Diagnóstico molecular de la infección por el virus de la hepatitis C

Diagnóstico molecular de la infección por el virus
de la hepatitis C mediante PCR en tiempo real
1
1
1
Celis Gandica-Vargas , Javier Hernández-Peñaloza , Leidith Berrueta-Carrillo ,
1
1
2
1
1
Melisa Colmenares , Luisa Barboza , Henry Montes , Siham Salmen , Lisbeth Berrueta .
1
Instituto de Inmunología Clínica, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela;
Centro Ambulatorio de Medicina Integral, Universidad de Los Andes, CAMIULA, Mérida, Venezuela
2
Recibido Marzo 15, 2009. Aceptado Marzo 28, 2009
MOLECULAR DIAGNOSTIC OF HEPATITIS C VIRUS
INFECTION BY REAL TIME-PCR.
Resumen
Abstract
La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) actualmente
es considerada una de las principales causas de enfermedad
hepática. Su principal vía de trasmisión es la exposición a
productos sanguíneos mediante transfusiones sanguíneas,
trasplante de órganos o por el uso de drogas endovenosas,
siendo responsable del 85-90% de las hepatitis
postransfusionales. El objetivo de este estudio fue
implementar la transcripción inversa y reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), para la detección y
cuantificación de la replicación del VHC, herramienta
necesaria para el diagnóstico y monitoreo de los pacientes en
terapia antiviral. Se concluye que la técnica de RT-PCR en
presencia de SYBR-Green es rápida, sensible y específica, ya
que evita el uso de la electroforesis y otros procedimientos
laboriosos durante la fase de detección, representando así, una
herramienta poderosa en la práctica clínica.
The hepatitis C virus (HCV) infection is considered worldwide as one of the main causes of liver disease. HCV is
transmitted most efficiently by exposure to blood or related
products, which include blood transfusion, transplantation of
infected organs, and intravenous drug abuse, being
responsible for 85-90% of post-transfusional hepatitis. In this
study, we used real-time reverse transcription-polymerase
chain reaction (RT-PCR) assay to detect and quantify HCV
replication, a procedure necessary for diagnosis of viral
infection and monitoring patients on antiviral therapy. We
conclude that SYBR-Green real-time RT-PCR could be easily
and reliably applicable, avoiding the use of laborious and
time-consuming electrophoresis techniques during the
detection steps, representing a powerful diagnostic tool in
clinical practice.
PALABRAS CLAVE: VHC, RT-PCR, SYBR Green, carga
viral
KEY WORDS: HCV, RT-PCR, SYBR-Green, viral load
Introducción
La hepatitis C afecta a mas de 170 millones de
personas en el mundo y es la causa mas común de
enfermedad hepática crónica (1). En la actualidad
está claramente establecido que el virus de la
hepatitis C (VHC) representa el principal agente
etiológico responsable de la gran mayoría de los
casos de hepatitis postransfusionales y esporádicas
a nivel mundial (2). Su identificación mediante
técnicas de biología molecular ha permitido no
solo su caracterización estructural, sino también el
desarrollo de ensayos serológicos y moleculares
que actualmente son utilizados para el diagnóstico
y estudio de esta infección viral crónica (3).
Numerosos individuos infectados con el VHC no
tienen ningún factor de riesgo obvio, y se asume
8 Revista Médica de la Extensión Portuguesa - ULA. Volumen 3/Número 1/2009
que la mayoría de estas personas se han expuesto al
virus probablemente de manera inadvertida, a la
sangre contaminada o a productos de la misma (2).
En Venezuela los datos preliminares reportan
una prevalencia de la infección por el VHC de
1,2%, dos veces superior a la reportada en la
mayoría de los países industrializados (4) y puede
variar dependiendo de la población a riesgo en
respuesta a productos sanguíneos, evidenciándose
una elevada prevalencia del anti-VHC en pacientes
hemofílicos en el Estado Mérida, reportada del
30% (5), similar a la detectada en Maracaibo (6), la
cual es relativamente baja comparada con la
referida internacionalmente (7). Por otro lado, la
prevalencia de la infección de VHC en pacientes
con insuficiencia renal crónica estudiados también
en el estado Mérida (22.7%) (8), es similar a las
Virus de la hepatitis C: diagnóstico molecular
obtenidas por Zeldis et al. (15.7%) en Estados
Unidos (9) y las de Esteban et al. (20%) en España
(7).
La utilidad clínica de la cuantificación del ARN
del VHC ha sido bien establecida, siendo el
monitoreo de la carga viral antes, durante y
después de la terapia, crítica para el manejo de
estos pacientes (10). Es por ello que en este trabajo
nos propusimos establecer las bases para la
implementación de la técnica de la reacción en
cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR)
para la detección y cuantificación de la infección
por el VHC, como herramienta fundamental en el
diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la
infección viral.
