descargar libro

III.-Capítulo 4
Polinización y fertilización in vitro.
Picca, Aurora; Cardone, Susana
1 Introducción
Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos, a
su vez, generan menos semillas que el número de óvulos disponibles para la fecundación.
Considerando que la producción de polen no
es el factor limitante, existen diferentes razones que explican esta situación. En ocasiones, a pesar de la ocurrencia de la polinización, la fecundación no puede llevarse a cabo.
Otras veces, la fecundación ocurre normalmente pero el embrión aborta en forma precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las
técnicas de cultivo in vitro y manipulación de
células aisladas son apropiadas para lograr el
proceso completo de desarrollo del embrión
y del endosperma y la obtención de semillas
normales.
En este capítulo se utilizarán indistintamente los términos «fecundación» y «fertilización» como sinónimos, refiriéndose a la
unión de las gametas masculina y femenina
para originar un nuevo individuo.
La técnica de fertilización o polinización
ovular in vitro fue desarrollada por Kanta
et al. en 1962, quienes demostraron que en
algunas especies de papaveráceas los granos
de polen tenían la capacidad de germinar in
vitro directamente sobre los óvulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polínico alcanzaba el saco embrionario para concretar
la fertilización, con la consiguiente formación
de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta técnica desarrollada en Papaver
somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus
caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica,
Argemone mexicana, Eschechlozia
californica, Petunia violacea, Antirrhinum
majus y Dicranostigma franchetianum.
Bajo el nombre de «polinización in vitro»
se suele englobar a varias técnicas que si bien
poseen puntos en común, difieren en otros.
Entre ellas se pueden citar la «polinización in
vitro de óvulos», la «polinización placental
in vitro» y la «polinización estigmática in
vitro». En todos los casos la gameta femenina es fecundada por células espermáticas liberadas por el tubo polínico, en forma «casi»
idéntica a la vía natural.
El término «fertilización in vitro» se utiliza para aquellos casos donde la fusión de
las gametas aisladas se logra por distintos
métodos como electrofusión, alta concentración de calcio o elevado pH.
A veces la fertilización ocurre normalmente, pero el embrión no puede alcanzar la
madurez debido a una ruptura del equilibrio
entre el mismo y el endosperma o por anomalías en el desarrollo embrionario que impiden una nutrición normal. Esto es lo que
se conoce como barreras posfertilización o
poscigóticas, que pueden contrarrestarse
con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado.
2 Fertilización in vitro
Durante años, los científicos utilizaron
técnicas de fertilización in vitro de gametas
aisladas tanto en animales como en plantas
inferiores. Sin embargo, estos métodos no
pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la década de los noventa. Esto se debió a que la fertilización in
vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que
ocurre in vivo, y también lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre.
El hecho más notable de la fertilización
in vivo de las angiospermas es el de la «doble fecundación», que es un proceso muy
complejo en comparación con lo que acontece en todos los demás seres vivos. Esto
ocurre en el saco embrionario, que se halla
profusamente cubierto por el tejido materno. Los núcleos espermáticos se encuentran
dentro de los granos de polen o tubos
polínicos. Durante la fertilización, el tubo
polínico llega hasta el aparato ovular, desorganizándose entonces el núcleo vegetativo.
Las dos células espermáticas contenidas en
el tubo, se vuelcan en una de las sinérgidas,
la misma se desorganiza y uno de los núcleos
espermáticos se fusiona con la oósfera para
dar el cigoto, que luego producirá el embrión.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
125
la célula espermática con la ovocélula, dando
como resultado un cigoto, un embrión y finalmente una planta madura.
Estudios posteriores (1998,1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro
de maíz a partir de la fusión por pares de
células espermáticas y núOósfera en fusión con uno de
cleos secundarios aislados.
los gametos
La fusión del núcleo de la célula espermática puede ocurrir con uno de los dos núNúcleos polares
cleos polares o con los núSaco embrionario
recibiendo al segundo cleos secundarios y se comSaco embrionario
gameto
pleta aproximadamente dos
horas después de la fusión in
Sinérgida que
vitro de las células. Los esturecibió el extremo
dios in vitro sobre los primedel tubo polínico
ros eventos después de la
fusión de las células y núcleos
indicaron que las primeras
células del endosperma resultante desarrollan un tejiTubo polínico
polínico
Tubo
do característico capaz de
autoorganizarse en forma
Figura 1: Corte longitudinal de un óvulo mostrando la doble fecundación
en angiospermas.
