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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 35, No. 2, 2004.
Cinética de degradación del naftaleno por células
inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus
cepa IDO-225
Roberto Rafael Núñez Moreira, Yoania Cabranes Campos, Eudalyz Ortiz Guilarte, Rolando
Gondres,* Cossette Martínez Tristá y Jorge Martínez.**
Departamento de Microbiología Aplicada, Instituto de Oceanología, Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente,
Avenida Primera No. 184 y 186, Reparto Flores, Ciudad de La Habana, Código Postal 12 100, Cuba. *Laboratorio Central de
Criminalística. Ministerio del Interior. **Facultad de Biología, Universidad de la Habana.
Recibido: 16 de septiembre de 2002.
Aceptado: 23 de enero de 2003.
Palabras clave: biorremediación , Bacillus alcalophilus, células inmovilizadas, naftaleno.
Key words: biorremediation, Bacillus alcalophilus, immobilized cells, naphthalene.
RESUMEN. Numerosas han sido las investigaciones sobre el estudio de la
biorremediación para su aplicación en la lucha para combatir la contaminación
ambiental por hidrocarburos. El Instituto de Oceanología del Ministerio de Ciencia, Tecnología y Ambiente, ha trabajado desde 1988 en el aislamiento y conservación de bacterias marinas que sean capaces de degradar el petróleo. Actualmente, cuenta con cuatro bioproductos degradadores de petróleo en medio marino denominados BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC e IDO-225. En el presente trabajo, se demuestra por Espectroscopia Infrarroja de las muestras extraídas a los 3,
6, 9, 12 y 15 d de contacto de las células húmedas inmovilizadas de Bacillus
alcalophilus cepa IDO-225 en el medio de degradación con el naftaleno, un
hidrocarburo del petróleo, que estas son capaces de degradar el naflateno como
única fuente de carbono y energía. La degradación de este hidrocarburo por las
células inmovilizadas de esta cepa se lleva a cabo mediante un mecanismo que
se basa en un modelo cinético de segundo orden correspondiente a un mecanismo de metil-oxidación y β-oxidación, al igual que las células libres de dicha
cepa, pero con la diferencia de que en el caso de las células inmovilizadas, el
término cuadrático (metil-oxidación) es mayor y el término lineal (β-oxidación)
es menor que en las células libres. En este mecanismo se produce acetil-CoA, el
cual se incorpora al ciclo de los acidos tricarboxílicos para formar dióxido de
carbono, agua y coenzimas reducidas, las cuales se dirigen a la cadena de transporte electrónica para obtener energía en forma de ATP y garantizar la síntesis
de compuestos esenciales y la obtención de energía.
ABSTRACT. The investigations about the study of the biorremediation for their
application in the struggle to fight the environmental contamination by hydrocarbons have been numerous. The Institute of Oceanology of the Ministry of
Science, Technology and Environment, has worked since 1988 in the isolation
and preservation of marine bacterias that are able to degrade petroleum. At
present, it has four bioproducts degraders of oil in the marine environment
denominated BIOIL, K-BIOIL, BIOIL-FC and IDO-225. In this work, it is demonstrated by Infrared Espectroscopy of the samples extracted at the 3, 6, 9, 12
and 15 days of contact of the immobilized wet cells of Bacillus alcalophilus
IDO-225 strain in the means of degradation with naphthalene, a hydrocarbon
of the petroleum, that they are able to degrade the naphthalene as the only
source of carbon and energy. The degradation of this hydrocarbon by the immobilized cells of this strain is carried out by means of a mechanism based on
a kinetic model of second order corresponding to a mechanism of metil-oxidation and β-oxidation. The same thing occurred with the cells free from this
strain, but with the difference that in the case of the immobilized cells, the
quadratic term (metil-oxidation) is bigger and the lineal term (β-oxidation) is
smaller than in the free cells. In this mechanism the production of acetil-CoA
takes place, which incorporates to the cycle of the acids thricarboxilics to pro-
duce dioxide of carbon, water and reduced coenzymes, which go to the electronic chain of transport to obtain energy in form of ATP and to guarantee
the synthesis of essential compounds
and the obtainment of energy.
