf9 de Spodoptera frugiperda (Orbigen®) a una concen-tración
inicial de 1x107 UFC/mL de cultivo celular de insectos TNM-FH. Se depositaron en viales y se esperó que se adhirieran a la superficie. Se descartó el medio, se adicionaron 15 mL de TNM-FH y se incubó a 27˚C. La incubación continuó hasta que la monocapa de células alcanzó del 80-90% de confluencia. Posteriormente, los cultivos
celulares fueron traspasados antes de alcanzar una densidad de 2 x106 UFC/mL diluyéndolas a una densidad de 1x106 UFC/mL. Las células fueron conservadas a -70º C.
SALUDLATINA
048
Co-transfección mediada por calcio en Células Sf9 :
La co-transfección se llevó a cabo en células de Spodoptera frugiperda (línea
celular Sf9), utilizando ADN linearizado de AcMNPV y los vectores recombinantes
construidos. Los nuevos virus recombinantes fueron denominados Ac-pP10-V1 y
Ac-pPolh-V1, respectivamente. Como control positivo de este experimento se usó
un vector de transferencia pVL1392-xyle provisto por el fabricante y como control
negativo no se usó ningún vector de transferencia. El virus generado de la co-transfección usando el vector pVL1392-V1 se denominó Ac-pPolh-V1. Por otra parte, el
virus generado de la co-transfección utilizando el vector pAcUW21-V1 se denominó
Ac-pP10-V1.
Extracción de ADN del sobrenadante infectivo fue realizado para confirmación de identidad de los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1.
Extracción de ADN de Sobrenadantes Infectivos para Confirmación de Identidad
de los Virus Recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 :
Los sobrenadantes de las células SF9 infectadas del quinto pase, fueron utilizados para la extracción de ADN genómico. Para este fin fue utilizado el kit comercial
Wizard® Genomic DNA Purification de la casa comercial Promega®.
Amplificación por PCR del gen CcV1 para Confirmación de Identidad de los Virus
Recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 :
El ADN previamente extraído de los sobrenadantes infecciosos fue utilizado para
corroborar la identidad de los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1. Se
efectuó una amplificación por PCR del gen CcV1 en un termociclador MJ Research®.
Cuantificación de los Títulos Virales :
Para llevar a cabo la cuantificación de los títulos virales fueron enfrentadas 2x106 UFC
con diluciones seriadas de los stocks virales comenzando en 10-1 hasta 10-10, excepto en el
caso del control negativo. Los tratamientos fueron incubados a 27˚C, y posteriormente se
revisaron las células en busca de signos de infección a los 5 días en un microscopio invertido.
RESULTADOS Y DISCUSION
Después de amplificado y secuenciado el inserto procedente del plásmido pBluescriptKS-CcV1, se alineó mediante el programa BLAST (National Center for Biotechnology Information (NCBI)). Los resultados indicaron correspondencia a la secuencia del décimo tercer círculo del genoma del CcBV, con identidad máxima del 100%.
Estos resultados coinciden con Espagne et al. (2004) quien había caracterizado previamente la secuencia del gen CcV1. Por otra parte, en el alineamiento uno
a uno efectuado mediante el programa EMBOSS del European Bioinformatics
Institute (EMBL-EBI) entre la secuencia obtenida contra la generada por el programa BLAST, se obtuvo una identidad y similitud del 99.8% entre las secuencias.
SALUDLATINA
049
Los resultados obtenidos a través de ambos programas nos permitieron
corroborar mediante los alineamientos entre secuencias, la identidad del inserto como el
ADNc del gen CcV1 de C. congregata.
Se elaboraron dos vectores de transferencia recombinantes con el gen CcV1
a partir de los vectores pVL1392 y pAcUW21. Para el primer vector el gen CcV1 fue
insertado entre los sitios KpnI-Bglll bajo el promotor de la proteína polihedrina, y se
le otorgó el nombre de pVL1392-V1. Para el segundo vector pAcUW21 el gen CcV1
fue insertado entre los sitios Sphl-Bglll bajo el promotor de la proteína p10, y se le
otorgó el nombre de pAcUW21-V1. La correcta construcción e inserción de este gen
fue verificado por medio de una digestión con las enzimas de restricción correspondientes a los sitios donde fue insertado el gen (Figura 2). El gen CcV1 en los recombinantes pudo ser identificado en base a la banda de 1.4kb, la cual corresponde al gen.
Figura 2. Patrones de restricción de los vectores de transferencia recombinantes. Marcador de 1 Kb de Promega
en carril A. Vector pGem+CcV1 en carriles B y E. Vectores nativos pAcUW21 y pVL1392 en carriles C y F. Vectores
recombinantes en Carriles D y G.
Existen diferencias marcadas entre los vectores de transferencia construidos. Se ha
demostrado que el gen de polihedrina y el de la proteína p10 no son eseciales para llevar
a cabo la replicación, y el ciclo infeccioso de los baculovirus, por lo que pueden ser remplazados con genes foráneos de interés (Smith et al., 1983; Belyaevl y Roy, 1993).
La deleción o sustitución del gen de la polihedrina da como resultado virus negativos
a polihedrina (Inceoglu et al., 2001). Por su parte, el gen de la proteína p10 es el responsable de la síntesis de una proteína no estructural (Belyaevl y Roy, 1993), cuya sustitución
o deleción da como resultado baculovirus negativos a la proteína p10, pero capaces de
completar su ciclo.
La recombinación homóloga entre cada uno de los vectores recombinantes
construidos, y el ADN viral linearizado de AcNPV permitió la recircularización del
mismo, agregando además el gen CcV1 al genoma de los nuevos virus recombinantes
en la locación donde se insertó en el vector. El virus generado de la co-transfección
usando el vector pVL1392-V1 se denominó Ac-pPolh-V1. Por otra parte, el virus generado de la co-transfección utilizando el vector pAcUW21-V1 se denominó Ac-pP10-V1.
El cultivo de la línea celular Sf9 de S. frugiperda fue establecido de manera exitosa. Los
cultivos celulares alcanzaron la confluencia aproximada del 80%-90% en un período promedio de 6 días (Figura 3).
SALUDLATINA
050
Figura 3. Línea celular SF9 en confluencia.
Al llevar a cabo la co-transfección mediada por calcio en células Sf9, los cultivos celulares desarrollaron signos de infección visibles. Esto produjo diferencias en
cuanto a la morfología de cada cultivo celular infectado con un virus recombinante específico, con respecto al control negativo y positivo posterior a los 4 días post-infección (Figura
4). En el control negativo de la co-transfección, se observaron células que conservaban su
capacidad de adherencia y crecían en monocapa, lo cual es característico de células sanas
libres de infección. En el caso de las células infectadas con el virus Ac-pPolh-V1, se observó
pérdida de adherencia celular, aglomeración e hinchamiento de las células, y pérdida de la
capacidad de reproducción celular. En las células infectadas con el virus Ac-pP10-V1, la morfología celular posterior a la co-transfección es similar a la presente en las células infectadas
con el AcMNPV tipo silvestre. En este caso, se observaron células muy hinchadas, pérdida de
la adherencia y capacidad de reproducción, y presencia de cuerpos de oclusión en el interior
de las células. Sharon et al., (1998), investigaron el efecto de la infección por baculovirus en
el ciclo de vida de las células Sf9.
Figura 4. Células Sf9 inoculadas con A) Control negativo, B) Ac-pPolh-CcV1, C) Ac-pP10-CcV1, D)
AcMNPV Silvestre.
SALUDLATINA
051
Los investigadores demostraron que la infección detiene el crecimiento del 84% de
las células en las fases G2/M de 18 a 24 horas posterior a la infección. Yanase, et al., en
1998 documentaron los cambios morfológicos como hincha-miento e incremento del
volumen nuclear que ocurren en células Se301 derivada de S. exigua 72 horas con un
baculovirus recombinante.
En el caso del Ac-pP10-V1, fue posible observar cuerpos de oclusión en el
interior de las células infectadas, debido a que el vector pAcUW21 con que fue
construido el virus, poseía el gen de polihedrina. Por otra parte, el vector pVL1392
con el cual fue construido el virus Ac-pPolh-V1 no contenía el gen de polihedrina,
por lo que no se pudieron observar los cuerpos de oclusión en el interior de las
células.
La presencia de fragmentos de aproximadamente 1400 pb fue evidenciado en los
virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1. No se observó amplificación del gen en
el virus tipo silvestre, ni en el control negativo (Figura 5). El fragmento correspondiente
a 1400 pb es indicativo de que los virus son recombinantes, ya que a su genoma les fue
integrado el gen CcV1 de C. congregata.
Figura 5. Productos de PCR de la amplificación del gen CcV1 en ADN genómico de células Sf9. En carril A, marcador de 1 kb; En B y C, virus
Ac-pP10-V1; En D y E, virus Ac-pPolh-V1; En F, el vector.pGem-CcV1 (Control) y en el G, ADN genómico de células Sf9 sin infectar (Control
negativo).
Los títulos virales para los virus recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 resultaron en el orden de 1x103 UFP/mL y 1x106 UFP/mL, respectivamente al cabo
de los cinco días post-infección. Títulos virales por debajo del orden de 1x106 UFP/
mL se consideran bajos, por lo que se tendría que elevar los títulos del Ac-pP10V1, previo a su uso en bioensayos. Por otro lado, para el virus AcMNPV silvestre
(control positivo) se detectaron títulos por encima de 1010 UFP/mL, mientras que
no se encontraron signos de infección en las células Sf9 utilizadas como control
negativo.
SALUDLATINA
052
CONCLUSIONES
1- Se construyeron de forma exitosa dos baculovirus recombinantes de AcMNPV con el
gen inmunosupresor CcV1 de Cotesia congregata, utilizando dos vectores de transferencia
específicos para baculovirus.
2-
Los virus construidos denominados Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 produjeron
alteraciones morfológicas en la línea celular Sf9, indicándonos que el genoma viral
pudo recircularizarse y ser infectivo.
3-
Las alteraciones morfológicas ocasionadas en las células Sf9 por lo virus
recombinantes Ac-pP10-V1 y Ac-pPolh-V1 presentaron diferencias marcadas. En el
caso del Ac-pP10-V1, fue posible observar cuerpos de oclusión en el interior de las
células infectadas, mientras que con el Ac-pPolh-V1 sólo se produjeron alteraciones
en la morfología celular.
4-
La construcción de baculovirus recombinantes negativos a polihedrina para
su uso como bioinsecticida es viable, debido a que siguen siendo capaces de infectar y matar larvas.
RECOMENDACIONES
1-
Llevar a cabo bioensayos con los nuevos virus recombinantes, exponiendo
diferentes especies de insectos plaga y benéficos (como especie no blanco), en
diversos estadios de desarrollo.
2-
Realizar nuevas construcciones de baculovirus con otros genes de polidnavirus con efectos inmunosupresores.
3-
Estudiar las propiedades y dilucidar la estructura de la proteína CcV1 de Cotesia
congregata.
4- Evaluar el uso de abrillantadores o bien de agentes de co-oclusión con baculovirus
tipo silvestre como nuevos formulados, para evitar el daño por agentes ambientales a los
baculovirus recombinantes generados. Principalmente, a los que son negativos a polihedrina.
SALUDLATINA
053
BIBLIOGRAFÍA
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SALUDLATINA
BIOTECNOLOGÍA
054
“Estudio de la variabilidad genética de Leishmania panamensis
mediante marcadores moleculares generados vía AFLP”
AUTORES:
Johanna G. Juliao Amaya1, Ricardo Lleonart C.2
Universidad Latina de Panamá, 2INDICASAT AIP.
1
SALUDLATINA
055
Leishmania panamensis
Protozoos flagelados del género Leishmania capaces de producir diversas
manifestaciones como lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales.
