INFORME 1: PRACTICA 1

Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
INFORME 1: PRACTICA 1. ESTERILIZACIÓN + PRACTICA 2. MORFOLOGIA MICROBIANA Y
MUESTREO DE AMBIENTES Y SUPERFICIES + PRACTICA 7. MICROMYCETOS
RESUMEN
En el laboratorio de microbiología se realizaron los pasos y se conocieron los requisitos mínimos para
poder esterilizar y operar adecuadamente los implementos de trabajo, en la práctica 1 se conocieron los
métodos de eliminación total de las bacterias que contaminan las herramientas de laboratorio durante su
uso como lo son cajas de petri; asas; probetas etc. También se realizo la preparación de dos tipos de
agar en nuestro caso correspondió el agar Plate Count, utilizado para cultivar bacterias y el agar
saboreaud para cultivar hongos. Una semana después en el laboratorio de microbiología se tomaron
muestras de yogur, de la boca de un compañero, también se hizo muestreo de superficies en la sede de
ingeniería ambiental, en manos de un compañero y otra al ambiente, por último se sembraron en los
agares saboreau y plate count para cultivar las muestras anteriormente mencionadas. Ahora bien una
semana después se revisaron las muestras y se hizo el reconocimiento morfológico de las bacterias
cultivadas de yogur, boca, ambiente, superficie y manos a través de la tinción de gram y observando en el
microscopio. Finalmente para la práctica siete se analizaron los hongos cultivados en la practica 2 y se
hizo su respectiva identificación.
Palabras Clave: Esterilización, hongos, bacterias agar
ABSTRACT
In the microbiology laboratory were performed the steps and met the minimum requirements to operate
properly sterilized and work tools, in practice the methods met a total elimination of bacteria that
contaminate the laboratory tools for use as are petri dishes, handles, cylinders etc. Also we made the
preparation of two types of agar in our case accounted Plate Count agar, used to grow bacteria and fungi
to grow Saboreaud agar. A week later at the microbiology laboratory yogurt samples were taken from the
mouth of a partner, was also sampled surfaces at the headquarters environmental engineering in the
hands of a partner and the other to atmosphere, and finally planted in the and plate count agars saboreau
to grow the samples above. But a week after the samples were revised and became the morphological
recognition of bacteria cultured yogurt, mouth, atmosphere, surface and hands through Gram staining and
observing under the microscope. Finally, to practice seven cultivated mushrooms were analyzed in
practice 2 and their respective identification was made.
Keywords: Sterilization, fungi, bacteria agar
OBJETIVO GENERAL
Realizar prácticas de laboratorio a través de las
guías y especificaciones dadas por la profesora
de microbiología.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Esterilizar los materiales de laboratorio.
2. Cultivar hongos y bacterias a través de
los agares dados en la práctica.
3. Realizar muestreos para aislar
microorganismos.
4. Preparar eficientemente agares para el
cultivo de hongos y bacterias.
5. Identificar las especies de hongos y
bacterias encontrados en el laboratorio
6. Aprender a realizar un montaje
microscópico para la observación de
hongos unicelulares y pluricelulares.
7. Aprender a realizar un microcultivo
para la observación de estructuras
fúngicas intactas.
8. Reconocer las diferentes estructuras
fúngicas vegetativas y de reproducción.
1.1: Materiales Práctica 1.1: Esterilización
1.
2.
3.
4.
Papel Kraft
Horno Eléctrico
Cajas de petri
Pipetas
Fardy Díaz
Laura Vélez
1: Metodología Práctica 1: Esterilización
Se realizo la limpieza del mesón de trabajo con
alcohol, después se tomaron tiras de papel Kraf
y se envolvieron las pipetas con mucho cuidado
de que quedaran bien empacadas, luego se
envolvieron en grupos de 3 cajas de petri en fila
una encima de otra y se envolvieron,
observamos de que estuvieran bien envueltas,
finalmente el material se marco con los nombres
de los integrantes y se llevo el hasta el horno
eléctrico que elimina todo tipo de vida incluidas
las endoesporas a través de calor seco para
esto se calibro la temperatura del horno a 160
grados centígrados que es la utilizada en la
técnica de esterilización de material de
laboratorio y se cronometro un tiempo de dos
horas
para la eliminación total de
microorganismos que se encontrasen en ese
momento en las cajas de petri y pipetas ya para
finalizar con mucho cuidado se retiro el material
con guantes y se dejo enfriar para su posterior
uso.