separada del tejido materno.
meninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las célu- 2.1 Aislamiento y selección de las
las asociadas. Las técnicas de micromani- gametas
pulación desarrolladas durante los años 80
Se han desarrollado métodos de aislapermitieron el aislamiento y la fusión in vitro
de gametas femeninas y masculinas de miento y selección de gametas para una
angiospermas. La combinación de estas téc- amplia variedad de especies vegetales entre
nicas con métodos de cultivo de células úni- ellas maíz (Zea mays), trigo (Triticum
cas posibilitaron la fertilización in vitro. Se aestivum), cebada (Hordeum vulgare),
pudo concretar de esta manera el desarrollo raygrass (Lolium perenne) y algunas
de cigotos y de endospermas en forma indi- brasicáceas.
Los pasos a seguir son los siguientes:
vidual in vitro, lo cual demuestra que cigotos
a) Conocer exhaustivamente la morfoloy endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del gía floral de la especie a utilizar con el objetitejido materno. Tanto los cigotos obtenidos vo de ubicar el saco embrionario y sus células
in vitro como los que son aislados después constituyentes.
b)Aislar las gametas masculinas a partir
de la polinización in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fér- de los granos de polen mediante choque
osmótico y/o de pH.
tiles en cultivo.
c) Aislar el saco embrionario y las gametas
En 1989 se fusionaron por primera vez
gametas aisladas de maíz in vitro (Zea mays). femeninas mediante microdisección individual
Llevó tres años más regenerar plantas en asociación con maceración enzimática.
híbridas fértiles, vía embriogénesis cigótica, a Este paso es crítico y limitante ya que puepartir de esos cigotos cultivados individual- den obtenerse pocas gametas femeninas y
mente. Actualmente puede reproducirse in el proceso de manipulación es muy delicado.
vitro el ciclo completo de vida de una planta El tratamiento de las espigas no polinizadas
superior, comenzando con la electrofusión de con 2,4-D, que induce a la expansión del ova-
El otro núcleo masculino se reunirá con dos
núcleos femeninos secundarios para dar la
célula madre del endosperma triploide (Fig.
1).
Para que la fertilización tenga lugar in
vitro no sólo deben aislarse las gametas fe-
126
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana
Figura 2: Fertilización in vitro mediante
electrofusión.
rio, facilita el proceso, resultando en ovarios
más grandes y óvulos más blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de
las ovocélulas.
Fertilización in vitro propiamente dicha.
Esta puede ser realizada mediante la
microinyección de células espermáticas o núcleos espermáticos aislados en células individuales obtenidas de los sacos embrionarios
o por electrofusión (Fig. 2). En este último
caso las gametas se ponen en contacto en
una cámara de electrofusión por alineación
dielectroforética y se fusionan mediante pulsos eléctricos. Los productos de fusión pueden ser entonces cultivados en una solución
con células nodrizas y algunos de ellos desarrollarán en proembriones.
2.2 Fusión de las gametas
Muchos de estos estudios, algunos de los
cuales datan de 1994, fueron realizados en
maíz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco
sometidos a un shock de pH en una solución
0,5 M de manitol. Las ovocélulas y los
protoplastos de las células centrales se aislan
de óvulos por tratamiento con enzimas
celulolíticas y microdisección manual. Las
gametas femeninas y masculinas aisladas se
colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusión simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2).
El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y
masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusión.
La adhesión y posterior fusión de las gametas
es rápida (aproximadamente 10 segundos).
A los 20 minutos de realizada la fusión, deja
de visualizarse el núcleo masculino y 20 horas
después es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos núcleos,
de manera similar a lo que se observa in vivo.
En 1995 se logró la fertilización exitosa de
trigo a través de la electrofusión de
ovocélulas con células espermáticas. En promedio, la frecuencia de fusión suele ser del
30%, pero bajo condiciones óptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dos
días después de la fusión eléctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusión
comenzó a dividirse y cerca del 90% de ellos
formó estructuras multicelulares y en unos
pocos casos microcallos.
Pese a que se ha tomado al maíz (Zea
mays L) como sistema vegetal modelo en el
cual estudiar los procesos de fusión de
gametas y posterior embriogénesis, también
se han realizado trabajos exitosos de fusión
de gametas en trigo (Triticum aestivum L.)
obteniendo como resultado estructuras
multicelulares y en algunos casos del tipo de
microcallos.