RESUMEN
La Leishmaniasis es una enfermedad parasitaria mortal, cuyos causantes son protozoos
flagelados del género Leishmania capaces de producir diversas manifestaciones como lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales. Esta enfermedad actualmente se encuentra en Latinoamérica
y en nuestro país, donde se ha identificado la presencia de especies como Leishmania panamensis, ampliamente distribuida en el territorio y de la cual no existen
estudios realizados anteriormente. En este trabajo, se
realizó la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis, especies genéticamente similares. Para llevar
a cabo la identificación y tipificación de las cepas, se
utilizaron técnicas moleculares como PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) y el posterior análisis de la
longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del
producto amplificado para distinguirlas. Finalmente
,se realizó la detección de polimorfismos en el ADN de
las especies, a través de la técnica de PCR-RFLP para
la caracterización y tipificación de cepas de L. panamensis y L. guyanensis. Como resultados se obtuvo
que el uso de la técnica PCR-RFLP del gen hsp70 con la
enzima de restricción BccI, permitió la diferenciación
entre las cepas de L. panamensis y L. guyanensis. Se
recomienda continuar hasta la etapa final de desarrollo de estos marcadores en Leishmania panamensis
ensayando combinaciones de cebadores a partir de
los ya escogidos para obtener resultados más precisos.
También es importante probar las combinaciones de
cebadores en más aislados de Leishmania panamensis
y guyanensis.
ABSTRACT
Leishmaniasis is a deadly parasitic disease, whose
causes are flagellate protozoa of the genus Leishmania and can produce various manifestations such as
cutaneous, mucocutaneous, and visceral. This is a
current disease in Latin America, and in our country
it has been identified the presence of species such as
Leishmania panamensis, widely distributed in the territory and from which there are no previous studies.
In this paper, we made the identification and typing
of references strains of Leishmania panamensis and
Leishmania guyanensis, which are genetically similar species. To carry out the identification
and typing of strains, we used molecular techniques such as PCR reaction (Polymerase chain
reaction) and subsequent analysis of fragment length (RFLP) to distinguish the amplified
product. Finally, we detected polymorphisms
in DNA of the species, by PCR-RFLP for the
characterization and classification of strains of
L. panamensis and L. guyanensis. The results
showed that using the PCR-RFLP technique of the
hsp70 gene with the restriction enzyme BccI, allowed
differentiation between strains of L. panamensis and
L. guyanensis. We recommend to continue the process
until the final stage of development of these markers in
Leishmania panamensis tested combinations of
primers from those already selected for more accurate results. It is also important to test combinations
of primers isolated from both Leishmania species.
SALUDLATINA
056
INTRODUCCION
La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria mortal, producida por protozoos flagelados del género Leishmania capaces de producir diversas manifestaciones clínicas como
lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales. Esta enfermedad parasitaria actualmente
se encuentra en Latinoamérica y en nuestro país, donde se ha identificado la presencia de
Leishmania panamensis, ampliamente distribuida en el territorio. Es una enfermedad reemergente en Panamá, clasificada de importancia I por la Organización Mundial de la Salud
(OMS). Actualmente su situación epidemiológica empeora, con una incidencia de infección
creciente, donde en los últimos años se ha llegado a diagnosticar hasta 3,000 casos anuales.
Durante años, la leishmaniasis estuvo confinada a las regiones selváticas y
rurales, pero debido al crecimiento de la ciudad y la invasión de áreas boscosas se ha
convertido en una amenaza para quienes entran en contacto con los vectores que la
transmiten. Por ello se ha observado una tendencia al incremento de casos en zonas
más cercanas a los centros urbanos (correlacionado con el incremento en la urbanización de estas áreas rurales).
Los estudios genéticos del parásito son de gran importancia para entender su
evolución, ya que este conocimiento es esencial para impulsar los estudios epidemiológicos de la enfermedad para desarrollar mejores métodos diagnósticos, así
como sistemas de control y evaluaciones de posibles candidatos vacunales.
En este estudio se realizó la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis, ya que ambas especies son genéticamente similares.
MATERIALES Y METODOS
Para el estudio se cultivaron cepas de Leishmania panamensis, las que fueron descongeladas y cultivadas en medio Schneider, el cual asemeja la hemolinfa del vector. Se incubaron
a 25ºC para el cultivo óptimo de los promastigotes.
Posteriormente, se realizó la extracción de ADN genómico de los parásitos cultivados
mediante el protocolo del Kit Wizard Genomic DNA purification (Promega). La electroforesis de ADN genómico se hizo para verificar el contenido de ADN de las muestras, en una
concentración que no sobrepasara los 400 ng/μL, y después se sometieron las muestras de
ADN genómico a una digestión con la enzima EcoRI. El marcador de peso molecular usado
fue el Lambda HindIII, que posee una banda de 2.3 kb lo cual ayudó a comparar con el ADN
genómico obtenido de Leishmania. Las muestras se corrieron durante 45 min a 110 V.
Para la amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico
Hsp 70 se realizó una PCR-Hsp 70, donde los cebadores utilizados amplificaban una
región de 1,3 kp del gen, que permitía la caracterización entre especies de Leishmania.
SALUDLATINA
057
Los cebadores fueron Hsp 70 sense (5’ GACGGTGCCTGCCTACTTCAA 3’) y Hsp
70 antisense (5’ CCGCCCATGCTCTGGTACATC 3’) (SIGMA Genosys, Inglaterra). Las
condiciones de PCR para un volumen final de reacción de 50 μL fueron 2 μL de
Primer mix (20pmol de cada primer), 25 μL de PCR Master Mix 1x (PROMEGA, WI,
USA), 22 μL de agua ultra pura calidad de cultivo y 1μL de ADN. Los ciclos térmicos
se realizaron en un termociclador GeneAmpThermoCycler 2700 (AppliedBiosystems).
Para la purificación del producto de PCR-Hsp 70, se usó acetato de sodio (NaAc) 2M y
etanol absoluto. También se realizó directamente la purificación mediante el Kit Wizard SV
Gel y PCR clean-up System, para lo que se resuspendió el ADN en 50 μL de agua libre de nucleasas. La verificación del producto purificado se realizó mediante una electroforesis utilizando un marcador de 100 pb para descartar la pérdida de ADN en el proceso de purificación.
Para identificar y tipificar entre especies de Leishmanias se realizó una digestión enzimática del producto amplificado con Hae III, la cual permitía identificar las especies de Leishmania pertenecientes al complejo Leishmania
guyanensis (Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis). La otra digestión fue con Bcc I. Esta enzima discrimina según su patrón de bandas, entre las especies Leishmania panamensis y Leishmania guyanensis. La digestión se
realizó en un volumen final de 31 μl, con 20 μl del amplicón, usando 1U de HaeIII (MBI Fermentas, StLeon-Rot, Germany) o 1U de BccI (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA, USA), 100 μg/mL de BSA. Las reacciones se incubaron a 37ºC de 3 a 4 h.
Para evidenciar la identificación y caracterización de las especies de
Leishmania del complejo guyanensis (L. panamensis y L. guyanensis) se realizó un análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado (RFLP). El análisis se hizo con un gel de agarosa al 2%, corriendo
a 110 V por 1.5 h. Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (AMRESCO).
Además, para detectar los polimorfismos en el ADN de Leishmania se ensayó
un AFLP, donde se usaron varias combinaciones de cebadores selectivos buscando cuales permitirían un número alto de bandas polimórficas en el rango útil de
separación para el sistema de electroforesis capilar utilizado (50 a 500 pares de
bases y más de 100 unidades de fluorescencia). Para la inyección de cada muestra se
preparó 0.5 μl del marcador de talla GeneScan ROX 500, 1μl del producto de amplificación selectiva y 20 μl de formamida (Applied Biosystems, USA). Las primeras muestras se analizaron mediante electroforesis capilar en un secuenciador Genetic Analyzer ABI 3130 de cuatro capilares (Applied Biosystems, USA). Las siguientes se analizaron
en el secuenciador del Smithsonian Genetic Analyzer ABI 3130 xl de 16 capilares
(Applied Biosystems, USA). Los resultados de las corridas se procesaron con el programa
GeneMapper v4.1 (Applied Biosystems, USA) y GeneMarker v1.95 (SoftGenetics, LLC).
SALUDLATINA
058
RESULTADOS Y DISCUSION
Para la etapa de identificación y caracterización de las muestras del complejo L. guyanensis es imprescindible obtener una cantidad satisfactoria de ADN (luego de la extracción del mismo). Por ello se realizó la primera electroforesis. La figura 1 muestra diferentes concentraciones de ADN de seis muestras de L. panamensis.
Figura 1. Resultado típico de electroforesis de ADN genómico para verificar concentración, talla molecular e integridad del ADN de las muestras. El marcador de peso molecular usado es ADN de fago Lambda digerido con HindIII.
El proceso de purificación que se realiza luego de la amplificación del
gen hsp70 es indispensable para eliminar los restos de impurezas que contenga la muestra. Se debe procurar no perder el ADN en este proceso. La
figura 2 muestra claramente un proceso de purificación realizado exitosamente,
en el cual se observa claramente la presencia de la banda del gen amplificado.
Figura 2. Verificación del producto purificado de hsp70 mediante electroforesis en un gel de agarosa1% para verificar la talla. El marcador utilizado es de 100pb, el cual tiene una banda de 1.5kb que nos permite comparar con la
banda del gen de 1.3kb.
SALUDLATINA
059
Al realizar la técnica de RFLP, se observó que las 22 muestras ensayadas correspondieron
tanto a la especie L. panamensis como a L. guyanensis, ya que mostraron el mismo patrón de bandas descritos por García y colaboradores. Observamos además, que ambas especies presentaron el mismo patrón de bandas con HaeIII, lo cual significa que ambas pertenecen al complejo
guyanensis. En cambio, se observaron diferentes patrones de bandas entre L. panamensis y L. guyanensis con BccI, lo que permitió diferenciar especies (Figura 3).
Figura 3. Análisis de la longitud de los fragmentos de restricción de las especies L. panamensis y L. guyanensis. MM: marcador
de peso molecular de 100pb; Líneas 1 y 2: ADN del amplicón de Hsp70 de L. panamensis; línea 3: ADN del amplicón de Hsp70
de L. guyanensis; líneas 1a, 2a y 3a, patrones de bandas con HaeIII; líneas 1b, 2b y 3b, patrones de bandas con BccI.
Finalmente el proceso de AFLP, última etapa en la que se realiza la exploración de la variabilidad genética de L. panamensis
mediante la detección
de polimorfismos en la secuencia de ADN se observa en la figura 4. En la misma se puede observar la aparición de bandas no repetitivas entre especies.
Figura 4. Ejemplo de un AFLP de fragmentos de DNA marcados con fluorescencia.
De este proceso en general se encontraron en total 209 combinaciones las que
fueron probadas mediante los tres kits mencionados. El Kit del Microbial mostró
más cantidad de picos, consecuencia de que tiene menos bases selectivas y la
complementariedad es más probable. De este mismo kit se tomaron las combinaciones que dieron más de diez picos, con lo cual se redujo a 67 combinaciones.
SALUDLATINA
060
Estas fueron ensayadas en cinco aislados de L. panamensis y L. guyanensis de referencias
para evidenciar polimorfismos y explorar comparativamente. De estas 67 combinaciones
probadas, se escogieron las combinaciones que mostraron polimorfismos y mayores picos.
(Tabla 1)
Tabla 1. Combinaciones de Cebadores de las series +0, +1, +2 que dieron altos números de picos en las especies de Leishmania ensayadas.
(1) Combinaciones de cebadores que dieron números más altos de alelos comunes para todas las L.guyanensis y L. panamensis ensayadas.
(2) Combinaciones de cebadores que dieron números más altos de alelos presentes solo en L. guyanensis, ausentes en todas las L.panamensis.
(3) Combinaciones de cebadores que dieron los números más altos de alelos comunes para todas las L. panamensis ensayadas, y ausentes en la L. guyanensis de referencia.
(4) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor número acumulativo de alelos en todas las L. panamensis ensayadas.
(5) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor número de alelos polimórficos en todas las L. panamensis ensayadas.
(6) Combinaciones de cebadores que dieron el mayor porcentaje de alelos polimórficos en todas las L. panamensis ensayadas.
También se ensayaron diferentes condiciones de ciclos de PCR para los procesos de amplificación pre-selectiva con el fin de detectar aquellos que mayores
números de picos reproducibles ofreciera. Este ensayo se realizó con un ADN control de
Escherichia coli y los cebadores fueron EcoRI +0 y MseI +C. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 2, donde se muestra que los números más altos de picos detectados se
dieron en el resultado de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con condiciones de
mayores ciclos.
