UNIVERSIDAD ESPECIALIZADA DE LAS AMÈRICAS FACULTAD DE SALUD Y REHABILITACIÒN INTEGRAL TECNICO DE INSTRUMENTACIÒN QUIRÙRGICA CATEDRA: BIOQUÌMICA I TEMA: ACTIVIDAD ENZIMÁTICA PRESENTADO POR: YIRA ARMUELLES CED. 4-715-930 NATALIE BEITIA CED.4-776-1896 ANGELICA JAEN CED. 4-763-1912 NORA MARTINEZ CED. 4-724-844 ISABEL RYFKOGEL CED. 4-786-2119 ALEJANDRA LEZCANO CED. 4-780-1247 KEISY CASTILLO CED. 4-756-916 FACILITADOR: JOSÈ SANCHEZ PRIMER TRIMESTRE 29/05/2015 1 INDICE Introducción………………………………………………………….………………..3 Marco teórico………………………………………………………………………….3 Objetivo general y especifico………………………………………..………………3 Materiales……………………………………………………………..……………….4 Métodos……………………………………………………………….……………….5 Resultados……………………………………………………………..………………7 Discusiones…………………………………………………………………………….8 Conclusiones y recomendaciones…………………………………..………………10 Bibliografía……………………………………………………………….…………….10 2 INTRODUCCIÓN El siguiente experimento está basado en el reconocimiento de la actividad enzimática mediante la comprensión de uno de los principales procesos ocurridos en los organismos vivos, esta es la representación química de la digestión de almidón usando la saliva que como todos conocemos es uno de los elementos primarios que nos permiten la transformación de los alimentos de compuestos más grandes a cadenas más simples para seguir todo el proceso de la digestión y por consiguiente obtención de energía de los mismos, por ende efectuaremos diferentes procedimientos para identificar la enzima en dicha solución (la saliva) mediante la inclusión de identificadores , también con los mismos identificadores, reconoceremos la composición de los productos finales obtenidos de dicha reacción. Marco teórico El proceso de la digestión comienza en la boca, donde los alimentos son embebidos por la saliva, triturados y divididos por la acción de la masticación y, una vez formado el bolo, deglutidos. La saliva es una secreción compleja proveniente de las glándulas salivales mayores en el 93% de su volumen y de las menores en el 7% restante, las cuales se extienden por todas las regiones de la boca excepto en la encía y en la porción anterior del paladar duro. Es estéril cuando sale de las glándulas salivales, pero deja de serlo inmediatamente cuando se mezcla con el fluido crevicular, restos de alimentos, microorganismos, células descamadas de la mucosa oral, etc. Las glándulas salivales están formadas por células acinares y ductales, las células acinares de la parótida producen una secreción esencialmente serosa y en ella se sintetiza mayoritariamente la alfa amilasa, esta glándula produce menos calcio que la submandibular, las mucinas proceden sobre todo de las glándulas submandibular y sublingual y las proteínas ricas en prolina e histatina de la parótida y de la submandibular. Las glándulas salivales menores son esencialmente mucosas. El 99% de la saliva es agua mientras que el 1% restante está constituido por moléculas orgánicas e inorgánicas. La saliva es un buen indicador de los niveles plasmáticos de diversas sustancias tales como hormonas y drogas, por lo que puede utilizarse como método no invasivo para monitorizar las concentraciones plasmáticas de medicamentos u otras sustancias. La saliva contiene la enzima amilasa, la cual inicia los primeros pasos de la digestión de los polisacáridos, almidón y glucógeno y los descompone en cadenas más cortas de distintos largos. Las enzimas son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas. Además de su importancia como catalizadores biológicos, tienen muchos usos médicos y comerciales. Un catalizador es una sustancia que disminuye la energía de activación de una reacción química. Al disminuir la energía de activación, se incrementa la velocidad de la reacción. La mayoría de las reacciones de los sistemas vivos son reversibles, es decir, que en ellas se establece el equilibrio químico. Por lo tanto, las enzimas aceleran la formación de equilibrio químico, pero no afectan las concentraciones finales del equilibrio. Objetivo general: Determinar la actividad enzimática encontrada en la saliva. Objetivos específicos: Reconocer la característica proteica de la enzima amilasa. Observar la actividad enzimática al mezclar la saliva con el almidón. Analizar los productos obtenidos de la reacción (digestión de polisacáridos). 3 MATERIALES Instrumentos de laboratorio utilizados 3 tubos de ensayo con tapa 2 vasos regulares 1 vaso térmico Estufa eléctrica Termómetro Pipeta Materiales necesarios para el laboratorio 2 goteros Papel toalla 2 Toallones Marcador Regla Bata de laboratorio Computadora Mar King tape Alcohol tópico Almidón Soluciones a utilizar Lugol (iodo) Benedict Biuret Solución biológica: Saliva 4 MÉTODOS Instrucciones para la preparación de las muestras que serán usadas en el laboratorio. Se debe de lavar los tubos de ensayo antes y después de haber sido utilizados. Lavado con Alcohol (10 %) (100) y Jabón (100 ml de H2O). Colocar todos los materiales a utilizar sobre la mesa. Preparar las soluciones y los reactivos para el experimento. Solución de Almidón: (se necesita agua caliente) Llena medio tubo cónico pequeño con polvo de almidón y vacía su contenido en el vaso graduado señalado Al, agrega 3 ml de agua fría y revolver bien para formar una pasta lisa. Después mientras se revuelve, se le agrega gradualmente agua caliente hasta la marca de 50 ml. Permitir que la solución se enfríe antes de hacer las pruebas. Procedimiento: a) ¿Es la enzima amilasa una proteína? recolectar saliva(no moco) en un vaso, agregar 10 ml de agua y revolver llenar el tubo de ensayo (1) con 1ml de solucion de saliva llenar el tubo de ensayo (2) con 1ml de agua (control) agregar 1 ml de solución Biuret a los tubos de ensayo (1) y (2) colocar los tubos en un vaso y observar los cambios lavar con cuidado los dos tubos de ensaye que se usaron antes de proceder con el siguiente experimento 5 b) Examina la actividad enzimática de la amilasa 1. llenar los tubos de ensaye 1, 2 y 3 con 1 ml de solución de almidón 