Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004. Cinética de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Roberto Rafael Núñez Moreira, Yoania Cabranes Campos, Eudalyz Ortiz Guilarte, Rolando Gondres,* Cossette Martínez Tristá y Jorge Martínez.** Departamento de Microbiología Aplicada, Instituto de Oceanología, Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente, Avenida Primera No. 184 y 186, Reparto Flores, Ciudad de La Habana, Código Postal 12 100, Cuba. *Laboratorio Central de Criminalística. Ministerio del Interior. **Facultad de Biología, Universidad de la Habana. Recibido: 16 de septiembre de 2002. Aceptado: 23 de enero de 2003. Palabras clave: biorremediación , Bacillus alcalophilus, células inmovilizadas, naftaleno. Key words: biorremediation, Bacillus alcalophilus, immobilized cells, naphthalene. RESUMEN. Numerosas han sido las investigaciones sobre el estudio de la biorremediación para su aplicación en la lucha para combatir la contaminación ambiental por hidrocarburos. El Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Ambiente, ha trabajado desde 1988 en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar el petróleo. Actualmente, cuenta con cuatro bioproductos degradadores de petróleo en medio marino denominados BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC e IDO-225. En el presente trabajo, se demuestra por Espectroscopia Infrarroja de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 d de contacto de las células húmedas inmovilizadas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 en el medio de degradación con el naftaleno, un hidrocarburo del petróleo, que estas son capaces de degradar el naflateno como única fuente de carbono y energía. La degradación de este hidrocarburo por las células inmovilizadas de esta cepa se lleva a cabo mediante un mecanismo que se basa en un modelo cinético de segundo orden correspondiente a un mecanismo de metil-oxidación y β-oxidación, al igual que las células libres de dicha cepa, pero con la diferencia de que en el caso de las células inmovilizadas, el término cuadrático (metil-oxidación) es mayor y el término lineal (β-oxidación) es menor que en las células libres. En este mecanismo se produce acetil-CoA, el cual se incorpora al ciclo de los acidos tricarboxílicos para formar dióxido de carbono, agua y coenzimas reducidas, las cuales se dirigen a la cadena de transporte electrónica para obtener energía en forma de ATP y garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía. ABSTRACT. The investigations about the study of the biorremediation for their application in the struggle to fight the environmental contamination by hydrocarbons have been numerous. The Institute of Oceanology of the Ministry of Science, Technology and Environment, has worked since 1988 in the isolation and preservation of marine bacterias that are able to degrade petroleum. At present, it has four bioproducts degraders of oil in the marine environment denominated BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC and IDO-225. In this work, it is demonstrated by Infrared Espectroscopy of the samples extracted at the 3, 6, 9, 12 and 15 days of contact of the immobilized wet cells of Bacillus alcalophilus IDO-225 strain in the means of degradation with naphthalene, a hydrocarbon of the petroleum, that they are able to degrade the naphthalene as the only source of carbon and energy. The degradation of this hydrocarbon by the immobilized cells of this strain is carried out by means of a mechanism based on a kinetic model of second order corresponding to a mechanism of metil-oxidation and β-oxidation. The same thing occurred with the cells free from this strain, but with the difference that in the case of the immobilized cells, the quadratic term (metil-oxidation) is bigger and the lineal term (β-oxidation) is smaller than in the free cells. In this mechanism the production of acetil-CoA takes place, which incorporates to the cycle of the acids thricarboxilics to pro- duce dioxide of carbon, water and reduced coenzymes, which go to the electronic chain of transport to obtain energy in form of ATP and to guarantee the synthesis of essential compounds and the obtainment of energy. INTRODUCCION La biorremediación es la adición de materiales a medio ambientes contaminados