Los recientes progresos relacionados a los
sistemas de fertilización in vitro así como los
proyectos de genómica posibilitarán una
mejor comprensión de los procesos de reconocimiento gamético, fusión, señales
intracelulares, eventos tempranos de activación del huevo y formación del cigoto.
3 Polinización in vitro
En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque éste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genéticas o fisiológicas. Algunas de estas barreras de
prefertilización o precigóticas se deben a:
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
127
a) la incapacidad del polen de germinar
en estigmas extraños
b)la incapacidad del tubo polínico para alcanzar el óvulo debido a una lenta velocidad
de crecimiento o a una excesiva longitud del
estilo. En estos casos, el ovario aborta antes
de que el tubo polínico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto
c) el hecho que el tubo polínico se deshaga en el estilo.
La polinización in vitro de óvulos con el
desarrollo posterior de embriones ha sido
exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando más adecuada su aplicación en aquellas especies que poseen ovarios grandes y
que contienen muchos óvulos. No obstante,
con el tiempo se desarrollaron varias técnicas de polinización in vitro más sofisticadas
ampliando con esto las posibilidades de aplicación. Entre estas técnicas se encuentran:
- La polinización estigmática, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el
polen sobre el estigma.
- La polinización placental, donde los
óvulos se ponen en contacto con el polen a
través de un corte en la parte superior del
ovario o quedan directamente expuestos por
remoción de la pared del ovario.
- La polinización de óvulos aislados que
se cultivan directamente sobre el medio de
cultivo.
- El injerto del estilo, en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta
madre que se desea fertilizar.
Es de esperar que en todos estos casos el
polen germine en pocas horas, y que después
de la polinización, tenga lugar la fertilización.
En la polinización placental in vitro los
porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los óvulos no resultan dañados
durante las manipulaciones involucradas en
su aislamiento. El cultivo junto con la placenta
incrementa, en general, las posibilidades de
un rápido desarrollo embrionario. El cultivo
de óvulos aislados (separados de su placenta)
es un procedimiento mucho más complicado y que ha sido empleado con éxito sólo en
pocas especies de plantas.
Para que las técnicas sean exitosas es
128
crucial realizar el aislamiento de los óvulos y
del polen en el estado fisiológico adecuado,
por lo que es indispensable realizar un estudio de la duración de los distintos estadios
del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en:
a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinización.
b)Precisar el momento en que el estigma
esté receptivo
c) Especificar el momento adecuado para
la polinización.
d)Establecer el tiempo adecuado para
recoger el polen.
Experimentalmente se intentó la polinización in vitro de óvulos de varias especies
de angiospermas con polen proveniente de
varias especies de gimnospermas. El análisis
embriológico de los óvulos de Melandrium
album, fijados tres días después de la polinización con polen de Pinus wallihiana, reveló
la presencia de remanentes de tubos
polínicos y embriones de 2-células en los sacos embrionarios.
4 Cultivo de óvulos y embriones in vitro
El cultivo de óvulos es un procedimiento
muy complejo debido a que la manipulación
del material es difícil. El óvulo es una estructura delicada, muy pequeña, altamente
hidratada, que puede ser dañada con suma
facilidad. Es imprescindible realizar la
microcirugía con rapidez para evitar que los
tejidos sufran desecación durante el proceso. Pese a las dificultades de la técnica, en
algunos cruzamientos interespecíficos como
los realizados en papa, algodón y Hevea
brasiliensis, se comprobó que el cultivo de
óvulos completos es más exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados.
El rescate de embriones consiste en aislar
los embriones de los óvulos de una planta y
cultivarlos en un medio estéril que contenga
los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta
técnica es relativamente fácil de llevar a cabo
en embriones maduros y sus posibilidades de
éxito son muy buenas. Las dificultades
incrementan cuanto más inmaduro sea el
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana
embrión a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son más específicos en las
etapas tempranas de desarrollo del embrión.
El cultivo de óvulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal
cuando se desea:
- sortear algunas de las barreras de
autoincompatibilidad
- rescatar embriones abortivos derivados
de la hibridación interespecífica o
intergenérica
- superar problemas de abscisión precoz
del fruto
- recuperar embriones de cruzas
interespecíficas que conducen a la obtención
de haploides
- acortar el período de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse
inhibidores del desarrollo del embrión, en el
endosperma o en la cubierta de la misma.
