La genética molecular de los procariotas y de los virus bacterianos

La genética molecular de los procariotas y de los virus bacterianos
La información genética esencial de los procariotas, de los cuales la bacteria E. coli es el ejemplo
mejor estudiado, está codificada en una molécula circular de DNA de doble cadena asociada con
una pequeña cantidad de RNA y proteínas no histónicas. Se encuentra empaquetada en la región
nucleoide en la célula bacteriana.
En el curso de su larga historia evolutiva, E. coli y otros procariotas han desarrollado
procedimientos que les permiten utilizar al máximo los nutrientes destinados al crecimiento
celular. No producen todas las proteínas posibles al mismo tiempo, sino sólo cuando se necesitan
y en las cantidades necesarias. En los procariotas la regulación de la síntesis de proteínas tiene
lugar principalmente a nivel de la transcripción aunque teóricamente podría ocurrir en muchos
puntos del proceso biosintético. La regulación implica interacciones entre el ambiente químico de
la célula y proteínas reguladoras especiales, codificadas por genes reguladores.
La supervivencia a corto plazo de una célula procariótica depende del mantenimiento de la
información genética y de la multiplicación de la célula que depende, a su vez, de una replicación
rápida y precisa. En una escala de tiempo mayor, la aparición de variantes genéticas, de las que
depende la evolución de las especies, es facilitada en gran medida por el reordenamiento
ocasional de secuencias de DNA causado por la recombinación genética. Existe un grupo de
elementos genéticos que son capaces de trasladarse de un lugar a otro insertándose dentro del
DNA. Estos elementos genéticos móviles son los plásmidos, los virus y los transposones
Una vez incorporado a la célula, el DNA puede integrarse al cromosoma por recombinación
genética.
Elementos genéticos móviles
Los elementos genéticos móviles son los plásmidos §, los virus § y los transposones §.
Además de los genes § que lleva el cromosoma § bacteriano, las bacterias pueden contener otros
genes llevados en los plásmidos, que son moléculas de DNA § de doble cadena mucho más
pequeñas y también circulares. La mayoría de los plásmidos pueden ser transferidos de célula a
célula. Esta transferencia de DNA por contacto célula a célula se conoce como conjugación §.
Parte de los plásmidos puede integrarse reversiblemente al cromosoma bacteriano, en cuyo caso
se conocen como episomas §.
El factor F (de fertilidad) de E. coli es un plásmido presente en las células F+ dadoras (machos) y
puede ser transferido a las células F- (hembras) receptoras; estas células pueden transformarse en
F+ y transferir, a su vez, el factor F. Cuando el factor F se integra al cromosoma de una célula de E.
coli (transformándolas en una célula Hfr), parte del cromosoma o (en raras ocasiones) todo el
cromosoma puede ser transferido a otra célula de E. coli por conjugación. En el momento de la
transferencia, el cromosoma se replica por el mecanismo de círculo rodante y una copia de DNA
de cadena simple entra a la célula receptora linealmente, de modo que los genes bacterianos
penetran uno tras otro, en una secuencia fija. Luego se sintetiza la cadena complementaria. Como
la velocidad a la cual los genes bacterianos entran en la célula receptora es constante a una
temperatura dada, la separación a intervalos regulares de las células que se conjugan permite
mapear el cromosoma bacteriano.
Transferencia de un plásmido F de una célula F+ a una célula F-, por medio de la conjugación. En
estos diagramas, el plásmido se muestra muy aumentado; en realidad, su tamaño es mucho menor
que el del cromosoma bacteriano, ya que contiene muchos menos pares de nucleótidos.
Una cadena única de DNA se mueve desde la célula dadora hacia la célula receptora, donde
posteriormente se sintetiza su cadena complementaria (líneas punteadas en el cromosoma de la
célula receptora). A medida que la cadena de DNA se transfiere, la cadena de la célula dadora
"gira" en sentido contrario a las agujas del reloj, exponiendo los nucleótidos desapareados. Éstos
sirven como molde para la síntesis de una cadena complementaria de DNA (líneas punteadas,
célula dadora). Como resultado, el plásmido en la célula dadora continúa siendo un círculo de DNA
de doble cadena y el plásmido transferido convierte a la célula receptora en una célula F+. Este
mecanismo de replicación del DNA del plásmido se conoce como "replicación en círculo rodante".