Material y métodos
Pacientes. Para este estudio se seleccionó un grupo
de 11 pacientes procedentes de las consultas de
gastroenterología del Centro Ambulatorio de
Medicina Integral de la Universidad de Los Andes
(CAMIULA), a quienes se les extrajeron 10 ml de
sangre periférica sin anticoagulante para la
separación de los sueros, los mismos fueron
almacenados a -30ºC. Estos pacientes fueron
previamente diagnosticados con serología positiva
para la infección por el VHC. Se incluyeron 8
individuos sanos relacionados o no con los
pacientes. Los controles y familiares admitidos
fueron negativos para el VHC, virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la
hepatitis B (VHB), citomegalovirus (CMV) y virus
de Epstein-Barr (VEB). Los pacientes no se
encontraban bajo tratamiento anti-viral para el
momento del estudio. Todas las personas incluidas
en este trabajo fueron notificadas del propósito del
estudio y dieron su consentimiento por escrito
siguiendo las normas del comité de ética de la
Facultad de Medicina de la Universidad de Los
Andes.
Pruebas serológicas. El diagnóstico de la
infección por el VHC se realizó mediante la
detección de IgG contra los antígenos del core,
NS3, NS4 y NS5 a través del ensayo
inmunoenzimático (EIA) de IV generación
(InnotestTM, Innogenetics NV). La detección de la
infección por VIH se llevo a cabo utilizando un
EIA de IV generación. La detección de anticuerpos
anti-VHB se realizó por ELISA (Organon Teknike,
Boxtel, NL, USA) y las infecciones recientes por
CMV y EBV se descartaron utilizando EIA para
detectar IgM específica para cada virus (Organon
Teknike, Boxtel, NL, USA).
Preparación y purificación del ARN viral. Para
la extracción del ARN viral se siguieron las
instrucciones de la casa comercial, Axigen
Biosciences, USA. Brevemente, a 250 µl de suero
se le añadieron 500 µl de buffer V-A, incubándose
a temperatura ambiente durante 5 min, seguido por
la adición de 125 µl del buffer AP2 y del buffer V-B
para luego mezclarlo vigorosamente, transferirlo a
las columnas de purificación y centrifugarlo a 5000
rpm durante 1 min. Después de 2 lavados con los
amortiguadores WA1 y W2, la muestra se eluyó
con 60 µl de buffer TE contentivo de inhibidor de
RNasa (RNasin) (1 unidad/µl).
RT-PCR en tiempo real para la cuantificación
del VHC. La cuantifica ción del genoma viral se
realizó utilizando el sistema que combina las
enzimas Super Sript III transcriptasa reversa (RT)
y la Platinum taq ADN polimerasa, en presencia de
SYBR Green I de Invitrogen, USA. Tanto para la
síntesis del ADNc como para la PCR, se utilizaron
las mismas sondas dirigidas contra genes
específicos (sentido 5' - GTC TAG CCA TGG CGT
TAG TAT GAG – 3' (77–100; HCVP1) y
antisentido, 5' - ACC CTA TCA GGC AGT ACC
ACA AG – 3' (abarcando el segmento 302 hasta
280 del HCVP2) ambos primers en una
concentración de 10 µM. Las muestras se
colocaron a 50º C por 3 min (paso donde comienza
la síntesis del ADNc), seguido de una incubación a
95ºC, durante 5 min. Posteriormente, se realizaron
40 ciclos de: 94ºC por 5 seg, 60ºC por 15 seg, 72ºC
por 30 seg. Finalmente un ciclo a 78ºC por 3 seg.
Para obtener la curva de fusión (melting curve), la
muestra fue expuesta a un incremento progresivo
de la temperatura desde 72ºC hasta 95ºC
generando una lectura cada 0.2ºC sostenido por 1
seg. En paralelo se utilizó un estándar de
concentración conocida (ACURRUN 325, BBI
Diagnostic, Boston USA) para de esta manera
establecer una curva de regresión lineal y obtener
la concentración del virus en copias/ml (Opticon3,
Inc).
Análisis estadístico. Los resultados se expresan
como la media ± desviación estándar (DS). Se
consideraron estadísticamente significativos los
valores de p < 0,05.
Revista Médica de la Extensión Portuguesa - ULA. Volumen 3/Número 1/2009 9
Gandica-Vargas y col.
Resultados y Discusión
La RT-PCR realizada a través de la detección de
marcadores fluorescentes es una de las tecnologías
mas versátiles de la era genómica y se ha
convertido en el método de elección para la
detección de ARN. Varios factores han contribuido
a que dicha tecnología represente actualmente una
piedra angular tanto en el área de investigación
como en el diagnóstico molecular: a) evita los
requerimientos de procesamiento del producto
amplificado una vez finalizado el PCR, b) posee un
amplio rango dinámico de detección de cantidades
mínimas de ARN con excelente poder de
resolución, y c) permite analizar al mismo tiempo
parámetros cualitativos y cuantitativos del ARN o
ADN en una muestra problema. Estas ventajas
indudablemente han favorecido la utilización de
esta técnica para estudios funcionales en
genómica, medicina molecular, medicina forense,
virología, microbiología y biotecnología (11) .