INTRODUCCION
La biorremediación es la adición
de materiales a medio ambientes
contaminados para acelerar los procesos de biodegradación natural.1 Es
conocida como el principal proceso
natural para eliminar del medio ambiente las fracciones no volátiles del
petróleo, por lo que permite reducir
notablemente las concentraciones
de petróleo residual.2 Esto contribuye de modo muy efectivo a que se
garantice una rápida y adecuada recuperación del área impactada por
un derrame.3
La biodegradación microbiana es
un proceso lento, que está determinado por numerosos factores como
la concentración y estructura química de las sustancias a degradar, tipo
y concentración de microorganismo
y otros físicos y químicos.4,5
Las condiciones ambientales
desfavorables influyen en el desarrollo de los microorganismos degradadores. Entre ellas están: las bajas
temperaturas existentes en el mar,
la elevada salinidad, la cual influye
en la permeabilidad de la membrana celular, las bajas concentraciones
de nutrimentos, específicamente,
nitrógeno y fósforo, así como bajas
concentraciones de oxígeno disuelto.6
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Las características moleculares
del hidrocarburo son un factor importante a tener en cuenta, ya que
determinan su solubilidad en agua
y definen la velocidad y los mecanismos de ataque del microorganismo.
El número de átomos de carbono, las
ramificaciones, los anillos (aromáticos o no, su número y ubicación) y
la presencia de sustituyentes, confieren ciertas particularidades a algunas etapas del proceso de biotransformación de determinados hidrocarburos.7
En el caso de los hidrocarburos
aromáticos que comprenden al
benceno (C6H6) y sus homólogos superiores, es más complejo el mecanismo de biodegradación. Los átomos de carbono están asociados en
anillos, pero solamente una valencia
de cada dos, es saturada. Al producirse la oxidación del anillo, este se
abre por un doble enlace y se obtienen compuestos oxigenados lineales, cuya degradación es más fácil.
Así, en dependencia del microorganismo y del hidrocarburo en cuestión, se obtienen diferentes productos intermedios.8
El Instituto de Oceanología trabaja en el aislamiento y conservación de bacterias marinas degradadoras de petróleo y cuenta con un
bioproducto llamado BIOIL formado por cepas del género Bacillus,
capaces de llevar a cabo ese proceso
con gran eficiencia y tiene la ventaja de no incluir nutrimentos en su
formulación.9 De las cepas integrantes de este bioproducto, se demostró por Cromatografía Gaseosa de
Alta Resolución, que la IDO-225 es
la responsable del elevado porcentaje de actividad, razón por la cual, fue
escogida para el desarrollo de este
estudio.
La efectividad del BIOIL se comprobó durante el tratamiento de los
derrames de petróleo ocurridos en
las Bahías de Cienfuegos y de Matanzas, en el recalo accidental de
petróleo que contaminó la Playa
Arroyo Bermejo con resultados satisfactorios.10
Para determinar la posible evolución de un sustrato durante el proceso de bioxidación por Bacillus
alcalophilus cepa IDO-225 se propusieron los objetivos siguientes: evaluar la cinética y determinar el posible mecanismo de la degradación del
naftaleno por la cepa IDO-225.
MATERIALES Y METODOS
Microorganismo empleado
78
El trabajo fue realizado con
Bacillus alcalophilus cepa IDO-225,
aislada de los sedimentos de la plataforma cubana en la bahía de Cárdenas, Matanzas11 y perteneciente a
la Colección de Bacterias Marinas
(CBM) del Instituto de Oceanología.
Medios de cultivo
Para la conservación del Bacillus
alcalophilus se utilizó el medio 6
agarizado para bacterias marinas
heterótrofas según Gorbienko12 y la
fermentación para la obtención de la
biomasa microbiana se realizó según
Núñez.13
En la degradación de naftaleno
por las células inmovilizadas de
Bacillus alcalophilus se empleó
un medio que contenía naftaleno
(30 g/L) disueltos en 1 L de agua
de mar. 9,13
Obtención del bioproducto inmovilizado
Para obtener la biomasa, el cultivo se sedimentó a 700 g en una centrífuga refrigerada Berkman (USA).
Las células fueron inmovilizadas por
atrapamiento en gel según la metodología descrita por Bellota.9
Evaluación de la capacidad degradadora de Bacillus alcalophilus
cepa IDO-225
Se realizó un experimento por
bloques completamente aleatorizado, con las células de IDO -225
inmovilizadas húmedas en el medio
de degradación.
La capacidad degradadora se determinó por inoculación de 0,5 g de
cada bioproducto en frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidad, que
contenían 50 mL de medio de degradación. Como control se utilizó medio de cultivo estéril. Los experimentos se realizaron en zaranda orbital
rotatoria Infors (Suiza) a 125 r/min y
30 ºC durante 15 d .