Una cadena única de DNA se mueve desde la célula dadora hacia la célula receptora, donde
posteriormente se sintetiza su cadena complementaria (líneas punteadas en el cromosoma de la
célula receptora). A medida que la cadena de DNA se transfiere, la cadena de la célula dadora
"gira" en sentido contrario a las agujas del reloj, exponiendo los nucleótidos desapareados. Éstos
sirven como molde para la síntesis de una cadena complementaria de DNA (líneas punteadas,
célula dadora). Como resultado, el plásmido en la célula dadora continúa siendo un círculo de DNA
de doble cadena y el plásmido transferido convierte a la célula receptora en una célula F+. Este
mecanismo de replicación del DNA del plásmido se conoce como "replicación en círculo rodante".
Transferencia de una porción del cromosoma bacteriano durante la conjugación.
a. Una célula F+ se convierte en una célula Hfr cuando el plásmido F se inserta en su
cromosoma.
b. Ocurre una ruptura en la secuencia del factor F integrado al cromosoma y comienza la
replicación en círculo rodante. Liderada por su extremo 5', una cadena simple de DNA, que
contiene una porción de la secuencia del factor F seguida por los genes a+ y b+, penetra en
la célula F-. En este ejemplo, sólo una porción del cromosoma se transfiere antes de que
las células se separen una de otra.
c. El fragmento de DNA transferido es homólogo a la parte del cromosoma receptor que
lleva los mismos genes. La "concordancia", sin embargo, no es exacta, dado que los genes
a- y b- son formas alternativas de los genes a+ y b+. Difieren en la secuencia de
nucleótidos como resultado de mutaciones § que han hecho, en este ejemplo, que a y b
sean no funcionales, o sea, que no den como resultado la síntesis de los productos a y b.
d. Ocurre la recombinación entre el DNA dador y el cromosoma receptor. La célula hija que
contenga los genes transferidos a+ y b+ será capaz de sintetizar los productos a y b. Esto
ofrece un medio por el cual puede demostrarse la conjugación. Nótese que la célula
dadora sigue siendo Hfr y que la célula receptora aún es una F-, al igual que sus células
hijas.
Otros elementos genéticos móviles son los virus bacterianos o bacteriófagos §; están formados por DNA o
RNA envuelto en una cubierta proteínica. Dentro de la célula hospedadora, el ácido nucleico viral puede
utilizar los recursos metabólicos de la célula para sintetizar más moléculas de ácido nucleico viral y más
proteínas virales. Empaquetados en sus cubiertas proteínicas, las partículas de virus pueden provocar la lisis
§ celular y escapar de la célula (ciclo lítico) para comenzar un nuevo ciclo de infección.
El DNA de algunos virus, conocidos como virus atenuados, puede integrarse en el cromosoma del
hospedador de la misma manera que un episoma § y replicarse junto con el cromosoma iniciando un ciclo
lisogénico. Cuando se integra en un cromosoma hospedador, el DNA de un virus bacteriano se conoce como
profago §. De tanto en tanto, los profagos se separan del cromosoma y establecen un nuevo ciclo de
infección.
Los virus pueden servir como vectores de material genético, transportando genes de una célula a otra,
proceso conocido como transducción §. La transducción general ocurre cuando el DNA hospedador,
fragmentado en el curso de la infección viral, se incorpora a nuevas partículas virales que llevan estos
fragmentos a una nueva célula hospedadora. La transducción especializada ocurre cuando un profago, al
liberarse del cromosoma hospedador, lleva con él, como parte del cromosoma viral, genes del hospedador
que luego son transportados a una nueva célula hospedadora.
Cuando ciertos tipos de virus infectan bacterias, puede ocurrir uno de dos hechos: que comience una infecció
o que el virus se integre al cromosoma bacteriano.
a. El DNA viral puede entrar a la célula y comenzar una infección (ciclo lítico); o
b. el DNA viral puede incorporarse al cromosoma bacteriano, replicarse con él y ser
transferido a las células hijas (ciclo lisogénico).