1.2 Materiales Practica 1.2 Esterilización
medios de cultivo
1. Agua Destilada.
2. Medio de cultivo Standard Plate Count
Agar
3. Medio de cultivo Sabouraud Dextrosa
Agar / Potato Dextrose Agar
(SDA/PDA)
4. Cajas de Petri.
5. Frascos tapa rosca.
6. Cinta indicadora.
7. Balanza.
8. Estufa.
9. Autoclave.
1.2 Metodología Practica 1.2 Esterilización
medios de cultivo
Los medios de cultivo para microorganismos se
venden en forma deshidratada, de modo que su
preparación implica únicamente mezclarlo con
agua destilada, pesando la cantidad
recomendada por el fabricante.
1. Se pesó la cantidad requerida del cultivo
deshidratado de acuerdo a las instrucciones
de la etiqueta.
Microbiología Ambiental
FUAC
2. Se transfirió el polvo a un recipiente de
vidrio resistente al calor se agrego el agua
destilada medida en una probeta.
3. Se calentó el medio de cultivo hasta su
ebullición.
4. En el caso del PDA o SDA adicionar el
cloranfenicol después de la ebullición,
inmediatamente antes de ingresar el medio
al autoclave.
5. Se Colocó tapa rosca sin apretar, o papel
aluminio, para esterilizar el medio en
autoclave.
6. Se colocó cinta indicadora sobre la tapa del
recipiente.
PROCESO DE ESTERILIZACION
Con el fin de eliminar todos los microorganismos
contaminantes y obtener el crecimiento
únicamente de los organismos que nos
interesan, los medios de cultivo son sometidos a
un tratamiento térmico conocido como
esterilización húmeda por medio de un equipo
conocido como autoclave.
El autoclave es un equipo hermético que
permite la entrada de vapor de agua a presión.
El uso de calor húmedo permite la muerte de los
microorganismos incluidas las endoesporas
bacterianas. Experimentalmente se ha
determinado que el tiempo requerido para matar
las endoesporas bacterianas es de 10-20
minutos y la temperatura de 1210C, razón por la
cual los autoclaves se han diseñado para
alcanzar esta temperatura. El autoclave utiliza la
presión para lograr esta temperatura, siendo la
presión de 15 libras por pulgada cuadrada, la
requerida para lograr 1210C de temperatura.
1.3 Metodología Practica1.3 Esterilización de
cultivos
1. Se coloco un pequeño trozo de cinta
indicadora a cada uno de los elementos a
esterilizar, con el fin de confirmar al final del
ciclo de esterilización, que la temperatura
de 1210C fue alcanzada en cada uno de los
materiales esterilizados.
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
2. Se introdujeron los elementos en el
autoclave dejando suficiente espacio entre
ellos, para permitir un adecuado contacto
con el vapor.
3. El tiempo de esterilización de los medios de
cultivo vienen definidos por el fabricante en
la etiqueta correspondiente, generalmente
es de 10-15 minutos.
4. Una vez cumplido el tiempo de
esterilización y únicamente cuando el
indicador de presión marque cero, podemos
abrir el autoclave, dejando la puerta o tapa
entreabierta por 15 minutos.
5. Utilizando alguna protección para el calor,
se retiro el medio de cultivo nos permitió
que se enfríe ligeramente, al ambiente (No
colocarlo en agua o en una superficie muy
fría).
6. Cuando tenga una temperatura cercana a
los 500C, lo vertió en las cajas de Petri,
esterilizadas previamente en el horno, en
una superficie previamente desinfectada y
siempre cerca de la llama.