El cultivo de embriones ha ayudado también al mejoramiento genético de especies
leñosas que tienen dificultad en la
germinación de sus semillas como en Taxus
mairei o con escasa producción de semillas
como es el caso de Pseudotsuga macrolepis
y constituye una herramienta interesante en
estudios básicos de biología reproductiva ya
que permite analizar la embriogénesis in
vitro.
4.1 Factores externos que condicionan el
cultivo de óvulos y de embriones
Entre los factores externos más importantes que afectan el cultivo de óvulos y de embriones se citan el medio de cultivo, la
osmolaridad y los reguladores de crecimiento.
El óvulo presenta una gran cantidad de
requerimientos nutricionales, que varían con
el estadio de desarrollo del mismo y que es
necesario identificar para cada especie en
particular. Es importante además obtener un
medio de cultivo adecuado para favorecer la
germinación de los granos de polen y permitir el desarrollo de los óvulos fertilizados hasta semillas maduras. En general, todos los
medios de cultivo para germinación de los
granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de ácido bórico.
Un aspecto fundamental a tener en cuen-
ta en el rescate de embriones es la selección
correcta de un medio de cultivo que pueda
soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Se pueden reconocer
dos fases en el desarrollo embrionario con
respecto a la nutrición: la fase heterotrófica
en la que el embrión es dependiente del
endosperma y demás tejidos maternos que
lo rodean, y la fase autotrófica, en la cual el
embrión es capaz de sintetizar las sustancias
requeridas para su crecimiento a partir de
sales minerales y azúcares. La etapa crítica de
pasaje de una fase a otra varía con las especies. Este cambio de requerimientos
nutricionales hace que, cuando crecen in
vitro, sea imprescindible la transferencia de
los embriones de un medio de cultivo a otro
para garantizar un óptimo crecimiento. Entre los medios de cultivo más difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog,
Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu y
col., etcétera.
El agua de coco y los extractos de
endospermas han sido muy útiles, activando
el crecimiento y desarrollo de los embriones
en el cultivo de óvulos de algunas especies
vegetales.
No existe demasiada evidencia acerca de
la absoluta necesidad de los reguladores de
crecimiento para el desarrollo de los embriones extraídos, sean inmaduros o maduros,
fuera de su rol en la ruptura de la dormición.
La concentración osmótica es un factor
importante en el desarrollo de óvulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en
los medios de cultivo no sólo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento
sino que además mantiene la osmolaridad
requerida para cada etapa del desarrollo. Está
demostrado que una presión osmótica elevada previene la germinación precoz de los
embriones inmaduros, evitando así la ocurrencia de malformaciones estructurales. A
medida que van creciendo, los embriones
necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa.
Los embriones de la mayoría de las especies presentan un buen crecimiento en un
rango de temperaturas que va de los 25ºC a
los 30ºC. Aunque algunos estudios indican
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
129
que la luz no es crítica para el crecimiento de
los embriones, se demostró que en el caso
de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinación precoz en los embriones
inmaduros.
5 Aplicaciones
La polinización placental in vitro puede
ser empleada para superar las barreras de
autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas
autoincompatibles son capaces de germinar
directamente sobre los óvulos y llevar a cabo
el proceso completo de la reproducción
sexual. En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinización directa de los óvulos
permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigótica, obteniéndose
embriones híbridos y aun plantas híbridas
imposibles de obtener mediante técnicas
convencionales, como es el caso de Zea mays
x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N.
amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria
vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En
aquellos cruzamientos en los que la barrera
de incompatibilidad se encuentra a nivel del
ovario como en Trifolium repens x T.
hybridum, es necesario rescatar los óvulos
recién fecundados.
La polinización placental in vitro también se emplea como vía para la obtención
de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes
condiciones de estrés. La polinización in vitro
con polen obtenido de plantas de maíz creciendo a temperaturas elevadas condujo a
la obtención de plantas tolerantes a estrés
por calor. En Brassica rapa, la selección de
polen a baja temperatura tuvo un efecto
positivo en el crecimiento de la progenie en
condiciones de frío, logrando acumular más
peso seco que en progenies normales. Se
podría entonces seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido
capaces de germinar bajo condiciones de
estreses ambientales, en este caso térmico,
acelerando así la obtención de plantas resistentes.