para acelerar los procesos de biodegradación natural.1 Es conocida como el principal proceso natural para eliminar del medio ambiente las fracciones no volátiles del petróleo, por lo que permite reducir notablemente las concentraciones de petróleo residual.2 Esto contribuye de modo muy efectivo a que se garantice una rápida y adecuada recuperación del área impactada por un derrame.3 La biodegradación microbiana es un proceso lento, que está determinado por numerosos factores como la concentración y estructura química de las sustancias a degradar, tipo y concentración de microorganismo y otros físicos y químicos.4,5 Las condiciones ambientales desfavorables influyen en el desarrollo de los microorganismos degradadores. Entre ellas están: las bajas temperaturas existentes en el mar, la elevada salinidad, la cual influye en la permeabilidad de la membrana celular, las bajas concentraciones de nutrimentos, específicamente, nitrógeno y fósforo, así como bajas concentraciones de oxígeno disuelto.6 77 Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004. Las características moleculares del hidrocarburo son un factor importante a tener en cuenta, ya que determinan su solubilidad en agua y definen la velocidad y los mecanismos de ataque del microorganismo. El número de átomos de carbono, las ramificaciones, los anillos (aromáticos o no, su número y ubicación) y la presencia de sustituyentes, confieren ciertas particularidades a algunas etapas del proceso de biotransformación de determinados hidrocarburos.7 En el caso de los hidrocarburos aromáticos que comprenden al benceno (C6H6) y sus homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de carbono están asociados en anillos, pero solamente una valencia de cada dos, es saturada. Al producirse la oxidación del anillo, este se abre por un doble enlace y se obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil. Así, en dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes productos intermedios.8 El Instituto de Oceanología trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas degradadoras de petróleo y cuenta con un bioproducto llamado BIOIL formado por cepas del género Bacillus, capaces de llevar a cabo ese proceso con gran eficiencia y tiene la ventaja de no incluir nutrimentos en su formulación.9 De las cepas integrantes de este bioproducto, se demostró por Cromatografía Gaseosa de Alta Resolución, que la IDO-225 es la responsable del elevado porcentaje de actividad, razón por la cual, fue escogida para el desarrollo de este estudio. La efectividad del BIOIL se comprobó durante el tratamiento de los derrames de petróleo ocurridos en las Bahías de Cienfuegos y de Matanzas, en el recalo accidental de petróleo que contaminó la Playa Arroyo Bermejo con resultados satisfactorios.10 Para determinar la posible evolución de un sustrato durante el proceso de bioxidación por Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 se propusieron los objetivos siguientes: evaluar la cinética y determinar el posible mecanismo de la degradación del naftaleno por la cepa IDO-225. MATERIALES Y METODOS Microorganismo empleado 78 El trabajo fue realizado con Bacillus alcalophilus cepa IDO-225, aislada de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas11 y perteneciente a la Colección de Bacterias Marinas (CBM) del Instituto de Oceanología. Medios de cultivo Para la conservación del Bacillus alcalophilus se utilizó el medio 6 agarizado para bacterias marinas heterótrofas según Gorbienko12 y la fermentación para la obtención de la biomasa microbiana se realizó según Núñez.13 En la degradación de naftaleno por las células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se empleó un medio que contenía naftaleno (30 g/L) disueltos en 1 L de agua de mar. 9,13 Obtención del bioproducto inmovilizado Para obtener la biomasa, el cultivo se sedimentó a 700 g en una centrífuga refrigerada Berkman (USA). Las células fueron inmovilizadas por atrapamiento en gel según la metodología descrita por Bellota.9 Evaluación de la capacidad degradadora de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 Se realizó un experimento por bloques completamente aleatorizado, con las células de IDO -225 inmovilizadas húmedas en el medio de degradación. La capacidad degradadora se determinó por inoculación de 0,5 g de