Las bacterias que albergan a estos virus se conocen como lisogénicas porque, de cuando en cuando, los
profagos se activan y establecen un nuevo ciclo lítico.
Los transposones son elementos genéticos móviles que difieren de los plásmidos y de los virus en
varios aspectos:
1. llevan un gen para la enzima § transposasa, que cataliza su integración al cromosoma del
hospedador;
2. en cada extremo del transposón hay una secuencia repetida directa o invertida;
3. la secuencia blanco en el cromosoma hospedador se duplica cuando se inserta el
transposón y el resultado es que el transposón queda flanqueado en cada extremo por la
secuencia blanco.
Los transposones pueden causar mutaciones, interfiriendo con la expresión normal de los genes
de la célula hospedadora. Los transposones simples contienen solamente genes implicados en su
transposición; los compuestos llevan genes estructurales adicionales.
Inserción de un transposón en un DNA receptor.
a. La secuencia de nucleótidos en la cual ocurre la inserción se conoce como sitio blanco.
b. Se producen cortes escalonados en el sitio blanco y
c. el transposón se une a los extremos que sobresalen de los cortes.
d. Cuando los espacios se completan por síntesis de la hebra complementaria, se forman
repeticiones idénticas en ambos lados del transposón insertado. Éstos, a menudo, se usan
como "mojones" para identificar las secuencias de DNA que han sido transpuestas.
Estrategias de recombinación
En ocasiones, DNA § foráneo, portador de información, puede introducirse en una célula
bacteriana. Las bacterias portadoras de estas secuencias de DNA pueden transmitir los plásmidos
§, transposones § o profagos § adquiridos a las células hijas durante la división celular por
transferencia vertical.
El DNA incorporado a la célula puede integrarse al cromosoma § por recombinación § genética.
Existen dos grandes tipos de recombinación: la recombinación general u homóloga y la
recombinación específica de sitio.
La recombinación homóloga implica el intercambio entre segmentos homólogos § de DNA.
Cuando dos segmentos homólogos de DNA de doble cadena se alinean uno con otro, pueden
ocurrir intercambios entre las moléculas de modo tal que los genes pueden ser transferidos de una
molécula a otra. Este fenómeno se produce en las células eucarióticas § en la meiosis §, durante el
crossing-over §; también ocurre entre el DNA de la célula receptora y el de la célula dadora, luego
de la conjugación §, la transformación § y la transducción § en las células bacterianas. Se han
propuesto varios modelos para explicar cómo ocurre la recombinación entre homólogos; uno de
ellos es el "intercambio de cadena simple".
El modelo "intercambio de cadena simple" de la recombinación genética entre dos cadenas
homólogas de DNA.
a. El DNA de cada uno de los progenitores homólogos se indican en negro y el otro en color
rojo.
b. Se rompe una cadena de cada molécula de DNA,
c. que se intercambia con la cadena homóloga de la otra molécula y
d. ídem,
e. se une a la cadena intercambiada.
f.
El intercambio de cadenas entre los DNA ocurre a lo largo del DNA y
g. en un punto específico, las cadenas intercambiadas se rompen nuevamente y
h. se resellan, completando el intercambio y la recombinación de los genes.
Un segundo tipo de recombinación, la llamada recombinación específica de sitio, implica la inserción de
elementos genéticos móviles (y removibles), como el plásmido F. Estos elementos pueden entrar o salir del
DNA de un cromosoma a través de un evento de recombinación. Esta recombinación involucra secuencias
específicas del DNA del fago o del plásmido y del DNA bacteriano, que incluyen una pequeña región de
homología y enzimas de recombinación específicas. Un tipo diferente de recombinación, que no involucra
ningún tipo de homología de secuencia, es la implicada en la inserción de los transposones. La transposasa,
enzima responsable de la inserción, introduce cortes en el DNA cromosomal, en secuencias blanco al azar.
DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio
Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y
transfieren información genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo
de sus propias manipulaciones genéticas. En los últimos años, se han desarrollado técnicas que
han permitido abordar el análisis y la manipulación del DNA en una forma antes inimaginada. La
tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función
de los genes, especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos.
Estas investigaciones permanentemente generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de
los cuales tienen profundas implicancias éticas.
Cuando los investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño y la complejidad del
DNA, incluso el del virus más simple, la posibilidad de descifrar la información genética codificada
parecía estar más allá de toda esperanza. Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se
lo debía aislar del resto del genoma ya que, cada gen, representa una pequeña sección dentro de
un cromosoma y, en ese contexto, no puede ser individualizado. Para el aislamiento de un gen o
de fragmentos más pequeños, el DNA debe ser fragmentado. Si bien la ruptura del DNA puede ser
realizada mecánicamente, por este medio la fragmentación se produce al azar. La obtención de
fragmentos específicos fue posible mediante un método desarrollado a partir de herramientas
propias de ciertos organismos.
Para avanzar hacia un estudio más detallado del DNA fue necesaria una metodología para obtener
grandes cantidades de fragmentos específicos de DNA. Estos fragmentos podían ser DNA
genómico, cDNA o DNA obtenidos a partir de oligonucleótidos sintéticos.
A menudo, antes de que un determinado fragmento de DNA o de mRNA pueda ser manipulado de
cualquier modo, debe primero ser localizado. Los cromosomas, incluso los de las células
eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un
segmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para localizar
fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos.
Con el desarrollo de técnicas para cortar moléculas de DNA y multiplicar los fragmentos, hoy es
posible, en principio, determinar la secuencia de nucleótidos de cualquier fragmento de ácido
nucleico aislado. Para secuenciar una molécula de DNA de gran tamaño, como el genoma
completo de un virus, es preciso analizar porciones pequeñas y posteriormente integrar los
resultados.
En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta de que
los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de importancia médica
o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados. Las bacterias pueden funcionar como
“fábricas” que suministran una fuente virtualmente ilimitada de proteínas. Esta propiedad de las
bacterias fue aprovechada por los científicos y así nació la biotecnología.
La metodología del DNA recombinante, permite transferir genes tanto a células procarióticas
como a células vegetales y a otros organismos eucariotas.
Aislamiento de fragmentos específicos de DNA
Los fragmentos específicos de DNA § se pueden obtener cortando moléculas de DNA con enzimas
de restricción §, transcribiendo el mRNA § a DNA con la enzima transcriptasa inversa §, o por
medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se
encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos §. Escinden las
moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8
nucleótidos § de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA
extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación
de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento.
Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos.
Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos “pegajosos” que luego pueden unirse, por
apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima.
Esto hace posible combinar segmentos de DNA de fuentes diferentes.. Una misma molécula de
DNA producirá distintos fragmentos, llamados fragmentos de restricción, si es tratada o digerida
con diferentes enzimas de restricción. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias
de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA
genómico § de una variedad ilimitada de fuentes.
Las secuencias de nucleótidos de DNA reconocidas por tres enzimas de restricción ampliamente
usadas: a) HpaI, b) EcoRI y c) HindIII.
Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares
de bases de longitud y, cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'), las dos cadenas
complementarias de la secuencia son idénticas; estas secuencias se denominan secuencias
palindrómicas. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado
extremos "pegajosos". Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su
nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae;
EcoRI es de E. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae.
Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue
aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA, los retrovirus §. Esta enzima es capaz de
sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA.
Cuando estos virus infectan una célula hospedadora, la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de
DNA a partir del molde de RNA viral; el mRNA viral, que codifica proteínas § virales, se transcribe a
partir de este DNA, como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales.
En el laboratorio, la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde
de RNA, segmentos que se conocen como DNA complementario, o cDNA §.
Infección de una célula animal por un retrovirus.
En el esquema anterior se observa que
a. la cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de
lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y
por proteínas virales. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un
nuevo hospedador, permitiendo que el virus entre en la célula.
b. Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula, el RNA viral se libera de la cápside y
c. se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA).
d. Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la
primera), produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. Estas reacciones, así
como la de degradación de la molécula original del RNA viral, son catalizadas por la enzima
transcriptasa inversa.