Dentro de las aplicaciones del cultivo de
embriones está la del rescate de embriones
130
para la producción de plantas haploides,
donde se cultivan embriones que se forman
por partenogénesis o por eliminación de
cromosomas luego de la hibridación
interespecífica o intergenérica. Los embriones
haploides en algunos casos se distinguen
morfológicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro
en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV.-1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar
el nivel de ploidía. Esta técnica se ha utilizado con éxito en cebada, trigo y tabaco.
El cultivo de embriones se utiliza también en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del
desarrollo debido a la incompatibilidad con
el endosperma, como en la producción artificial del triticale. Precisamente fue en este caso
donde la técnica de cultivo de embriones junto con la aplicación de colchicina fueron de
fundamental importancia en la transformación del triticale en cultivo comercial, para
superar el alto grado de incompatibilidad del
cruzamiento inicial y la marcada esterilidad
que poseía la F1. El perfeccionamiento de
estas dos metodologías fue decisiva para la
producción de un gran número de triticales
hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, con un alto grado de fertilidad.
También se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se
desarrolla normalmente, como sucede en los
cruzamientos de cultivares diploides y
tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se
desintegra después de la fecundación, como
en Oenothera biennis x O. muricata o O.
biennis x O. lamarckiana. Esta técnica también es de utilidad para sortear barreras de
dormición o en casos donde la viabilidad de
la semilla es baja, como en yuca y otras especies del género Manihot.
El cultivo in vitro de embriones es una
alternativa para el intercambio de semilla a
través de fronteras internacionales. En un
proyecto de mapeo de genes con resistencia
al virus del mosaico en yuca, desarrollado
entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA
(Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar «stocks» de semillas desde
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana
Sudamérica al continente africano, el cultivo
de embriones resultó ser un excelente método para transferir germoplasma con mínimos
riesgos fitosanitarios.
El cultivo de embriones inmaduros también puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional, entre las
estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtención de un nuevo
cultivar. Por ejemplo en soja se requieren
unos diez años para este fin. Si se consiguen
realizar varias generaciones por año, en
contraestación, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorraría además el tiempo de maduración de la semilla.
Cultivo de nucelas. Existen pocos
explantos que poseen la capacidad de producir callos embriogénicos. Las inflorescencias
y los embriones inmaduros se utilizan para
este fin en los pastos y en los cereales, constituyendo excelentes herramientas para la
transformación de plantas. En las plantas leñosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneración, se ha inducido entonces con éxito la embriogénesis
somática a partir de nucelas de óvulos jóvenes. Este es el caso de Citrus sp, Vitis
vinifera, Malus domesticus, Psidium
guajava y Pyrus serotina. En estas especies
también permiten acortar el período de
siembra a floración.
Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos básicos es la obtención
de un embrión a partir de cigotos
transgénicos o micromanipulados. Para ello
son importantes la fertilización in vitro de
gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusión hasta la obtención de una planta. Bajo esas condiciones el embrión no se
diferencia de los embriones obtenidos in
vivo. En maíz también es posible cultivar los
cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos
embrionarios parcialmente aislados.
5.1 El cultivo de óvulos y embriones y la
embriogénesis somática para dilucidar
aspectos básicos del desarrollo en
plantas
Las plantas parecen poseer un programa
embriogénico específico preestablecido que
puede dispararse en respuesta a condiciones
específicas. La embriogénesis cigótica se dispara por la fertilización mientras que la
somática lo hace a través del cultivo de tejidos.
El estudio de los eventos moleculares que
tienen lugar durante la embriogénesis temprana es actualmente uno de los campos
principales de la biología vegetal. Los embriones somáticos constituyen una excelente
herramienta para estudiar los procesos de
desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. En
su medio natural los embriones cigóticos ofrecen dificultades debido a su pequeño tamaño y al hecho de estar inmersos en el tejido
materno.
Los embriones vegetales son morfológicamente simples pero molecularmente
complejos. A diferencia de lo que ocurre en
los embriones animales, donde los patrones
de expresión génica se hacen más complejos
a medida que progresa el desarrollo, en los
embriones vegetales se encontraron unos
20.000 ARN, número similar al encontrado
en órganos más complejos como hojas, raíces, flores, anteras, etc., donde los ARN que
son específicos de un estadio determinado
constituyen una modesta fracción del total,
representando, sin embargo, a un gran número de genes. En algodón, por ejemplo, el
10% de los ARN presentes en embriones en
la fase media de maduración son únicos de
aquel estadio.