Tabla 2. Número de picos detectados reproducibles en un DNA control de E. coli después de varias condiciones de ciclos. (Cebadores EcoRI+0/MseI+C).
SALUDLATINA
061
Figura 5. Electroferograma típico obtenido mediante la técnica de AFLP. A) Representa un pico polimórfico presente solo en la muestra
L. guyanensis de referencia; B) Muestra un alelo común presente solo en los aislados de L. panamensis; C) Representa un pico polimórfico presente solo
en una de las muestras de L. panamensis que corresponde a la muestra P9; D) Muestra un alelo común para ambas especies (L. guyanensis y L. panamensis).
Finalmente, se escogieron solo 13 combinaciones para seguir la exploración
de la variabilidad genética en cepas de L. panamensis. En la tabla 3 se muestran las
combinaciones finales de cebadores escogidas en base a la mayor cantidad de alelos polimórficos en L. panamensis y el porcentaje más alto de picos polimórficos.
Tabla 3. Combinaciones finales de cebadores escogidas en base a la mayor cantidad de alelos polimórficos en L.
panamensis y el porcentaje más alto de picos polimórficos.
SALUDLATINA
062
CONCLUSIONES
1. Todas las técnicas llevadas a cabo para el experimento fueron enseñadas
en forma teórica previamente durante la carrera, y éstas técnicas hoy en día nos
han proporcionado muchos conocimientos para el avance científico, ya que al ser
innovadoras constituyen una gran herramienta para llevar a cabo experimentos
como, por ejemplo, el PCR-RFLP utilizado para la caracterización y tipificación de
este estudio, ya que anteriormente solo se realizaba por electroforesis de variantes
isoenzimáticas, cariotipaje molecular y otras técnicas más laboriosas y menos precisas.
2. Utilizando la técnica PCR-RFLP del gen hsp70 con la enzima de restricción BccI, hemos podido comprobar que es una herramienta muy útil para diferenciar entre las cepas de
L. panamensis y L. guyanensis.
3. También, se ha demostrado que la técnica de AFLP resulta ser muy útil en estudios de
variabilidad genética para detectar sitios polimórficos en varios organismos. El empleo de
esta técnica también presenta ventajas importantes, entre las cuales podemos mencionar
su fácil y rápida implementación, permite un alto poder de discriminación, tiene alta reproducibilidad. No es necesario un conocimiento previo del genoma y finalmente permite la
posibilidad de convertir rápidamente marcadores AFLP a marcadores co-dominantes.
RECOMENDACIONES
1. Continuar hasta la etapa final de desarrollo de estos marcadores en Leishmania panamensis ensayando combinaciones de cebadores a partir de los ya escogidos para obtener
resultados más precisos.
2. También, es importante probar las combinaciones de cebadores en más aislados de
Leishmania panamensis y guyanensis.
ARTICULOSINVESTIGACION
063
BIBLIOGRAFÍA
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SALUDLATINA
BIOTECNOLOGÍA
064
“Análisis de expresión de un gen de trealosa -6- fosfato sintetasa en variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris)”
AUTORES: Sandra Judith Rodríguez1, Raymundo Rosas Quijano2
Universidad Latina de Panamá, 2Centro de Biotecnología Genómica-Instituto Politécnico
1
Nacional, México.
SALUDLATINA
065
Phaseolus vulgaris
es un cultivo ampliamente consumido en México y países latinoamericanos. Sin embargo,
su rendimiento es afectado por distintos factores bióticos y abióticos, dentro de los cuales
se destaca el estrés hídrico, generando pérdidas económicas importantes.
RESUMEN
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo ampliamente consumido en México y países latinoamericanos. Sin embargo, su rendimiento es afectado
por distintos factores bióticos y abióticos, dentro de los
cuales se destaca el estrés hídrico, generando pérdidas
económicas importantes. Estudios realizados en organismos eucariotas tolerantes a este tipo de estrés, demuestran la acumulación de un disacárido reductor, llamado “trealosa”, la cual está ampliamente distribuida en
muchos organismos desde bacterias, hongos, insectos y
plantas. La trealosa tiene distintas funciones biológicas,
donde se distingue su papel como osmoprotector celular en situaciones de estrés hídrico. Su síntesis en plantas
ocurre a través de la enzima trealosa -6- fosfato sintetasa
(TPS), codificada por el gen treaolosa -6- fosfato sintetasa
(Arabidopsis thaliana, gen AtTPS1). Existen reportes sobre la posible implicación de la trealosa en la tolerancia
al estrés hídrico en frijol común (P. vulgaris), sin embargo
se desconoce su verdadera función a nivel molecular en
la tolerancia a la sequia, convirtiendo a P. vulgaris en un
modelo excelente para medir la actividad transcripcional
de la trealosa, por medio de la reacción en cadena de la
polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR). Con el fin
de elucidar el papel que tiene la trealosa en esta tolerancia, se construyeron oligonucleótidos específicos a
partir de secuencias conservadas de genes TPS de otras
plantas, con lo que se amplificó RNA mensajero de un
segmento del gen de trealosa en dos variedades de frijol:
BAT 407 tolerante a la sequía y Pinto UI 104 susceptible,
sujetas a distintos tratamientos de estrés. La mayor expresión del gen de interés la observamos en el primer
muestreo el cual se realizó a los 15 días de siembra, sin
embargo como lo menciona la literatura, ésta expresión
va disminuyendo a medida que avanza el tiempo de
exposición al estrés. No se encontró diferencia en la expresión de este gen entre las variedades utilizadas.
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a grain
widely consumed in Mexico and Latin America. However,
the crop is affected by different biotic and abiotic factors
like the water stress, resulting in economical losses. Studies made in eukaryotic organisms tolerant to this type of
stress, show the accumulation of a reducing disaccharide,
called “Trehalose”, which is widely distributed in many
organisms like bacteria, fungi, insects, and plants.
The trehalose has different biological functions where its role
as osmoprotectant cellular is distinguished in water stress situations. Its
synthesis in plants occurs through the enzyme
trehalose-6-phosphate
synthase
(TPS),
encoded by the gene treaolosa -6 - phosphate synthase
(Arabidopsis thaliana gene AtTPS1). There are
reports about the possible participation of trehalose in water stress tolerance in the common bean
(P. vulgaris), but its true function is unknown at the
molecular level in tolerance to the drought, making P. vulgaris an excellent model to measure the
transcriptional activity of the trehalose, by means
of the chain reaction of the polymerase in inverse
transcription (RT-PCR). In order to elucidate the role
that trehalose has in this tolerance, specific oligonucleotides were constructed from conserved sequences of TPS genes from other plants, with which
was amplified the messenger RNA of a gene segment of trehalose in two varieties of beans : BAT
407 drought tolerant and susceptible Pinto UI 104,
subject to various stress treatments. The greatest
expression of the gene of interest was observed in
the first sampling which was performed at 15 days
after planting, however, as it was mentioned by the
literature, this expression decreases as time goes
on exposure to stress. There was no difference in
the presence of this gene among the kinds of beans
used.
SALUDLATINA
066
INTRODUCCION
El frijol común Phaseolus vulgaris es una de las leguminosas más consumidas en México
y demás países latinoamericanos (Leterme et al., 2002), ya que representa una importante
fuente de proteínas y fibra, que incluso ayudan a la prevención de ciertas enfermedades
(Granito et al., 2008). La producción de frijol en México es alta, sin embargo, este cultivo se ve
afectado por una gran variedad de factores tanto bióticos como abióticos; siendo el principal, el estrés hídrico, muy frecuente en el área de siembra (Santos et al., 2010).
Por otra parte, la trealosa es un disacárido no reductor formado por dos moléculas de glucosa; en una gran variedad de organismos, después de ser sometidos naturalmente a la deshidratación la concentración del disacárido se ve incrementada, a
tal grado, que existe una íntima relación entre la concentración de trealosa con la
tolerancia al estrés hídrico.
Hasta ahora son conocidas cinco diferentes vías de síntesis de la trealosa, sin
embargo, la que se encuentra más ampliamente distribuida en los organismos es
aquella que involucra dos reacciones químicas, catalizadas por las enzimas trealosa
6 fosfato sintetasa (TPS) y trealosa 6 fosfato fosfatasa (TPP); en la etapa inicial, una
molécula de UDP-glucosa y otra de glucosa-6-fosfato, reacción por la acción de la
TPS para formar el precursor trealosa-6-fosfato. En la segunda etapa, el grupo fosfato
es removido de la molécula precursora por la enzima TPP originando finalmente la
molécula de la trealosa. De estas enzimas, la TPS tiene regulación, por lo que llama la
atención su estudio. En la literatura se han reportado hasta 11 miembros de TPS para
plantas.
Se sugiere que aquellos organismos que presentan los genes codificantes para
las enzimas TPP y TPS, tienen la capacidad de acumular este azúcar en condiciones
de estrés, por lo tanto, presentan una mayor tolerancia al mismo. Debido al importante rol de la trealosa, propuesto en organismos tolerantes a la sequía (déficit hídrico), se hace de suma importancia determinar su presencia y comportamiento en rubros indispensables en la alimentación en países en vías de desarrollo. Sobre todo
al tratarse de un cultivo que se ve dramáticamente afectado por las condiciones ambientales.
Es de notable importancia seleccionar variedades que presenten un alto rendimiento
bajo condiciones de escasez de agua, o poder modificar genéticamente (transgénicos) otros
rubros afectados por déficit hídrico, utilizando genes relacionados con la tolerancia a la sequía. Conocido esto, nuestra hipótesis es la siguiente: ¿Podría la presencia y expresión de
alguno de los genes de la familia de las enzimas TPS, en el genoma de Phaseolus vulgaris,
favorecer la tolerancia al déficit hídrico de la variedad BAT 477, tolerante a la sequía; y lo contrario en la variedad susceptible PINTO UI114?.
Cuyo objetivo general es: Identificar y medir la expresión un gen de Trealosa -6fosfato sintetasa (TPS), en dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris); una
variedad tolerante al estrés por déficit hídrico (BAT 477); y otra susceptible (Pinto UI
114).
SALUDLATINA
067
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron plantas de frijol común (P. vulgaris), una variedad experimental al déficit
hídrico, BAT 477 y otra susceptible Pinto UI 114, crecidas en condiciones controladas de invernadero. Todas las muestras utilizadas durante este proyecto fueron proporcionadas por
el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Centro de Biotecnología Genómica del I.P.N. en
Reynosa, México (CBG).
Para la extracción de ácidos nucleídos, el ADN molde utilizado, fue extraído
a partir de hojas de frijol común (P. vulgaris), de la variedad BAT 477 y se utilizó el Kit
comercial de purificación de ADN genómico “Genomic DNA Extraction WIZARD A1120” (Promega, EEUU 2010). Para esto, se pesaron 100 mg de muestra de tejido vegetal. Se maceró rápidamente con nitrógeno líquido, para evitar la degradación de los ácidos nucleídos y se añadió
la solución de precipitación de proteínas. Se incubó durante 5 min y se centrifugó. Al sobrenadante se agregó 600 µL de isopropanol. La muestra se centrifugó nuevamente, esta vez se
descartó el sobrenadante. Se agregaron 600 µL de etanol al 70%, se centrifugó y descartó
otra vez el sobrenadante. La muestra fue secada a temperatura ambiente, hasta desaparecer trazas de etanol. Se rehidrató el sedimento, durante una incubación en baño maría a 65ºC
durante 1 h. Las muestras se guardaron a -20ºC. Se determinó la eficiencia de la
purificación y se evaluó la integridad y concentración del ADN en un gel de agarosa
en TAE1x. Se registró en un fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR de
BioRad.
Para la extracción de ARN de las muestras de ambas variedades de frijol, se usó el protocolo del TRIzol® Reagent (Invitrogen). Se trituró la muestra sin descongelarla y se agregó
1mL del reactivo, todo esto permaneció en frío. Luego, la muestra se agitó y se incubó por
5 min 37ºC. Después, se agregó 0.2 ml de cloroformo atemperado, se mezcló y se incubó
durante 3 min. Se centrifugó la muestra a 12000 rpm por 20 min a 8ºC y se recuperó la
fase acuosa. Para precipitar el ARN se adicionaron 50 µL de isopropanol, se mezcló por
inversión, y se incubó por 10 min a temperatura de laboratorio. Se centrifugó a 12000 rpm
durante 10 min a 8ºC y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 1ml de etanol al 75%, y
finalmente se centrifugó 5 min a 8000 rpm, se descartó el sobrenadante y se resuspendió
en 20 µL a 30 µL de agua DEPC según el tamaño el sedimento.