Se tomaron muestras cada 3 d
para la determinación de la concentración de hidrocarburos según
Dubois.14
Estudio del posible mecanismo de
degradación
El hidrocarburo residual y el resto de los componentes orgánicos del
proceso fermentativo fueron recuperados cada 3 d mediante tres extracciones sucesivas con 50 mL del disolvente (CCL4) (1:1) (v/v) en la fase
orgánica, las cuales fueron posteriormente deshidratadas con Na2SO4. El
análisis cualitativo y cuantitativo de
los hidrocarburos de la fase orgánica se realizó por espectroscopia
infrarroja en un Konik de fabricación norteamericana.
Tratamiento estadístico de los resultados
En el procesamiento estadístico
de los resultados se utilizó el análisis de varianza de clasificación simple15 y la prueba de comparación de
medias de rangos múltiples de
Duncan.16 Todos los experimentos se
llevaron a cabo por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSION
Cinética de oxidación del naftaleno
por células inmovilizadas húmedas
de Bacillus alcalophilus cepa IDO225
Las células inmovilizadas se encuentran en un estado de no crecimiento y utilizan la fuente de carbono fundamentalmente para la obtención de energía de mantenimiento.10
La figura 1 muestra los resultados del estudio con las células
inmovilizadas de B. alcalophilus utilizando naftaleno como fuente de
carbono y energía en medio de degradación.
La curva de concentración de
naftaleno (Fig. 1) muestra la transformación de este sustrato por el
microorganismo inmovilizado. La
concentración de este hidrocarburo
disminuyó rápidamente en los primeros 6 d . Posteriormente, continuaron disminuyendo lentamente
hasta alcanzar un elevado porcentaje de remoción al final del proceso.
El modelo cinético de segundo
orden obtenido durante el proceso
de biodegradación del naftaleno por
células inmovilizadas húmedas de
Bacillus alcalophilus cepa IDO-225
(Tabla 1), según Head17 y Núñez,18 se
corresponde con un mecanismo de
metil-oxidación representado por el
coeficiente del término cuadrático y
una β-oxidación por el coeficiente
del término de primer orden.
Según los resultados, el modelo
cinético y la velocidad a la que ocurrió el proceso, es poco probable que
ocurran mecanismos de ∝-oxidación
y ω-oxidación, que son más lentos y
menos comunes en la estrategia
degradativa de los microorganismos
frente a los hidrocarburos.17
El mecanismo inicial en todo proceso de oxidación de hidrocarburos
es la metil-oxidación. Al comparar
los modelos cinéticos de segundo
orden de la degradación de naftaleno
por células inmovilizadas húmedas
y células libres19 de Bacillus alcalophilus (Tabla 1), es necesario mencionar que en el caso de las células
inmovilizadas pueden obtener energía suficiente y fácilmente para el
mantenimiento celular a través de la
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35
N aftaleno (g/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
t (d)
Fig. 1. Consumo de naftaleno por las células inmovilizadas húmedas de B. alcalophilus
en medio de degradación.
Tabla 1. Modelos cinéticos de la degradación del naftaleno por células libres e
inmovilizadas de Bacillus alcalophilus.
Células
Modelo cinético de degradación
R2
Libres
dC/dt = − 0,069 3C2 + 0,536 6C − 0,8
0,962 0
Inmovilizadas
dC/dt = − 0,058 0C − 0,266 7C + 0,3
0,977 0
2
Posible mecanismo de degradación
del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus
C Representa la concentración de naftaleno (g/L).
150
100
50
0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
(cm−1)
Fig. 2. Espectro infrarrojo del naftaleno puro.
metil-oxidación, por esta razón, en
el modelo cinético de esta variante
el término cuadrático es mayor. Sin
embargo, en las células libres,19 se
observó que el coeficiente correspondiente a la β-oxidación es mayor
que en las células inmovilizadas,
porque se requiere de la síntesis de
material celular para la multiplicación acompañado de un gran requerimiento energético.17
Mediante el mecanismo de β-oxidación de naftaleno por células
inmovilizadas de Bacillus alcalophilus se obtiene acetil-CoA, que se incorpora directamente al ciclo de los
ácidos tricarboxílicos, para garantizar la síntesis de compuestos esenciales y la obtención de energía.20
desbalanceado, por lo que ocurre la
transformación del sustrato por un
mecanismo de bioconversión con el
que la célula transforma a este y además, obtiene la energía de mantenimiento a partir de la fuente de carbono.10
Resultados similares fueron obtenidos por Omar21 en 1990 cuando
logró un 30 % de degradación de crudo con Candida parapsilosis inmovilizada en arcilla durante 4 semanas y sin embargo, con células libres
necesitaron 8 semanas para alcanzar
igual nivel de degradación.