7. Se marcaron las cajas con las iníciales del
medio de cultivo utilizado, en la tapa.
8. Una vez el medio se encuentre a una
temperatura por debajo de 450C, se
solidifica y puede ser utilizado.
9. Si el medio no se ha de utilizar
inmediatamente se guardo en forma
invertida en la nevera.
10. Se tomó una caja de cada tipo de medio y
se colocó en la incubadora a 30ºC como
prueba de esterilidad del medio de cultivo.
11. Se observó las cajas a las 24 horas. Si el
procedimiento ha sido adecuado no debe
aparecer ningún tipo de crecimiento en las
cajas incubadas.
2.1
Materiales Practica 2.1 Morfología
bacteriana
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Crystal Violeta.
Lugol.
Alcohol Acetona.
Fuscina.
Microscopio.
Mechero.
7.
8.
9.
10.
Agar Plate Count.
Cajas de petri.
Gotero.
Yogur
2.1 Metodología
Morfología Bacteriana
En esta práctica se tomaron muestras del sarro
dental de un compañero de laboratorio, de
yogur natural y contaminación ambiental
brindada por el laboratorio. Ahora esas
muestras tomadas a través de un asa metálica y
un algodón se esparcen en una lamina de vidrio,
luego se le aplica una gota de agua y se seca
las muestras con el mechero, ya secas la
muestras se le realizó el proceso de la tinción
de gram que consiste en identificar el tipo
bacterias a través de una serie de químicos que
se le aplican en el siguiente orden y tiempo de
exposición:
Tabla 1: Tinción de Gram
Compuesto
Crystal Violeta
Se lava la muestra
Lugol
Se lava la muestra
Alcohol Acetona
Se lava la muestra
Fuscina
Tiempo
de
Exposición
1 Minuto
Se lava la muestra
1 Minuto
Se lava la muestra
15 – 30 Segundos
Se lava la muestra
1 Minuto
Hay dos tipos de bacterias, gram positivas y
gram negativas. Las bacterias gram positivas se
pueden apreciar en el microscopio de coloración
morada, las bacterias gram negativas se
pueden mirar en el microscopio de color rosada,
ahora bien esto es porque las bacterias se
componen de peptidoglucano, en las bacterias
gram positivas se determinan que absorben
hasta un 90% de peptidoglucano, mientras que
las bacterias gram negativas absorben un 10%
de peptidoglucano
Después de que se realizó la tinción de gram las
tres muestras se marcaron y se dejaron secar
para su correspondiente análisis en el
laboratorio de microscopia, en donde se
determino el tipo de bacteria por su coloración y
su forma esto con ayuda de bibliografía para
determinar con precisión e identificar el nombre
de las bacterias.
Fardy Díaz
Laura Vélez
2.2 Metodología
Muestreo de Ambientes y Superficies
Se preparó agar para cultivar bacterias y agar
para cultivar hongos, se escogió agar plate
count para aislar las bacterias y agar saboreaud
para cultivar los hongos. El agar Plate count(1)
esta hecho de nutrientes de suplemento de
tryptone, vitaminas de extractos y glucosa que
le dan energía para el crecimiento de las
bacterias, su preparación normal es 25g del
agar deshidratado en 1 litro de agua destilada,
hervir lentamente y agitar hasta que se disuelva,
esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a
una temperatura de 121 °C y finalmente servir
en las cajas de petri. Ahora el agar
Saboreaud(2) se utiliza para cultivar hongos y
levaduras, este agar esta hecho a partir de
muestras de alimentos, derivados de leche y
cosméticos. Algunos procedimientos señalan
bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido
tartárico al 10 %, para inhibir el crecimiento
bacteriano. Su preparación recomendada es
39g del medio en un litro de agua destilada,
calentar y hervir 1 minuto y esterilizar en el
autoclave a 121 °C y dejar enfriar durante 15
minutos a una temperatura de 40 – 45 °C y
servir en las cajas de petri estériles. Las
muestras son tomadas en manos de un
compañero, ambiente y superficies, se hizo
muestreo de superficie el en borde de la
baranda de una escalera, la de ambiente se
hizo al aire libre en un pequeño patio y la de
manos se pasó el isopo entre los nudillos y las
uñas de las manos de un compañero, se tomo
un tubo de ensayo con agua destilada y se
sumergió la muestra, también se hizo lo del tubo
de ensayo con la muestra de superficies.