El diseño de los cebadores para el ADN total fue a partir de un alineamiento de secuencias conservadas de TPS en plantas, depositadas en la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los cebadores escogidos amplificaban 6 regiones dentro del fragmento de interés de TPS. Los mismos tenían
como finalidad encontrar fragmentos que por su buena resolución en los geles,
puedan secuenciarse y analizarse en la base de datos. Los cebadores de TPS, programas
de temperaturas y mezcla de reacción para PCR, fueron modificados a partir de los utilizados en estudios previos (Santos et al., 2010). La cadena adelantada (forward), se identificó
como, “F”, y los de la cadena reversa (reverse), con la letra “R”. Se realizaron ensayos de
amplificación por PCR con diferentes cebadores cuyos datos no son mostrados y que corresponden a los NTPS. Igualmente, fueron diseñados dentro del fragmento escogido (1,4),
para amplificar nuevas regiones.
SALUDLATINA
068
Las combinaciones de amplificación fueron utilizadas: Pv1AF/Pv1BR, amplifica un fragmento
de 240 pb, y fue diseñado en la base 100 del fragmento 1,4; Pv1BF/4R, amplifica un fragmento de
500 pb, diseñado a los 340 pb del fragmento 1,4; y por último Pv1AF/4R, amplifica un fragmento de
aprox. 800 pb, diseñado a los 100 pb de fragmento 1,4. Se diseñaron cebadores específicos para
β-actina de frijol común, a partir de una secuencia de ADNc de actina-1 de P. vulgaris depositada en
la base de datos de NCBI. El programa utilizado fue el PrimerSelect del Suite DNAStar (Lasergene v.
7), con el que se determinaron los marcos de lectura y las características (tamaño, temperatura de
alineamiento, formación de horquillas, etc.), más adecuadas. Se corroboró la secuencia
con la base de datos del NCBI. Fueron sintetizados en Eurofins mwg/operon.
Para los cebadores se obtuvo una concentración final de 10µM. De las bandas
amplificadas se tuvieron en cuenta las de mejor rendimiento y que se amplificaran por ambos
cebadores, F y R. Se reamplificaron los productos de la PCR, cuando se necesitó aumentar el
rendimiento de ADN en la muestra para los distintos procesos. Las cantidades de reactivos (MgCl2
y de buffer de reacción, etc.) fueron modificadas, así como la temperatura y tiempo de cada segmento del programa de amplificación, para obtener el programa más adecuado en cada caso.
Para los ensayos de transcripción, el diseño de cebadores se basó en SMART PCR y SMART RT,
junto con el cebador dT de Clontech. Se sintetizó el ADNc, y se realizó la PCR con los diferentes
cebadores utilizados para ADN. Se realizaron amplificaciones utilizando la pareja de cebadores
Pv4AF/dT. El cebador dT tenía aproximadamente 16 timinas (concentración, 10µM). Luego se
corrió la totalidad de los productos en gel de agarosa (0.8%). Se purificaron y se mandaron secuenciar.
Se amplificaron 6 regiones utilizando el ADN de P. vulgaris como molde, dentro del mismo
fragmento conservado antes mencionado, utilizando cebadores degenerados. Se utilizó el programa en el termociclador 9800 Thermal Cycler de Apllied Biosystems para la reacción de PCR,
siguiendo un esquema determinado. Los productos de amplificación fueron separados en geles
de agarosa (0,8%), visualizados y registrados en el fotodocumentador Gel-DocTM XR de BioRad.
Para eliminar contaminaciones y asegurar la integridad de la muestra, se siguió el protocolo de Invitrogen. Una vez obtenido el ADNc de las 80 muestras de P. vulgaris Pinto UI 114 y
BAT 477, se procedió a amplificar los fragmentos escogidos con los cebadores Pv1AF/Pv1BR. Se
amplificó sobre el producto del RT-PCR, utilizando los cebadores PvBacF/PvBacR , ajustando las
reacciones al molde inicial con el gen de mantenimiento actina, usando el par de oligos β-actina
para los cebadores TITANT One Tube RT-PCR System (Delp et al., 1997).
Las distintas concentraciones de agarosa para la electroforesis, fueron proporcionales al tamaño de fragmento amplificado. Se usaron las concentraciones de agarosa más altas, 1.5% para bandas menores a 500 pares de bases (Sambrook et al., 1998),
y los de menor concentración, 0.8%, para los fragmentos más grandes.
Después de separar en agarosa los segmentos, se cortaron los que contenían el fragmento
de interés. Éste se purificó con el Kit comercial Quiaex II Gel Extraction Kit (150) y se midió su
concentración, pureza y rendimiento en una segunda separación en gel de electroforesis. Con
un bisturí estéril en el trasiluminador se cortó cada banda y se guardaron en Buffer QX. Se resuspendieron en 10 µlL de la sílica Qiaex II con vortex de 30s. Se incubaron a 50ºC durante 10 min
hasta disolver completamente el trozo de agarosa.
SALUDLATINA
069
Se centrifugó y se descartó el sobrenadante. Se lavó una vez el sedimento con
buffer QX1, y dos veces con buffer PE, descartando el sobrenadante en ambos casos.
Luego se secó el sedimento al aire libre hasta tomar un color blancuzco, sin dejar secar
demasiado. Se eluyó el ADN mezclando con vortex e incubando 5 min a temperatura de
laboratorio. Se centrifugó la muestra por 30 s y el sobrenadante fue almacenado a -20º.
Se utilizaron dos variedades de frijol para los estudios de tolerancia a la sequía, B (BAT
477, tolerante) y P(PINTO UI114, susceptible). Dependiendo del tipo de tratamiento y la
variedad utilizada se definió PMP (punto de marchitez permanente), S (plantas en sequía),
pal (muestra inoculada con palillo) y R (plantas en riego).
Las plantas de frijol fueron inoculadas con M. phaseolina, cepa patogénica HMP5 a los
13 días luego de su siembra. Los muestreos empezaron a los 15 días de siembra y culminaron a los 24 días con el muestreo de recuperación.
Las muestras fueron enfrentadas a los ensayos de RT-PCR, y amplificaciones sobre ADNc,
que se muestran en los puntos anteriores. Los fragmentos de interés fueron sujetos a una
reacción de secuenciación (kit comercial BigDye Terminator Sequencing) (Applied Biosystems). Los cebadores, Forward y Reverse, se usaron para la secuenciación del fragmento.
Para determinar la secuencia nucleotídica de los fragmentos de ADN, se usó un
secuenciador ABI 3130, por el protocolo Big Dye Terminador (v3.1). La preparación
y tratamiento de la muestra se realizó por el empaque comercial Cycle Sequencing
Kit de Applied Biosystems. Se sometieron a un análisis tipo Blastx frente al banco
de datos del NCBI. Los segmentos identificados como TPS se consideraron para el
diseño de oligonucleótidos específicos para determinar la secuencia total del gen
y para realizar los ensayos de expresión, mostrados en puntos anteriores. Para la
medición semicuantitativa de bandas se utilizó la herramienta de volumen del programa Quantify One del fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR de
BioRad. (Ver Quantify One User Guide).
RESULTADOS Y DISCUSION
El ADN molde extraído, con una concentración de 0,800 µg/µL, tuvo el suficiente
rendimiento para su uso en los ensayos.
Los productos amplificados fueron: TPS1F/TPS2R (1,2), de tamaño esperado de 300 pb,
(Figura 1), con buen rendimiento, aunque con una notable saturación de la reacción de
PCR y demasiado fondo inespecífico. Esto pudo deberse a las temperaturas del programa
o concentraciones utilizadas en la PCR. Esta inespecificidad no lo hizo un buen candidato para purificar y secuenciar; por el contrario, el fragmento elegido TPS1F/TPS4R (1,4),
mostró una única banda específica en 900 pb (tamaño esperado), sin fondo y con excelente rendimiento. Además, el fragmento 1.4 de mayor tamaño, incluye dentro el fragmento conservado en la base de datos siendo excelente para la secuenciación, en comparación con otras TPS y modelos de diseños de otros cebadores más específicos. Los demás
fragmentosTPS1F/TPS3R (1,3), TPS2F/TPS3R (2,3), TPS2F/TPS4R (2,4), TPS3F/TPS4R (3,4) coincidieron en los tamaños esperados, sin embargo, se mostraron inespecíficos. Ninguno de
estos fue escogido para la continuación del estudio.
SALUDLATINA
070
Fig. 1. En la fotografía se muestra los distintos fragmentos amplificados:
1,2 (TPS1F/TPS2R); 1,3 (TPS1F/TPS3R); 1,4 (TPS1F/TPS4R); 2,3 (TPS2F/TPS3R); 2,4 (TPS2F/TPS4R); 3,4 (TPS3F/TPS4R).
Se secuenció un fragmento en ambas cadenas, uno de la cadena positiva y otro de
la cadena negativa, con los iniciadores elegidos TPS1F y TPS4R respectivamente.
La secuencia obtenida tuvo un total de bases legibles de 823 pb. Al empalmar las secuencias
amplificadas por ambos cebadores (TPS1F Y TPS4R), quedó una zona central sin empalmar, para
lo que se diseñaron nuevos cebadores utilizados sobre ADNc para conseguir el fragmento completo. Del análisis bioinformático, se derivó que la cadena positiva tenía una identidad del 70%
(93/132 aminoácidos) con la trealosa-6-fosfato de Ricinus communis; mientras que la cadena
negativa arrojó una identidad de 82% (125/153 aminoácidos) que corresponden a la trealosa6-fosfato de Ricinus communis. Se puede concluir que la identidad es de 218/235 aminoácidos,
correspondiendo a un 75% con la trealosa-6- fosfato sintetasa de Ricinus communis. Los fragmentos de las cadenas mostraron una región que no se empalmó (Figura 2).
Fig 2. Alineamiento de secuencia Base de datos Blastx
En este punto resulta importante conocer la temperatura de alineamiento con la que el cebador se aparea con la hebra de ADN molde. Temperaturas muy bajas provocan un apareamiento inespecífico que causa un barrido en la corrida electroforética y muestra bandas intensas,
que pueden ser falsos positivos, por ejemplo el gel de ADN para elegir el fragmento 1,4 (Fig.1).
SALUDLATINA
071
Por el contrario, utilizar temperaturas muy altas puede provocar que no se pegue del
cebador.
Por otro lado, el tiempo de elongación, también constituyó un factor importante.
Para fragmentos de alto peso molecular se recomienda un tiempo de reacción más prolongado. Por ejemplo, el fragmento 1,4 de 900 pb utilizó 1 minuto de elongación, mientras que el fragmento amplificado por Pv1AF y Pv1BR de 240 pb utilizó 30 s. Esto se debe
a que la enzima Taq polimerasa sintetiza aproximadamente 1 kb por min, es decir, necesita el tiempo suficiente para polimerizar un fragmento de gran tamaño y menor tiempo
para uno pequeño.
Para el ARN total, las muestras presentaron un excelente rendimiento, con el doblete característico del ARN ribosomal. Algunas muestras aparecieron degradas, probablemente por el tiempo de duración de extracción o el estado de las hojas.
Se trata de una de las moléculas más susceptibles a cambios a nivel celular. En la figura 3, se observa el doblete que corresponde a los ribosomas, los
dNTP’S sobrantes en la reacción que corren con el frente de corrida semejante
a bandas, y muestras degradas, con una enorme mancha al final del frente de
corrida. No se observa contaminación con ADN.
Fig. 3. Geles de agarosa de ARN
extraído.
En la figura 4, se observan los productos amplificados de los cebadores de los controles de β-actina tanto de ADN de P. vulgaris, como de ADNc de los distintos tratamientos. Se amplificó un fragmento de 550-600 pb ADN de frijol, mientras que sobre ADNc,
un fragmento más pequeño de 490-550 pb (esperado: 585pb). Esto demuestra la diferencia entre ADN, con presencia de intrones y exones. Mientras que en ADNc sólo vamos
a encontrar las regiones codificantes para alguna proteína, es decir, los exones. Los ciclos
de 30 y 35 utilizados en la reacción procedieron a la saturación del PCR, reflejado por la
banda notablemente gruesa e intensa en gel. El cálculo de la diferencia de volúmenes
de las bandas y la medición de la cantidad de ARN presente en cada una de las muestras
no pudo determinarse, parámetros necesarios para saber el nivel de expresión del fragmento de trealosa en los distintos tratamientos.