El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. Posteriormente se
transcriben, a partir del DNA viral integrado, tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la
síntesis de proteínas virales.
Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de
poliacrilamida.El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo
nucleótido. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño, se utilizan matrices con poros mayores, como
los geles de agarosa §, un polisacárido aislado de ciertas algas.
Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente, por ejemplo, mediante el uso
de técnicas de tinción.
Obtención de múltiples copias de DNA
La maquinaria para duplicar DNA § ya estaba presente en la E. coli y en otras células bacterianas. Pero
hacían falta vectores § que pudiesen llevar las moléculas de DNA de interés al interior de estas células e
iniciar la replicación. Nuevamente, los procariotas § y los virus § aportaron la solución.
Los clones, en genética molecular, son copias múltiples de la misma secuencia de DNA. Las secuencias a ser
clonadas se introducen en células bacterianas por medio de vectores. Los plásmidos § y los bacteriófagos §
se usan como vectores; los cósmidos § son vectores sintéticos que combinan características del fago lambda
(que tienen los extremos cohesivos o regiones COS) con propiedades de los plásmidos. La secuencias de
DNA que se desean clonar deben ser insertadas en los vectores. Una vez en la bacteria, el vector y el DNA
extraño que lleva se replican y las copias múltiples pueden ser recuperadas de las células.
Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca genómica §que consiste en una colección de
fragmentos de DNA genómicos §, clonados en vectores (plásmidos, bacteriófagos o cósmidos), que
representan el genoma § entero del organismo. Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA § que
representan la colección completa de los mRNA § que se sintetizan en un momento en una célula dada.
La enzima de restricción EcoRI escinde este plásmido en la secuencia GAATTC, dejando extremos "pegajosos"
expuestos.
Los extremos pegajosos, formados por secuencias TTAA y AATT, pueden unirse con cualquier otro segmento
de DNA que haya sido escindido por la misma enzima. Así es posible insertar un gen extraño en el plásmido.
(En este diagrama, la longitud de las secuencias GAATTC se ha exagerado y las longitudes de las otras
porciones del gen extraño y del plásmido se han acortado). Cuando estos plásmidos recombinantes, que
llevan un gen extraño, se incuban en ciertas condiciones con bacterias en medio líquido, son captados por
algunas de las células bacterianas. Cuando estas células se multiplican, los plásmidos también se replican; el
resultado es un número creciente de células, todas sintetizando copias del mismo plásmido. Los plásmidos
pueden separarse luego de los otros contenidos celulares y tratarse con EcoRI para liberar copias múltiples
del gen clonado
Hasta la década de 1980, el único método para obtener grandes cantidades de un fragmento de DNA era
clonándolo en vectores adecuados e introduciéndolo y multiplicándolo en bacterias. En el año 1986, un
investigador norteamericano, K. Mullis, desarrolló un método que permite, a partir de una muestra muy
pequeña de DNA, obtener millones de copias de DNA in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar
células vivas. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia
de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para
diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de DNA complementarios a una porción de cada una de las dos
cadena de la doble hélice.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
a.
b.
c.
d.
La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos
sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los
cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato –dATP, dGTP, dCTP y dTTP–.
La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de
desnaturalización, una de hibridación y una de elongación. Durante la desnaturalización, que se
realiza por calentamiento de la mezcla a 95 ºC, se separan las dos cadenas del DNA molde.
Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de
las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72 ºC, temperatura a la cual la DNA
polimerasa extiende la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar
cada ciclo, la cantidad de DNA molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal
de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes
cantidades de fragmentos de DNA humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros
métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación.
Localización de fragmentos específicos de DNA: hibridación
Un fragmento de interés se puede identificar mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos § que
dependen de la capacidad de una cadena simple de RNA o de DNA (que puede ser separada de la doble
hélice por calentamiento) para combinarse o hibridar con otra cadena que tiene una secuencia de
nucleótidos § complementaria. Cuanto mayor sea la similitud entre las secuencias de nucleótidos de las dos
cadenas, más rápida y más completa será la hibridación.