2. agregar 1 ml de la solución de saliva a los tubos de ensaye 1 y 2 y revuelve 3. colocar los tubos de ensaye en un vaso 4. esperar 10 minutos 5. agregar 2 gotas de solución de benedict a los tubos de ensaye 1 y 3 6. agregar 2 gotas de solución de iodo al tubo de ensaye 2 7. examinar los cambios de color en los tres tubos de ensaye 6 RESULTADOS Preguntas Respuestas a) ¿Qué cambio observaste en el tubo de ensaye 1? Se tornó a un color verde olivo b) ¿Qué cambio observaste en el tubo de ensaye 2? Se mantuvo el color celeste c) ¿qué indica la aparición del color morado? Presencia de proteína. b) Preguntas Respuestas a. ¿qué cambio observaste en el tubo de ensaye 1? b. ¿qué indica la aparición de un color naranja-amarillo? explica c. ¿qué cambio observaste en el tubo de ensaye 2? d. ¿qué indica esto? explica Coloración a amarillo e. ¿qué cambio observaste en el tubo de ensaye 3? explica No hubo cambios Reacción es positiva Cambio de color a azul Presencia de polisacáridos (almidón) 7 DISCUSIONES Es importante iniciar explicando algunas de las reacciones que han ocurrido durante este experimento. El efecto de la temperatura utilizada en este caso el baño maría, sobre las enzimas podemos explicarla con la siguiente premisa: puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimática, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una pérdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas está, con pocas excepciones, entre 30°C y 40°C,( razón por la cual usamos este rango en la experiencia), en que la actividad es máxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10°C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por desnaturalización térmica. Para muchas enzimas la región de inactivación térmica extensiva está muy próxima de la temperatura óptima. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Las proteínas están formadas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, mismos enlaces que presentan 2 pares de electrones libres que forman un complejo de coordinación con el ion cúprico que se forma por la disociación del sulfato de cobre contenido en el reactivo de Biuret, el complejo formado da origen al color violeta. Comprobamos que el líquido del tubo adquirió un cierto color verdoso olivo. Dándonos asi una reacción negativa, probablemente por la desnaturalización de la enzima de la saliva a causa de un aumento exorbitante de temperatura puesto que a pesar que iniciamos a 40 0C luego al observar el color verde teníamos una temperatura de 78 0C. Para el procedimiento de la parte b, la Prueba de Benedict se usa para detectar la presencia de azúcares reductores porque este contiene cobre y éste se reduce en presencia de azúcares reductores. Durante esta reacción el azúcar se oxida y se torna de color amarillo-naranja. La reacción antes mencionada se conoce como una reacción oxidación-reducción. Un punto interesante de esta práctica es la explicación del proceso de digestión de la saliva sobre el almidón. Se remueve el tubo para que la saliva se mezcle con el almidón, se añadió un poco de agua para facilitar esa mezcla. Como la amilasa de la saliva (enzima que “digiere” el almidón hasta transformarlo en maltosa) actúa normalmente a la temperatura corporal (37 ºC), pudimos agilizar el proceso calentando un poco , evitando la desnaturalización de las enzimas por excesivo calor, después el reactivo de benedict y lugol determinan presencia de diferentes compuestos finales de la reacción. 8 También la glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Su concentración en la sangre está sometida a un cuidadoso mecanismo de regulación en individuos sanos y, en personas que padecen diabetes, aumenta sustancialmente. Esto lleva a que éste sea el azúcar reductor generalmente considerado en las reacciones de glucosilación no enzimática de interés biológico. Los azúcares reductores son aquellos azúcares que poseen su grupo carbonilo intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar como reductores con otras moléculas. Estos provocan la alteración de las proteínas mediante la reacción de glucosilación no enzimática. El método de reacción de Lugol se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. El tubo 1 contenía saliva y almidón los cuales en presencia de la temperatura optima da como resultado la producción de azucares reductores como ejemplo, la maltosa, esta al actuar en presencia del biuret se torna de un color amarillo- naranja , indicador de la oxidación del péptido con el cobre. El tubo 2 tenía saliva y almidón , al agregar el lugol, se tornó de un color azul característico de la reacción del yodo en contacto con polisacárido en este caso el almidón. Y al final el tubo 3 el cual solo tenía almidón , al reaccionar con el biuret no tiene ningún cambio puesto que el mismo no actúa sobre polisacáridos sino sobre azúcares reductores. 9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible , pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. La Amilasa es una enzima que fragmenta el almidón en sus componentes. La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de diastasa. Los órganos productores de amilasa sérica son: Las glándulas salivares; sobre todo en las glándulas parótidas, que secretan amilasa que forma parte de la saliva para degradar almidones y el páncreas. Es importante reconocer la importancia de los factores que afectan la actividad enzimática: Concentración del sustrato.- A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. Concentración de la enzima.- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite. Temperatura.- Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. En este punto es algo muy esencial puesto que es uno de los factores más importantes para que la enzima realice un trabajo óptimo. pH.- El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago cuyo pH óptimo es ácido. Presencia de cofactores.- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima. 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