Acercamientos de Investigación Hacia una Cura para la Distrofía Muscular Duchenne Un reporte del estado actual de la investigación internacional para el desarrollo de una terapia causal de la distrofía muscular Duchenne Actualizado en Agosto del 2003 Escrito en cooperación con especialistas y científicos para el Duchenne Parent Project de Alemania Aktion Benni & Co y dedicado a todos los chicos con distrofía muscular Duchenne y sus familias alrededor de todo el mundo por Dr. Guenter Scheuerbrandt Este reporte ha sido escrito para familias quienes tienen uno o más chicos con distrofia muscular tipo Duchenne. En el se les explica algunos de los hechos científicos básicos e informarles de los numerosos acercamientos o enfoques con los cuales investigaciones internacionales tratan de encontrar un causal, por ejemplo una justificación científica, así como una terapia efectiva para la distrofía muscular Duchenne. Debido a que científicos en algo más de cien laboratorios en varios países del mundo están trabajando para encontrar una cura para esta enfermedad, solo lo más importante de sus resultados será descrito en gran detalle. Algunos resultados anteriores son reportados en un formato muy abreviado. La primera edición de este reporte en el 2001 estuvo basada en un seminario internacional sobre investigaciones en terapia de la distrofía muscular Duchenne en Mayo del 2000 en los Institutos Nacionales de Salud en Bethesda cerca de Washington en los Estados Unidos. Esta tercera edición fue escrita en Julio y Agosto del 2003 mayormente con información de literatura y correspondencia con muchos de los investigadores Introducción Algunos hechos científicos básicos son explicados, que genes son, como trabajan ellos, porque es importante la distrofina, como las mutaciones causan distrofia muscular Duchenne, y como es heredada la enfermedad. Los genes y su función: Los Genes son las unidades funcionales del material genético de los cromosomas en el núcleo de cada célula. Este material es conocido como ácido desoxiribonucleico, o ADN, su estructura se parece a dos escaleras espirales (o de caracol) entrelazadas, o de doble hélice doble. Esta fue detectada por James Watson y Francis Crick en 1953, hace 50 años. Las dos columnas vertebrales o los barandales de las escaleras son largas cadenas compuestas de ácido fosfórico y desoxirribosa, un tipo de azúcar. Los peldaños consisten en cuatro sustancias químicas diferentes, las bases o letras genéticas: adenina, guanina, timina, y citosina (abreviadas como A, G, T, C), dos de las cuales siempre se enfrentan en un peldaño de la hélice. Por razones espaciales, los peldaños solo pueden contener un par A-T y G-C. Si la secuencia de estos pares base o letras genéticas en una cadena es por ejemplo: ---AGGCTTAATCGT--la secuencia de la cadena opuesta debe ser: ---TCCGAATTAGCA--Las dos cadenas son complementarias una de la otra. Cada una de las 100 billiones (100 x 1012) de células del cuerpo humano contienen en su núcleo 46 cromosomas con más de 6 mil millones de letras genéticas, agrupadas en aproximadamente 25 000 a 35 000 genes. Casi todos los detalles de la secuencia de estas letras o nucleótidos son conocidos actualmente. Esta es la información genética de un ser humano individual, y es pasada de generación en generación rias más frecuentes. Aproximadamente uno de cada 3 500 chicos, independientemente de su origen étnico, nace con esta enfermedad, que es causada por una mutación o daño del gen de la distrofina con la consecuencia de que la proteína distrofina no esta presente mas o existen solo muy pequeñas trazas en sus células musculares. El gen de la distrofina fue identificado en 1986 en el brazo corto del cromosoma X (Kunkel, Boston) y su estructura fue aclarada poco después (Hoffman, Washington). Con 2,6 millones de pares de bases, este es uno de los genes más largos alguna vez encontrados en humanos. Sólo el 0,5 % de los pares de bases, 13 973, pertenece a 79 exones del gene, que combinados juntos contienen la secuencia de codificación activa, la información para la síntesis de las diversas formas de la proteína distrofina. La transcripción de la información genética del gen de la distrofina en ARNm esta bajo el control de al menos cinco promotores, regiones de ADN, las cuales gobiernan el proceso de empalme para que un número de proteínas diferentes sean producidas. El producto principal es la distrofina de extensión completa, una proteína muy larga con forma de varilla que consiste de 3 685 aminoácidos. La distrofina es parte de los costameros, los cuales conectan los discos Z del sarcomero, las estructuras contráctiles, con el sarcolema o la membrana celular. Por esto es importante para la estabilidad de las células musculares durante la contracción muscular. La red de la Distrofina (Complejo distrofino): La distrofina pertenece a una red o estructura de varias proteínas diferentes, de las cuales más de 50 son conocidas. Entre ellas están la distrofina y sarcoglicanos, las sintrofinas e integrinas, distrobrevina, oxido nítrico sintetasa, y otros componentes tales como la disferlina, sarcospan, laminina, caveolina, telethonina, miotolina, agrina, neurexina, desmuslina, sincoilina, fukutina, aquaporina, espectrina, colágeno, calpaina y otros. En el futuro, mas componentes se espera sean identificados (Campbell, Iowa City). Cuando la distrofina esta faltante, el balance entre las diferentes partes de este complejo distrófino (ligado a la distrofina) es perturbado. Especialmente los distroglicanos, los sarcoglicanos y sarcospan que se muestran reducidos o desaparecidos completamente. Cada una de las proteínas del complejo tiene su propio gen el con pequeños cambios o mutaciones. Estas mutaciones las cuales son necesarias para la evolución de la vida y todas las criaturas vivas, pueden también tener consecuencias negativas, por ejemplo, una enfermedad genética. La mayor parte de los genes llevan la información para la construcción de una o más proteínas, las cuales consisten de secuencias de aminoácidos, sus componentes básicos, de los que hay 20 tipos diferentes. La secuencia de los aminoácidos es importante para la función de las proteínas como enzimas, catalizadores de reacciones químicas, o como agentes de control para otros genes, o como material estructural. En el núcleo de célula, donde los cromosomas residen, la información genética es copiada o transcrita en otra sustancia genética de una estructura similar (al ADN), el ácido ribonucleico pre-mensajero, ARNpre-m. Los genes de los organismos multicelulares consisten en secciones activas, los exones, y secciones inactivas, los intrones. Después de la transcripción, los intrones, que a menudo son muchos más de largos que los exones, son removidos del ARNpre-m, y los exones transcritos son empalmados o unidos entre ellos para crear un ARN mensajero, ARNm, el cual entonces es exportado hasta los ribosomas, la proteína que sintetiza (crea) estructuras en el citoplasma de la célula. En los ribosomas, actúan catalíticos de ARN’s, o ribozimas, que usan la información genética del ARNm para construir proteínas especificas a partir de aminoácidos, los cuales son entregados a los ribosomas por otro tipo de ARN, el ARN de trascripción o ARNt, para transferir ARN’s o ARNt. Los ARN’s usan la base uracilo, U de forma abreviada, en sustitución de la muy similar base T del ADN. En el ARNm, tres letras genéticas consecutivas siempre significan o se leen como uno de los 20 diferentes aminoácidos según un diccionario genético, el código genético. Así, la escritura genética sólo usa cuatro letras, y sus palabras, los codones, siempre tienen de extensión tres letras, también llamadas tripletas o triadas. No hay espacios entre las palabras, y pero hay tres diferentes codones de parada o de finalización, UAA, UAG, y UGA, que significan que la síntesis (creación) de la proteína debe finalizarse. Gen de la distrofina: La distrofia muscular Duchenne es una de las enfermedades heredita2 ser dividido por tres, sin que sobre ninguna letra. En este caso, la distrofina hecha es más larga o más corta. Si este cambio sólo concierne a las estructuras no esenciales de la distrofina como por ejemplo la parte central, esta todavía puede ser en parte funcional. Es entonces, que la forma benigna de la distrofia, la distrofia muscular Becker, se desarrolla. Si la mutación cambia el marco de lectura por una o dos bases (letras genéticas), entonces, una cadena entera de aminoácidos incorrectos es incorporada a la proteína comenzando en el sitio de la mutación hasta que finalmente alcanza un nuevo y prematuro codón de parada, el cual da por terminada la síntesis. En este caso, la distrofina incompleta no puede realizar completamente su función normal, siendo esta degradada y desarrollándose distrofia muscular Duchenne. Sin distrofina, las células del músculo se degeneran. Continuamente estas son regeneradas, pero el mecanismo de regeneración finalmente falla. Las fibras del músculo destruidas son substituidas por tejido graso y conectivo, apareciendo a la edad de dos a tres años los primeros signos visibles de la enfermedad. Donde los nervios motores se ponen en contacto con los músculos, se localiza otra proteína con una estructura similar a la distrofina, la utrofina, la cual contribuye en algún grado a la estabilidad de la membrana del músculo (Davies, Oxford). Sin la utrofina, la enfermedad podría progresar mucho más rápido. Herencia de la distrofia muscular Duchenne: Además de los 44 cromosomas normales, llamados autósomas, los varones tienen dos cromosomas sexuales diferentes en cada célula de su cuerpo, un cromosoma Y y un cromosoma X. Si su gen de la distrofina en su único cromosoma X es dañado por una mutación, este no puede ser compensado por un gen intacto de un segundo cromosoma X, como es posible para mutaciones en los autósomas, que siempre están presentes en pares. Por lo tanto, la distrofia Duchenne y Becker afectan sólo a varones. Las mujeres, sin embargo, tienen dos cromosomas X en cada célula de su cuerpo. Cuando ellas portan un gen de la distrofina mutado en uno de sus cromosomas-X, ellas pueden transmitir la enfermedad, por lo que son portadoras genéticas. Como uno de los cromosomas es inactivado de forma aleatoria (al azar), cerca de cual también puede ser afectado por mutaciones. Esto conduce a los 13 tipos diferentes de distrofia de cinturas y 5 distrofias musculares congénitas, así como a al menos 8 otras enfermedades neuromusculares. Que tan grande son las moléculas, el ADN y la distrofina? Una persona común rara vez tiene una idea correcta del tamaño de las estructuras moleculares con las que trabajan los científicos. El siguiente experimento mental demuestra lo pequeñísimo de una simple molécula. Arroje un cuarto de litro de vino en un extremo del mar Mediterráneo. Entonces mezcle bien el Mediterráneo, y en el otro extremo del mismo, recoja un cuarto de litro de agua. ¿Cuantas moléculas de alcohol podría encontrar en ese cuarto de litro de agua? ¡Increíblemente serian 22 millones! La doble hélice del ADN tiene un diámetro de dos nanometros, que es una millonésima de milímetro. ¿Si alguien aumentara el diámetro normal de la hélice a un centímetro, que tanto aumentaría la altura de alguien de 1,80 metros si se aplicara el mismo factor de aumento anterior? ¡Aumentaría a nueve mil kilómetros, la distancia aproximada entre Europa y Florida! Cada núcleo celular de las de cerca de 100 billones (un 1 con 14 ceros) de células de un ser humano adulto, contiene un material genético completo compuesto por 6 mil milliones de pares de bases. ¡El ADN entero de todos los cromosomas de cada único núcleo celular mide cerca de dos metros! Cada molécula de distrofina es de 125 nanometros de largo, por lo que se necesitan colocar en línea 80 000 de ellas para alcanzar apenas un centímetro. Hay cerca de 114 mil milliones de moléculas de distrofina y el mismo numero de proteínas del complejo distrófino en un gramo de músculo. Mutación y origen de la enfermedad: La distrofia muscular Duchenne es causada por tres clases diferentes de mutaciones en el gen de la distrofina: las deleciones, si partes del gen faltan, duplicaciones, si partes del gen están duplicadas, y mutaciones puntuales, si solo una letra genética se encuentra cambiada, eliminada o agregada. Como el mecanismo de lectura en los ribosomas siempre lee las palabras del código de tres letras una tras otra sin espaciado, una mutación no trastorna el marco de referencia de lectura si el número de letras faltantes o adicionales puede 3 co, debido a que la mutación nueva surgió en un momento temprano de la formación de la célula germinal y la célula desarrollada se transformo en un grupo de óvulos, cada uno con la mutación. Como más de un óvulo es afectado, otro hijo puede heredar la enfermedad también, o una hija puede ser una portadora genética. Como los métodos genéticos actualmente no pueden descubrir una célula germinal de mosaico, debería ser ofrecido un diagnóstico prenatal durante el segundo embarazo a todas las mujeres quienes ya tienen un chico con distrofia muscular Duchenne, no sólo a las que han probado ser portadoras genéticas (Müller-Reible, Würzburg). Curso clínico de la distrofia muscular Duchenne: Los primeros síntomas clínicos aparecen cerca de los dos o tres años de edad, causando dificultades al caminar y especialmente al subir escaleras. Sin una detección temprana, aun hoy la enfermedad se diagnostica generalmente entre los 3 y 5 años. Debido al aumento de contracturas en las articulaciones del pie, rodilla y cadera, los pacientes pierden su capacidad para caminar entre los 10 y 12 años. El aumento de deformidades espinales, escoliosis, y restricción de movimiento hace que pronto se vuelva dependiente de intensivo cuidado. La afectación de la función respiratoria y cardiaca conduce al deceso por insuficiencia cardiaca y respiratoria en la edad adulta temprana. Cirugías ortopédicas tempranas para evitar contracturas y deformidades espinales, así como ayudas respiratorias y otras medidas pueden mejorar la calidad de vida y prolongar significativamente las expectativas de vida. solo la mitad de sus células musculares en su núcleo tienen un gen de la distrofina activo. Esto es suficiente para causar casi ninguno o solo leves síntomas clínicos de la enfermedad. Aproximadamente dos terceras partes de los chicos con Duchenne heredan la enfermedad porque sus madres son portadoras genéticas. En la meiosis, la división celular que conduce a los óvulos, cada óvulo recibe sólo un cromosoma X. La probabilidad que este sea un cromosoma X con la mutación génica es del 50 %. Por lo tanto el 50 % de sus hijos varones por regla general tendrán distrofia muscular Duchenne y el 50 % de sus hijas por regla general serán portadoras al igual que la madre. Estos riesgos permanecen igual para todos los niños de una familia, no son más pequeños si la familia ya tiene un hijo con distrofia muscular Duchenne. Si la madre es una portadora, la mutación surgió en las células germinales de sus padres o de los antepasados de su madre, la abuela del paciente. Como todas las células del cuerpo de un portador genético tienen el gen mutado, el defecto