Wu y Wisecarver22 demostraron
también la superioridad de las células inmovilizadas en la degradación
del fenol, donde no solo estas se
reutilizaban con efectividad, sino
que ocurría una mayor disminución
en las concentraciones de este compuesto aromático en el tiempo.
El paso determinante en la velocidad de degradación del naftaleno
es la metil-oxidación. El coeficiente
de este mecanismo (Tabla 1) es mayor en las células inmovilizadas con
respecto a las células libres,19 por lo
que la velocidad global del proceso
de biodegradación del naftaleno por
Bacillus alcalophilus es mayor en el
caso de las células inmovilizadas
húmedas.
Esto se debe a que las células libres, necesitan no solo de fuente de
carbono, sino de otros nutrimentos
para poder llevar a cabo sus procesos metabólicos. Sin embargo cuando están inmovilizadas, se encuentran en un estado de no crecimiento, ya que el medio se encuentra
En el espectro infrarrojo (IR) del
naftaleno puro (Fig. 2), se pueden
observar bandas en 2 969, 2 730, 2 669,
2 404, 2 365 cm-1, las cuales corresponden a un compuesto aromático
que coincide con la estructura del
naftaleno. Las tres primeras bandas
corresponden a grupos CH2 (ν) y las
dos últimas a grupos CH2 (σ).
Al comparar el espectro IR del
patrón de naftaleno (Fig. 2) con el
espectro IR de la muestra extraída
al tercer día de contacto de las células inmovilizadas húmedas de la cepa IDO-225 con el naftaleno como
única fuente de carbono (Fig. 3), se
apreció el consumo del hidrocarburo representado por una disminución del área bajo la curva de las bandas correspondientes a los intervalos 1 600, 2 900-3 000 cm-1.
En los espectros IR de las muestras extraídas en los sucesivos días
(Fig. 3) se observó cómo el naftaleno
se degrada lentamente por las células inmovilizadas húmedas, lo cual
puede estar relacionado con dificultades difusionales del naftaleno y de
los intermediarios de la degradación
por Bacillus alcalophilus en el interior de las perlas de las células inmovilizadas. A los 15 d (Fig. 3) se
había degradado prácticamente todo
el naftaleno añadido inicialmente.
La aparición y moderado incremento de las bandas 1 200-1 400 cm-1
(alcoholes aromáticos), 1 600, 1 200 y
1 000 cm -1 (benceno disustituido
orto), 1 250 y 1 600 cm-1 (ácido carboxílico), 3 000 y 1 650 cm-1 (alqueno)
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150
15
100
12
9
50
6
3
0
(cm−1)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Fig. 3. Espectros infrarrojos de las muestras extraídas a los 3, 6, 9, 12 y 15 d de contacto del naftaleno con células inmovilizadas
húmedas de Bacillus alcalophilus en el medio de degradación.
80
y 1 450 cm-1 (grupo metil), posteriores a la disminución de la concentración de naftaleno, indican la aparición de metabolitos cuyos grupos
funcionales emiten en este intervalo del IR y justifican el posible mecanismo que se propone para la degradación del naftaleno.
Según García23 y los resultados
obtenidos, se propone un mecanismo para la biodegradación del
naftaleno por Bacillus alcalophilus
cepa IDO-225 (Fig. 4). Primeramente, por la acción de una oxigenasa
(posiblemente dioxigenasa), se debe
formar el cis-1,2-dihidroxi-1-2dihidronaftaleno, vía que debe facilitar la apertura del anillo aromático. Seguidamente, sería factible la
deshidrogenación por las posiciones
1 y 2 mediante la acción de alguna
deshidrogenasa, para de esta forma,
dar lugar a la formación de 1,2dihidronaftaleno. Este compuesto
tiene posibilidad de apertura entre
los carbonos 1 y 2, lo que justifica la
aparición de las bandas correspondientes al benceno disustituido orto
(1 600, 1 200, 1 000 cm-1) en el espectro infrarrojo. Uno de sus sustituyentes es una cadena carbonada de cuatro átomos, que podría ser escindida
para facilitar la apertura del segundo anillo aromático. El producto liberado, de tres átomos de carbono,
puede ser incluso el piruvato que es
transformado por la enzima piruvato
carboxilasa a acetil-CoA, el cual se
incorpora al ciclo de los ácidos
tricarboxílicos.20 El benceno disustituido orto, con grupos más sencillos,
puede fácilmente ser transformado
en catecol, como uno de los metabolitos intermediarios en las vías de
desintoxicación de muchos microorganismos frente a los hidrocarburos
aromáticos.24
Al ser es escindido el catecol se
produce una molécula lineal de ácido cis-mucónico, el cual presenta dos
insaturaciones detectadas en las
bandas pertenecientes a ácidos
carboxílicos y alqueno. El ácido cismucónico se incorpora a la maquinaria celular mediante un mecanismo de β-oxidación.