SALUDLATINA
072
Por tanto, se decidió tomar alícuotas de ciclos menores como 20 y 25, donde
la concentración de β-actina resultó distinta en cada una de las muestras. El alto
rendimiento observado se debió a que los genes de β-actina, son genes de mantenimiento, indispensables para la vida de toda célula. Se trata de una proteína implicada en los microfilamentos de la célula vegetal, además de intervenir en otras
importantes funciones en la división celular.
Fig. 4. Gel de agarosa a donde se manifiesta la amplificación del gen de  actina. Amplificación sobre el
ADN genómico (ADNg/-ac) o en el cADN (cADN/-ac) tomando las muestra a los 30 o 35 ciclos de
amplificación.
La muestras de ARN para los ensayos de RT-PCR fueron previamente desnaturalizadas,
ya que esta molécula tiende a formar estructuras y enlaces intracatenarios muy fácilmente.
La combinación Pv1AF/Pv1BR, amplificó un fragmento de 240 pb, como se esperaba y la
combinación Pv1BF/4R, amplificó un fragmento de 500 pb, ambas en la prueba sobre ADN
genómico. La temperatura de alineamiento (Tm) de 57ºC fue la seleccionada por el mejor
rendimiento de los cebadores, en comparación con los otros programas utilizados con Tm
más altas. En este programa la banda de 500 pb es única, no siendo así la banda de 240 pb.
Además, se observó una banda inespecífica en las 600 pb con menor rendimiento. Esta banda podría tratarse de un homólogo del fragmento presente en ADN, y no necesariamente
tiene que estar presente en ADNc (Figura 5).
SALUDLATINA
073
Fig. 3. Geles de agarosa de ARN
extraído.
Al amplificar utilizando este programa sobre ADNc de las muestras de tratamientos,
se observó que sólo apareció el fragmento de 240 pb, más no el 500 pb, probablemente
este último no es un fragmento codificante para ARNm, y se encuentra dentro de un
intrón del fragmento de interés. Este intrón es amplificado en ADN, es decir, no es transcrita.
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Primer muestreo 15 días
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Primer muestreo 16 días
Primer muestreo 19 días
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Primer muestreo 20 días
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Primer muestreo 28 días
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078
De los estudios de campo, observamos que algunas hojas presentaban pigmento de hojas secas. Se piensa que por esta razón muchos de los ARNm se encontraban degradados y no mostraron señal de TPS. Los controles negativos se muestran sin bandas, confirmando que efectivamente se amplificó ARN sin contaminación
por ADN. La banda obtenida en el gel del muestreo de recuperación de 460 pb no
correspondió con la banda de 240 pb esperada, sin embargo se cree que podía tratarse de un
gen homólogo a los mensajeros TPS. De la misma después de purificada, concentrada y secuenciada se obtuvieron bases legibles desde la 12 hasta la base 360. En el análisis informático no se mostró identidad con los genes de trealosa, pero aparece con alta homología con
una proteína de vacuolas (Figura 6). Puede que se esté activando otros genes, que se relacionan a conservar agua dentro de la célula.
Figuras 6. Banda hallada en muestras de recuperación (20/10/08)
Los distintos muestreos revelaron una trascripción de trealosa por vía sintética TPS, que
va disminuyendo a razón del avance del tiempo de exposición al estrés por déficit hídrico.
Esto sugiere que al igual que en Saccharomyces cerevisiae, la trealosa se acumula en las primeras etapas de exposición a altas temperaturas, para luego sufrir un rápido decaimiento por
degradación de la misma, al transcurrir el tiempo de exposición (Mahmud et al., 2010). Se
debe resaltar que en este estudio medimos la expresión de ARNm por la vía biosintética de
la enzima trealosa-6- fosfato sintetasa (TPS), y es frecuente encontrar organismos que tienen
más de una vía de síntesis de trealosa (Gallardo et al., 2005). Probablemente, la trealosa continúa sintetizándose en una cascada de transcripción de genes involucrados en la tolerancia
al estrés hídrico, pero por distintas vías de síntesis a la de TPS (Fernández et al., 2010).
La banda de 460 pb observada correspondiente al muestreo de recuperación (20/10/08),
fue secuenciada y comparada en el Blastx del NCBI, dando similitud con una proteína de
vacuola. Esto sugiere que la síntesis de trealosa, podría activar otros genes involucrados en la
retención de agua en vacuolas dentro de la célula, así como se han observado en organismo
que sobreexpresan el gen, los cuáles muestran un 92% de retención de agua (Suárez et al.,
2008). Pudiera deberse además, a que la trealosa cumpla su papel como molécula señal para
que se restablezca inmediatamente la célula vegetal al primer contacto con el agua, ó se active la transcripción de genes relacionados con la tolerancia a los distintos estreses. (Gallardo
et al., 2005).
SALUDLATINA
079
Otras bandas observadas en los geles de agarosa en los controles positivos,
pudieron tratarse de genes homólogos de TPS.
No se determinó diferencia en el aumento o disminución en la expresión de trealosa
entre las variedades de frijol común BAT 477 y Pinto UI 114. Tampoco fue encontrada la
relación entre la infección con Macrophomina phaseolina y la expresión entre las dos variedades. Puede que la diferencia entre la tolerancia y susceptibilidad observada en estas variedades se deba o implique la expresión de otros genes, que puedan ser independientes
a los TPS aquí estudiados.
CONCLUSIONES
1.
Los genes TPS, representan la clave para la selección y multiplicación de
variedades resistentes e incluso de cultivos transgénicos que sobreexpresen el gen. En
nuestro estudio, el fragmento 1,4 seleccionado corresponde a una región dentro de un
gen de la familia de TPS en P. vulgaris, con el que mostró alta similitud (75%) con la TPS de
Ricinus communis.
2. Los cebadores específicos usados sobre ADNc, amplificaron un fragmento de 240
pb y otro de 420 pb. El primero corresponde a una región codificante para proteína, probablemente la enzima trealosa-6-fosfato sintetasa. El segundo corresponde a una región con
alta similitud a una proteína de vacuola, que podría estar implicada en la recuperación de
la planta al contacto con el agua.
3. No queda claro si la expresión o el incremento de la síntesis de trealosa tiene que
ver directamente con la tolerancia en variedades resistentes de P. vulgaris, como la BAT
477; o su susceptibilidad a la sequía en la variedad Pinto UI 114. La trealosa se está expresando casi por igual, en éstas dos variedades, sin embargo, si se observa una mayor
expresión del gen, cuando las condiciones de estrés se presentan inicialmente. Se observó
el comportamiento anteriormente citado para trealosa, en las cuales este azúcar aparece
durante las primeras etapas de las condiciones de estrés y luego va desapareciendo con el
tiempo de exposición, hasta hacerse indetectable.
RECOMENDACIONES
1. El fragmento escogido para el estudio fue el 1,4 amplificado por la combinación de
cebadores TPS1F/TPS4R, los mismos fueron construidos casi a los extremos de la secuencia conservada de TPS en plantas, por lo cual era el fragmento con mayor peso molecular.
Su tamaño, que encerraba casi toda la secuencia conservada escogida, su ausencia de barrido en gel y por lo tanto su alta resolución, indicaba la alta afinidad de los cebadores para
amplificarlo por la PCR clásica y lo hace un excelente candidato para seguir utilizándolo
en próximos estudios tanto para conocer los extremos flanqueantes del gen como realizar
análisis de medición de ARN mensajeros.
SALUDLATINA
080
2.
En este estudio se probaron ensayos para amplificar fragmentos de TPS sobre el
hongo patógeno M. phaseolina, cepa HMP5. Las amplificaciones de ADN por medio de PCR,
mostraron bandas de distintos tamaños, las que fueron comparadas con las observadas en
P.vulgaris diferentes a las mostradas en los fragmentos de TPS de frijol común (debido a que
pueden tratarse de distintas familias de genes), podrían tratarse de fragmentos del gen en el
hongo (datos no mostrados). Valdría la pena llevar a cabo, estudios para elucidar qué papel
juega el gen de TPS, en las condiciones de co-infección y si efectivamente la TPS, está relacionada con su tolerancia a la sequía.
3. En este estudio llevamos a cabo ensayos de restricción y ligación de ADN genómico
de P. vulgaris, por los cuales se buscaba conocer por PCR inversa los extremos flanqueantes
del gen de TPS. Los resultados mostraron un interesante patrón de bandas con alto peso molecular que podrían tratarse de la parte faltante de este gen. Se recomienda continuar, para
lograr secuenciar el gen de TPS completamente. Al igual que la banda de 460 pares de bases
encontrada en el muestreo de recuperación, resultaría interesante secuenciarla completamente y vislumbrar a que proteínas pertenece verdaderamente.
4. Deberían hacerse ensayos de medición de mensajeros, en hojas tiernas de P. vulgaris,
durante las primeras etapas de exposición al estrés. En nuestro estudio, no se logró medir
el nivel basal o constitutivo del fragmento de TPS. Esto podría elucidar el comportamiento
de la trealosa desde la etapa en cual aún no se ha llegado al punto de marchitez, y cuál es el
nivel de expresión que muestra la planta cuando aún no ha sido puesta bajo condiciones de
estrés.
5. Continuar en P. vulgaris, investigaciones sobre trealosa sintetizada por otras vías enzimáticas, por ejemplo, la de trealosa -6- fosfato fosfatasa (TPP), para su expresión.
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SALUDLATINA
083
SALUDLATINA
BIOTECNOLOGÍA
084
“Obtención y aplicación de quitosano”
AUTORES:
G. Chong, B. Córdova, M. Correa, M. Cuevas,
J. Delgado, A. Tristán
Universidad Latina de Panamá
SALUDLATINA
085
LA QUITINA
La quitina, polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido, derivado de la celulosa y es uno de los componentes principales del resistente exoesqueleto de los crustáceos.
Este polisacárido, blanco, duro e inelástico, es la mayor fuente de contaminación superficial de
las áreas cercanas al mar.
RESUMEN
La quitina, polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido, derivado de la celulosa y es
uno de los componentes principales del resistente
exoesqueleto de los crustáceos. Este polisacárido,
blanco, duro e inelástico, es la mayor fuente de
contaminación superficial de las áreas cercanas al
mar. Es altamente insoluble en agua y en solventes
orgánicos debido a los enlaces de hidrógeno que
presenta la molécula. La quitina se vuelve soluble
en ácidos inorgánicos diluidos cuando pierde el
acetilo del grupo acetilamino, convirtiéndose en
quitosano. El quitosano es un polisacárido de cadena lineal poco frecuente en la naturaleza, tiene
gran potencial y es soluble en soluciones acuosas
de algunos ácidos. Es un polímero con propiedades
tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad,
toxicidad nula. Las propiedades del quitosano han
permitido su aplicación en una gran variedad de
áreas tales como la alimentación, medicina, agricultura, cosmética, y farmacia, entre otras. Por esta
razón nos propusimos obtener quitosano a partir del
exoesqueleto de camarones desechados por el Mercado de Marisco. Para ello aislamos y purificamos la
quitina mediante un proceso químico de desmineralización y desproteinización del exoesqueleto del
camarón, obtenido como desecho en el procesamiento del mismo. Obtuvimos el quitosano a partir
de la desacetilación de la quitina aislada, mediante
un tratamiento alcalino fuerte, y enunciamos cinco
vías de uso del mismo. Con la realización de este
proyecto se obtuvo un polisacárido poco común en
la naturaleza, el quitosano, siendo este, producto de
la desacetilación química de la quitina encontrada
en los exoesqueletos del camarón, en forma final de
polvo o de hidrogel.
ABSTRACT
Chitin, a natural polymer that is classified within
the polysaccharide derived from cellulose and is one
of the main components of resistant exoskeleton of
crustaceans. This polysaccharide, white, hard and
inelastic is the largest source of surface contamination of the areas near the sea. It is highly insoluble
in water and in organic solvents due to the hydrogen
bonds present in the molecule. Chitin becomes soluble in dilute inorganic acids when it loses the acetyl
acetylamino group, turning into chitosan. Chitosan
is a polysaccharide of a linear chain, rare in nature.