genético de la portadora puede ser descubierto por un análisis génico de los leucocitos, las células o glóbulos blancos de la sangre, los cuales contienen cromosomas. Aproximadamente un cuarto de los casos son causados por una mutación nueva. En estos casos, la mutación ocurrió espontáneamente en el óvulo de la madre que dio lugar al paciente. Como sólo un óvulo es afectado, todos los otros niños de estas mujeres no afrontan un mayor riesgo que el riesgo general para la enfermedad. Aproximadamente un décimo de los pacientes tienen una madre con célula germinal de mosai- Diagnostico Genético Los métodos de diagnosis de la distrofia muscular Duchenne y Becker en un chico, durante un embarazo cuando hay riesgo, y para determinar si una mujer es portadora. Detección temprana. primera revisión de estas deleciones puede ser en cualquier parte del gen, pero son más numerosas en algunas regiones que en otras. Generalmente, en el primer paso, se seleccionan 19 de los 79 exones del gen de la distrofina, los cuales son multiplicados o amplificados. Normalmente, no son amplificados todos esos 19 exones simultáneamente, pero por medio reacciones múltiplex se realiza en grupos de 4 a 6 exones. Esta forma permite la detección del 98 % de Diagnosis de la distrofia muscular Duchenne en un chico: Para un análisis genético, una muestra de sangre con leucocitos es necesaria. Tales glóbulos blancos, no los glóbulos rojos, tienen un núcleo celular el cual contiene el material hereditario o ADN. Los glóbulos blancos son aislados y se obtiene de ellos el ADN. Cerca del 60 % de los pacientes con distrofía muscular Duchenne tienen deleciones en uno o más de los exones de su gen de la distrofina, una 4 miento quirúrgico menor. Sin embargo si una biopsia muscular es necesaria, puede realizarse mejor una biopsia por cánula o aguja bajo anestesia de local. Diagnosis Prenatal: Para una diagnosis prenatal de distrofía muscular Duchenne, debe haber generalmente una razón definitiva como que ya hay o hubo un afectado en la familia. Para una diagnosis durante el embarazo temprano, tejido del feto debe ser obtenido por medio de biopsia de vellosidades coriónicas (chorionic villi), entre la décima o decimosegunda semana de embarazo o por técnica de amniocentesis entre la decimotercera y decimosexta semana. Para una biopsia de vellosidades coriónicas, una pequeña pieza de la futura placenta es aspirada a través de una fina cánula. Si ciertas células del feto son obtenidas, ese tejido puede ser usado para un análisis directo. El riesgo de esta intervención es que en cerca de un 3 a 5 % puede finalizar de forma involuntaria el embarazo. La ventaja de la amniocentesis es el bajo riesgo de aborto, menor al 1 %. La desventaja es que las pocas células del feto en el líquido amniótico deben ser primero multiplicadas en el laboratorio, y esto demora más de 3 semanas, por lo que el análisis de esas células no puede ser realizado antes de la decimoquinta o decimoctava semana. Si son obtenidas suficientes células del feto, los cromosomas son investigados primero. Esto permite saber el sexo del feto. Si es niña, entonces, en la mayoría de los casos, no son necesarios mas estudios, debido a que las consecuencias de una portadora de distrofía muscular Duchenne deben ser discutidas con la niña cuando ella sea lo suficientemente mayor para entender y hacer sus propias decisiones. Si el feto es niño, entonces un análisis genético es realizado en la mayoría de los casos con las mismas técnicas descritas para la diagnosis después de nacer. Diagnosis de una portadora: Si la mutación de un chico con DM Duchenne en la familia es conocida de forma precisa, alguien puede buscar la misma mutación en la madre y mujeres emparentadas. Esto es técnicamente más dificultoso que en los chicos con distrofía Duchenne debido a que solo uno de los dos cromosomas-X de una mujer puede portar la mutación. Si ella es una portadora, la intensidad de las bandas después de electroforesis es solo reducida a la mitad de lo normal si uno de los exones esta delecionados o todas las deleciones. En dos tercios de estos casos, se puede ya deducir donde el marco de lectura es perturbado o no, por lo que puede predecirse si el paciente tiene una distrofia muscular Duchenne o Becker. Para el remanente tercio de casos, más exones deben ser amplificados. La amplificación es realizada por la técnica de reacción en cadena de polimerasa, o PCR, necesitando la aplicación de primers (o cebar) a cada exon. Los primers son cortas secuencias sintéticas de ADN las cuales se unen por si solas al inicio y al final de cada secuencia del exon. Los pequeños fragmentos del gen obtenido de esta manera son separados con técnica de electroforesis donde estos fragmentos migran diferentes distancias en un contenedor de gel y de esta forma hacerlos visibles como bandas en espacios desiguales escalonados dentro de una escala. Cada banda representa uno de los 79 exones. Una deleción es detectada cuando una o mas de esas bandas esta faltante. Si no se encontrara ninguna deleción, es probable se trate de una mutación puntual. Para caracterizar de forma inequívoca esta mutación, la secuencia de bases de la mayoría de los exones deberá ser determinada. Tales determinaciones de la secuencia, no obstante, requieren trabajo muy demandante, por lo que no se ofertan rutinariamente. En estos casos, el diagnostico final solo puede ser realizado por un análisis de tejido muscular obtenido por una biopsia. Es entonces que lo que se analiza no es el gen de la distrofina, si no la proteína distrofina misma por una técnica llamada western blot. En este método, después una separación electroforetica, los patrones de la proteína en las células son calcados a otro material al oscurecerlos, donde los hacen visibles con anticuerpos. O anticuerpos fluorescentes que se unen a la distrofina, la cual puede ser entonces detectada bajo el microscopio como líneas brillantes alrededor de células musculares sanas. En la distrofía Duchenne, esta no es observada o solo se ven muy pequeñas trazas, en la distrofía Becker en cambio, estas líneas están a menudo raídas, interrumpidas y mayormente mas débil su brillo que lo normal. Si el análisis provee un resultado inequívoco de distrofia muscular, una biopsia muscular a menudo no es necesaria más. Especialmente en niños pequeños, pudiéndose evitar este procedi5 presentes o faltantes puntos luminosos, lo que significaría regiones genéticas normales o faltantes respectivamente. Pero este método, denominado hibridización fluorescente en situ o FISH, puede solo ser usado si ciertas deleciones específicas han ocurrido en la familia. Análisis de secuencia del gen de la distrofina como examen de rutina: La nueva técnica analítica SCAIP (amplificación de condición individual/”primer” interno) permitirá que en el futuro sea posible analizar en tres días de forma confiable mutaciones puntuales, pequeñas deleciones, así como todas las otras mutaciones en forma rutinaria. En este método, todos los exones del gen de la distrofina, todas las regiones límite exón-intrón con sus señales de empalme, y todos los promotores son completamente secuenciados. Estas regiones del gen, que juntas tienen una extensión de cerca de 110 000 pares de bases son amplificadas con sus primers específicos en una sola reacción PCR y luego son checados con micro electroforesis. Esto permite determinar todas las deleciones en exones y promotores, también aquellas que no se localizaban con otros métodos. La secuencia de bases de cada fragmento de gen es entonces determinado automáticamente con secuenciación individual por primers para detectar las mutaciones puntuales. Como este método también detecta todas las mutaciones de las portadoras de distrofía muscular Duchenne, esto conducirá a una mejora en el consejo genético. Archivos de datos son ahora compilados, lo cual permitiría la predicción del curso clínico de una distrofia muscular Duchenne o Becker basándose la definición de la deleción, duplicación o mutación puntual. Para este propósito, varios pacientes serán investigados clínicamente y genéticamente (Flanigan, Salt Lake City). Detección temprana infantil (sin técnica genética): En Alemania, entre las 4 semanas y el año de edad los chicos con distrofia muscular Duchenne o Becker, los cuales todavía no tienen síntomas clínicos, son detectados en un programa voluntario de detección CK en el cual la enzima creatina kinasa, CK, es determinada en una mancha de sangre seca. Desde 1974, hasta Julio del 2003, más de 500 000 infantes varones han sido analizados. Entre ellos, se encontraron 178 chicos con muy altos niveles de CK, y 130 de ellos fueron diagnosticados con distrofia muscular Duchenne (1:3 700) y 28 tenían distrofia faltantes. No obstante, la amplificación de los exones no es fácil de controlar. Adicionalmente a menudo es dificultoso detectar de forma confiable las diferencias en la intensidad de las bandas. Por esto a menudo se usan marcadores polimorficos para el análisis. Estos marcadores son secuencias de ADN en los intrones entre los exones, los cuales son casi siempre tienen diferente organización en un cromosoma individual, y de igual forma tienen diferentes longitudes pudiéndose así distinguir dos cromosomas. Estas secuencias marcadoras no tienen relación con la enfermedad, ellas son características de cada persona, y pueden también ser amplificadas con el método de PCR y de esta forma ser inequivocadamente identificadas después por electroforesis Si un chico tiene una deleción en el gen de la distrofina, no solo esta faltante uno o mas exones, si no también los marcadores en los intrones entre los exones. En una mujer, pueden checarse en donde estos marcadores están también faltantes en uno de sus cromosomas X. Si los marcadores estuvieran faltantes, entonces es altamente probable que ella tenga las misma deleción en uno de sus cromosomas X. Ella por lo tanto es una portadora genética. Si ella no es una portadora, deberá tener marcadores adicionales en esa región. Los marcadores de ADN pueden también ser usados si el afectado en la familia no tuviera una deleción en el gen. Por lo que en ese caso no se conocería que mutación se debe buscar en las mujeres emparentadas. Pero basándose en la organización de los marcadores, se puede decir en cual de los dos cromosomas-X de la mujer se localiza el gen mutado, el cual heredo y afecto a su hijo. Cada mujer en la familia con el mismo cromosoma-X tiene un alto riesgo de ser portadora. Este método indirecto ha sido usado por cerca de 20 años, no obstante actualmente se conocen muchos mas marcadores. Por lo que, es posible distinguir uno del otro los dos cromosomas X de una mujer, y es difícil no ocurra a menos que sea una familia poco informativa. Sin embargo si todos estos métodos no son exitosos, entonces, en algunos casos, pueden marcarse ciertas regiones genéticas en el cromosoma X con sondas genéticas fluorescentes y entonces checar bajo el microscopio donde están 6 años hasta encontrar un experto en enfermedades musculares. Tales programas serán necesarios en el futuro, porque el progreso de la investigación terapéutica conducirá a estudios con pacientes muy jóvenes quienes no tienen ninguno de los síntomas clínicos y cuyos músculos están todavía en gran parte intactos. (Scheuerbrandt, Breitnau/ Friburgo). muscular Becker (1:17 800). Una detección temprana permite a los padres hacer con suficiente tiempo las decisiones que serán las correctas para ellos, y así evitar otros chicos con la misma enfermedad nazca en la misma familia o de mujeres emparentadas. Adicionalmente, puede ser evitada la odisea del diagnostico que a menudo todavía toma varios Posibilidades Terapéuticas Estrategias de investigación para una terapia causal. No hay ninguna terapia aún para distrofia muscular Duchenne. pueda curar la enfermedad de los chicos con Duchenne. Sólo en un tipo de fármacos, tres cortico-esteroides estrechamente relacionados, prednisona, prednisolona, y deflazacort, ha sido encontrado que, durante un período limitado de tiempo, pueden reducir la velocidad de la degeneración de los músculos. Por la severidad de la enfermedad, las familias de los pacientes, sus doctores, y el público en general buscan desesperadamente aun el más pequeño resultado positivo de investigación, y los medios de comunicación, principalmente los periódicos y la televisión, tienden a exagerar pequeños avances como saltos importantes. No sólo los medios de comunicación, los mismos científicos son a menudo sobre-optimistas y pueden declarar los resultados de experimentos con animales como victorias terapéuticas, levantando así falsas esperanzas. Ni un solo chico con Duchenne alguna vez ha sido curado (Dubowitz, Londres). Para curar la distrofia muscular Duchenne, la consecuencia de la mutación que dañó el gen de la distrofina, que es la degeneración del músculo, tiene que ser detenida o al menos aliviada. La investigación intenta hacer esto por medio de una terapia génica o por una terapia farmacológica. La terapia génica significa que todas las secciones activas, los exones, del gen intacto de la distrofina, su ADNc, o partes de el, sean introducidos en cada célula muscular, o que el daño específico del gen sea reparado por técnicas genéticas. Una terapia farmacológica significa que se de una sustancia química ordinaria, un fármaco o droga normal, que no tiene nada que ver con un gen, para bloquear o reducir la velocidad de la degeneración del músculo. En ambos enfoques, se han hecho progresos durante los pasados últimos años. No hay ninguna terapia aún: A pesar de este progreso, ni una terapia génica, ni una farmacológica ha sido desarrollada hasta ahora que Transferencia de un nuevo gen de la distrofina Los exones del gen de la distrofina completo o acortado pueden ser transferidos a las células musculares por medio de virus, plásmidos o mioblastos. Reacciones inmunes deben ser evitadas. Ratones distróficos: La mayor parte de los experimentos para transferir el gen son realizados con una clase de animal de laboratorio: el ratón-mdx distrófico, que tiene una mutación puntual en el nucleótido 3,185 en el exón 23 de su gen de la distrofina. En esta mutación se ha cambiado un codón CAA, que representa un aminoácido glutamina, por un codón TAA, que es un codón de parada, para que la síntesis de distrofina sea parada antes de tiempo y el ratón no tenga ninguna distrofina funcional en sus músculos. Estos ratones no pierden sus múscu- Es razonable de creer que la transferencia, o el transporte, de cantidades suficientes del gen intacto de distrofina en los núcleos de las células del músculo distrófico podría curar la enfermedad proporcionando la información genética de los nuevos genes que será usada para sintetizar la proteína por los ribosomas de la célula, produciendo cantidades bastante grandes de distrofina funcional que entonces emigraría a su lugar normal bajo la membrana de célula, para ser incorporada en el intrincado complejo distrófinoglicoproteico de forma normal. 