Transformación de bacterias y localización de un segmento de DNA de interés por medio de una sonda
radiactiva.
a.
Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de
DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. Los plásmidos
contienen, además, un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las
colonias que hayan incorporado el plásmido.
b.
c.
d.
e.
Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido
que contiene el antibiótico de selección. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido
recombinante crecerán formando colonias aisladas. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas
de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido
recombinante.
Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una
réplica. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el
DNA del plásmido. El DNA se une químicamente al filtro
El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda
radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple, complementaria al
segmento de DNA de interés. Se permite que la sonda se hibride.
Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas
de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se
realiza por medio de autorradiografía, técnica en la cual primero, cada filtro es cubierto con una
película fotográfica y dejado en la oscuridad. Durante el período de exposición, el radioisótopo
libera energía que impacta la emulsión fotográfica. Luego del revelado de la película, la posición del
fragmento radioactivo se observa como una marca oscura, producida por un depósito de plata de la
emulsión. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este
tratamiento, identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que
se deseaba estudiar.
Existe también una técnica que permite localizar secuencias específicas de DNA o RNA en células y tejidos
mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos. Esta técnica, conocida como hibridación in situ, permite, por
ejemplo, localizar una determinada secuencia en un cromosoma §. Las sondas, que también pueden ser
marcadas con un colorante fluorescente, son hibridizadas a los cromosomas, expuestos previamente a un
alto pH § que rompe las uniones puentes de hidrógeno § y separa las dos cadenas de DNA.
El método de hibridación in situ también puede ser usado para detectar la presencia de moléculas de RNA
específicas en células de distintos tejidos e indicar, de esta manera la expresión diferencial de genes en esos
tejidos.
Hibridación in situ. Cromosomas humanos en metafase, en los cuales se identifican secuencias específicas de
nucleótidos mediante la técnica de hibridación in situ de ácidos nucleicos.
En la hibridación in situ, las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. Cada color indica la
localización de una secuencia de DNA diferente: rojo, localización en el cromosoma X del gen de la distrofia
muscular infantil mas común; verde, región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del
Síndrome de Down; blanco, un oncogen en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica una proteína de
membrana de los glóbulos blancos; amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5.
En los últimos años, se ha desarrollado una técnica que promete generar un salto cualitativo en los estudios
de la expresión genética. Se trata de los microarreglos o chips de DNA que permiten monitorear la expresión
de un genoma en forma integrada y en un tiempo récord.
La base de la técnica es simplemente la hibridación de secuencias complementarias de ácidos nucleicos a
una escala microscópica. Este altísimo nivel de miniaturización permite que la cantidad de sonda requerida
sea mínima Con el empleo de diferentes "etiquetas" fluorescentes se pueden comparar los patrones de
hibridación de dos tipos celulares cualesquiera encontrando rápidamente aquellos genes que poseen un
patrón de expresión diferencial. De este modo es posible detectar genes específicamente activados en
células que han sufrido algún tipo de diferenciación, como células de diferentes tejidos, tumorales,
sometidas a ciertos tratamientos, etc.
Los microchips proveen una revolucionaria herramienta para explorar la expresión génica y el análisis de
secuencias tanto en la investigación básica como aplicada.
Secuenciación del DNA
La secuenciación del DNA § es la determinación de la secuencia de nucleótidos § de una molécula de DNA.
Se usan dos técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra métodos
químicos.
La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por
clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción § o por la técnica de PCR §.
Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable.
Combinando la información de la secuenciación de distintos fragmentos del mismo DNA producidos por
diferentes enzimas de restricción, los biólogos moleculares pueden determinar la secuencia completa de un
segmento largo de DNA (como por ejemplo un gen entero).
Existen dos métodos de secuenciación. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el
método de Maxam y Gilbert, el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca
radiactivamente en el extremo 5'. La solución § que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones,
cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas § en una
sola de las cuatro bases nitrogenedas §. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un
gel de poliacrilamida desnaturalizante, en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un
nucleótido de longitud. Combinando la información obtenida con cada reacción, se puede inferir la
secuencia del segmento completo.