Muchos de estos genes específicos de
estadio han sido clonados como ADNc, pero
en general se trata de genes expresados
mayoritariamente, como aquellos de las
proteínas de reserva de la semilla. Estos ADNc
resultaron ser marcadores útiles de la diferenciación celular, como el gen inhibidor de
la tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumula
en el polo micropilar del embrión globular
(por donde penetra el núcleo espermático al
saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciación celular. La expresión de
este gen es uno de los primeros indicadores
moleculares de polaridad en la transición del
embrión globular a uno de simetría bilateral
con forma de corazón.
Para estudiar el desarrollo en plantas, al
igual que en el caso de animales, se ha recurrido al uso de mutantes. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana,
que es una planta de genoma pequeño y ci-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
131
clo de vida muy corto, lo cual la hace apta
para estudios genéticos. Se han detectado
dos tipos de mutantes, letales embrionarios
y con alteraciones en el patrón de desarrollo.
Calculando el número de mutantes letales embrionarios que se encontraron, algunos investigadores han concluido que existen unos 4.000 genes expresándose durante la embriogénesis. En el punto superior de
esta compleja vía se encuentran genes reguladores principales («master regulators») y
sólo de 40 a 50 genes que afectan el patrón
embriogénico.
Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1, que es letal y detiene la
embriogénesis en el estadio de corazón temprano. No es un gen regulador principal y sus
efectos se ven revertidos en presencia de
biotina. Otra mutación es raspberry. Estos
mutantes quedan bloqueados en el estado
globular y poseen protuberancias en las células externas lo que le da el aspecto de una
frutilla. El bloqueo se presenta en un estadio
anterior a la formación de órganos, momento en el que ya existe diferenciación celular.
En maíz también se han encontrado
mutantes letales embrionarios. En algunos se
encuentran inhibidos el desarrollo del embrión y el endosperma. En otros, sólo el embrión.
Una importante conclusión a la que permitieron arribar estos mutantes es que el
embrión de Arabidopsis está constituido por
el ensamblaje de dos patrones superpuestos,
uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a
lo largo del eje radial.
Ninguno de los mutantes encontrados
fueron mutantes tempranos, lo cual sugeriría un control de los primeros estadios del
desarrollo embrionario por parte de genes
maternos, como sucede en animales. Sin
embargo, se han identificado pocos genes
maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los
embriones somáticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilización
in vitro induciría a sospechar que los genes
maternos no juegan un rol primordial. Un gen
materno encontrado en Arabidopsis es sin1
(short integument 1). Este gen afecta la formación de óvulos, el tiempo de floración y el
desarrollo embrionario. No se sabe si real-
132
Preglobular
Globular
Embrión maduro
Corazón
Torpedo
Figura 3: Estadíos de la embriogénesis de Arabidopsis
thaliana.
mente se requiere para la embriogénesis o si
los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el
tejido materno. Los embriones provenientes
de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenéticos. Embriones con ese
genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. 3).
Un gen embrionario muy importante es
GN/EMB30. No se sabe si es un regulador
principal y actúa muy temprano en el desarrollo, durante la primera división celular del
cigoto. En los mutantes las dos células resultantes no son diferentes, como ocurre en
embriones normales, donde la primera división celular es asimétrica.
El sistema mejor estudiado en relación
con la embriogénesis somática es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus
carota). En este sistema, la remoción del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) genera un
respuesta embriogénica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio líquido. La disponibilidad de gran cantidad de embriones
creciendo sincrónicamente en un medio líquido representa un buen sistema para estudiar
los eventos genéticos involucrados en el desarrollo embrionario. Los primeros estudios
tendientes a identificar patrones de expresión génica relacionados con la embriogénesis
somática fueron realizados en 1981. Utilizando electroforesis bidimensional se encontra-
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana
ron pocas diferencias entre patrones
proteicos de embriones somáticos y células
en proliferación, aunque, en virtud de lo expresado anteriormente, se esperaría un patrón más complejo.
Habría varias explicaciones para esta inconsistencia. Una es que los productos de
genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las
genotecas de ADNc. Otra es que la sincronización fuera sólo aparente, particularmente en estadios tardíos y que estas diferencias
enmascararan las diferencias entre estadios.