7 en ratones jóvenes como en los más viejos (Lochmüller, München; Chamberlain, Seattle). Dos genes en un virus: En recientes experimentos dos ADNc de distrofina de ratón fueron empacados en un mismo virus destripado, lo que significa la duplicacion de todos los 79 exones sin sus intrones, y en adición a esto dos secuencias genéticas, el muy fuerte reforzador genético del citomegalovirus y el promotor de la betaactina. Estos vectores génicos fueron inyectados en el músculo tibial interior de ratones-mdx recién nacidos y juveniles de 4 a 6 semanas de edad. Después de 30 días, en los ratones recién nacidos el 42 % de las células en el músculo tratado tenía nueva distrofina, la cual todavía fue detectada después de seis meses. En los ratones juveniles, el 24 % de las células musculares tenían nueva distrofina después de 30 días, no obstante, fue reducida la cantidad a la mitad después de seis meses. Solo los ratones juveniles mostraron pequeños problemas inmunes. Hasta el momento, tales nuevos vectores construidos son mas efectivos para el tratamiento de la distrofia muscular Duchenne vía terapia génica (Karpati, Montreal). Transferencia génica con virus adeno-asociados: Los pequeños virus adeno-asociados sólo pueden transportar material genético que no sea mayor de aproximadamente 5.000 nucleótidos, un tercio del ADNc de distrofina entero. Su ventaja consiste en que ellos transfieren el gen con más eficacia que los adenovirus normales. La desventaja es que para ser transferido el ADNc de distrofina, este tiene que ser acortado bastante para que quepa en este pequeño vector. Los pacientes con distrofia muscular Becker, que progresa mucho más despacio que la distrofia Duchenne, tienen tal distrofina acortada en sus músculos, por lo tanto, una posible terapia génica con la transferencia de uno de estos mini genes tipo Becker no curarían completamente la distrofia muscular Duchenne, sólo la transformarían en la forma Becker mas benigna. Para determinar cuales de las cuatro regiones de la proteína distrofina normal - las dos regiones terminales, la rica en cisteina, o las regiones de la barra central - son importantes y cuales no lo son, se han hecho extensos experimentos en el que ratones distrófico fueron genéticamente modificados para que ellos tuvieran una de nueve diferentes proteínas distrofinas acortadas en sus músculos. los, debido a que ellos no desarrollan fibrosis, la proliferación de tejido conectivo, como en los chicos con Duchenne, sus procesos de degeneración causados por la enfermedad no sobrepasen la regeneración. Aunque la transferencia génica pueda ser estudiada con ellos, habría que tener presente que cualquiera de los resultados obtenidos con estos ratones no pueden ser considerados como inmediatamente aplicable a niños sin estudios clínicos adicionales con pacientes con Duchenne. ¡Un niño no es un ratón grande! Perros distróficos: Algunos experimentos son realizados en perros distróficos, con distrofia muscular del perdiguero dorado, perros GRMD en sus siglas en ingles, los cuales en contraste con los ratones, tienen una distrofia muscular similar a la distrofia Duchenne. Ellos realmente están impedidos y por lo tanto difíciles de criar y mantener. Su gen de la distrofina tiene una mutación puntual en el sitio donde se empalma el receptor del intrón 6 que conduce a una deleción del exón 7 en el ARNm, un cambio del marco de lectura y un codón de parada prematuro. Transferencia génica con adenovirus: Para transferir un gen, un transportador, un vector génico es necesario. Un modo de transferir el material genético a células vivas es empaquetarlo en virus, que consisten en una cadena de sus propios genes dentro de una cápsula de proteína. Ellos se unen por si mismos a receptores especiales de proteínas en la superficie de la célula, introducen sus genes en la célula y luego usan, o esclavizan, el aparato sintetizador de la célula para reproducirse. Principalmente dos clases de virus son usadas como vectores génicos en la investigación de Duchenne, el adeno virus y el diez veces el más pequeño virus adeno-asociado. Estos virus no pueden multiplicarse dentro de la célula objetivo porque los científicos han eliminado casi todos sus propios genes. El virus que mas ventajas tiene parece ser el destripado, prácticamente vaciar el contenido de un adenovirus, que no contenga ningunos de su propios genes, y así tener el espacio para las mas de 36 000 letras genéticas foráneas, suficiente para contener el ADNc entero, por ejemplo todos los exones con la información para la proteína distrofina completa, y para secuencias adicionales de control. Con estos virus destripados, en hasta el 30 % de las fibras de músculo de un ratón distrófico, fue sintetizada distrofina nueva seguida de una mejoría de la función del músculo tanto 8 en la circulación sanguínea. Para asegurar que nueva distrofina sea sintetizada sólo en las células musculares, otra secuencia genética es agregada al gen de la distrofina en el virus, un promotor CK, el cual normalmente activa el gen de la proteína muscular creatina kinasa. Este promotor se aseguraría que el nuevo gen de la distrofina sea activado sólo en células de músculo y no en otra parte. Para investigar que tanto tales estrategias podrían funcionar en un animal viviente, fueron creados ratones-mdx los cuales tienen una construcción génica insertada en sus cromosomas. Esta consiste en el a menudo usado gen Becker (el gen de la distrofina con el defecto común de la distrofía muscular Becker), con 6,300 pares de bases, y de solo la mitad de la longitud del gen normal, el cual es precedido de un promotor CK de 1,354 pares de bases. La distrofina acortada estuvo presente durante el completo tiempo de vida de los ratones, más de 24 meses, en cantidades suficientes para mejorar todos los síntomas clínicos cuantificables. La nueva proteína aparecía solo en los músculos de los ratones transgénicos, significativamente mas en músculos de contracción rápida que de contracción lenta. Los músculos de contracción rápida, los cuales pueden trabajar inmediatamente pero no de forma consistente, obteniendo su energía a través de la glicólisis, por la rápida degradación de la glucosa sin el uso de oxigeno. La energía de los músculos de contracción lenta y consistente es proveída por las enzimas de la cadena del proceso respiratorio, o la lenta “combustión” de sustancias orgánicas con oxigeno. Como los músculos de contracción rápida son destruidos primero en la distrofia muscular, la aparición predominante de nueva distrofina en esos músculos de contracción rápida permite el simple aminoramiento de esta consecuencia temprana de la enfermedad. Experimentos también han mostrado que algo tan poco como 20 a 30 % de la cantidad normal de distrofina tiene un significante efecto terapéutico. Para estos experimentos con ratones transgénicos, el gen Becker de la distrofina junto al promotor CK fue introducido en las células germinales por medio de inseminación artificial y manipulación genética, así que esto fue heredado a la progenie de los ratones. Esta es una técnica la cual obviamente no puede ser realizada con humanos. Para curar a un niño afectado, Hasta ahora se sabía que algo de la región central parecida a una barra puede ser quitada sin la pérdida de función. El análisis detallado de la estructura tridimensional ahora revela cuales partes particulares de la estructura de la barra podrían ser suprimidas sin perderse considerablemente la función que protege al músculo. Una de las distrofinas acortadas, que era aproximadamente la mitad de lo normal, tenía prácticamente las mismas propiedades que la proteína inalterada. La entrega de este y algunos otros genes acortados de la distrofina por medio de virus adeno-asociados en los músculos de los ratonesmdx previno y parcialmente revirtió los síntomas distróficos. Estos resultados demostraron que modificaciones específicas a la distrofina pueden generar nuevas proteínas que son considerablemente más pequeñas, pero más funcionales que las distrofinas naturalmente acortadas en pacientes con distrofia muscular Becker (Chamberlain, Seattle). Si aproximadamente el 30 % de la cantidad normal de distrofina inalterada reaparece, medidas hechas sobre el diafragma de los ratones indican que la función del músculo también se mejora. La transferencia del mini gen también conduce a una mejora de la función muscular. Además, estos experimentos han mostrado que la transferencia génica conduce a un mejor término en los animales más jóvenes, debido a que hay menos problemas de rechazo inmune y, a que después de una sola inyección, la nueva distrofina recién sintetizada se mantiene en los músculos por mayor tiempo que en animales adultos. Después de aplicarse un solo tratamiento en ratones recién nacidos, la recién formada distrofina todavía puede ser encontrada después de un año. Para un uso futuro en la gente, esto significa que los pacientes tendrían que ser tratados cuanto antes después del nacimiento cuando sus músculos todavía están en gran parte intactos (Clemens, Pittsburgh). Transferencia génica vía circulación sanguínea: En los experimentos hasta ahora descritos, las soluciones han sido que los virus que contienen el gen de la distrofina fueran inyectados directamente en los músculos de los animales. Para alcanzar todos los músculos, hasta aquellos del corazón y los pulmones, son realizados experimentos para desarrollar un tratamiento sistémico, lo que posibilitaría inyectar los virus 9 mentos para transferir el gen de la distrofina están siendo preparados (Kochanek, Colonia). Transferencia de genes desnudos: Para esta técnica, el ADN del material genético a ser transferido no es incorporado en virus, si no en plasmidos, pequeñas estructuras de ADN circulares sin cubierta de proteína, que existen, a veces en cantidades grandes, en bacterias donde sobre todo dan lugar a la resistencia contra los antibióticos. La ventaja de esta clase de transferencia génica consiste en que los plasmidos no contienen ninguna proteína, sólo material genético, ADN desnudo, para que ninguna reacción inmune se desarrolle contra el material vector. Los experimentos fueron hechos con plasmidos que contenían un marcador o delator de genes, genes cuyas proteínas pueden ser descubiertas en el tejido del músculo por tinción o por la producción de luz para que así el éxito de un experimento de transferencia pueda ser supervisado fácilmente. Cuando volúmenes relativamente grandes de una solución de plasmidos fue inyectada bajo presión en arterias de los miembros de ratas y monos de rhesus, el delator de los genes betagalactosidasa y luciferasa fueron transferidos en hasta el 20 % de las fibras del músculo después de una sola inyección y en hasta el 40 % después de varias inyecciones repetidas. La presión fue creada bloqueando la salida venosa de un miembro durante un corto tiempo. Los experimentos para transferir el gen de la distrofina actualmente son realizados en ratones mdx, monos, y perros GRMD (Wolff, Madison; Braun, Estrasburgo). En Francia, estudios clínicos con chicos con Duchenne han sido iniciados, los cuales serán descritos en la sección “Estudios clínicos”. Experimentos para vencer los problemas inmunológicos: Como los plasmidos de ADN no contienen ninguna proteína, la transferencia génica con tal ADN desnudo también permite examinar los problemas potenciales con respuestas inmunes hacia la distrofina recién creada sin la interferencia de otras proteínas que son introducidas con otros métodos de transferencia génica como los que usan vectores virales y celulares. Si el gen humano de la distrofina es introducido en músculos de ratones-mdx, una respuesta inmune se desarrolla contra la distrofina extraña. Esto no pasa después de la transferencia del gen de raton de la distrofina, a pesar que no estaba se tendría que transportar el gen con su promotor por medio de transferencia génica con un vector pronto después de nacer, si es posible, en todos sus músculos. (Lochmüller, Munich). Amplificación del blanco de la transferencia génica: Los virus se unen por si mismos a estructuras específicas sobre la membrana de la célula, los receptores usados por el virus coxsackie y el adenovirus son por donde ellos penetran a través de la membrana de la célula del músculo. Estos receptores, sin embargo, son más numerosos en el desarrollo y regeneración de las células músculares. Siendo menos numerosos en los músculos maduros que no se regeneran más. Así, la transferencia génica con adenovirus vectores es más eficiente en células de músculo que se dividen. Para vencer esta deficiencia, los ratones transgénicos fueron producidos para que expresen estos receptores en grandes cantidades sobre la superficie de las fibras maduras del músculo. Esto conduce a una transferencia del gen de la distrofina 10 veces más eficiente (Holland, Montreal; Lochmüller, Munich). Ya que la multiplicación de los receptores, a los que se une el virus, en las células musculares del paciente solo puede ser lograda por medio de métodos o técnicas génicas adicionales con todos sus riesgos, deberan ser creadas proteínas de ayuda. En este caso, serian anticuerpos monoclonales los cuales consisten en una clase unicas de moléculas que pueden por un extremo unirse muy específicamente con un solo receptor entre otros receptores más numerosos. Por el otro extremo, tales proteínas inmunes pueden unirse a las proteínas modificadas del recubrimiento de los adenovirus. Para lograr esta union, información genética adicional de una cadena de 33 aminoácidos de una bacteria fueron introducidos en los adenovirus por manipulación genética. Estos adenovirus pueden entonces unirse ellos mismos, por medio del anticuerpo que hace de puente, a los receptores de la integrina y los receptores nerviosos (NCAM) de la membrana, que son más numerosos que los receptores a los que se une normalmente el adenovirus. Este método permite que 77 veces mas adenovirus pasen a través de la membrana de la célula muscular que antes. Con esta nueva técnica, la cual también es usada en otras enfermedades, únicamente fue transportado el gen que produce la fácilmente detectable proteína beta-galactosidasa. Experi10 con mutaciones puntuales que no interfieren con la síntesis de otras formas de distrofina. El trabajo experimental actual se enfoca en la determinación de cuales otras distrofinas deben estar presentes para permitir la tolerancia inmune al aspecto (forma) del nuevo tipo de distrofina muscular después de la transferencia génica (Wells, Londres). presente distrofina normal en los músculos de estos ratones distróficos. La carencia de una respuesta inmune a la distrofina de ratón podría haberse debido a la presencia de otras formas de distrofina. Estos resultados sugieren que respuestas inmunes a la transferencia génica de distrofina no puedan ser un problema particular en pacientes con Duchenne, sobre todo en aquellos Experimentos con células madre Entre las células satélite y los mioblastos de los músculos, así como entre las células de la piel y vasos sanguíneos, se encuentran células madre las cuales pueden formar nuevos músculos o regenerarlos. como en células nerviosas o de vasos sanguíneos para crear nuevos músculos. Y que estas pueden ser cultivadas por largo tiempo. Estas células madre de músculo fueron multiplicadas en el laboratorio, y a continuación 400,000 de ellas en 25 microlitros (un cuarentavo de centímetro cúbico) de liquido se inyectaron en una sola porción de un músculo de ratones-mdx. Con el fin de ver en que forma son diferentes estas células de las células miogénicas normales, las más especializadas células EP fueron inyectadas en ratones-mdx bajo las mismas condiciones. En los ratones que fueron tratados con células EP, 130 células musculares en la zona de la inyección contenían nueva distrofina después de 30 días, la cual no obstante, después de 90 días, habia desaparecido extensivamente. En estos ratones, reacción inmune de linfocitos fue observada, la cual probablemente es responsable de la lenta desaparición de la nueva distrofina. En contraste a estos resultados, 1,500 células musculares en la zona de la inyección en los ratones tratados con células madre de músculo contenían nueva distrofina, cerca de 10 veces mas que después de la inyección con células EP. Aun después de 90 días, en prácticamente todas estas células, la nueva distrofina estaba todavía presente. En este caso, no hubo reacción inmune aunque los ratones receptores no habían recibido ninguna medicación inmuno supresora. Debido a que las células madre de músculo usadas en estos experimentos fueron aisladas de ratones normales recién nacidos, esta técnica probablemente no será aplicable en humanos sin una modificación para el caso de niños con distrofía muscular Duchenne. Esto puede, no obstante, influenciar los recientes trabajos de Las células madre existen en muchos tejidos del cuerpo, también en músculos esqueléticos y en la médula ósea. Estas células no-especializadas pueden desarrollar muchas clases de células especializadas, por ejemplo células madre de médula ósea en los diferentes tipos de células sanguíneas, y células madre de músculo en células de músculo nuevas. Estas células pluripotentes son células madre somáticas o adultas, en contraste con las células madre embrionarias que son totipotentes y que pueden desarrollarse en todas las clases de células del cuerpo y células germen. La investigación de células madre para encontrar una terapia para la distrofia Duchenne sólo usa las células madre adultas de animales experimentales, así los problemas éticos unidos con el empleo de células madre humanas embrionarias serian evitados. Células madre de músculos esqueléticos: En la superficie de las células musculares se encuentran las denominadas células satélite, también llamadas células miogénicas o mioblastos, las cuales después de una activación a través de varios pasos intermedios, pueden formar nuevos músculos o reparar músculos lesionados. Para determinar cuales de tales células de “respaldo” son entera o parcialmente células madre, fueron aisladas células satélite de músculos esqueléticos de ratones recién nacidos. De esta forma se encontró que estas consisten de tres diferentes clases, principalmente las así llamadas células miogénicas EP y LP, las cuales ya se encuentran algo especializadas. La tercera clase son células madre derivadas de músculo, MDSC. Estas son bastante raras, solo una entre 100,000 células satélite es una de tales células MDS. Pero estas raras células son pluripotentes, esto es, que pueden desarrollarse en células musculares así 11 20,000 de estas fueron inyectadas en el flujo sanguíneo de ratones-mdx hembras. Después de un mes, entre 5 y 9 % de sus células musculares contenían distrofina normal y algunas también contenían cromosomas-Y. Actualmente, en el 2002/2003, estos experimentos fueron repetidos y extendidos a células madre obtenidas de la piel. Las ventajas de un aislamiento de células de la piel es que este tejido es más accesible que el tejido muscular, y que los animales receptores no tienen más que ser irradiados. Una pequeña población lateral de células fue también obtenida con la técnica FACS de células de piel, las cuales tienen las mismas propiedades en su superficie, o marcadores, como las células madre de músculo SP. Los porcentajes de células SP actualmente es de 0,1 % entre células de medula ósea, de 0,7 % entre células musculares, y de 1,2 % entre células de piel. Tres meses después de la inyección de 6,000 a 50,000 de células SP de piel, 2,3 % de las células musculares de los ratones hembra contenían nueva distrofina y algunas también contenían cromosomas-Y. Este experimento ha probado que las células madre pueden ser aisladas de piel, y que, después de su aplicación vía flujo sanguíneo, pueden formar nuevas células musculares con distrofina normal. Esta técnica todavía no es suficientemente efectiva para ser significativamente terapéutica. Pero después de ser optimizada con más investigación, una terapia para distrofía muscular Duchenne posiblemente se base en ella (Kunkel, Boston). Activación de células madre de músculo: Las células madre de músculo con estructuras específicas en su superficie se localizan en músculos intactos, y no se desarrollan en nuevas células musculares, estas por lo tanto no son miogénicas. Pero si los músculos son lesionados y las células musculares se regeneran solas, entonces el número de células madre de músculo aumenta más de diez veces. Estas células son ahora miogénicas, pudiendo desarrollarse en mioblastos y nuevas células musculares, esto fue observado en experimentos con cultivos de células y ratones. Esta activación fue iniciada por proteínas Wnt, una familia de proteínas señaladoras las cuales aparentemente son producidas al lesionarse las células musculares y las cuales también juegan un rol durante el desarrollo embrional (Rudnicki, Ottawa). estudios con mioblastos (Huard, Pittsburgh; Wernig, Bonn). Células madre de medula ósea, músculo y piel: A finales de la última década, fue realizado el primer experimento con células madre de medula ósea y con células satélite musculares. En todos los experimentos, las células madre fueron obtenidas de ratones machos normales con genes normales de distrofina, y estas células fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones-mdx hembras. Los ratones hembras eran homocigóticos, esto es, que los genes en sus dos cromosomas-X estaban mutados, así que no podían producir ninguna distrofina propia. Esto permitía que las células inyectadas en los ratones hembras pudieran ser localizadas por el cromosoma-Y. Los ratones hembras habían recibido una irradiación muy alta de rayos X, letal para el sistema inmune, para evitar una reacción inmune. La transferencia de las células madre regenero la medula ósea de los ratones. Se inyectaron 10 a 50 millones de células de medula ósea sin tratar. Tres meses después, distrofina pudo ser detectada en más de un 10 % de las células musculares de los ratones. Algunas de las células positivas de distrofina contenían cromosomas-Y, comprobándose que las células de medula ósea de los ratones machos, que llegaron vía el flujo sanguíneo, se fundieron con las células musculares de los ratones-mdx hembras. Estos tuvieron de esta forma la información normal de la distrofina, la cual fue entonces usada para la producción de distrofina funcional. Esto fue muy importante para probar que la nueva distrofina no apareció por reversión, esto es, por una omisión espontánea de exón la cual ocurre en pequeñas excepciones en ratones-mdx y también en chicos con Duchenne. Para encontrar cual parte de las células de medula ósea tenían propiedades de célula madre, un pequeña población lateral, SP, pudo ser separada de la mezcla celular original por el método de clasificación por activación celular fluorescente o FACS. Como estas células SP tenían propiedades de célula madre, fueron usadas para experimentos posteriores. Tres meses después de la inyección de solo 2,000 a 5,000 de esas células SP de medula ósea, mas del 4 % de las células musculares de los ratones-mdx tenían distrofina. En una forma similar, células madre SP de músculo fueron aisladas de células satélite musculares, y 7,000 a 12 Genes de la distrofina intactos podrían ser transferidos en estas células madre derivadas del paciente por procedimiento ex-vivo con vectores conocidos, siendo después multiplicadas en el laboratorio, y finalmente inyectadas en las más importantes arterias del niño. Posiblemente, el tratamiento tendría que ser repetido después de varios meses, por lo que es importante que esas células no sean rechazadas por el sistema inmune. Una de las más importantes ventajas podría ser, que con esta técnica pueden ser alcanzados todos los músculos, incluido el cardiaco y músculos respiratorios. Este podría ser un tratamiento sistémico con relativamente pocas inyecciones comparado a otros acercamientos de terapia génica (Cossu, Milan). Un experimento natural con células madre: A la edad de un año, un chico con distrofía muscular Duchenne recibió un transplante de medula ósea de su padre debido a que sufría otra enfermedad (sin relación a distrofía Duchenne). Ya que el todavía caminaba a los 14 años a pesar de tener una deleción en el marco de lectura del exón 45, fue asumido que las células madre de la medula ósea habían proveído la información para nueva distrofina. La investigación con un nuevo material bioptico, no obstante, ahora mostró que los síntomas mas moderados de la enfermedad se debían únicamente en un pequeño grado al transplante, pero principalmente a la deleción espontánea adicional del exón 44, así que en el ARNm, el exón 46 seguía inmediatamente después del exón 43. Esta omisión de exón normalizo el marco de lectura. La distrofina pudo otra vez ser producida pero de una extensión mas acortada, por lo que causaría síntomas de distrofia Becker (Ver el párrafo sobre la omisión de exon). Aparentemente, después de 13 años, un transplante de medula ósea pudo contribuir en algún grado como una terapia para distrofía muscular Duchenne, no obstante, no es suficiente para causar un cambio significativo de la enfermedad (Kunkel, Boston). Terapia celular con mioblastos: Los músculos tienen sus propias células madre, las células satélite o mioblastos, los cuales durante el desarrollo o la reparación de músculos, se funden entre ellos para formar miotubos y estos a la vez en largas fibras musculares. Debido a que la palabra “transferencia de mioblastos” ha sido mal usada de forma fraudulenta, actualmente se prefiere a menudo decir células miogénicas en Algunas proteínas Wnt han sido aisladas y caracterizadas ahora. Estas tienen cerca de 400 aminoácidos largos y contienen ácido palmitico, un ácido graso el cual parece es importante para la transmisión de señales moleculares (Nusse, Stanford). Mesoangioblastos, células madre de vasos sanguíneos: Medio millón de células madre de vasos sanguíneos de fetos de ratones normales, recientemente detectadas, fueron inoculadas en una sola inyección en la arteria de una de las patas posteriores de ratones. Estos ratones tenían faltante una proteína del complejo distrófino, la alfa-sarcoglicano, lo cual causa una de varias distrofias musculares del anillo óseo (cinturas) en los humanos. Las células inyectadas migraron hacia los capilares sanguíneos, pasaron a través de sus paredes celulares, y desde ahí a todos los músculos de la pata inyectada, especialmente en las fibras regenerantes. Por al menos tres meses después de la inyección, nuevo sarcoglicano estaba otra vez presente en cantidades casi normales. Lo mismo ocurrió para varias de las otras proteínas del complejo distrófino las cuales también estaban faltantes. También, no hubo reacciones inmunes. Después de tres inyecciones consecutivas cada 40 días, no solo fue casi corregido el defecto genético, si no que también la fuerza de la pierna tratada prácticamente fue normalizada. De la misma forma, no fueron encontrados problemas inmunes. Con el objetivo de checar que tanto esta técnica podía posiblemente ser usada para una terapia génica, los mesoangioblastos de ratones “enfermos” fueron aislados, y el gen faltante de alfa-sarcoglicano fue transferido por medio de retrovirus en las células madre defectuosas. La aplicación sistémica de estas células tratadas exvivo condujeron a los mismos resultados positivos que en los encontrados con células madre normales. Para estos experimentos, células madre derivadas de vasos sanguíneos fueron aisladas de fetos de ratón. Pero si fuera posible aislarlas de los mismos chicos con distrofia muscular Duchenne, estos resultados positivos inesperados significaría que un numero de problemas relacionados con los presentes experimentos de transferencia génica podrían ser evitados, por ejemplo, la baja efectividad, rechazo inmune, y el requerimiento de varias inyecciones en todos los músculos que puedan ser alcanzados. 13 nos. Estos han mostrado que el inhibidor inmune FK506 solo o combinado con el inhibidor MMF evitaba los problemas de rechazo mucho mejor por varios meses. Una gran densidad de aplicación, con una distancia de inyecciones de solo 1 milímetro y un alto número de transplantes de células, contribuyo al resultado de que en los monos mas del 67 % de las células musculares habían recibido los mioblastos, volviéndose células musculares híbridas (Tremblay, Québec). Un estudio clínico con la técnica modificada ha sido iniciado en Canadá (ver la sección “Pruebas Clínicas”). También en otros laboratorios, se trabaja para mejorar esta técnica de terapia celular. Por ejemplo se encontró que la m144, una proteína del sistema inmune, evita la inmediata muerte de los mioblastos después del transplante en los músculos de ratón (Hodgetts, Crawley, Australia). Experimentos con terapia génica ex-vivo: Para evitar completamente los problemas inmunes, experimentos fueron realizados para aislar los mioblastos del paciente mismo, y después en el cultivo celular, transferir un gen intacto de distrofina a las células, antes de re-inyectarlas de nuevo. En experimentos preliminares, usando electroporación, se transportaron plasmidos con un gen para una proteína fluorescente marcadora a través de la membrana celular de los mioblastos humanos en un recipiente de cultivo. Esta técnica transitoriamente hace permeables las membranas con un solo pulso eléctrico, por ejemplo 400 V a través de un hueco de 4 mm. En condiciones óptimas, hasta al 70 % los mioblastos se les transfirió el gen, el cual producía proteína fluorescente. Las células mantenían su habilidad para fusionarse en miotubos, la siguiente etapa de desarrollo muscular (Bernheim, Ginebra). vez de mioblastos. En los años 1990 y 1991, fueron realizados extensivos estudios con mioblastos en chicos con DM Duchenne. Esta técnica de transferencia de mioblastos había mostrado resultados positivos en ratones-mdx. Las células usadas contenían el gen normal de la distrofina debido a que estas derivaban de donadores sanos, mayormente el padre del paciente. Estas células fueron aplicadas en múltiples inyecciones a 0,5 centímetros de distancia en algunos músculos de los chicos con DM Duchenne con la esperanza de que células musculares con distrofina normal fueran encontradas. Estos experimentos no fueron exitosos en chicos con Duchenne, porque los mioblastos no emigraron suficientemente fuera de los sitios de la inyección, había problemas inmunológicos y, encima de todo, casi todos los mioblastos inyectados habían muerto después de un corto tiempo (Karpati, Montreal). Nuevos