En la secuenciación por el método enzimático, se procede en varias etapas. En una primera etapa, el
oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se
inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. La mezcla en la que se
producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene, además, uno de los
nucleótidos terminadores (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP). Estos son dideoxinucleótidos que carecen del
OH- en la posición 3’, por lo que, una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando, no pueden
reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman, así, en el último nucleótido de la cadena.
En una segunda etapa, los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel, en “calles”
separadas. Luego de la corrida electroforética, se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la
secuencia complementaria del DNA original. En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía
del gel, que esquematiza la cuba electroforética, se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una
porción aumentada del gel. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de
nucleótidos incógnita de la sigueiente manera: por ejemplo, si el un fragmento de un solo nucleótido, que se
ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucléotido de la
secuencia contiene, como base nitrogenada, una guanina.
De la misma manera, si buscamos en qué calle se ubica el fragmento de dos nucleótidos, verificaremos que
el segundo nucléotido de la secuencia contiene, como base nitrogenada, también una guanina. De esta
manera, se puede deducir, a partir de la ubicación de los fragmentos en el gel, la secuencia de nucleótidos
complementarios de la cadena incógnita. La secuencia completa de nucleótidos se presenta a la derecha del
recuadro que esquematiza el gel y es: 5’ GGACAATTGT 3’.
La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por
clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción § o por la técnica de PCR §.
Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable.
Combinando la información de la secuenciación de distintos fragmentos del mismo DNA producidos por
diferentes enzimas de restricción, los biólogos moleculares pueden determinar la secuencia completa de un
segmento largo de DNA (como por ejemplo un gen entero).
Biotecnología
El término biotecnología fue creado en 1917 por el ingeniero húngaro Karl Ereky para describir procesos en
los que se formaban productos a partir de materiales crudos, con la ayuda de la actividad metabólica de
organismos vivos. Hoy el término biotecnología engloba todo tipo de producción industrial de “bienes y
servicios” por medio de procesos que utilizan organismos, sistemas o procesos biológicos.
Las técnicas de DNA recombinante § permiten la construcción de vectores §, portadores de genes §
específicos, que son introducidos en células bacterianas, las cuales sintetizan las proteínas § codificadas por
los genes.
La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada usando el gen para
la hormona somatostatina, una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos § que podía ser detectada en
cantidades muy pequeñas.
Más recientemente, se ha logrado introducir en células bacterianas genes para otras proteínas útiles en
medicina, que han funcionado correctamente para la síntesis de las proteínas codificadas. Los plásmidos §
utilizados para la expresión de proteínas foráneas se conocen con el nombre de vectores de expresión. Un
ejemplo es el gen para la insulina humana. Otro es el gen para la somatotropina u hormona de crecimiento,
que se utiliza para tratar cierta forma de enanismo en los niños.
Desde el punto de vista económico, la síntesis bacteriana de otras proteínas es de importancia creciente. Por
ejemplo, la enzima § renina, que se extrae del estómago de terneros y se usa en la industria láctea para
elaborar queso, ha sido producida por tecnología de DNA recombinante. Más recientementese ha logrado
inducir la síntesis bacteriana de la enzima celulasa, producida en la naturaleza por ciertos hongos. Esta
enzima convierte a la celulosa, que no es digerible por la mayoría de los organismos, en glucosa, la molécula
alimenticia de gran importancia.
Las vacunas contra enfermedades virales son otro producto importante de la biotecnología. Todos los virus,
como se sabe, consisten en ácido nucleico envuelto por una cubierta proteínica. Son las proteínas exteriores
del virus las que determinan si el virus puede unirse o no a la célula blanco y penetrar en ella. En el torrente
sanguíneo de los animales, estas proteínas del virus, reconocidas como extrañas por células del sistema
inmune, generan la formación de anticuerpos, moléculas que desempeñan un papel central en la inmunidad
futura contra el virus. La mayoría de las vacunas se hacen utilizando partículas virales inactivas o
modificadas. Las vacunas producidas exclusivamente a partir de las proteínas virales externas sintetizadas en
bacterias son más seguras dado que, sin el ácido nucleico viral, no puede ocurrir contaminación de la vacuna
por partículas infectivas.