Otra es que las constelaciones génicas
involucradas en la embriogénesis somática
podrían estar ya activadas en las células proliferando en cultivo. Algunos estudios indicarían que muchos de los genes expresados en
los embriones somáticos ya estarían haciéndolo en las masas proembriogénicas. Uno de
estos genes es el SERK que se expresa en
células competentes. Se conoce la secuencia
de su ADNc y codificaría para una proteína
receptora con repeticiones ricas en leucina del
tipo proteína quinasa. La expresión de este
gen está correlacionada con la aparición de
células competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipocótilos. La expresión continúa en las masas proembriogénicas y persiste hasta el estadio de
embrión globular.
Se encontró una línea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que
en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazón. Este efecto es revertido al colocar las células en un
medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. El compuesto responsable de la reversión resultó ser una
endoquitinasa acídica. Aparentemente, esta
enzima puede hidrolizar un sustrato que se
encuentra en las paredes celulares vegetales
y liberar un compuesto indispensable para
disparar la embriogénesis somática. Tal
sustrato no pudo ser identificado pero se
encontró un lipoligosacárido de Rhizobium,
NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar a
estas líneas celulares mutantes a fin de que
prosigan los procesos de embriogénesis
somática. Hasta el momento no se ha encontrado cuál es la sustancia en células vegetales que produce este efecto.
El programa de eventos que tiene lugar
durante la embriogénesis somática es muy
elaborado como para estar regulado solamente por el 2,4-D. La perturbación causada
por la deprivación de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos
clave que involucran la acción de factores de
crecimiento más específicos y fuerzas
biofísicas que confieren información
posicional y de desarrollo.
6 Lecturas recomendadas
BARNABAS, B.; PONYA, Z. 1999. Test-tube Plants as Tools
for Crop Improvement. Hungarian Agriculture Research.
2: 5 – 9.
BHOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. 1996. Plant Tissue
Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Elsevier.
DUMAS, C; MORGENSEN, H. L. 1993. Gametes and
fertilization: Maize as a model system for experimental
embryogenesis in flowering plants. Plant Cell. 5: 13371348.
FAURE, J. E.; DIGONNET, C.; DUMAS, C. 1994. An in Vitro
System for Adhesion and Fusion of Maize Gametes.
Science. Vol 263, pp 1598-1600.
FAURE, J. E.; ALDON, D.; ROUGIER, M.; DUMAS, C. 1996.
Emerging data on pollen tube growth and fertilization
in flowering plants, 1990-1995. Protoplasma, Vol 193, Iss
1-4, pp 132-143.
GUEVARA, C.; OSPINA, J.; MAFLA, G.; V. VERDIER. 1998.
Zygotic embryo culture of Manihot esculenta Crantz : a
practical approach for the safe internacional movement
of cassava seed stocks. Plnat Genetic Resources Newsletter
115:33-38.
HOWELL, S. 1998. Molecular Genetics of Plant
Development. Cambridge University Press.
KANTA, K.; RANGASWAMY, W. S.; MAHESHWARI, P. 1962.
Test tube fertilization in a flowering plant. Nature
194:1214-1217.
KOVACS, M.; BARNABAS, B.; E. KRANZ. 1995. Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes
develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15:
178-180.
KRANZ, E.; DRESSELHAUS, T. 1996. In vitro fertilization
with isolated higher plant gametes. Trends in plant
science reviews. Vol. 1, Nro. 3, pp 82-89.
KRANZ, E.; KUMLEHN, J. 1999. Angiosperm fertilization,
embryo and endosperm development in vitro. Plant
Science. Vol. 142, Iss 2, pp 183-197.
LITZ, R. E. 1991. «Cultivo de embriones y óvulos». En
Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y
Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT). Roca y Mroginsky editores. pp 295-312.
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
133
MOL, R.; MATTHYS-ROCHON, E.; DUMAS, C. 1995.
Embryogenesis and plant regeneration from maize
zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs. Plant
Cell Reports. 14: 743-747.
PONYA, Z.; TIMAR, I.; SZABO, L.; KRISTOF, Z. 1999.
Morphological characterisation of wheat (T. aestivum
L.) egg cell protoplast isolated from immature and
overaged caryopses. Sex Plant Reprod. 11: 357–359.
ROUGIER, M.; ANTOINE, A. F.; ALDON, D.; DUMAS, C.
1996. New lights in early steps of in vitro fertilization in
plants. Sexual Plant Reproduction. Vol 9, Iss 6, pp 324329.
ZENKTELER, M. 1999. In vitro pollination of excised
ovaries. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. Vol.
41, pp 31-38.
134
PICCA, Aurora; CARDONE, Susana