experimentos de transplante de mioblastos: Se continúo trabajando en esta técnica con el objetivo de determinar la razón por la que menos del 1 % de los mioblastos transplantados sobrevivía en los músculos distróficos. Los investigadores ahora están tratando de caracterizar estas pocas y raras células activas, y encontrar la forma de aislarlas de la mayoría de células inactivas. Por lo que ellos buscan señales moleculares, sustancias especiales en las células musculares, las cuales pueden activar a los mioblastos (Partridge, Londres). En los primeros experimentos, solo dos fármacos conocidos, la ciclosporina A y la ciclofosfamida fueron usadas para suprimir las reacciones inmunes en los pacientes con distrofía muscular Duchenne. Actualmente, otras sustancias han sido investigadas en estudios con mo- Cambiando la información genética (reparación génica) Mutaciones del gen de la distrofina en el cromosoma-X son reparadas con oligoribonucleótidos. Exones enteros son omitidos con el objetivo de restaurar el marco de lectura. Codones finales, o de parada, prematuros pueden posiblemente ser omitidos. serían evitados, (2) no sólo la distrofina de los músculos esqueléticos, si no todas otras formas de distrofina también serían reparadas, (3) la regulación específica de la producción de distrofina en el tejido sería mantenida, (y 4) la fabricación del agente terapéutico, los oligonucleótidos, probablemente sería más fácil y más barata que Experimentos han sido emprendidos con el objetivo de no introducir una secuencia génica funcional de distrofina en las células de músculo, pero si de cambiar la información genética defectuosa reparando la mutación. Tal técnica tendría cuatro ventajas importantes: (1) los riesgos de una transferencia génica mediada por virus 14 dedor del sitio de la inyección contenían distrofina nueva la cual no era distrofina revertante, por ejemplo distrofina normal después de una supresión espontánea de la mutación. Esta cantidad de distrofina nueva permaneció estable durante al menos 10 semanas (Rando, Palo Alto). Omisión de exón: Con esta técnica se intenta cambiar una mutación Duchenne en una mutación Becker. Esto puede ser hecho induciendo el mecanismo de empalme, el cual elimina los intrones del ARN pre-mensajero, a eliminar también un exón específico después de una mutación puntual o una deleción que ha alterado el orden del marco de lectura y por lo tanto causando un codón final o de parada prematuro. El objetivo de este método es restaurar el marco de lectura perturbado. El gen con su mutación no es alterado al omitir el exón, sólo el ARN mensajero, ARNm, el cual no contiene la información del exón omitido. Como el ARNm es más corto de lo normal, la proteína distrofina es también más corta, esta contiene menos aminoácidos. Si los aminoácidos faltantes formaran parte de la región central de la distrofina, no serian esenciales, y la proteína más corta resultante todavía podrá realizar su papel estabilizante en la membrana de las células del músculo. El resultado sería un cambio de los severos síntomas de la distrofia Duchenne a los mucho más suaves síntomas de la distrofia muscular Becker. Eliminación de la mutación de ratonesmdx: Este acercamiento fue usado para pasar de largo un solo defecto nucleótido, la mutación puntual en el exón 23 del ratón mdx. Un oligonucleótido en antisentido, consistiendo de 20 pares de bases que son complementarias a la secuencia de ARN del ARNpre-m en una de las zonas entre el exón 23 y el intrón 23, indujo la omisión del exón que contenía la mutación durante el proceso de empalme. La información genética del exón 23 del gen, que codifica 71 aminoácidos en la zona de la barra (de la proteína distrofina), fue omitida de esta forma durante el proceso de lectura. Este y los otros oligonucleótidos de antisentido fueron químicamente modificados, por ejemplo, protegiendo los normalmente libres y sensitivos grupos-OH en las unidades de ribosa del ARN por medio de grupos metílicos (-CH3). Cerca de 5 microgramos (una millonésima de gramo) de estos fármacos génicos, potencial- la fabricación del virus vectores con el material genético a ser transportado. Los Oligonucleótidos son cortas secuencias específicas de ADN o ARN, las cuales consisten en unas pocas bases (nucleótidos) conectadas unas con otras por puentes de fosfato-ribosa o desoxirribosa de los andamios del ácido nucleico. Estos pueden ser manufacturados en el laboratorio automáticamente. Tres clases de estrategias de reparación son aplicadas: (1) reparar la mutación a nivel del gen mismo, (2) cambiar la información genética durante trascripción del ARN por omisión de exón, (y 3) ignorando un codón de parada prematuro. Reparando el gen de perros GRMD: Los intentos para reparar las mutaciones puntuales a nivel génico son hechos usando cortos oligonucleótidos quiméricos, que contienen tanto ARN sobre unas de las cadenas como ADN sobre la otra. La cadena de ADN de los oligonucleótidos quiméricos es perfectamente complementaria a la correcta secuencia génica del sitio de la mutación puntual del gen, mientras que la parte de ARN es perfectamente complementaria a la secuencia mutante. Esto conduce a estructuras cuádruples apareadas, cadenas cuádruples, que son capaces de corregir una mutación tan pequeña activando los mecanismos biológicos de reparación del ADN de la célula. Con esta técnica, un ADN y un ARN oligoucleótido complementario se empalmarian al sitio de la mutación en el gen de la distrofina de perros GRMD distroficos al ser inyectados en un perro afectado de 6 semanas de edad. El músculo tratado mostró: (1) La evidencia de restauración del exón que se omitía debido a la mutación, (2) la restauración de la región codificada de la proeína por el exón faltante dentro de la proteína de completa de distrofina que se localizo correctaente en la membrana del músculo, (y 3), el más importante, la demostración de que el gen en el cromosoma-X fue corregido. La reparación de la mutación fue sostenida para casi un año en este perro (Bartlett, Bethesda). Reparando el gen de ratones-mdx: En un experimento similar, fue reparada en-vitro la mutación puntual en el exón 23 de mioblastos de ratones mdx y estos mioblastos entonces se uniron en miotubos los cuales crearon distrofina completa normal. Dos semanas después de una sola inyección de oligonucleotidos en los músculos de ratones mdx, del 1 a 2 % de las fibras alre15 última página de este reporte muestra los detalles moleculares de este experimento.) Este porcentaje de ARNm acortado sin exones 45 y 46 condujo a cantidades normales de distrofina acortada en al menos el 75 % de los miotubos. Después de 16 horas, esta nueva distrofina pudo ser detectada en las células, después de 48 horas esta se movió a la membrana celular y ahí se mantuvo por al menos una semana. La reaparición de la distrofina también condujo a la restauración del complejo distrófino en y bajo la membrana de la célula muscular. Entre tanto, el marco de lectura pudo ser corregido en preparaciones in-vitro de seis otros pacientes quienes tenían diferentes deleciones y también una mutación puntual. Esta técnica fue sumamente específica, resultando solamente en el retiro de un exón objetivo. Con la misma técnica, fue posible omitir otros 18 exones en las células de músculo cultivadas. Así, que esta estrategia muy prometedora, probada en experimentos en probeta, posiblemente más tarde pueda convertir las mutaciones Duchenne en mutaciones Becker en más del 65 % de los pacientes con deleciones. Los estudios en curso investigan diferentes métodos para la transferencia de los oligonucleótidos de antisentido en un organismo vivo. En este extremo, experimentos con ratones vivos son realizados, los cuales en lugar de su propio gen de la distrofina (de ratón), tienen el gen humano en sus músculos, el cual ha sido cambiado para crearles deleciones “humanas”. Estudios clínicos en chicos con DM Duchenne con estos métodos solo pueden ser considerados después de que estos estudios con ratones “humanizados” den resultados positivos. Ya que la estructura del gen de la distrofina es conocida en todo detalle, es posible predecir cual exón debe ser omitido con el fin de restaurar el marco de lectura después de una deleción o mutación puntual definida. Sin embargo, en este momento tales predicciones solo pueden ser puramente teóricas. No hay certeza, que tanto los resultados obtenidos en cultivo de células como en ratones, serán los mismos en chicos con DM Duchenne, de igual forma no hay certeza si en un caso individual, la restauración de distrofina acortada conducirá realmente a síntomas de distrofia muscular Becker (van Ommen, van Deutekom, Leiden). mente estabilizados, fueron inyectados junto con el detergente F127 en los músculos de la pata de ratones-mdx vivos. Después de dos a cuatro semanas, más del 20 % de las fibras musculares contenían al menos cantidades normales de la levemente acortada distrofina. Junto a esta, los otros componentes del complejo distrófino fueron localizados correctamente en la membrana celular. La fuerza muscular fue mejorada significativamente pero no completamente normalizada. Un repetido tratamiento incremento el número de fibras musculares positivas de distrofina sin el desarrollo de un rechazo inmune (Wilton, Perth, Partridge, Londres). Omisión de exón en el ARNm de la distrofina humana: El exón 45 del gen de la distrofina es el exón delecionado con más frecuencia en chicos con distrofia Duchenne. Esto causa un cambio del marco de lectura en el ARNm y un codón de parada prematuro, lo que conduce a una proteína truncada y no-funcional de distrofina que posteriormente es degradada en las células del músculo. Sin embargo, si ambos exones 45 y 46 se encuentran delecionados simultaneamente, el marco de lectura no es afectado, resultando una distrofina más corta de lo normal con la falta de una cadena de 108 aminoácidos no esenciales de la parte media de la proteína. Los pacientes con esta clase de deleción tienen síntomas más suaves, de distrofia muscular Becker. En experimentos en-vitro para deleciones especificas del exón 46 del ARNpre-m de distrofina en miotubos de ratones mdx se logro exitosamente con cuatro diferentes oligoribonucleótidos en antisentido complementarios a una secuencia regulatoria de empalme en el interior del exón 46. Con estos oligonucleótidos, una secuencia de reconocimiento de exón (ERS) o un reforzador de empalme exonico (ESE) son bloqueados, estructuras las cuales son necesarias para los procesos de empalme, la unión de los exones en el ARNm. Seguidos a estos, experimentos en-vitro similares fueron realizados con varios oligonucleótidos en antisentido específicos en el sitio de empalme análogo del exón humano 46. Con uno de ellos, consistiendo de 19 nucleótidos, era posible suprimir el exón 46 de aproximadamente el 15 % de los ARNpre-m’s de distrofina en miotubos obtenidos de dos pacientes con Duchenne quienes tenían una deleción del exón 45. (La 16 final del exón 23 del ARNpre-m de la distrofina en los sitios importantes del proceso de empalme. Por lo que, estos sitios de empalme fueron bloqueados y el exón 23 fue removido junto a los intrones durante el empalmado del ARNpre-m (siendo una omisión de exon). Como la mutación puntual de los ratones-mdx se localiza en el exón 23, la remoción de este exón resulto en que los células musculares de los ratones-mdx, las cuales no podían crear ninguna distrofina, ahora producían una proteína distrofina levemente acortada la cual fue correctamente localizada bajo la membrana celular. El objetivo de este fundamental experimento in-vitro – fuera de ratones vivos – fue probar que las células musculares pueden por si mismas producir los oligonucleótidos de antisentido terapéuticos. Para una aplicación humana, tendrían que ser usados ARNsn-U7 adaptados para la mutación individual del paciente, cuyo gen debe ser transportado por un vector génico terapéutico al núcleo celular de las fibras musculares. Una alternativa podría ser una transferencia ex-vivo transportando genes ARNsn-U7 a células satélite u otras células madre de músculo y después inyectar estas al flujo sanguíneo o directamente en el músculo. Como los genes de ARNsn-U7 son muy cortos, la transferencia seria probablemente más fácil que transferir el ADNc de la distrofina entera o acortada, como se ha venido tratando con otros métodos (Weis, Berna; Lochmüller, Munich). Recombinación homóloga: La mutación puntual en el gen de la distrofina de ratones mdx podría ser reparada en el 15 a 20 % de mioblastos aislados por la adición de una cadena de ADN de 603 pares de bases (nucleótidos) cuya secuencia es la misma que la secuencia antes y después del sitio de mutación del exón 23 de los ratones, pero sin contener el cambio C-a-T de la mutación. Parte del segmento del nuevo gen fue cambiado siguiendo una correspondencia, u homólogia, en el exón 23. Esta técnica de recombinación homóloga por fragmento corto, SFHR con sus iniciales en ingles, ahora es aplicada a mioblastos aislados de pacientes con Duchenne con mutacion de deleción en el exón 13. (Kapsa, Melbourne). Ignorar un codón de parada prematuro por medio de antibióticos: Aproximadamente el 5 % de los chicos con Duchenne tienen una Los sitios de empalme son secuencias de ARN específicas en la frontera entre exones e intrones, la cual es esencial para el retiro correcto del intrón no-codificando de la secuencias de ARNpre-m. Este ARN pre mensajero es el primer producto de un gen activo; después del retiro de las secuencias del intrón por empalme este se convierte en ARN mensajero, ARNm, que se mueve a los ribosomas donde actúa como el transmisor de la información para la síntesis de la proteína. Omisión de exón con oligonucleótidos producidos internamente: En un nuevo método de omisión de exon, los oligonucleótidos de antisentido no tienen que ser inyectados aunque son sintetizados en el núcleo celular, donde son necesarios, después de transcribirse su propio gen. Las secuencias del intrón son cortadas y eliminadas del ARNpre-m en el núcleo celular por los splicesomas. Estos son estructuras complejas que consisten en varias proteínas y pequeños ARN's, o ARNn’s, los cuales reconocen los limites entre exón e intrón y unen los exones después de cortarlos, empalmandolos sin alterar el marco de lectura. Algunos de estos muy cortos ARN’s son los ARNn-U7. Estos se unen a sitios de empalme al reconocer secuencias especiales en el ARNprem, bloqueando el empalme de exones específicos, y de esta forma asegura que varias proteínas de diferente longitud puedan ser producidas por un mismo gen. Los ARNn-U7 normalmente regulan el proceso de empalmado del ARNm de las histonas. Las histonas son proteínas necesarias para el empacado del ADN en los cromosomas. Para este nuevo método, los ARNn-U7 fueron genéticamente modificados para que no estén ligados mas al ARNpre-m de la histona, si no a los sitios de empalme en la región del exón 23 del ARNpre-m de la distrofina de ratón. Para lograr esto, el gen que codifica el ARNsn-U7 modificado junto con un reforzador de creatinakinasa fue empacado en plásmidos como vectores, seguido a esto, en un experimento de laboratorio, se transfirieron a