cada bioproducto en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que contenían 50 mL de medio de degradación. Como control se utilizó medio de cultivo estéril. Los experimentos se realizaron en zaranda orbital rotatoria Infors (Suiza) a 125 r/min y 30 ºC durante 15 d . Se tomaron muestras cada 3 d para la determinación de la concentración de hidrocarburos según Dubois.14 Estudio del posible mecanismo de degradación El hidrocarburo residual y el resto de los componentes orgánicos del proceso fermentativo fueron recuperados cada 3 d mediante tres extracciones sucesivas con 50 mL del disolvente (CCL4) (1:1) (v/v) en la fase orgánica, las cuales fueron posteriormente deshidratadas con Na2SO4. El análisis cualitativo y cuantitativo de los hidrocarburos de la fase orgánica se realizó por espectroscopia infrarroja en un Konik de fabricación norteamericana. Tratamiento estadístico de los resultados En el procesamiento estadístico de los resultados se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple15 y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan.16 Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. RESULTADOS Y DISCUSION Cinética de oxidación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO225 Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento.10 La figura 1 muestra los resultados del estudio con las células inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de carbono y energía en medio de degradación. La curva de concentración de naftaleno (Fig. 1) muestra la transformación de este sustrato por el microorganismo inmovilizado. La concentración de este hidrocarburo disminuyó rápidamente en los primeros 6 d . Posteriormente, continuaron disminuyendo lentamente hasta alcanzar un elevado porcentaje de remoción al final del proceso. El modelo cinético de segundo orden obtenido durante el proceso de biodegradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 (Tabla 1), según Head17 y Núñez,18 se corresponde con un mecanismo de metil-oxidación representado por el coeficiente del término cuadrático y una β-oxidación por el coeficiente del término de primer orden. Según los resultados, el modelo cinético y la velocidad a la que ocurrió el proceso, es poco probable que ocurran mecanismos de ∝-oxidación y ω-oxidación, que son más lentos y menos comunes en la estrategia degradativa de los microorganismos frente a los hidrocarburos.17 El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos es la metil-oxidación. Al comparar los modelos cinéticos de segundo orden de la degradación de naftaleno por células inmovilizadas húmedas y células libres19 de Bacillus alcalophilus (Tabla 1), es necesario mencionar que en el caso de las células inmovilizadas pueden obtener energía suficiente y fácilmente para el mantenimiento celular a través de la Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004. 35 N aftaleno (g/L) 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 t (d) Fig. 1. Consumo de naftaleno por las células inmovilizadas húmedas de B. alcalophilus en medio de degradación. Tabla 1. Modelos cinéticos de la degradación del naftaleno por células libres e inmovilizadas de Bacillus alcalophilus. Células Modelo cinético de degradación R2 Libres dC/dt = − 0,069 3C2 + 0,536 6C − 0,8 0,962 0 Inmovilizadas dC/dt = − 0,058 0C − 0,266 7C + 0,3 0,977 0 2 Posible mecanismo de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus C Representa la concentración de naftaleno (g/L). 150 100 50 0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 (cm−1) Fig. 2. Espectro infrarrojo del naftaleno puro. metil-oxidación, por esta razón, en el modelo cinético de esta variante el término cuadrático es mayor. Sin embargo, en las células libres,19 se observó que el coeficiente correspondiente a la β-oxidación es mayor que en las células inmovilizadas, porque se requiere de la síntesis de material celular para la multiplicación acompañado de un gran requerimiento energético.17 Mediante el mecanismo de β-oxidación de naftaleno por células inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se obtiene acetil-CoA, que se incorpora directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.20 desbalanceado, por lo que ocurre la transformación del sustrato por un mecanismo de bioconversión con el que la célula transforma a este y