Para la degradación del naftaleno
por las células inmovilizadas húmedas del Bacillus alcalophilus, el mecanismo propuesto es la β-oxidación.
A través de este se obtienen moléculas de acetil-CoA que son consumidas en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos para formar finalmente, coenzimas reducidas (NADH
y FADH 2 ), dióxido de carbono y
agua.25 Las coenzimas reducidas se
dirigen a la cadena de transporte
electrónica para la obtención de
energía en forma de ATP.20
Marr y Stone26 demostraron que
durante la biodegradación del
benceno se obtienen como intermediarios trans-1,2-dihidroxi-1,2dihidrobenceno y finalmente, el
catecol. También fue descrito por
Smitch y Rosaza27 que el cis-2,3-dihidro-2,3-dihidroxifenilo fue intermediario de la ruta degradadora del
bifenilo. A partir de este momento,
se desencadena una secuencia de
reacciones en dependencia del hi-
drocarburo y del microorganismo, que conduce a la aparición
de un ácido carboxílico por la acción de enzimas deshidrogenasas. 28, 29
Con este trabajo se demuestra
que el Bacillus alcalophilus puede
degradar el naftaleno como única
fuente de carbono y energía, sin necesidad de llevar a cabo un proceso
de cometabolismo, donde, según
Hodgson, 24 Martinkova 30 y Murakam,31 los cicloalcanos necesitan de
los n-alcanos para obtener energía y
como base para su crecimiento. Además, bajo las condiciones experimentales estudiadas y teniendo en
cuenta los espectros infrarrojos realizados, el mecanismo de degradación de este hidrocarburo por la
cepa IDO-225 fue similar al planteado por Hodgson, 24 aunque para
verificar la presencia y estructura
de los intermediarios de una forma más concluyente, se hace necesario el aislamiento, purificación e identificación de cada uno
de estos y de las enzimas participantes mediante técnicas más
confiables y certeras.
CONCLUSIONES
Las células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus cepa
IDO-225 son capaces de utilizar el
naftaleno como única fuente de carbono y energía.
El mecanismo propuesto para
oxidación del naftaleno se basa en
la metil-oxidación y en la β-oxidación.
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NAFTALENO
OXIGENASA
OH
OH
CIS-1,2-DIHIDROXI-1,2DIHIDRONAFTALENO
OH
OH
1,2-DIHIDRONAFTALENO
DIOXIGENASA
OH
O
COOH
DIHIDROXIBENZOLPIRÚVICO
OH
ALDOLASA
CHO
SALICILALDEHÍDO
+ CH3-CO-COO−
PIRUVATO
OH
DESHIDROGENASA
COOH
ÁCIDO SALICÍLICO
OH
DIOXIGENASA
OH
+
CATECOL
CO2
OH
HOOC-CH=CH-CH=CH-COOH
ÁCIDO CIS-MUCÓNICO
β-OXIDACIÓN
ACETIL-CoA
TCA
Fig. 4. Posible mecanismo de degradación del naftaleno por células inmovilizadas húmedas de Bacillus alcalophilus.
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PUBLICACIONES CIENTIFICAS RECIENTES
MINISTERIO DE EDUCACION SUPERIOR DE CUBA
NUEVOS TITULOS PUBLICADOS POR LA EDITORIAL
DEL INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL.
& Contribución al Conocimiento del Reciclaje de los Nutrientes en el Sistema Suelo-Pasto-Animal
en Cuba. Gustavo Crespo López e Idalmis Rodríguez.
& Sistemas Silvopastoriles. Conceptos y Tecnologías desarrolladas en el Instituto de Ciencia Animal
de Cuba. Emilio Castillo, Juana Galindo, Gustavo Crespo, Humberto Jordán, Bertha Chongo, Raúl
Mejías, Denia Delgado, Tomás E. Ruiz y Gustavo Febles.
& Manual Teórico Práctico de Caracterización de Productos Fibrosos. Lourdes Savón, Ana I. Marrero,
Odilia Gutiérrez y Luis M. Machín.
& La Caña de Azúcar y la Ceba de Cerdos. Carlos P. Díaz.
Para cualquier información dirigirse a:
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Editorial del Instituto de Ciencia Animal,
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