mioblastos aislados de los ratones. Estas células se desarrollaron en el contenedor de cultivo en células musculares. En el núcleo de los mioblastos transgénicos, el gen transferido produjo los ARNn-U7 modificados. Estos realizaron el nuevo reconocimiento de secuencias y se unieron ahora al inicio y 17 posible terapia para la distrofia muscular no necesitaría largos procedimientos de aprobación (Sweeney, Filadelfia). Con el fin de confirmar estos resultados positivos, otros dos estudios con ratones-mdx fueron realizados los cuales mostraron, sin embargo, que bajo condiciones similares después de un tratamiento con gentamicina no pudo detectarse nueva distrofina (Karpati, Montreal; Lochmüller, Munich). Dos estudios clínicos con gentamicina han sido realizados en chicos con Duchenne, pero tampoco condujeron a nueva distrofina. Posiblemente el periodo de prueba de 14 días fue insuficiente. Por lo que, otra y mas larga prueba clínica con 36 pacientes es ahora realizada (Mendell, Columbus). mutación puntual en su gen de la distrofina donde esta cambiada una palabra del código de aminoácidos en uno de los tres codones de parada, TGA, TAG y TAA, después de los cuales la síntesis de distrofina se detiene o finaliza prematuramente. La gentamicina es un antibiótico que causa que el mecanismo de traducción del ARN en los ribosomas ignore un codón de parada tan prematuro, esto es leer a través de el. Los codones de parada normales, los que están protegidos por una estructura especial tridimensional, sin embargo, serian leídos o usados como antes. En ratones-mdx, hasta el 20 % de la cantidad normal de distrofina nueva y funcional ha sido obtenida de este modo. La gentamicina tiene la ventaja de ser un fármaco conocido, cuyo empleo como una Reemplazo de la distrofina La utrofina es una proteína muscular presente en pequeñas cantidades en los pacientes con Duchenne. En grandes cantidades esta podría asumir las funciones de la distrofina. utrofina únicamente cuando se les daba el antibiótico tetraciclina en su agua de beber. El incremento de las cantidades de utrofina prevenía el desarrollo de síntomas de distrofía muscular Duchenne, y esto efecto fue mas pronunciado en ratones recién nacidos que en de 10 o 30 días de edad. Para una posible terapia para la distrofia Duchenne, otra estrategia es seguida, que es aumentar la cantidad normalmente baja de utrofina aumentando la actividad de su gen. Para hacer esto, una sustancia de activación es necesaria, la que podría ser un fármaco conocido, o alguna otra sustancia química o natural. Durante los últimos años, la química sintética actual ha desarrollado métodos para producir automáticamente miles de sustancias parcialmente desconocidas. Varias de esas sustancias han sido probadas en el laboratorio, también automáticamente, en cultivos de células de ratones-mdx por su habilidad de activar el gen de la luciferasa, la cual es precedente de dos promotores del gen de la utrofina. Cada acierto, por ejemplo, cada sustancia que mostraba al menos una pequeña actividad en estas pruebas preliminares, es posteriormente modificada, y entonces, todas estas sustancias similares son probadas primero en cultivos de células musculares, y si estas reaccionan positivamente, se observa que tanto en ratones-mdx vivientes pueden también Activación del gen de la utrofina: La utrofina es una proteína similar a la distrofina. En los humanos, su gen esta localizado en el cromosoma 6, teniendo 75 exones y cerca de un millón de pares de bases de extensión. La proteína de la utrofina es aproximadamente 7 % más corta que la distrofina. Está presente en muchos tejidos del cuerpo, también en el músculo, pero allí se concentra en las regiones donde los nervios motores se ponen en contacto con la membrana del músculo. Antes del nacimiento, la concentración de utrofina en el músculo es mucho más alta que después del mismo. Esta proteína, incluso cuando está presente sólo en pequeñas cantidades, hace los síntomas de la distrofia Duchenne menos severos de lo que serían si la utrofina también estuviera ausente. De hecho, en ratonesmdx, cuyo gen de la utrofina fue eliminado experimentalmente, no teniendo ni distrofina, ni utrofina, tienen síntomas como de DM Duchenne y mueren pronto en contraste a los ratones-mdx normales cuyos músculos no se degeneran. Los experimentos con ratones han mostrado, que la utrofina, si está presente en cantidades suficientes, puede sustituir a la distrofina. Los ratones usados fueron ratones transgénicos los cuales contenían mini genes de utrofina en su línea germinales, introducidos por una técnica que no puede ser usada en humanos. Otros ratones transgénicos fueron inducidos a producir 18 nica en los músculos de ratones-mdx conduce a una marcada activación de la utrofina en la membrana exterior que contacta con los nervios motores. --- El aminoácido L-arginina puede incrementar las cantidades de utrofina en ratones-mdx y aliviar significativamente los síntomas distróficos. La enzima oxido nítrico sintetasa usa arginina para la producción del biológicamente activo oxido nítrico gaseoso. Pero el oxido nítrico es también activo en otros procesos biológicos. La arginina, no obstante, no puede ser usada como un tratamiento para la distrofía muscular Duchenne sin posteriores investigaciones. --- La pequeña proteína llamada heregulina con la cual los nervios motores estimulan al músculo a desarrollarse, puede también aliviar significativamente los síntomas de ratones-mdx. --- Un extremo del ARNm de la utrofina no es trasladado en proteína, pero se une a estructuras en las regiones de contacto con los músculos de los nervios, interfiriendo de esta forma a la utrofina en esos sitios. Si esta interferencia pudiera ser prevenida por medio de un fármaco, esto podría hacer posible que la utrofina se distribuya mucho mas sobre la membrana muscular entera, pudiendo así reemplazar mejor a la distrofina. --- Otra forma de utrofina, la muy similar utrofina-B fue recientemente identificada en vasos sanguíneos. Pero solo la “normal” utrofina-A esta presente en los músculos y puede parcialmente compensar a la distrofina después de la activación de su gen. activar el gen de la distrofina. Solo después que una o varias sustancias activas convincentes son encontradas, serian entonces posible iniciar estudios clínicos con pacientes con distrofía muscular Duchenne en unos pocos años (Davies, Oxford). Tal activador del gen de la utrofina podría, si fuera una molécula pequeña, ser aplicado vía el flujo sanguíneo desde donde pudiera alcanzar todos los músculos. El sistema inmune reconocería las cantidades adicionales de utrofina como una sustancia propia del cuerpo debido a que esta ya presente en pequeñas cantidades en los chicos con distrolfía Duchenne. Por lo que, ninguna reacción inmune deberá desarrollarse. Sin embargo, algo que puede activar el gen de la utrofina, podría también hacer lo mismo con otros genes. Por lo tanto, antes de que tal activador sea probado en niños, debe tenerse la certeza que este no producirá efectos secundarios adversos. Otros experimentos para incrementar la utrofina: La transferencia de un gen acortado de la utrofina en perros distróficos condujo a la producción de utrofina, la cual pudo tomar las funciones de la distrofina faltante. --- Glucocorticoides, entre ellos la prednisona, pueden aumentar la expresion del gen de la utrofina en algun grado. --- Tales corticoesteroides han sido aislados de medicinas chinas de plantas que tradicionalmente son usadas contra la distrofia muscular. --- Un leve grado de inflamación cró- Otras proteínas Las mutaciones del gen de la distrofina y la ausencia de distrofina influencian la actividad de varios otros genes. donde hay secuencias complementarias de ADN de esos genes activos. La intensidad de la luminosidad de esos puntos es automáticamente medida, lo cual hace posible determinar cuales genes están activos, en que proporción y cuales no están activos. Con este perfilamiento de expresión génica, varios miles de genes de muestras musculares fueron examinadas provenientes de ratones normales y mdx, chicos sanos y con distrofía muscular Duchenne, de ratones transgénicos sin distrofina ni utrofina propia, y también de ratones que en vez de la propia tienen distrofina humana en sus músculos. Estos resultados mostraron que la ausencia de Actividad de miles de genes musculares: Con el objetivo de medir simultáneamente la actividad de infinidad de varios genes en una muestra de tejido muscular en un único experimento, se usa un método de clasificación con chips génicos (gene arrays). Ya que las secuencias de prácticamente todos los genes humanos son conocidas, pequeños segmentos de miles de genes pueden ser producidos automáticamente y aplicados por un robot en ciertos patrones a un chip de cuarzo de pocos centímetros cuadrados de extensión. Si se producen bioquímicamente copias de ADN de ARNm’s de todos los genes activos, se aplican como muestra de análisis al chip, apareciendo puntos luminosos en aquellos lugares del chip 19 elegans es un gusano transparente de 0,9 milímetros de largo que es usado extensivamente por investigadores génicos debido a que todos sus 19.733 genes son ya conocidos, así como sus 959 células de su cuerpo, 95 de las cuales son células musculares. Sus músculos tienen una distrofina similar a la de los humanos, la cual también puede tener mutaciones causando síntomas distróficos. Genes individuales les fueron inactivados y también activados, permitiendo que los síntomas distróficos puedan ser estudiados y ver donde son causados por la falta o incremento de la actividad génica. Por ejemplo, esto podría mostrar que la activación de la distrobrevina, una muy corta forma de distrofina, puede aminorar significativamente la degeneración muscular. Posteriores investigaciones contribuirán a aclarar todavía desconocidas relaciones moleculares durante el desarrollo de la distrofia muscular (Ségalat, Lyón). Integrinas y sintrofinas: Las integrinas son una familia de proteínas las cuales se localizan en la membrana de las células musculares. Estas son necesarias para la fusión de los mioblastos a los miotubos y el desarrollo de miotubos a células musculares maduras. También estas participan en la propagación de señales de célula a célula. En ratones sin distrofina y utrofina, la cantidad de una de esas integrinas fue aumentada cerca de dos veces por vía de terapia génica. La extensión de la expectativa de vida de los ratones fue tres veces mayor, y sus síntomas distróficos aminoraron significativamente (Kaufman, Urbana). Las cinco sintrofinas conocidas son proteínas que median la interacción de las proteínas señalizadoras entre los complejos distrófino y utrofino en la membrana de la célula muscular. El entendimiento más detallado de este proceso puede tener consecuencias para una terapia con utrofina (Froehner, Seattle). distrofina causa el incremento y la disminución de la actividad de varios genes musculares. Toda una serie de genes que son responsables de la producción de energía en las células musculares son menos efectivos en ratones sin distrofina y utropina, por ejemplo, sus músculos sufren una crisis de energía la cual contribuye a la degeneración de sus músculos distróficos. Por otro lado, varios genes necesarios para el desarrollo y reparación de los músculos ven aumentada su actividad, en algunos casos cien veces, por ejemplo, se ven activados por el proceso de la enfermedad. Similares resultados fueron obtenidos con muestras musculares humanas. Experimentos posteriores mostraron que en ratones varios otros genes se encontraban sobre activados, genes los cuales están implicados en el desarrollo de estructuras de la superficie celular, en la producción de factores señalizadores para la síntesis de proteínas, en la intensificación de reacciones inmunes, y en otros procesos responsables de los síntomas de los músculos distróficos de ratones-mdx. En los pacientes con distrofía Duchenne, estos cambios fueron menos pronunciados, y en los ratones transgénico con distrofina humana, esta actividad de lo genes fue normal, debido a que ellos no tenia distrofia muscular. Después de estos primeros resultados que fueron obtenidos hace pocos años, varios mas experimentos con esta nueva técnica han sido realizados para responder otras preguntas de la investigación en DM Duchenne. Los resultados actuales y futuros ayudaran a entender la compleja relación entre las varias partes de la arquitectura muscular y los cambios que ocurren si uno de sus más importantes componentes, la distrofina, esta ausente. Abriendo esto nuevas vías para el desarrollo de una terapia para la distrofía muscular Duchenne (van Ommen, Leiden; Kunkel, Boston; Hoffman, Washington, y otros). Un gusano distrófico: El Caenorhabditis Estrategías Farmacológicas Los corticoesteroides y otras drogas pueden aminorar los síntomas de la distrofia muscular Duchenne sin curar la enfermedad misma. menos aliviar los síntomas de la distrofia Duchenne por medio de un tratamiento farmacológico. Recientemente ha habido algunos éxitos en esta área. Debido a que los grandes esfuerzos para transferir un gen funcional de la distrofina o reparar el gen dañado por el momento no han conducido a una cura, se han venido haciendo intentos por al 20 cura para la distrofia muscular Duchenne debido a que la causa genética de la enfermedad no será eliminada. Pero, comparado con otros métodos, este podrá tener ventajas: no provoca problemas inmunes o de toxicidad, no hay riesgo genético de virus, y seria un fármaco de fácil manufactura. Compañías farmacéuticas están actualmente interesadas en esta técnica debido a que el incremento de masa muscular podrá ser importante para personas ancianas y personas con otras enfermedades musculares degenerativas (Khurana, Filadelfia). Glucocorticoides (corticoesteroides): Los corticoides relacionados prednisona, prednisolona, y deflazacort retrasan la degeneración muscular, pero la causa de este efecto no es todavía comprendida. Mientras parte de su acción implica propiedades anti-inflamatorias, podrían también tener otros mecanismos de acción posibles. Por el análisis por medio de micro clasificación de la actividad de mas de un millar de genes de ratones-mdx tratados con prednisona, se encontró que cerca del 5 % de los genes mostró una reducción o aumento de su actividad. Análisis posteriores del patrón de expresión génica inducida por glucocorticoides podría ayudar a entender el mecanismo molecular de la acción de los glucocorticoides en músculos esqueléticos. Esto podrá ayudar a desarrollar un más específico pero menos toxico tratamiento con estos fármacos (Muntoni, Londres). Creatina: Este compuesto puede posiblemente también aminorar la degeneración muscular. Este es un compuesto natural el cual es usado en grandes cantidades por los atletas para aumentar su rendimiento. La creatina, la forma fosforilatada de la fosfocreatina, provee energía no solo para la contracción muscular si no también para la remoción del calcio superfluo, una de las causas de la destrucción de las células musculares. Experimentos con ratones mdx han mostrado que suplementación con creatina mejora la salud muscular, y pudiera