It has great potential and is soluble in aqueous solutions of some acids. It is a polymer with properties
such as biocompatibility, biodegradability, and none
toxicity. The properties of chitosan have enabled its
application in a variety of areas such as food, medicine, agriculture, cosmetics, and pharmaceuticals,
among others. For this reason, we decided to obtain
chitosan from the exoskeleton of shrimp discarded
by the seafood market. We isolated and purified the
chitin by a chemical process of demineralization
and deproteinization of the exoskeleton of shrimp,
obtained as waste in the processing of it. We obtained chitosan from the deacetylation of isolated
chitin by means of a strong alkali treatment on it,
and we enunciated five ways for using it. With the
completion of this project, we got the chitosan an
unusual polysaccharide in nature,and this is a product of the chemical deacetylation of chitin found in
the exoskeletons of shrimp, in a final form of powder
or hydrogel.
SALUDLATINA
086
INTRODUCCION
La quitina es un polímero natural que se clasifica dentro del tipo polisacárido,
derivado de la celulosa y es uno de los componentes principales del resistente
exoesqueleto de los crustáceos. Normalmente la quitina es blanca, dura, inelástica
y es la mayor fuente de contaminación superficial de las áreas cercanas al mar. Es
altamente insoluble en agua y en solventes orgánicos debido a los enlaces de hidrógeno que presenta la molécula. La quitina se vuelve soluble en ácidos inorgánicos
diluidos cuando pierde el acetilo del grupo acetilamino, convirtiéndose en quitosano.
El quitosano es un polisacárido de cadena lineal poco frecuente en la naturaleza,
tiene gran potencial y es soluble en soluciones acuosas de algunos ácidos. Es un
polímero con propiedades tales como biocompatibilidad, biodegradabilidad, toxicidad nula, etc. Las propiedades del quitosano han permitido su aplicación en una
gran variedad de áreas tales como la alimentación, medicina, agricultura, cosmética,
y farmacia, entre otras.
Estos productos bioquímicos se pueden obtener a partir del tratamiento químico
de exoesqueletos del camarón. El quitosano se obtiene por modificación química de la
quitina, la cual es tratada con una solución alcalina concentrada y caliente con el fin de
retirar la mayor cantidad de unidades acetilo de la estructura del polímero. El polímero
que se obtiene posee ciertas características químicas y físicas de gran interés industrial.
En este trabajo se presentan los materiales y métodos necesarios para la producción de quitosano por modificación de la quitina extraída de exoesqueletos de camarones obtenidos en el Mercado del Marisco, para así reducir el efecto de contaminación y disminuir la cantidad de basura que se genera. A nuestro conocimiento, los
exoesqueletos desechados en el Mercado no han sido objeto de estudio con fines de
obtener una sustancia útil de gran valor industrial que pueda ser aplicado de manera
eficiente.
Tanto el quitosano como sus derivados han presentado excelentes propiedades físicas y químicas para desarrollar un amplio número de productos con
características sumamente interesantes para el sector de la salud. Sus aspectos fundamentales tales como sus propiedades muco adhesivas facilitan la liberación de los principios activos directamente al tracto nasal o peri oral y las biológicas permiten que el quitosano sea útil para el tratamiento de reconstrucción de la piel y las características humectantes y antibactericidas hace que
sea útil para personas con quemaduras graves o con problemas de la piel.
ANTECEDENTES
El consumo de los crustáceos deja como desechos, aproximadamente, entre el
70 y 80%, considerados contaminantes. Al hacer uso de estos desechos, la presente
investigación estaría aportando con el control de la contaminación ambiental. Los
desechos pueden aprovecharse para la obtención de dos biopolimeros especializados que ha tomado mucho auge por la infinidad de aplicaciones que ha logrado encontrárseles, y, especialmente, por su poco impacto ambiental que son la quitina y
su derivado funcional, el quitosano. De esta manera se pueden crear productos de
mayores valores comerciales y aceptados mundialmente.
SALUDLATINA
087
Ambos biopolímeros están químicamente emparentados; la quitina mediante
una reacción de desacetilación que elimine al menos un 50 % de sus grupos acetilo,
se convierte en quitosano. Estos dos biopolímeros poseen la ventaja de ser conocidos por la naturaleza desde hace millones de años. En efecto, si hacemos caso de
infinidad de hallazgos paleontológicos, es posible asignarle a la quitina una edad
de al menos 570 millones de años, al haber sido encontrada en el exoesqueleto de
artrópodos acuáticos fósiles conocidos como trilobites, que datan de la era paleozoica.
Los derivados de quitina tienen un inmenso campo de aplicación con relevante
valor económico, por ejemplo en la utilización en la medicina por sus propiedades
antimicrobianas y capacidad de retención de humedad. A pesar de las ventajas
considerables de usar materiales poliméricos, aún en áreas tan delicados como la
medicina, por ejemplo, en el reemplazo de órganos, aún está pendiente resolver
problemas como su biocompatibilidad y su biodegradación. En ese sentido la balanza se ha ido inclinando cada vez más por el uso de materiales ya existentes en la
naturaleza, o por la modificación fisicoquímica de éstos, con el propósito de lograr
su reconocimiento por los principales agentes degradantes naturales, en el caso
del medio ambiente, o evitar el temido rechazo, en el caso de implantes quirúrgicos.
En la industria textil, para evitar el encogimiento de los tejidos, el quitosano fija
el color de componentes de fibras que se utilizan en la mejora de lanas, impermeabilización de algodones y linos. En el tratamiento de agua, para removedores de
iones metálicos, quelantes de metales de transición y contaminantes ambientales,
floculantes, coagulantes y precipitantes de proteínas, aminoácidos, tintes, colorantes, algas, aceites, metales radioactivos, partículas en suspensión y pesticidas.
En la industria alimentaria para aditivos en los alimentos, espesantes, gelificantes
y emulsionantes, agentes que previene la precipitación del vinagre, aditivos con
características nutricionales, aditivos para la alimentación animal, envoltura y recubrimiento protector de alimentos, retrasa el envejecimiento, disminuye la oxidación, disminuye las perdidas por transpiración y protege frente al ataque de hongos, entre otros usos.
En nuestro país no existe ninguna empresa o entidad privada que se encargue de la
producción de quitosano en tierras panameñas. Ha habido investigaciones previas apoyadas por el SENACYT para la producción y caracterización de quito-sano, pero ninguna con
carácter comercial, dirigida a la producción y venta del producto a nivel nacional e internacional.
Por lo tanto, la presente investigación aportará en lo social y medio ambiental del país;
asimismo forma una cadena productiva con la pesca, la preservación del medio ambiente
y los consumidores finales.
El problema se crea a partir de la facilidad con la cual se genera desechos, lo
cual ha contribuido a incrementar el interés por la búsqueda de opciones de reducción y de aprovechamiento, adquiriendo mayor relevancia la incorporación de procesos de gestión ambiental. Todo proceso productivo no es reconocido solo por la
calidad de sus productos, sino también por la calidad total, desde la utilización de
materia prima hasta los desechos finales del proceso.
SALUDLATINA
088
La industria camaronera no puede hacer caso omiso de las tendencias mundiales ya que
esto ha traído consigo un incremento en la cantidad de desechos. Cabezas y exoesqueletos
son depositados en vertederos de basura a cielo abierto o en el mar, constituyendo una fuente
de contaminación ambiental. Se estima que los desechos de camarón constituyen alrededor
del 30% en peso del recurso; en 1994 se produjeron 990 toneladas de desechos y en 1995
1.090 toneladas.
Por otra parte, el camarón destinado al mercado nacional es fuente creciente de
desechos debido a cambios en los hábitos de consumo de los pobladores y en la comercialización del producto. Los exoesqueletos de cangrejo, langosta y camarón son
fuentes importantes de materia prima para producción de quitina y de quitosano. La
quitina y el quitosano deben importarse, de allí que se haya dado un impulso para
evaluar la posibilidad de utilizar los desechos generados por la industria camaronera
para la extraer dichos productos por medio de tratar los desechos.
La mayoría de los países tienen una riqueza de biomasa marina incalculable, pero
lamentablemente este recurso se explota muchas veces irracionalmente, sin tomar en
cuenta las implicaciones medio ambientales que esta genera. Con la apertura de los
mercados, las empresas nacionales del sector farmacéutico se ven en la obligación de
dirigir sus esfuerzos hacia la investigación y el desarrollo de productos innovadores,
que les permitan mantenerse compitiendo frente a las grandes empresas a nivel mundial.
Este estudio plantea la obtención de quitosano a partir de biomasa marina resi-dual, como
una alternativa para disminuir la contaminación ambiental producida por los desechos de crustáceos. La utilización de estos biopolímeros extraídos de las fuentes marinas será la base para
el diseño de productos farmacéuticos innovadores en el campo de soportes poliméricos compatibles para ser utilizados en regeneración de tejidos humanos, como lo es la piel. Por tanto
nos proponemos, comprobar que podemos obtener quitosano a partir de la desacetilación
de la quitina extraída del exoesqueleto de camarones provenientes del mercado de marisco y
utilizarlo en las diferentes líneas de aplicación.
Por esta razón, nos trazamos como objetivo general obtener quitosano a partir del
exoesqueleto de camarones desechados por el mercado de marisco.
Como objetivos específicos aislar y purificar quitina mediante un proceso químico de desmineralización y desproteinización del exoesqueleto del camarón, obtenido
como desecho en el procesamiento del mismo; obtener quitosano a partir de la desacetilación de la quitina aislada, mediante un tratamiento alcalino fuerte de ésta; aplicar el quitosano en cinco vías de utilización.
MATERIALES Y METODOS
DIA 1:
Se viajó al Mercado del Marisco donde se obtuvieron 6 libras de desecho de camarón, separados de cáscaras de cabeza, patas y cola.
Las 6 libras se lavaron tenazmente con abundante agua para eliminar cualquier residuo
orgánico, esto se hizo en 3 tanques de lavado en cadena, con cambios de agua al ver el agua
muy turbia. Todo este proceso tomó 5 h, de 6 libras de desechos se
SALUDLATINA
089
obtuvo 1 libra de cáscara: limpia, suave, de color casi transparente y se procedió a
congelar por 3 días. Y se sacaron del congelador la noche anterior al secado.
DIA 2
Las cáscaras se calentaron dentro de un vaso químico en un plato caliente a 225ºC,
a esta temperatura se calentaban y se ponían duritas, tostadas. Después de secar los
exoesqueletos se van a pasar en porciones pequeñas al mortero de porcelana donde se
van a triturar hasta llegar a hojuelas muy pequeñas y finas. Al final del tamizado se obtuvo
108 g de polvo, a partir de 1 libra de cáscara lavada.
DIA 3
De los 108g de polvo de cáscara se tomaron 20 g y se colocara en un vaso que contiene
una solución de HCl 0.6N en una relación 1:11 sólido-líquido a una tempe-ratura de 28ºC30°C durante 3 h con agitación constante. Al final del proceso se obtuvo un sólido al fondo
del vaso. Se decantó el líquido.
El sólido obtenido se trató utilizando NaOH 1% durante 3 horas de agitación constante
a 65ºC. Al no saber la cantidad de NaOH 1% a utilizar se procedió a agregar poco a poco
el hidróxido y se fue midiendo el pH hasta llegar a de 10.7, que se consiguió con 85 mL.
Después de las 3 horas se obtiene una masa desproteínizada.
El material desproteinizado se filtró a vacío, este lavado y filtrado al vacío se da
hasta que el agua filtrada sea tranparente. El producto final de estos cinco pasos
es la Quitina. Para ello se realizó una prueba de caracterización de azúcares con
reactivo de Molish y ácido sulfúrico, la prueba dio positiva al observar la aparición
de un anillo morado.