además, obtiene la energía de mantenimiento a partir de la fuente de carbono.10 Resultados similares fueron obtenidos por Omar21 en 1990 cuando logró un 30 % de degradación de crudo con Candida parapsilosis inmovilizada en arcilla durante 4 semanas y sin embargo, con células libres necesitaron 8 semanas para alcanzar igual nivel de degradación. Wu y Wisecarver22 demostraron también la superioridad de las células inmovilizadas en la degradación del fenol, donde no solo estas se reutilizaban con efectividad, sino que ocurría una mayor disminución en las concentraciones de este compuesto aromático en el tiempo. El paso determinante en la velocidad de degradación del naftaleno es la metil-oxidación. El coeficiente de este mecanismo (Tabla 1) es mayor en las células inmovilizadas con respecto a las células libres,19 por lo que la velocidad global del proceso de biodegradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus es mayor en el caso de las células inmovilizadas húmedas. Esto se debe a que las células libres, necesitan no solo de fuente de carbono, sino de otros nutrimentos para poder llevar a cabo sus procesos metabólicos. Sin embargo cuando están inmovilizadas, se encuentran en un estado de no crecimiento, ya que el medio se encuentra En el espectro infrarrojo (IR) del naftaleno puro (Fig. 2), se pueden observar bandas en 2 969, 2 730, 2 669, 2 404, 2 365 cm-1, las cuales corresponden a un compuesto aromático que coincide con la estructura del naftaleno. Las tres primeras bandas corresponden a grupos CH2 (ν) y las dos últimas a grupos CH2 (σ). Al comparar el espectro IR del patrón de naftaleno (Fig. 2) con el espectro IR de la muestra extraída al tercer día de contacto de las células inmovilizadas húmedas de la cepa IDO-225 con el naftaleno como única fuente de carbono (Fig. 3), se apreció el consumo del hidrocarburo representado por una disminución del área bajo la curva de las bandas correspondientes a los intervalos 1 600, 2 900-3 000 cm-1. En los espectros IR de las muestras extraídas en los sucesivos días (Fig. 3) se observó cómo el naftaleno se degrada lentamente por las células inmovilizadas húmedas, lo cual puede estar relacionado con dificultades difusionales del naftaleno y de los intermediarios de la degradación por Bacillus alcalophilus en el interior de las perlas de las células inmovilizadas. A los 15 d (Fig. 3) se había degradado prácticamente todo el naftaleno añadido inicialmente. La aparición y moderado incremento de las bandas 1 200-1 400 cm-1 (alcoholes aromáticos), 1 600, 1 200 y 1 000 cm -1 (benceno disustituido orto), 1 250 y 1 600 cm-1 (ácido carboxílico), 3 000 y 1 650 cm-1 (alqueno) 79 Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004. 150 15 100 12 9 50 6 3 0 (cm−1) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Fig. 3. Espectros infrarrojos de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 d de contacto del naftaleno con células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus en el medio de degradación. 80 y 1 450 cm-1 (grupo metil), posteriores a la disminución de la concentración de naftaleno, indican la aparición de metabolitos cuyos grupos funcionales emiten en este intervalo del IR y justifican el posible mecanismo que se propone para la degradación del naftaleno. Según García23 y los resultados obtenidos, se propone un mecanismo para la biodegradación del naftaleno por Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 (Fig. 4). Primeramente, por la acción de una oxigenasa (posiblemente dioxigenasa), se debe formar el cis-1,2-dihidroxi-1-2dihidronaftaleno, vía que debe facilitar la apertura del anillo aromático. Seguidamente, sería factible la deshidrogenación por las posiciones 1 y 2 mediante la acción de alguna deshidrogenasa, para de esta forma, dar lugar a la formación de 1,2dihidronaftaleno. Este compuesto tiene posibilidad de apertura entre los carbonos 1 y 2, lo que justifica la aparición de las bandas correspondientes al benceno disustituido orto (1 600, 1 200, 1 000 cm-1) en el espectro infrarrojo. Uno de sus sustituyentes es una cadena carbonada de cuatro átomos, que podría ser escindida para facilitar la apertura del segundo anillo aromático. El producto liberado, de tres átomos de carbono, puede ser incluso el piruvato que es transformado por la enzima piruvato