Después de hacer esto se realizó el respectivo
cultivo en el agar para bacterias dentro de las
cajas de petri y en el agar de los hongos en la
respectiva caja de petri . Se determino la
temperatura de crecimiento de las bacterias a
37 °C, durante 24 – 48 horas y para los hongos
de 8 dias de incubación a una temperatura de
25 – 28 °C. En total se hizo esto en 6 cajas de
petri, 3 para hongos y 3 para bacterias. Luego
se realizo el proceso de esterilización en una
cámara a través de un horno que funcionaba
con bombillos halógenos, primero se limpio el
mesón con alcohol, después se acomodaron las
6 cajas de petri una encima de otra, finalmente
se encendió la cámara y se espero un lapso de
tiempo de 10 minutos para retirar las cajas de
Microbiología Ambiental
FUAC
petri y volver a limpiar el mesón con alcohol, ya
para terminar se dejaron las cajas de petri
marcadas con la fecha, agar y tipo de
muestreo, es decir ambiente, manos y
superficie.
7. Materiales Práctica Micromycetos.
1. Portaobjetos
2. Cuabreobjetos.
3. Asas Micológicas.
4. Tinción de Azul de Lactofenol
5. Cultivos fúngicos.
6. Acido láctico.
7. Solución estéril de glicerina al 5%.
8. Caja de petri con cámara húmeda para
montaje de microcultivo.
9. Bisturís.
10. Alcohol al 70%.
11. Pipetas estériles.
12. Microscopio.
13. Mechero.
7.1 Metodología Práctica Micromycetos.
Montaje
Se desinfectó el mesón de trabajo con alcohol
en concentración al 70%, Luego se paso el
bisturí por el mechero para eliminar
contaminación y se hizo un corte cuadrado de 1
cm2 en el agar ya preparado de P.D.A para
hongos, el cuadrado de agar cortado se colocó
sobre una lámina de la cámara húmeda y se
paso por el mechero un cubreobjetos y se puso
por encima de la superficie del agar, después se
aplicó 2 ml de solución estéril de glicerina al 5%,
en el fondo de la cámara húmeda , se tomó la
muestra de los hongos cultivados desde la
practica 2, se escogió la muestra de ambiente,
se abrió la caja de petri del cultivo de hongos de
ambiente cerca del mechero para que no se
contaminara y se realizó la toma de muestra a
través de un asa previamente flameada en el
mechero, ya con la pequeña porción de muestra
se sembraron 4 puntos en el agar y se le puso
el cubreobjetos, para finalizar la muestra se
incuba en un tiempo de 5 – 8 días, la caja se
invierte y se marca con los nombres de los
integrantes del grupo, se somete a temperatura
ambiente para su posterior análisis en el
microscopio.
Observación de microcultivo
Pasada una semana después de someter una
muestra ambiente de hongo a la cámara
húmeda se retira el cubreobjetos, ahora bien
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
previamente en el laboratorio de microscopia se
aplica una gota de azul de lactofenol a la lamina
de vidrio y graduar el aumento del microscopio a
10x y 40x y se registro las estructuras del
hongo.
Color del reverso de la colonia: negro
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: si
Presencia de zonación: ocupa un gran espacio
Textura: aterciopelada
Resultados. Practica: 1 Esterilización
Imagen 2: Hongo muestra de superficie
A la semana de la práctica de esterilización
gracias a la acción del papel kraf que protegió el
material de vidrio utilizado, es decir las cajas de
petri y las pipetas del ambiente para que no se
contaminaran, estos permanecieron estériles y
listos para usarse en el laboratorio. También
porque las grandes temperaturas del horno
eliminaron toda forma de vida porque cambia
bruscamente el ambiente de las bacterias e
inhibe que estas puedan generar endoesporas,
al no poder hacer esto entran en un fase de
muerte por falta de nutrientes para su
supervivencia.