proveer las bases científicas para su uso como terapia coadyuvante en la distrofia Duchenne (Wallimann, Zürich; Rüegg, Lausanne). Otros experimentos farmacológicos: Extractos de te verde en el alimento de ratones-mdx aminoro la degeneración de algunos de sus músculos, posiblemente debido a que el te verde contiene sustancias antioxidantes. --- Ratones transgénicos fueron creados para que produzcan Miostatina: El ganado bovino belga “azulblanco” ha existido por cerca de 200 años, el cual tiene más de 20 % más carne que el ganado normal. Hace seis años, se encontró que tales reses tenían una deleción de 11 pares de bases en el gen de la proteína miostatina. Los ratones transgénicos sin el gen de la miostatina tenían de dos a tres veces mas peso que los ratones normales, no a causa de tener mas células musculares, si no debido a que sus células musculares eran mucho mas grandes. La miostatina es una proteína señalizadora, un tipo de hormona, que consiste de 375 aminoácidos y es necesaria para limitar la masa muscular. Esta proteína es producida en las células musculares y sus células precursoras, después de lo cual es modificada: dos tercios de la cadena de aminoácidos son removidos, y dos de las cadenas remanentes de 109 aminoácidos cada una forman un doble anillo. Esta miostatina activa inhibe el crecimiento de los músculos al influenciar la regulación genética de las células precursoras miogénicas. Otros factores están también implicados en la optimización de la masa muscular. Estos hechos conducen suposición de que si se bloquea la actividad de la miostatina, los músculos de los chicos con distrofía muscular Duchenne podrían hacerse más grandes o al menos reducir su destrucción. Por lo que, fueron creados anticuerpos monoclonales, por ejemplo, proteínas inmunes que se unen muy específicamente solo a la miostatina y de esta forma inactivarla. Estos anticuerpos fueron inyectados una vez por semana debajo del diafragma de ratones-mdx. Después de tres meses, los animales tratados eran 12 % mas pesados que los animales de control sin tratamiento debido a que en estos su masa muscular había disminuido. Adicionalmente, tenían mejor función muscular, ellos podían trepar mejor la rueda de ejercicios, su degeneración muscular disminuyo y los niveles de CK estuvieron prácticamente normales. Posteriores experimentos están ahora siendo realizados con ratones. Estos tendrán que ser repetidos con perros distróficos los cuales tienen una distrofia mas parecida a la enfermedad humana que la distrofia de los ratones. Solo cuando los resultados sean positivos podrán ser hechas pruebas clínicas con pacientes con distrofía muscular Duchenne. Este método de tratamiento no podrá ser una 21 neran cantidades normales de oxido nítrico sintetasa mostraron una reducción de los síntomas distróficos. --- En ratones-mdx, la proteína señalizadora JNK1 es activada y esta contribuye a la degeneración de las células musculares. La inyección de adenovirus que portaban el gen de la proteína natural JIP1, inhibidora de la actividad de la JNK1, redujo la degeneración muscular.--La proteína galectina-1 participa en el proceso que conduce a nuevo o regenerado tejido muscular. Los fibroblastos obtenidos de piel de ratones recién nacidos se desarrollaron en células musculares con distrofina, si crecían en cultivos celulares que contenían galectina-1. Tales fibroblastos podrían ser fácilmente colectados de pacientes con distrofía muscular Duchenne, transformados en células musculares con galectina-1, siendo entonces modificadas genéticamente para sintetizar distrofina normal, y finalmente transplantadas de nuevo al paciente. en sus músculos, en relativamente grandes cantidades, el factor de crecimiento muscular similar a la insulina-1 (mIGF1). Este aumento su masa muscular en más de 40 %, y la fibrosis, como la degeneración muscular fue disminuida, y la regeneración mejoro significativamente. --- La leupeptina es un péptido que consta de tres aminoácidos parcialmente modificados. Combinada con la carnitina, esta inhibe la enzima calpaina que destruye proteínas en las células musculares cuando el calcio entra de forma descontrolada, como en la distrofia Duchenne. En experimentos con monos y ratones, la degeneración muscular fue significativamente aminorada con el uso de leupeptina. --- La concentración de la enzima oxido nítrico sintetasa en el complejo distrófino de ratones-mdx esta significativamente reducida. Por lo que, su producto, el biológicamente activo oxido nítrico gaseoso, no puede mas completar su función. Esto contribuye a la degeneración muscular. Los ratones-mdx transgénicos que ge- Estudios clínicos en pacientes con Duchenne La primera prueba de transferencia génica y una nueva prueba con mioblastos han iniciado. Corticoesteroides, creatina, y otras sustancias químicas son estudiadas. Un largo estudio con prednisona junto a ciclosporina empezó a prepararse. den tomar varios años, y son costosos de realizar. Transferencia del gen de la distrofina por medio de plásmidos: La primera fase de este primer experimento de transferencia génica con pacientes con distrofíoa Duchenne fue completada a principios del 2003 y los resultados se reportaron en Junio del 2003. La compañía biotecnológica Transgène en Estrasburgo junto con la asociación francesa de distrofia muscular (AFM) comenzaron a preparar este acercamiento de terapia génica en 1995. La autorización para esta primera prueba en humanos fue dada por las autoridades francesas en Noviembre 1999, y las primeras inyecciones de los vectores fueron aplicadas en Septiembre del 2000 en el Hôpital de la Pitié Salpêtière en Paris. Los 9 chicos participantes eran todos mayores de 15 años, por lo que ellos pudieron dar su consentimiento de manera informada. Ellos estaban conscientes que no habría ningún beneficio clínico de este tratamiento, este todavía no es una terapia. Después de que varios métodos de transferencia génica fueran probados en ratones y perros Estudios clínicos con chicos con Duchenne serán más y más necesarios en vista del aumento de resultados positivos en experimentos con animales.Estos estudios con humanos tendrían que ser realizados en varios pasos, el primero de los cuales, la fase I, actualmente llevaría varios años para probar que el nuevo tratamiento no vendrá acompañado de inaceptables efectos secundarios. Solo después de esto pueden ser iniciados estudios posteriores con afectados, lo que seria la fase II, para determinar que tanto el tratamiento realmente puede mejorar o mantener la fuerza muscular, seguido a esto, en la fase III, se determina cual podría ser la dosis optima. Todos estos estudios tienen que ser realizados con el método denominado doble-ciego, por ejemplo, solo cerca de la mitad de los pacientes recibe la sustancia que se probaba, mientras la otra mitad recibe un compuesto inactivo, llamado placebo. Ni a los pacientes, ni a los investigadores se les permite saber cual paciente forma parte de cual grupo antes de que termine la prueba, que es cuando el código es roto y los resultados son analizados. Estos estudios y los procedimientos de aprobación consumen tiempo, pue22 distróficos, se decidió usar el ADNc entero del gen de distrofina de extensión completa, el cual se coloco en un plasmido que haria de vector, junto a un fuerte promotor proveniente de un virus. Los plásmidos tienen la ventaja de no contener ninguna proteína y por lo cual no deben causar una reacción inmune. El gen terapéutico a ser transportado no tenia ninguna proteína, era ADN puro o desnudo. En experimentos preeliminares ulteriores con cultivos de células musculares y ratones, se mostró que este vector construido conducía a la aparición de nueva distrofina en el lugar correcto bajo la membrana de las células musculares de los animales, restaurando el complejo distrófinoglicoproteico, y prolongando la vida de las células. El objetivo de este estudio clínico con pacientes con distrofía muscular Duchenne fue demostrar que el procedimiento es seguro, por ejemplo, que este no conduce a una reacción inmune o inflamación, y que la nueva y normal distrofina aparecía en los lugares correctos en aquellas fibras musculares que habían recibido el plásmido vector. La solución (liquida) a inyectar contenía 0,2 mg de plásmidos con 10 billiones (1 seguido de 13 ceros) de copias del gen de la distrofina y fue inyectada en un músculo del antebrazo de los primeros tres pacientes. Esta es una muy pequeña cantidad de material génico comparado a experimentos similares en animales. Los siguientes tres pacientes recibieron una dosis de 0,6 mg y los últimos tres pacientes dos dosis de 0,6 mg con dos semanas de separación. La seguridad de los pacientes fue la principal preocupación, por consiguiente, ningún otro paciente fue tratado antes de tener la certeza que el primer paciente tratado no mostraba ninguna señal de intolerancia inmune. Tres semanas después de las inyecciones, el área tratada de músculo de cerca de 0,5 centímetros cúbicos fue extraída por medio de biopsia y checada en busca de presencia de distrofina. En tres de los seis chicos de los dos primeros grupos y en todos los tres chicos del tercer grupo, nueva distrofina apareció entre menos de 1 % a más de 25 % de las fibras musculares alrededor de los sitios de la inyección. No hubo señales de una respuesta inmune, ni a los plásmidos ni a la nueva distrofina producida. Esto respondió las preguntas de la fase-I de un estudio: La trans- ferencia génica con ADN desnudo es un procedimiento seguro. Esto podría, después de una ampliación, volverse un método terapéutico debido a que se sabe que en experimentos animales una producción de distrofina en cerca del 20 % de las fibras musculares puede mejorar la función muscular significativamente. Los científicos franceses ahora trabajan con el equipo de Jon Wolff en Madison en los Estados Unidos, el cual inyecto construcciones de plásmidos similares con genes de una proteína marcadora en el flujo sanguíneo de patas de ratones, perros, y monos a presión. Posterior a esto, más del 40 % de las fibras musculares contenían la proteína marcadora transferida. El siguiente paso seria aplicar este procedimiento de entrega arterial en chicos con distrofía Duchenne, probablemente en una prueba clínica iniciada en el 2004. En esta etapa de la prueba, se planea tratar, de nuevo por razones de seguridad, solo un pequeño músculo del pie. Si el resultado es positivo, este método seria aplicado en un los músculos de una pierna o brazo entero. Esto podría ser planeado para el 2006. Mas adelante, los músculos respiratorios y cardiaco podrían ser el objetivo. Por razones de seguridad, es imposible proceder rápido, debido a que podría ser una catástrofe si efectos secundarios adversos severos o algún otro evento indeseables ocurrieran, lo cual conduciría a la interrupción de este y otros experimentos de terapia génica (Braun, Estrasburgo). Estudios clínicos con mioblastos (transferencia de mioblastos): A principios del 2003, inicio en Québec en Canadá la fase-1 de una prueba clínica con chicos de 5 a 15 años de edad con distrofía muscular Duchenne por deleción. Esta deberá responder la pregunta de que tanto la transferencia de mioblastos bajo modificaciones es segura, por ejemplo, que no provocara rechazo inmune o inflamación, y que tanta nueva distrofina aparece después del tratamiento. La diferencia con los experimentos fallidos realizados en 1990, es que ahora es usado el mucho mas efectivo inhibidor inmune FK506 (Tacrolimus) A en vez de ciclosporina, y que a diferencia de antes, donde se inyectaron 60 a 90 millón de células en el músculo bíceps entero, ahora se inyectaran 30 millones de células en el músculo tibial interior del pie por múltiple aplicaciones, a una distancia de un milímetro entre ellas en un volumen de músculo de solo un cen23 an comenzar este tratamiento deben hacerlo en acorde con un estudio bien documentado para obtener más información y garantizar los extensos controles necesarios debido a los efectos secundarios. El estudio en Alemania es continuado con documentación a largo plazo que incluye los datos de algunos pacientes quienes fueron tratados durante más de siete años (Reitter, Mainz). Prednisolona: En el Reino Unido una prueba de largo termino ha sido preparada, en la cual será probado que tanto la prednisolona es capaz de prolongar la habilidad para caminar y mejorar la calidad de vida. Un tratamiento intermitente, 10 días con y 10 días sin medicación ha sido planeado. Debido a que el financiamiento no pudo ser obtenido, solo será posible llevar a cabo un estudio abierto, sin método doble-ciego, con el objetivo de documentar la eficacia y los efectos secundarios (Muntoni, Londres). Prednisona combinada con ciclosporina A: En Alemania un estudio clínico empezó a ser preparado para iniciar a fines del 2003, el cual deberá responder dos preguntas: ¿Puede la ciclosporina A por si sola aumentar la fuerza muscular a corto plazo? ¿Puede la combinación de ciclosporina A y prednisona reducir mejor la perdida de fuerza a largo plazo que la prednisona sola? ¿Cuando dar prednisona de forma intermitente, por ejemplo, en un ciclo de 10 días con y 10 días sin tratamiento? Ya que los procesos inmunes juegan un papel en la distrofia muscular Duchenne, experimentos tempranos han mostrado que los fármacos inmuno supresores tales como la ciclosporina A pudieran retrasar la degeneración muscular. Con el objetivo de obtener resultados confiables, al menos 150 pacientes con distrofía muscular Duchenne deberán participar, lo cuales estarán inequivocadamente diagnosticados, serán mayores de seis años, y que todavía pueden caminar 50 metros. Durante la primera fase de al menos tres meses, todos los niños recibirán, en procedimiento doble-ciego de 3, 5 a 4 mg/Kg/día de ciclosporina A sola o galactosa, azúcar de leche, como placebo. Durante la segunda fase de al menos 12 meses, todos los niños recibirán adicionalmente 0, 75 mg/Kg./día de prednisona por 10 días, seguidos por 10 días sin prednisona. Ocho centros alemanes musculares realizaran esta prueba (Korinthenberg, Friburgo). Creatina: En un estudio clínico controlado, tímetro cúbico. No se espera un mejoramiento de la función muscular. Como en la prueba francesa, los participantes no tendrán un beneficio terapéutico de estas inyecciones. Un mes después del tratamiento y después de una biopsia será determinado que tanto ADN y ARNm de distrofina, así como la proteína misma, ha aparecido y que tanto se genera alguna reacción inmune. Tres pacientes han sido tratados hasta Julio del 2003, la prueba completa deberá ser terminada antes del fin del 2003. Si los resultados son positivos, la prueba continuaría con la fase-II de estudio, durante la cual serán transferidos mioblastos a todo el músculo bíceps entero. Después de lo cual, durante dos años, la fuerza muscular será medida, esperándose pueda posiblemente incrementar o al menos mantenerse sin cambios (Trembley, Québec). Prednisona y deflazacort: Dieciséis estudios clínicos en todo el mundo han probado la eficacia de fármacos derivados de la cortisona, sobre todo la prednisona, para reducir la pérdida de la fuerza muscular de chicos con Duchenne. Entonces, hubo