DIA 4
Se pesaron 8 g de la quitina obtenida y se vertió en un vaso químico con 32 mL de
NaOH al 50% en una relación 1:4 sólido líquido y se calentó primero por 2 horas a 60°C. Al
terminal las 2 horas se hizo secado al vacío con agua destilada. Se procedió a añadir otros
32 mL de NaOH al 50% y se calentó por 1,5 h, sin agitación a 100°C. Al cabo de las 2 horas
se hizo el último lavado al vacío. El producto obtenido fue el Quitosano, que se presentó
como una especie de cristal, color blanco, aceitoso y brillante. Se realizó una prueba de
caracterización de polisacáridos con Lugol y la prueba dio positiva al observar un color
chocolate.
DIA 5, 6 y 7.
Se empezó el segundo ciclo de producción de Quitosano utilizando el resto de
la cáscara pulverizada. Todos los procesos se realizaron de igual manera.
DIA 8.
En el Laboratorio de Residuos Tóxicos del MIDA se procedió a lavar con agua destilada
el producto en un filtrado a presión hasta obtener un pH neutro. Al medir el pH la primera
vez del producto, este era de 9.61. Después de varios lavados con un total de 500 mL se
llegó al pH 7.0. El resultado de la muestra final fue de 59 g de Quitosano purificado a partir
de 76 g de Quitina. SALUDLATINA
090
Uso como Antimicrobiano.
Se procedió a hacer cultivos de diferentes bacterias, a los cuales se le aplicaron discos de
papel filtro empapados en soluciones de quitosanos diluido en ácido acético al 30% y un control de ácido acético al 30%. Las concentraciones utilizadas fueron 01 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1.0
mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL.
RESULTADOS Y DISCUSION
Una vez terminado los procesos químicos para transformar las cascara de camarón
a quitina y posteriormente la desacetilación de la misma, se obtuvo el producto esperado, el quitosano, como un polvo fino de color blanco.
Las pruebas de caracterización con lugol, específica para polisacáridos, resultaron
positivas, al igual que la prueba con el reactivo de molish que es una prueba general
para azúcares.
Al producto se le procedió a realizar pruebas de espectrofotometría infrarroja en el Insituto
Especializado de Análisis (I. E. A.) de la Universidad de Panamá. Se realizó la prueba de cenizas
en la cual se obtuvo un resultado de 0.19 % (g / 100 g) y la identificación de la señal en el espectrofotómetro infrarrojo FTIR (Fourier Transform Infrared Spectrophotometer) coincidio con
el patrón, en un pico a 2886.60 (cm-1), pico característico del quitosano según la literatura
(Hernández y col. (2009). El quitosano patrón fue proporcionado por COMACO.
La actividad antimicrobiana mostrada en la tabla 1 y en la figura 4 pudo deberse a la interacción electrostática entre los grupos amino del quitosano y los sitios aniónicos de las paredes
celulares bacterianas con restos de ácidos carboxílicos y fosfolípidos. En el caso de E. coli, la acción bactericida del quitosano se explica por la unión de los policationes del polímero con los
aniones de la superficie bacteriana, alterando la permeabilidad de la membrana, de la glucosa
y lactato deshidrogenasa.
Tabla No. 1: Diámetro del halo en centímetros producidos por Quitosano en el Antibiograma
*No hubo crecimiento
SALUDLATINA
091
Figura 4: Antibiograma de quitosano diluido a diferentes concentraciones de
ácido acético al 30%
Klebsiella sp.
E. coli
Pseudomonas sp.
S. pyogenes
S. auereus
CONCLUSIONES
Con la realización de este proyecto se obtuvo un polisacárido poco común en la
naturaleza, el quitosano, siendo este, producto de la desacetilación química de la
quitina encontrada en los exoesqueletos del camarón, en forma final de polvo o de
hidrogel.
POSIBLES BENEFICIARIOS
Los beneficiarios finales serán los seres humanos, ya que el quitosano se podría
utilizar en diferentes áreas de uso común para hombre, como la medicina, la estética
y cosmética. Los agricultores podrán utilizar quitosano para la mejora de sus cosechas, también los científicos podrían utilizar este producto en el campo de los biosensores, tanto de macro como de nano partículas.
SALUDLATINA
092
BIBLIOGRAFÍA
• Caldera, Y. et al, Quitosano como coagulante durante el tratamiento de aguas
de producción de petróleo.(2008), Maracaibo, Venezuela.
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• Velásquez, C. (2006). “Quitina y quitosano: materiales del pasado para el presente y el futuro”. Avances en Química 1(2), 15-21. Universidad de Los Andes, Venezuela.
SALUDLATINA
Producción de antisuero murino contra
veneno de Bothrops asper y Porthidium lansbergii
AUTORES: Josué Young1,2, Marlon Núñez2, Johanna Juliao2,
Thiago Vial2, Cirilo Lyons1, Mario Urriola3, Olmedo Otero1,2,Omar Dupuy2
Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud, Rep. de Panamá.
Instituto de Investigaciones en Biotecnología y Ciencias Biomédicas, Escuela de
Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Latina de Panamá, Rep.
de Panamá.
3
Serpentario Maravillas Tropicales, Valle de Antón, Rep. de Panamá.
1
2
RESUMEN
Los envenenamientos por mordeduras de serpientes constituyen un problema de salud pública en Panamá. Las serpientes de la familia Viperidae son las principales causantes de los accidentes ofídicos en nuestro
país. Existen limitaciones técnicas para la identificación
y cuantificación del veneno de serpiente en sangre. El
objetivo de esta investigación fue obtener antisuero
murino contra el veneno de las serpientes Bothrops asper y Porthidium lansbergii, que será evaluado en futuros
inmunoensayos. Las giras de colectas fueron realizadas a
Punta Soropta, Bocas del Toro y El Valle de Antón, Coclé.
Se capturaron 10 B. asper y 5 P. lansbergii y se les realizó
la extracción del veneno. Ratones Balb/c fueron inoculados intraperitonealmente con 100 ml de veneno de B.
asper (días 0, 7, 14, 26, 33) y P. lansbergii (días 0, 7, 19, 26,
37) diluido 1:1000, se extrajeron muestras de sangre semanalmente y se separó el suero. Se realizaron pruebas
de ELISA utilizando los sueros de los ratones inoculados
y el veneno de las serpientes. Los resultados muestran
que los sueros murinos obtenidos a partir del día 7 postinmunización con veneno de B. asper, reconocieron (p
<0.001) el veneno de esta serpiente en un ELISA. Los sueros de los ratones inoculados con veneno de P. lansbergii, reconocieron el veneno correspondiente a partir del
día 19 post-inmunización (p <0.001). En conclusión, los
sueros obtenidos de ratones inoculados con veneno de
B. asper y P. lansbergii reconocen el veneno de estas serpientes en un ELISA. En la siguiente etapa de esta investigación, estos antisueros serán ensayados en el desarrollo
de inmunoensayos, para la detección de venenos de B.
asper y P. lansbergii en suero.
ABSTRACT
Envenoming by snake-bite is a public health problem in Panama. Snakes of the Family Viperidae are the
main causes of the snake-bites in our country. There are
technical limitations for the identification and quantification of snake venom in blood. The aim of this research
was to obtain murine antiserum against the venom from
snakes Bothrops asper and Porthidium lansbergii, which
will be evaluated in future immunoassays. Tours of collections were carried out at Punta Soropta, Bocas del
Toro and El Valle de Antón, Coclé. Ten B. asper and five
P. lansbergii were captured and the extraction of venom
was performed. Balb/c mice were intraperitoneally inoculated with 100 ml of venoms from B. asper (days 0, 7,
14, 26, 33) and P. lansbergii (days 0, 7, 19, 26, 37) diluted
1:1000, blood samples were weekly extracted and serum
was separated. ELISA tests using sera from inoculated
mice and the venom from the snakes were performed.
Results show that murine sera obtained from day 7 postimmunization with venom from B. asper recognized (p
< 0.001) venom from this snake in ELISA. The sera from
inoculated mice with the venom from P. lansbergii, recognized the corresponding venom from day 19 post-immunization (p < 0.001). In conclusion, the sera obtained
from inoculated mice with venom from B. asper and P.
lansbergii recognizes these snake venoms. In the next
part of this research, these antisera will be tested in the
development of immunoassays for the detection of venoms from B. asper and P. lansbergii in serum.
BIOTECNOLOGÍA
093
SALUDLATINA
094
Palabras claves: Veneno, antisuero, serpientes, ELISA, Bothrops asper, Porthidium lansbergii.
INTRODUCCION
Los accidentes ofídicos en Panamá se estiman en unos 2 000 casos anuales (Gutiérrez
et al., 2007; Lomonte, 2012), por lo que constituyen un problema de salud pública en nuestro país, especialmente en las áreas rurales. Las serpientes de la familia Viperidae son las
principales causantes de los envenenamientos por mordeduras de ofidios en territorio panameño (Bolaños, 1982). Los venenos de los vipéridos (como Bothrops asper y Porthidium
lansbergii, entre otros) pueden producir manifestaciones locales que incluyen edema, dolor, hemorragia, dermonecrosis, mionecrosis y formación de ampollas (Gutiérrez y Lomonte
1989, Nishioka y Silveira 1992), y manifestaciones a nivel sistémico como alteraciones de la
coagulación, trombocitopenia, sangrados a distancia, equimosis, hipotensión e insuficiencia renal (Barrantes et al., 1985; Kamiguti et al., 1991; Cardoso et al., 1993). La detección y
medición de veneno de serpiente en sangre es importante para confirmar la identificación
de la serpiente, determinar si se administró suficiente antiveneno, detectar la recurrencia de
envenenamiento y en investigación forense, sin embargo, a menudo no existe la disponibilidad técnica para la identificación y cuantificación del veneno de serpiente en sangre (Kulawickrama et al., 2010). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) es un método
eficiente para la detección de veneno de serpiente (Theakston, 1983; Chavez-Olortegui et
al., 1993) y podría ser útil para el seguimiento de la cinética de distribución de los antígenos
ofídicos en pacientes o animales envenenados (Núñez Rangel et al. 2012).
El objetivo de esta investigación fue obtener antisuero murino contra el veneno de las
serpientes B. asper y P. lansbergii, con miras a determinar, en inmunoensayos futuros, los
niveles séricos de veneno de estas serpientes en envenenamientos ofídicos.
MATERIALES Y METODOS
Animales
Ratones BALB/c machos de entre 5-8 semanas de edad y ~20 g de peso fueron mantenidos en condiciones ambientales estándares. Los ratones fueron alimentados con una dieta
de “pellet” estándar y agua ad libitum.
Las serpientes fueron capturadas durante la realización de cinco giras de colectas, una
de las giras fue realizada a Punta Soropta, Bocas del Toro, y las otras cuatro a El Valle de
Antón, Coclé. En estas giras se colectaron 10 ejemplares de B. asper (Figura 1A) y 5 ejemplares de P. lansbergii (Figura 1B). Los especímenes colectados fueron mantenidos en cautiverio en terrarios acondicionados según las necesidades de las serpientes, para lo cual se
incluyó un bebedero para cada animal. Las serpientes fueron alimentadas de acuerdo a las
preferencias de cada especie.
SALUDLATINA
095
Obtención del veneno
La extracción del veneno de las serpientes B. asper y P. lansbergii se realizó por medio
del método tradicional de ordeño, el cual consistió en forzar la mordida de cada serpiente
a través de un guante que cubría la boca de un recipiente colector mientras se exprimían
manualmente las glándulas de veneno del animal. El veneno colectado de cada serpiente se
mezcló en un “pool” y fue congelado a -20°C hasta que fue utilizado.
Toxicidad
Ratones BALB/c fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 100 mL de veneno
de B. asper y P. lansbergii diluido 1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000 en solución salina estéril. Los animales fueron observados diariamente durante 72 h para detectar signos de toxicidad (disminución de la actividad y muerte). Las inmunizaciones descritas más adelante se realizaron
a partir de veneno de serpiente diluido 1:1000.
Producción de Antisuero
Veinte ratones BALB/c fueron distribuidos al azar en cuatro grupos. El primer grupo,
fue inoculado i.p. con 100 mL de veneno de B. asper diluido 1:1000 en solución salina estéril, siguiendo el esquema que se muestra en la tabla 1.
Día
0
7
14
26
33
Tabla 1. Esquema de inmunización de ratones BALB/c
con veneno de B. asper.