Medio de cultivo: saboreaud
Para preparar los agares en el laboratorio de
microbiología es muy necesario seguir las
indicaciones en la etiqueta de los frascos, ser
muy cuidadosos en aspectos tan fundamentales
en su preparación como lo son temperatura,
presión, cantidad disuelta, volumen a preparar,
en caso de no encontrar el agar preparado
conseguir la ficha técnica para su preparación y
seguir las recomendaciones anteriores. Esto es
importante para el optimo desarrollo de las
bacterias y hongos a cultivar. Resultados
Práctica 7: Micromycetos
Temperatura de incubación: ambiente
Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8
marzo 2012
Diámetro de la colonia: 0.7
Color del anverso de la colonia: rosado
Color del reverso de la colonia: anaranjado
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: no
Presencia de zonación: muy remoto y
pequeño el espacio
Textura: cremosa
Resultados Práctica 7: Micromycetos
Imagen 3: Hongo muestra de ambiente
Imagen 1: Hongo muestra de manos
Morfología Macroscópica.
Medio de cultivo: saboreaud manos
Temperatura de incubación: ambiente
Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8
marzo 2012
Diámetro de la colonia: 4
Color del anverso de la colonia: gris oscuro
Medio de cultivo: saboreaud
Temperatura de incubación: ambiente
Tiempo de incubación: 9 febrero 2012 – 8
marzo 2012
Diámetro de la colonia: 5.5
Color del anverso de la colonia: gris claro
Color del reverso de la colonia: negro
Presencia de pigmentos difusibles: no
Presencia de plegamientos o surcos: si
Presencia de zonación: ¼ de la caja de petri
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
Textura: algodonoso
Morfología Microscópica
Imagen 6: de la muestra de ambiente
Imagen 4: Hongo de muestra de manos
Hongo levaduriforme: no
Hongo micelial o filamentoso: si
Hifas cenocíticas o aseptadas: cenociticas
Hifas septadas: si
Presenta estructuras de reproducción:
fragmospora
Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: si
Presenta cuerpos fructíferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
Hongo levaduriforme: no
Hongo micelial o filamentoso: si
Hifas cenocíticas o aseptadas: cenociticas
Hifas septadas: no
Presenta estructuras de reproducción:
escolespora
Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: no
Presenta cuerpos fructíferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
Discusión de
esterilización.
Resultados
Práctica
de
La esterilización es el proceso por el que todas
las células vivas, esporas viables virus y
viroides son destruidos o eliminados de un
objeto o hábitat. Un objeto esterilizado esta
totalmente libre de microorganismos viables,
esporas y otros agentes infecciosos (Prescott M,
2004),(3)
Imagen 5: Hongo muestra de superficie
Hongo levaduriforme: si
Hongo micelial o filamentoso: no
Hifas cenocíticas o aseptadas:
Hifas septadas: no
Presenta estructuras de reproducción:
amerosporas
Presenta cuerpos fructíferos: cuerpos
globosos o piriformes que en el interior
contienen conidias: si
Presenta cuerpos fructíferos que en el
interior contienen ascos y ascosporas: si
En el presente trabajo se eliminaron los
microorganismos que pudieran estar presentes
en los implementos de trabajo los cuales son las
cajas de petri y las pipetas a través del
autoclave
permitiendo la inhibición de
endoesporas de las baterías
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
Tabla 2: Experimento teórico de destrucción
térmica microbiana
minutos
Numero
inicial
MO
MO
Destruidos
en 1 min.