indicaciones de que un nuevo corticoide, el deflazacort, podría actuar de modo similar, pero con menos efectos secundarios. Desde 1992 hasta 1997, fue realizado con la participación de 14 centros musculares alemanes un estudio en el cual el efecto de mantenimiento muscular de los dos fármacos similares fue comparado con la historia natural bien documentada de la enfermedad. Las dosis empleadas eran de 0,75 mg por kilogramo de peso corporal por día para la prednisona y 0,9 mg por kilogramo por día para el deflazacort. Ambos fármacos pueden mantener la fuerza muscular durante al menos dos o tres años y, en casos aislados, pueden prolongar la capacidad de andar hasta los 14 años de edad. El efecto secundario más importante de la prednisona es el aumento de peso en aproximadamente el 20 % de los pacientes. Con el deflazacort, las cataratas leves, opacamiento de la lente del ojo, eran más frecuentes que con la prednisona. Ambos fármacos tenían un efecto de retardación del crecimiento, otros efectos secundarios fueron insignificantes. Después de detenerse la medicación, la degeneración del músculo y crecimiento normal inicio de nuevo. Los resultados del estudio aún no permitieron decidir todavía cual es el mejor momento para empezar el tratamiento, por ejemplo antes de los cinco años de edad. Los pacientes quienes dese24 trado un significativo aumento de la fuerza muscular (de cerca de 8 %) y muy pocos efectos secundarios en una prueba preeliminar con 10 chicos con DM Duchenne. En Agosto del 2002, un estudio doble-ciego fue iniciado con entre 25 y 30 chicos por al menos 9 meses. Una prueba con coenzima Q10 inicio en Septiembre del 2001 con 15 chicos, los cuales también recibían regularmente deflazacort o prednisona. Otra prueba es planeada con pacientes en silla de ruedas. Oxatomida, un antihistamínico, empezó a ser probado en una prueba de 9 meses con 15 chicos con distrofía muscular Duchenne. Pentoxifilina interfiere con el sistema inmune, por lo que reduce la inflamación y la fibrosis. Una prueba inicio en Febrero del 2003 y durara al menos 15 meses. Una prueba clínica de al menos 15 meses ha iniciado en Enero del 2003 para comparar los efectos positivos y negativos de la prednisona cuando es dada cada dia o solamente uno o dos días cada semana en una dosis alta. Una prueba con 54 chicos con distrofía muscular Duchenne fue realizada durante 6 meses terminando en Marzo del 2003, en la cual tanto creatina y glutamina fueron probadas en un estudio doble-ciego. Los resultados están siendo evaluados. Pruebas con otras tres sustancias: taurina, carnitina, y ácido nicotinico, son planeadas. Para la documentación y supervisión de estos estudios, se han desarrollado métodos de control estandarizados para medir no solo las funciones musculares, si no también otros parámetros tales como la calidad de vida. Algunos de esos métodos están siendo modificados para que puedan también ser usados para pacientes muy jóvenes o mayores (Escolar, Washington). también llamado doble ciego, con 8 pacientes con Duchenne, 10 con Becker, y 18 con otras enfermedades musculares, mostró después de 8 semanas con dosis de creatina monohidrata de 5 gramos para niños y 10 gramos para adultos, un ligero pero significante efecto benéfico a corto plazo en la fuerza y rendimiento muscular sin efectos adversos. Mas estudios clínicos deberán ser hechos antes de que pueda ser recomendado como medicación a largo termino para preservar el músculo en chicos con Duchenne (Walter, Munich). En Canadá, una prueba clínica para determinar el efecto de la creatina ha iniciado con 40 chicos con distrofía distrofía muscular Duchenne. --- En Bélgica, la creatina fue probada tres meses en 12 pacientes con distrofía muscular Duchenne y 3 con distrofía muscular Becker con el resultado de un leve aumento de la fuerza muscular. Oxandrolona: Un esteroide anabólico (diferente de los corticoesteroides, que son esteroides catabólicos) a veces usado por atletas, fue probado en un estudio con 51 chicos con Duchenne. Sin embargo, la pequeña mejora en la fuerza del músculo encontrada, no justifica su empleo como fármaco en vez de la prednisona o el deflazacort (Fenichel, Nashville). Pruebas clínicas internacionales: El Grupo Cooperativo Internacional de Investigación Neuromuscular (CINRG en sus siglas en ingles) en Washington, una cooperación de laboratorios en EUA, Canadá, Bélgica, Argentina, Australia, y India realizan estudios clínicos en chicos con Duchenne con sustancias, algunas de las cuales han sido seleccionadas de entre 45 sustancias que han mostrado resultados positivos cuando fueron probados varios compuestos en largos experimentos de observación con ratones. Albuterol, un fármaco para el asma, ha mos- ¿Cuándo se tendrá una terapia? pio del siglo 20 que un defecto en el cromosoma -X es responsable de la enfermedad. Pero sólo hasta 1986 era identificado el gen mismo, el gen de la distrofina, (Kunkel, Boston) y poco tiempo después la proteína distrofina fue caracterizada (Hoffman, Washington), la que esta ausente en los chicos con Duchenne. El rápido paso de la investigación genética dio lugar a la esperanza de que pronto sería posible sustituir o reparar el La distrofia muscular Duchenne siempre ha acompañado al hombre y también a los animales que tienen músculos esqueléticos. Esta fue descrita correctamente por primera vez en 1851 por el doctor inglés Edward Meryon. Sin embargo, obtuvo después su nombre del médico francés Duchenne de Bologne, quien describió en 1861 no sólo sus síntomas, sino también su histología. De su modo de herencia, se conoció a princi25 podía curar a cerca del 90 % de los pacientes con leucemia mieloide crónica, un cáncer sanguíneo. Todos estos resultados de investigación deben ser considerados y muchos datos adicionales colectados, antes de que sea posible hacer cualquier predicción sobre cuanto tiempo mas tomará que se tenga listo un tratamiento seguro y eficaz para niños con distrofia muscular Duchenne en todas partes del mundo. La respuesta a esta pregunta es la más importante para los padres y sus hijos enfermos. Esto probablemente todavía tomará muchos años hasta que la distrofia muscular Duchenne sea derrotada. Esto es menos de que lo que había sido esperado, lo que es el lado negativo de este difícil problema, lo positivo es que cientos de investigadores capaces y dedicados en varios laboratorios alrededor del mundo entero trabajan para encontrar una cura: por lo tanto, es seguro que un tratamiento eficaz estará ahí, tarde o temprano. gen y así curar la enfermedad. Este optimismo fue prematuro. Los primeros estudios en 1991 con la transferencia de mioblastos mostraron que esta técnica, que se veía promisoria en ratones, era ineficaz en los chicos con Duchenne. Ahora, más de 17 años después de la detección del gen, no hay en ninguna parte ninguna terapia para la distrofia Duchenne. Como este informe muestra, el trabajo de investigación se realiza basándose en más de 30 métodos diferentes que son aplicados en ratones y perros distróficos, y algunos ya en chicos con Duchenne. Sin embargo, estos estudios consumen tiempo, y la aprobación de un tratamiento tomará años adicionales. No obstante, hay ejemplos de tratamientos que alcanzan a los pacientes muy rápido, tales como el Gleevec, un fármaco que fue aprobado en el 2001 en pocos meses sin examinarse todos los efectos secundarios después que se mostró Los científicos mencionados en el informe Únicamente los científicos mencionados en este reporte son enlistados con sus direcciones abreviadas y sin ninguno de sus títulos. La mayor parte de ellos son profesores y todos tienen una especialidad médica o postgrado (MD o PhD). Muchas publicaciones originales, que contienen los nombres de todos los miembros de un equipo de investigación, pueden ser obtenidas del autor de este informe. Richard J. Bartlett, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA Laurent Bernheim, Hôpital Cantonal Universitaire, Ginebra, Suiza Serge Braun, Synthetic Vector Products, Transgène S.A., Estrasburgo, Francia Kevin P. Campbell, University of Iowa College of Medicine, Iowa City, IA, EUA Jeffrey Chamberlain, Dept. of Neurology, University of Washington, Seattle, WA, EUA Paula Clemens, Dept. of Neurology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EUA Judith C. T. van Deutekom, Dept. of Human Genetics, Leiden University Med. Center, Leiden, Holanda Kay Davies, Dept. of Genetics, University of Oxford, Oxford, Inglaterra Diana Escolar, Children's National Medical Center, Washington, DC, EUA Gerald M. Fenichel, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, EUA Kevin M. Flanigan, Dept. of Neurology and Pathology, University of Utah, Salt Lake City, UT, EUA Stanley Froehner, Dept. of Physiology and Biophysics, University of Washington, Seattle WA, EUA Stuart Hodgetts, University of Western Australia, Crawley, Australia Eric Hoffman, Children's National Medical Center, Washington, DC, EUA Paul C. Holland, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montreal, Canadá Johnny Huard, Children's Hospital, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA, EUA Robert Kapsa, Melbourne Neuromuscular Research Institute, Melbourne, Australia George Karpati, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montreal, Canadá Stephen Kaufman, Dept. of Cell and Structural Biology, University of Illinois, Urbana, IL, EUA Tejvir S. Khurana, Pennsylvania Muscle Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EUA Stefan Kochanek, Zentrum für Molekularmedizin, University of Colonia, Alemania Louis Kunkel, Harvard University, Children's Hospital, Boston, MA, EUA Hanns Lochmüller, Genzentrum der Universität, Munich, Alemania Jerry Mendell, Dept. of Neurology, Ohio State University, Columbus, OH, EUA 26 Clemens Müller-Reible, Humangenetisches Institut, Biozentrum der Universität, Würzburg, Alemania Francesco Muntoni, Dept. of Paediatrics, Imperial College School of Medicine, Londres, Inglaterra Roel Nusse, Dept. of Developmental Biology, Stanford University, Stanford, EUA Gertjan B. van Ommen, Dept. of Human Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda Terrence Partridge, Muscle Cell Biology Group, Hammersmith Hospital, Londres, Inglaterra Thomas Rando, Dept. of Neurology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, EUA Bernd Reitter, Kinderklinik der Universität, Mainz, Alemania Michael Rudnicki, Ottawa Health Research Institute, Ottawa, Canadá Urs T. Rüegg, Ecole de Pharmacie de l'Université, Lausanne, Suiza Günter Scheuerbrandt, Testlaboratorium Breitnau, Breitnau near Freiburgo, Alemania H. Lee Sweeney, Dept. of Physiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EUA James G. Tidball, Dept. of Physiological Sciences, University of California, Los Angeles, EUA Jacques Tremblay, Unité de Génétique Humaine, Université Laval, Québec, Canadá Theo Wallimann, Institut für Zellbiologie, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, Suiza Maggie C. Walter, Friedrich-Baur-Institut, Medizinische Klinik der Universität, Munich, Alemania Dominic Wells, Dept. of Neuromuscular Diseases, Imperial College of Medicine, Londres, Inglaterra Steve Wilton, Australian Neuromuscular Research Institute, Univ. of Western Australia, Perth, Australia Jon Wolff, Dept. of Pediatrics, University of Wisconsin Medical School, Madison, WI, EUA Dr. Günter Scheuerbrandt Im Talgrund 2 D-79874 Breitnau Alemania Tel.: +49-7652-1777, Fax: +49-7652-91813-13 e-Mail: gscheuerbrandt@t-online.de Este informe será actualizado cada tanto tiempo con los nuevos resultados de investigación. Aquellos que deseen recibir estas actualizaciones y la versión del 2004 de este informa deben enviar su dirección de correo electrónico al Dr. Scheuerbrandt. El informe puede ser visto en Internet en http://www.duchenne-investigacion.com, también en alemán, francés, ingles e italiano. Traducción al español: Ricardo Rojas Caballero E-mail: distrofiamuscular@yahoo.com.mx Internet: http://www.distrofia-mexico.org Playa Rosarito 319 Fracc. Playa Sur CP 82040 Mazatlan, Sinaloa, Mexico 27 Omisión de Exon, un Ejemplo Aquí los detalles moleculares de la omisión del exón 46 son explicados cambiando una distrofia muscular Duchenne causada por la deleción del exón 45 en una distrofia muscular Becker. Parte de la secuencia de bases del exón 45 y 46 del ARNm del gen de la distrofina es mostrado sin defectos al final del exón 44 y del inicio del exón 47. En el exón 45, 50 tripletas de bases no son mostradas y 30 en el exón 46. Debajo de cada tripleta, se muestra el nombre abreviado del aminoácido que concuerda con el código genético. Las tripletas están seguidas cada una de otra sin espacios entre ellas, pero aquí se usan guiones indicando la separación entre tripletas del marco de lectura y líneas verticales para indicar los bordes de los exones. En la omisión de exón “terapéutica”, un oligoribonucleótido se une por si mismo a las 19 bases subrayadas en el exón 46 del ARNpre-m. Las tres bases que señalizan un codón de parada oculto en el código (por lo que no es leído como tal) se encuentra subrayado en azul. El exón 45 finaliza después de la segunda base de su ultima tripleta, la cual es entonces completada como AGG con la primera base del exón 46 (-AGG-AG | G-CUA-). final exon 44 | inicia exon 45 final exon 45 | inicia exon 46 -UGG-UAU-CUU-AAG | GAA-CUC-CAG-GAU---AGA-AAA-AAG-AG | G-CUA-GAA-GAAtrp tyr leu lys | glu leu gln asp arg lys lys arg| leu glu glu codón de parada oculto oligoribonucleótido en antisentido GUC-GUU-GAU-UUU-UUU-UUC-G final exon 46 | --AAU-GAA-UUU---AAA-GAG-CAG-CAA-CUA-AAA-GAA-AAG-CUU-GAG-CAA-GUC-AAG | asn glu phe lys glu gln gln leu lys glu lys leu glu gln val lys | | inicia exon 47 | UUA-CUG-GUG-GAA-GAG-UUG--| leu leu val glu glu leu Si el exón 45 estuviera faltante en el ARNm, el marco de lectura en el exón 46 es alterado, al quedar incompleta la tripleta (AGG), iniciando con solo un nucleótido el exón 46. Cambiando la lectura de | G-CUA-GAA-GAA-C | leu glu glu por | GCU-AGA-AGA-ACA | ala arg arg thr con la consecuencia de que 16 aminoácidos incorrectos son incorporados en la distrofina hasta que finalmente es alcanzado el codón de parada prematuro UGA el cual antes había estado oculto entre la secuencia (-AAU-GAA-UUU-) y que ahora deja de estarlo y es leído (–AAA-UGA-AUU-). La síntesis de proteína es entonces interrumpida prematuramente, quedando la distrofina incompleta, y la distrofia muscular Duchenne se desarrolla. Después de una deleción del exón 45, el exón 44 es seguido directamente por el exón 46: final exon 44 | inicia exon 46 -UGG-UAU-CUU-AAG | GCU-AGA-AGA-ACA---AGA-UUU-AAA-UGA-AUU-UGU-UUU-AUGtrp tyr leu lys | ala arg arg thr arg phe lys alto! Si adicionalmente a la falta del exón 45, es removido también el exón 46, el marco de lectura no es alterado, no habría ningún codón de parada prematuro, aunque 108 aminoácidos estarían faltantes en la parte central de la distrofina, sin embargo aunque acortada, esta seria todavía funcional. Esto cambiaria la distrofia muscular Duchenne en una menos severa distrofia muscular Becker. final exon 44 | inicia exon 47 ---UAC-AAA-UGG-UAU-CUU-AAG | UUA-CUG-GUG-GAA-GAG-UUG--tyr lys trp tyr leu lys | leu leu val glu glu leu 28