carboxilasa a acetil-CoA, el cual se incorpora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos.20 El benceno disustituido orto, con grupos más sencillos, puede fácilmente ser transformado en catecol, como uno de los metabolitos intermediarios en las vías de desintoxicación de muchos microorganismos frente a los hidrocarburos aromáticos.24 Al ser es escindido el catecol se produce una molécula lineal de ácido cis-mucónico, el cual presenta dos insaturaciones detectadas en las bandas pertenecientes a ácidos carboxílicos y alqueno. El ácido cismucónico se incorpora a la maquinaria celular mediante un mecanismo de β-oxidación. Para la degradación del naftaleno por las células inmovilizadas húmedas del Bacillus alcalophilus, el mecanismo propuesto es la β-oxidación. A través de este se obtienen moléculas de acetil-CoA que son consumidas en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos para formar finalmente, coenzimas reducidas (NADH y FADH 2 ), dióxido de carbono y agua.25 Las coenzimas reducidas se dirigen a la cadena de transporte electrónica para la obtención de energía en forma de ATP.20 Marr y Stone26 demostraron que durante la biodegradación del benceno se obtienen como intermediarios trans-1,2-dihidroxi-1,2dihidrobenceno y finalmente, el catecol. También fue descrito por Smitch y Rosaza27 que el cis-2,3-dihidro-2,3-dihidroxifenilo fue intermediario de la ruta degradadora del bifenilo. A partir de este momento, se desencadena una secuencia de reacciones en dependencia del hi- drocarburo y del microorganismo, que conduce a la aparición de un ácido carboxílico por la acción de enzimas deshidrogenasas. 28, 29 Con este trabajo se demuestra que el Bacillus alcalophilus puede degradar el naftaleno como única fuente de carbono y energía, sin necesidad de llevar a cabo un proceso de cometabolismo, donde, según Hodgson, 24 Martinkova 30 y Murakam,31 los cicloalcanos necesitan de los n-alcanos para obtener energía y como base para su crecimiento. Además, bajo las condiciones experimentales estudiadas y teniendo en cuenta los espectros infrarrojos realizados, el mecanismo de degradación de este hidrocarburo por la cepa IDO-225 fue similar al planteado por Hodgson, 24 aunque para verificar la presencia y estructura de los intermediarios de una forma más concluyente, se hace necesario el aislamiento, purificación e identificación de cada uno de estos y de las enzimas participantes mediante técnicas más confiables y certeras. CONCLUSIONES Las células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa IDO-225 son capaces de utilizar el naftaleno como única fuente de carbono y energía. El mecanismo propuesto para oxidación del naftaleno se basa en la metil-oxidación y en la β-oxidación. Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004. NAFTALENO OXIGENASA OH OH CIS-1,2-DIHIDROXI-1,2DIHIDRONAFTALENO OH OH 1,2-DIHIDRONAFTALENO DIOXIGENASA OH O COOH DIHIDROXIBENZOLPIRÚVICO OH ALDOLASA CHO SALICILALDEHÍDO + CH3-CO-COO− PIRUVATO OH DESHIDROGENASA COOH ÁCIDO SALICÍLICO OH DIOXIGENASA OH + CATECOL CO2 OH HOOC-CH=CH-CH=CH-COOH ÁCIDO CIS-MUCÓNICO β-OXIDACIÓN ACETIL-CoA TCA Fig. 4. Posible mecanismo de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus. BIBLIOGRAFíA 1. Chhatre S., Purohit H., Shanker R., Khanna P. Bacterial consortia for crude oil spill remediation, 18. Biennial Conference of the IAWQ, (Singapore), 2328, Jun, 1996. 2. Prince R.C. Petroleum spill bioremediation in marine environments, Crit. Rev. Microbiol., 19, 217-242, 1993. 3. Kirby M. F. y Matthiessen, R. J. Procedures for the approval of oil spill treatment products, Fish.-Res.-Tech.-Rep.Dir.-Fish.-Res.-G.B. Lowestoft,-UK Ministry-of-Agricultur, Fisheries-andFood, 102, 19, 1996. 4. Bergueiro J.R. y Dominguez F. 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Emilio Castillo, Juana Galindo, Gustavo Crespo, Humberto Jordán, Bertha Chongo, Raúl Mejías, Denia Delgado, Tomás E. Ruiz y Gustavo Febles. & Manual Teórico Práctico de Caracterización de Productos Fibrosos. Lourdes Savón, Ana I. Marrero, Odilia Gutiérrez y Luis M. Machín. & La Caña de Azúcar y la Ceba de Cerdos. Carlos P. Díaz. Para cualquier información dirigirse a: 82 Editorial del Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Tel.: (53-62) 99433 y 24773. Fax: (53-7) 335382. e mail: ica@ceniai.inf.cu