(90% del
total)
Mo
sobrevivientes
Log
De
supervivientes
1
106
9 * 105
105
5
2
105
9 * 104
104
4
3
104
9 * 103
103
3
4
103
9 * 102
102
2
5
102
9 * 101
10
1
101
9
1
0
1
0.9
0.1
-1
6
7
Se asume que la muestra inicial contiene 106
microorganismos vegetativos por ml, y el 90%
de los microorganismos se destruyen cada
minuto de exposición. La temperatura es de 121
C (Prescott M, 2004)(3)
El tiempo que se utilizó para la esterilización del
material de laboratorio fue de 15 – 20 minutos a
la temperatura de 120 C y con la explicación de
la tabla anterior no cabe duda que se eliminó
totalmente microorganismos que se encuentre
en el material de vidrio de laboratorio. El equipo
Usado para esto fue el autoclave.
Discusión de
Micromycetos.
Resultados
Práctica
de
En la mayoría de los hongos se presenta
formación de de una estructura externa que
envuelve las esporas sexuales protegiendolas
de las condiciones adversas. Este tipo de
estructutras se denominan, según el caso,
Zigote, Ascocarpo, dando el nombre a los tres
grandes grupos de hongos Zigomycetes,
Ascomycetes y Basidiomycetes (Suarez M,
Muñoz J,),(4)
De los tres hongos analizados en el laboratorio,
se observó en el microscopio por su morfología
microscópica que presentan ascosporas con lo
cual se deduce que los hongos que se
estudiaron pertenecen al grupo de hongos
conocido con el nombre de Ascomycetes.
Los Ascomycetes protegen las esporas
sexuales dentro de un asco o asca. Los
Ascomycetes mas sencillos hacen la
reproducción dentro de un asco desnudo, tal es
el caso de algunos levaduras como la Candida
guillermondii Otros Ascomycetes han adoptado
un proceso de protección mas elaborado para
sus esporas :los ascos se envuelven dentro de
un ovillo de hifas que forman el ascocarpo; este
según su forma y la manera como libera las
esporas, recibe diferentes nombres nombres
como lo son: peritecio, apotecio y clesitotesio.
(Suarez M, Muñoz J,), (4)
En la morfología microscópica de las muestras
de manos (figura 4) se puede establecer que
posee un proceso de protección mas elaborado
en sus esporas porque posee hifas septadas,
También la muestra de ambiente(figura 6) se
observo que el hongo microscópicamente posee
hifas no septadas con las miasmas propiedades
de la muestra anterior. Por ultimo la (figura 5)
corresponde a una levadura ya que se observo
que no posee hifas y que su morfología
microscópica evidencia que tiene crecimiento
radial y textura cremosa características típicas
de las levaduras.
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
CONCLUSIONES
1. La esterilización elimina con eficacia
los microorganismos y sus esporas
garantizando buen manejo del material
en el laboratorio.
2. Los agares son el hogar de bacterias y
hongos para su óptimo desarrollo en el
laboratorio.
3. Los muestreos dan una información
fundamental a la hora de hacer
estudios con microorganismos.
4. Preparar el agar garantiza un óptimo
desarrollo de cultivos de bacterias y
hongos.
5. Con libros y el microscopio podemos
identificar especies de hongos.
6. Con la ayuda de químicos como el
lactofenol se puede observar hongos a
la perfección.
7. Tener cuidado a la hora de realizar
procesos como extracción de
muestras.
8.
Teniendo bibliografía disponible se
puede identificar macroscópicamente y
microscópicamente diversas especies
de hongos.
BIBLIOGRAFÍA
1. Medicatec, Biokar Diagnostics – Rue des
Quarante Mines, consultado el 11 abril de
2012http://www.medicatec.com/arg/?291,%
28bk144ha%29-plate-count-agar%28p.c.a.%29-500-grs.
2. Mcdlab, Especificaciones agar dextrosa y
papa, México, consultado el 11 de abril
de2012http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_
dextrosa_papa.pdf.
3. Prescott M, Microbiología. 5ed. Madrid,
McGraw Hill, 147 -149p.
4. Suárez M, Muñoz J,. Manual de
fundamentos de Micología. Universidad
Javeriana, Falcultad de ciencias. 1999. 15
19p.
.
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC
Fardy Díaz
Laura Vélez
Microbiología Ambiental
FUAC