Cantidad de Veneno (mL)
Cantidad de Adyuvante (ml)
0.5
99.5 (Adyuvante Completo)
1.0
99 (Adyuvante Incompleto)
1.0
99 (Adyuvante Incompleto)
1.5
98.5 (Adyuvante Incompleto)
1.5
98.5 (Adyuvante Incompleto)
El segundo grupo de ratones (control) fue inyectado i.p. sólo con 100 ml de solución salina
estéril los días 0, 7, 14, 26 y 33.
El tercer grupo de ratones fue inoculado i.p. con veneno de P. lansbergii siguiendo el esquema que se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Esquema de inmunización de ratones BALB/c con veneno de P. lansbergii.
Día
Cantidad de Veneno (mL)
Cantidad de Adyuvante (ml)
0
0.5
99.5 (Adyuvante Completo)
7
1.0
99 (Adyuvante Incompleto)
19
1.0
99 (Adyuvante Incompleto)
26
1.5
98.5 (Adyuvante Incompleto)
37
1.5
98.5 (Adyuvante Incompleto)
SALUDLATINA
096
El cuarto grupo de ratones (control) fue inyectado i.p. sólo con 100 mL de solución salina
estéril los días 0, 7, 19, 26 y 37.
Se extrajeron semanalmente 500 mL de sangre de la región retroorbital de cada ratón,
desde el día 0 hasta el día 40 post-inmunización. Las muestras de sangre fueron centrifugadas
a 14 000 rpm por 10 min y el plasma fue congelado a -20°C hasta su posterior utilización.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA)
Los sueros de los ratones inoculados con veneno de B. asper y los de los ratones controles
fueron ensayados en un ELISA. Para ello, se diluyó 0.5 ml del veneno de B. asper en 49.5 mL
de solución tampón de recubrimiento (Sigma, EE.UU) por pocillo, y se incubó toda la noche a
4°C. Los platos fueron lavados cuatro veces con Tween 20 (AppliChem, Alemania) al 0.1% en
solución salina tampón de fosfato pH 7.4 (PBS, Sigma, EE.UU). Luego, los platos fueron cubiertos con PBS que contenía 5% de leche en polvo y se incubaron durante 1 h a 37°C. Posteriormente, se lavaron cuatro veces con PBS-Tween y se agregó en cada pocillo 100 mL de suero
de los ratones inoculados, diluido 1:50 en PBS que contenía leche descremada al 5%. Seguidamente, los platos fueron incubados durante 1 h a 37°C y se lavaron con PBS-Tween. Luego,
se agregó en cada pocillo 100 ml de anticuerpos anti-IgG de ratón marcados con peroxidasa
(Jackson ImmunoResearch, EE.UU), diluida 1:5000 en PBS que contenía 5% de leche en polvo.
Posteriormente, los platos fueron incubados durante 1 h a 37°C y luego fueron lavados con
PBS-Tween y se agregó 100 mL de una solución de o-fenilenediamina (Sigma, EE.UU) a 2 mg/
mL en solución tampón de fosfato de potasio al 0.01 M, pH 7.3 (Sigma, EE.UU) en presencia de
peróxido de hidrógeno (Fischer Scientific, EE.UU) al 0.06%.
La reacción se desarrolló durante 10 min a 37°C en oscuridad. Luego de lo cual se detuvo
añadiendo HCl al 1 M por pocillo y se midió la absorbancia a 492 nm con un lector de platos
de microtitulación (HumanReader HS, Alemania).
Los sueros de los ratones inoculados con veneno de P. lansbergii y los de los controles
también fueron ensayados en un ELISA utilizando veneno de P. lansbergii, siguiendo la metodología descrita arriba.
Adicionalmente, se realizaron inmunoensayos para determinar si los sueros de los ratones
inmunizados con veneno de B. asper reconocían el veneno de P. lansbergii y viceversa.
Análisis estadístico
Los datos fueron evaluados por medio de un análisis de varianza (ANOVA). Los resultados
se presentan como el promedio de las absorbancias ± la desviación estándar. P < 0.05 fue
considerado como nivel de significancia estadística.
RESULTADOS
Las inoculaciones realizadas con diluciones 1:1, 1:10 y 1:100 de veneno de B. asper y P.
lansbergii causaron la muerte de los ratones. Los animales inmunizados a partir de diluciones
de veneno 1:1000 sobrevivieron todo el estudio.
SALUDLATINA
097
Los sueros murinos obtenidos a partir del día 7 post-inmunización con veneno de B.
asper, reconocieron (p < 0.001) el veneno de esta serpiente en un ELISA (Figura 2). En el
caso de los ratones inoculados con veneno de P. lansbergii, los sueros obtenidos a partir
del día 19 post-inmunización (p <0.001) reconocieron el veneno correspondiente (Figura
3).
Los sueros de los ratones inmunizados con veneno de B. asper reconocieron el veneno
de P. lansbergii y viceversa
Figura 1. Especímenes colectados de A. Bothrops asper (Equis) y B. Porthidium lansbergii (Patoca).
Figura 2. Promedio de las absorbancias registradas desde el día 0 hasta el día 40 por
medio de un ELISA realizado con antisuero murino post-inoculación con veneno de B.
asper. Desde el día 7, se observa un incremento en la absorbancia de los ratones inmunizados con veneno de B. asper a diferencia de los ratones controles no inmunizados. * P <
0.001. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2 mg/mL, H2O2 0.06%.
SALUDLATINA
098
Figura 3. Promedio de las absorbancias registradas desde el día 0 hasta el día 37 por
medio de un ELISA realizado con antisuero murino post-inoculación con veneno de P. lansbergii. Desde el día 19, se observa un incremento en la absorbancia de los ratones inmunizados con veneno de P. lansbergii a diferencia de los ratones controles no inmunizados. *
P <0.001. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2 mg/mL, H2O2 0.06%.
DISCUSIÓN
Las variaciones geográficas de los componentes del veneno de los ofidios, demandan
el desarrollo de pruebas inmunodiagnósticas regionales, específicas para las serpientes
que habitan una región determinada (Brunda et al., 2006; Núñez Rangel et al., 2012).
Existen reportes de trabajos realizados en otros países, que demuestran que es posible
la utilización de inmunoensayos, para la detección de veneno de serpientes con fines diagnósticos (Theakston, 1983; Cox et al., 1992; Chavez-Olortegui et al., 1993, Kulawickrama
et al., 2010, Núñez Rangel et al., 2012).
Esta investigación forma parte de un proyecto destinado a desarrollar un método para
la detección del veneno de B. asper y P. lansbergii en suero. La identificación de la serpiente involucrada en el accidente ofídico, permite la selección del antiveneno específico
correcto (Núñez Rangel et al., 2012).
Los antisueros murinos contra B. asper y P. lansbergii podrían ser utilizados en el diseño de un dispositivo que detecte los niveles séricos de los venenos de B. asper y P. lansbergii en víctimas de accidentes ofídicos y en animales envenenados experimentalmente.
Resultó evidente que la inmunización de los ratones con veneno de B. asper se alcanzó
antes que la realizada con veneno de P. lansbergii, esto podría deberse, al menos en parte,
a diferencias en la inmunogenicidad de los componentes de los venenos de ambas serpientes.
El hecho de que los sueros de los ratones inmunizados con veneno de B. asper reconocieron el veneno de P. lansbergii y viceversa, podría deberse a que ambos venenos poseen
algunos inmunógenos similares y/o a reacción cruzada.
SALUDLATINA
099
El desarrollo de inmunoensayos para la detección del veneno de B. asper y P. lansbergii podría contribuir a mejorar el diagnóstico y tratamiento de los accidentes ofídicos en
Panamá.
En conclusión, los sueros obtenidos de ratones inmunizados con veneno de B. asper y
P. lansbergii reconocen el veneno de estas serpientes. En la siguiente etapa de esta investigación, estos antisueros serán ensayados en el.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT)
por financiar esta investigación.
BIBLIOGRAFÍA
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SALUDLATINA
Fisioterapia
101
“Gimnasia laboral aplicada a la disminución del estrés laboral y mejora
del desempeño en los colaboradores de Panasonic Latin America”
AUTOR: Nicole R. Fish M.
Panasonic Latin America; Panamá, Panamá.
RESUMEN
La Gimnasia Laboral (GL) es una técnica
de cinesiterapia en donde se aplica ejercicios en el área de trabajo de un individuo. Este
estudio se realizó con el objetivo de realizar
ejercicios en el puesto de trabajo en corto
tiempo sin generar gastos de tiempo ni dinero al empleador de quien lo práctica. Para
ello, se elaboró un programa de GL para la
empresa Panasonic Latin America PLA con el
propósito de que los realizaran 3 veces diarias 6 ejercicios, con ello comprobar al cabo
de 8 semanas que disminuye el estrés en estas personas y mejora su desempeño laboral. Participaron de este estudio 21 personas
para conseguir un 85% de acertamiento. Se
realizó una encuesta al inicio y al final del
estudio. Para 136, la evaluación del estrés
se realizó la suma de las ponderaciones en
donde se clasifico el estrés como nulo, poco
o mucho. El inicio en relación al final del estudio es que en su mayoría migraron hacia lo
positivo hablando del estrés. Al final, logramos comprobar que se disminuye el estrés
con tan solo 18 min de ejercicio diario aproximadamente y se mejoró el desempeño levemente.
ABSTRACT
The Labor Gymnastics (L.G.) is a
kinesitherapy
technique
in
which
exercise is done at the work place of an
individual. This study was conducted
with the purpose of encouraging exercise
in the workplace taking a short period
without generating costs, in both time and
money for the employer of the personnel.
These L.G programs were developed for
the company Panasonic Latin America
PLA. The plan included to do six kinds
of exercises, three times a day, with a
follow up. After eight weeks we found
that stress was reduced on these people
and their job performance had improved.
The study group of 21 people resulted
in approximately 85% of improvement.
A survey was conducted at the beginning
and end of the study. For the evaluation
of stress, it was classified as a lot, little
or none. Over the course of the study
it was found that most participants mi
grated from the negative state to the
positive one. At the end of the study we
saw that with only 18 minutes of daily
exercise, an improvement in both stress
reduction and production was obtained.
Key Words
Labor Gymnastics, stress at work, sedentary work, job performance, physical self.
Palabras Claves
Gimnasia Laboral, Estrés laboral, sedentarismo laboral, Desempeño Laboral, autogestión física.
SALUDLATINA
102
INTRODUCCION
La gimnasia laboral es una nueva disciplina que busca prevenir las lesiones y
dolores posturales, que repercute en la disminución del estrés y motiva a los empleados de una empresa a través de estiramientos, ejercicios de balance y coordinación que serán llevados a cabo en el área de trabajo durante cortos períodos de
tiempo.
Este proyecto llevó como misión central, la prevención de los problemas
laborales producidos por estrés en los colaboradores de Panasonic Latin America
y como objetivos la poca “pérdida de tiempo laboral” por parte de los colaboradores que quisieran participar. Estuvo conformado por tres fases de aplicación que
fueron:
La capacitación del programa
La supervisión de los ejercicio in situs laboral
La recolección de los datos
Se muestra por parte de colaboradores y de la empresa un gran entusiasmo por
la aplicación de dicho programa.
MATERIALES
Folleto Invitación, Presentación en Power Point de la capacitación, programa de
GL para PLA, cuadros de supervisión.
MÉTODOS
En 21 personas se aplica un programa de gimnasia laboral para disminuir el estrés laboral y mejorar el desempeño al cabo de 8 semanas.
RESULTADOS
Con una intensidad media y una mediana de 18 ejercicios diarios, durante 8 semanas en el puesto de trabajo, se logró que mejorara el estrés en los empleados en un 80%
aproximadamente.
Al igual que en el estrés la mayoría de los colaboradores que participaron del
estudio mejoraron su desempeño laboral en casi un 90%.
SALUDLATINA
103
DISCUSIÓN
Los ejercicios a corto tiempo aplicados en el puesto de trabajo funcionan para
disminuir el estrés en los empleados de una empresa y a mejorar su desempeño
laboral.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al profesor Rudy Quijano y Flia. que me apoyaron en todo momento,
a mi Flia. que siempre fueron mis pilares para alcanzar esta meta. Y a mis compañeras porque juntas superamos esta etapa.
BIBLIOGRAFÍA
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Kounnovsky, N. 1981. Cómo lograr una buena condición Física con solo seis
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Revista Salud Latina 2013