En este trabajo se implementó esta tecnología
para obtener una medición cuantitativa del VHC en
muestras de suero de pacientes infectados y
permitió detectar de manera reproducible el
número de copias virales en muestras previamente
conocidas como positivas para la infección por el
VHC, pudiendo además diferenciar entre otras
muestras negativas para el virus. Siguiendo todos
los requisitos para la separación de muestras y
extracción del material genómico en ambientes
físicamente separados, las muestras previamente
preparadas, se dispusieron en un soporte especial
para la realización de la RT-PCR. Se incluyeron
muestras positivas y negativas con número de
copias previamente determinados además del
blanco para la mezcla de reacción.
En la tabla 1 se resumen los datos de la
valoración clínica de los individuos infectados
crónicos. Como puede observarse en general la
población estudiada presentaba un cuadro
inflamatorio hepático a juzgar por los niveles
elevados de las enzimas hepáticas.
Del grupo de pacientes estudiados (11 en total)
9 resultaron positivos. Para determinar estos
resultados se tomaron como referencia los valores
obtenidos de la curva de disociación o de fusión,
considerando el valor de la Tm o temperatura
melting, superior a 85 como positivo (Figs. 1 y 2),
punto en el cual se detectó en forma específica el
grupo de amplicones correspondientes al
segmento que se buscaba identificar a través de las
sondas específicas utilizadas, con una declinación
marcada de la fluorescencia del resto de las
muestras que representaban uniones inespecíficas.
Es notorio destacar que todos los pacientes
resultaron positivos por ELISA, sin embargo dos
de ellos se registraron como negativos en la RTPCR; esto se debe probablemente a que los
pacientes se recuperaron de la infección (crearon
anticuerpos contra el virus) o su sistema inmune ha
sido capaz de controlar la replicación viral a pesar
de no eliminar definitivamente la infección por
VHC (12); por este motivo cuando se realizó la RTPCR no hubo una detección de carga viral
significativa. El promedio de copias de los
pacientes considerados como positivos fue de 3,5
8
X 10 copias/ml relacionándose positivamente con
la efectividad y sensibilidad esperada en la
amplificación del genoma viral a través de la
técnica de PCR.
El uso de la RT-PCR es una herramienta útil
para propósitos de diagnóstico, clasificación
clínica y seguimiento de pacientes infectados por
VHC, que además muestra ser altamente sensible,
específica y rápida (13). Dicha técnica no solo ha
permitido mejorar la sensibilidad de detección de
un genoma viral sino que también ha evidenciado
Tabla 1. Características clínicas de los pacientes crónicamente infectados
Edad
(años)
Sexo
(F/M)
59,5 + 11,80
6/5
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
+ 29,9
73 + 35,2 56,6 -
GGT
(U/mL)
84 + 43,9
Carga viral
(copias/ml)
3,5x108
7
+ 6,1x10
-
Los valores representan la media más o menos la desviación estándar.
ALT, alanina amino transferasa; valores normales: 5-45 U/L. AST, aspartato amino transferasa; valores
normales: 9-40 U/L. GGT, gamma-glutamil transpeptidasa; valores normales: 75-200 U/L.
10 Revista Médica de la Extensión Portuguesa - ULA. Volumen 3/Número 1/2009
Virus de la hepatitis C: diagnóstico molecular
Figura 1. Ciclo umbral de la reacción, a: proyección del ciclo umbral, b: primer paciente en registrar incremento de
florescencia, c: ciclo en iniciar fluorescencia.
Figura 2: Curva de fusión (curva melting): a: primer paciente en alcanzar la Tm más alta, b: temperatura de fusión de la prueba,
c: pacientes de Tm inferiores a 85.
Revista Médica de la Extensión Portuguesa - ULA. Volumen 3/Número 1/2009 11
Gandica-Vargas y col.
ser una técnica de resultados precisos,
reproducibles y sensibles. Si bien la tecnología
implementada en este trabajo es de gran
aplicabilidad y actualmente es considerada como
de primera elección para la cuantificación de
ácidos nucleicos, con gran aplicabilidad en el
diagnóstico clínico y seguimiento de
enfermedades infecciosas, su utilización debe
hacerse con extremo cuidado siguiendo protocolos
ampliamente comprobados a nivel mundial que
permitan una interpretación fidedigna de los
resultados obtenidos (10). Su implementación en
nuestro medio representa un gran avance en lo que
al conocimiento en el área de diagnóstico
molecular se refiere, poniéndonos a la par de
laboratorios clínicos y de investigación a nivel
mundial, lo que contribuye además a la
implementación de herramientas de punta en el
diagnóstico virológico.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado a través del proyecto
CDCHT-ULA- M-937-07-07-F.
Correspondencia: Dra. Lisbeth Berrueta,
Instituto de Inmunología Clínica, Edificio Louis
Pasteur, Anexo al IAHULA, Av. 16 de Septiembre,
Mérida, Venezuela. e-mail: lberruet@ula.ve
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12 Revista Médica de la Extensión Portuguesa - ULA. Volumen 3/Número 1/2009
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