El proyecto de la somatostatina.
Un gen para somatostatina sintetizado artificialmente se fusiona con el gen para la beta-galactosidasa de un
plásmido bacteriano. Introducido en E. coli, este plásmido dirige la síntesis de una proteína híbrida, que
comienza como betagalactosidasa, pero termina como somatostatina. El bromuro de cianógeno escinde la
proteína en el sitio de la metionina, liberando así la hormona intacta, junto con muchos fragmentos de betagalactosidasa, de los que puede ser separada. Leyendo en el sentido del movimiento de las agujas del reloj,
la secuencia de nucleótidos que se muestra en este diagrama es la secuencia 5' a 3' de la cadena inactiva de
la doble hélice de DNA. Es complementaria de la cadena molde a partir de la cual se transcribe el mRNA y,
con excepción de la sustitución de la timina por uracilo, es idéntica a la secuencia 5' a 3' de la molécula de
mRNA transcripta.
Transferencia de genes
La metodología del DNA recombinante §, que permite la modificación de plásmidos § para transferir genes
§ tanto a células procarióticas como a células vegetales, se utiliza para desarrollar vectores adecuados para
la transferencia de genes a otros organismos eucarióticos.
Uno de los problemas técnicos con que se tropieza cuando se intenta transferir genes, es saber si un gen
determinado realmente ha sido introducido en una nueva célula hospedadora y, si una vez transferido, está
dirigiendo la síntesis de proteína.
Agallas de corona creciendo sobre un tallo de tabaco.
El Agrobacterium tumefacienses una bacteria común del suelo que infecta a las plantas, produciendo una
tumefacción o tumor del tejido, conocido como agalla de corona. Las investigaciones han mostrado que la
causa de esta agalla no es el A. tumefaciens mismo, sino un plásmido relativamente grande contenido en la
bacteria. Parte de este plásmido, que se conoce como Ti (inductor de tumor), se integra al DNA de la célula
vegetal hospedadora.
Para tratar de comprender de qué manera el plásmido Ti ejerce sus efectos, se ha usado la tecnología de
DNA recombinante para examinar sus genes. Tres de sus genes, según se ha encontrado, rigen la síntesis de
hormonas vegetales, que actúan directamente sobre las células de la agalla para promover su crecimiento.
Uno o más genes adicionales subvierten la maquinaria celular para producir aminoácidos particulares,
llamados opinas, que pueden ser utilizados por las células de la agalla, pero no por las células normales.
Además, las opinas actúan, de alguna manera, como “afrodisíacos moleculares”, incrementando la
conjugación bacteriana y promoviendo así la diseminación del plásmido Ti en bacterias no infectadas. En
efecto, el Ti asume y dirige las actividades de sus dos hospedadores, las células bacterianas y las células
vegetales, para promover su propia multiplicación. El plásmido Ti ha suscitado considerable atención no sólo
a raíz de sus notables propiedades, sino también por ser un vector potencial para transportar genes útiles a
plantas cultivadas.
Un caso interesante de transferencia de genes se ilustra en este notable experimento en el que aislaron el
gen para la enzima luciferasa de las luciérnagas.
El sustrato para la enzima luciferasa es una proteína llamada luciferina. En presencia de oxígeno, la luciferina
junto con luciferasa y ATP producen bioluminiscencia, como se ve en el destello de la luciérnaga. El gen de la
luciferasa fue clonado en E. coli y luego empalmado en el cromosoma de un virus vegetal, lo cual le
suministró una secuencia regulatoria. El cromosoma viral modificado se insertó luego en plásmidos Ti, los
plásmidos fueron transferidos a las bacterias y las bacterias se incubaron con células foliares del tabaco. Las
células formaron una masa de tejido, conocido como callo, a partir del cual se obtuvieron nuevas plantas en
medio de crecimiento adecuado. Las nuevas plantas fueron regadas con una solución que contenía luciferina
y al cabo de un tiempo las plantas resplandecían.