protocol experiment VIH ES

Investiga la vacuna
del VIH
Taller de experimentación
PROTOCOLO
Resumen
El Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa
está investigando una vacuna para proteger
a las personas contra el virus del sida (VIH) y
actualmente ya ha identificado a un candidato a
vacuna, que se encuentra en proceso de desarrollo. Una de las principales dificultades a la
hora de desarrollar la vacuna consiste en superar la inmensa variabilidad del virus que circula
por las distintas regiones del mundo.
En este taller investigarás si la vacuna contra el
VIH desarrollada por IrsiCaixa podría ser eficaz
para proteger a la población de distintos continentes.
Introducción
Más de 33 millones de personas en todo el
mundo están infectadas por el virus del sida,
o VIH, y cada minuto se infectan seis nuevas
personas. En la actualidad, ya disponemos de
medicamentos para prolongar y mejorar la calidad de vida de las personas infectadas, pero no
existe una cura definitiva ni tampoco contamos
con una vacuna.
Hace más de 15 años que el Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa investiga para desarrollar una vacuna y avanzar en la mejora de
los tratamientos existentes. Mientras tanto, la
mejor herramienta para combatir la pandemia
es la prevención.
2
Una vacuna es una sustancia que "enseña" a
nuestro sistema inmunitario a reconocer virus
o bacterias que causan enfermedades y defenderse de ellos. Cuando nos vacunamos, nuestro
sistema inmunitario reconoce los agentes de
la vacuna como extraños y desencadena una
respuesta contra ellos. De esta manera, cuando
el microbio nos infecta, nuestro sistema inmunitario está preparado para responder.
1
2
3
1. La proteína candidata a vacuna estimula el
sistema inmunitario para que produzca anticuerpos contra ella
2. Si un día la persona vacunada se infecta, ya
tiene anticuerpos para luchar contra el VIH
3. Pero, si un día la persona vacunada se infecta
con un VIH que tiene la proteína diferente, los
anticuerpos generados por la vacuna no le servirían para luchar contra la infección
3
La dificultad para desarrollar la vacuna contra
el VIH radica en encontrar una vacuna que sea
capaz de activar el sistema inmunitario para
que elimine totalmente la infección causada por
los millones de tipos de VIH que existen en todo
el mundo.
1 _ AE 13832
0
4,3 %
02 _ AG 9594
3,0 %
A 22714
7,1 %
B 199411 62,1 %
C 42993 13,4 %
DE 8465
2,6 %
F
3050
0,9 %
G
3909
1,2 %
otros 17227
5,4 %
- - - - - - - - - - - total 321195 100,0%
Distribución de las distintas variantes de VIH-1 en todo el mundo. (Los Alamos HIV sequence Database, www.hiv.lanl.gov)
4
¿Cómo puedes participar tú en la
investigación de la vacuna contra el
VIH?
En este taller podrás investigar con una proteína del VIH que IrsiCaixa ha identificado como
un posible componente de una vacuna para
proteger a las personas contra ese virus. Se ha
demostrado que, in vitro, esa proteína estimula
la respuesta inmunitaria.
Actualmente, IrsiCaixa está realizando estudios
in vitro para evaluar su eficacia y, si todo va
bien, después se iniciarán fases de investigación
más avanzadas que culminarán en pruebas con
pacientes.
El objetivo del taller será averiguar si el candidato a vacuna de IrsiCaixa será eficaz para
proteger a las personas contra la inmensa
variabilidad de tipos de VIH que circulan por las
distintas regiones del planeta. ¿Tendremos que
desarrollar diferentes vacunas para diferentes
zonas del planeta?
Para investigarlo, tendrás que analizar si esta
proteína está presente en variantes del VIH procedentes de África, Asia y Europa.
Si está presente, la vacuna podría ser eficaz
para prevenir la infección por estas variantes del
VIH, ya que estimularía una respuesta inmunitaria contra ellas. Por lo tanto, podría ser eficaz
para proteger a la población de estos continentes.
Pero si alguna de las variantes no contiene la
proteína candidata, entonces la vacuna no sería
eficaz contra esta variante del VIH y habría que
modificarla.
?
Virus africano
?
Virus asiático
?
Virus europeo
5
Objetivos
• Participar en el proceso de desarrollo de la
vacuna del sida de IrsiCaixa, siguiendo las
etapas de la metodología científica.
• Utilizar las técnicas de laboratorio que se utilizan en este campo de investigación, como la
separación de fragmentos de ADN mediante
electroforesis o la segmentación de ADN por
medio de enzimas de restricción.
• Investigar y familiarizarse con la inmensa
variabilidad que posee el virus del sida.
• Comprobar si la proteína que IrsiCaixa ha
identificado como posible candidato a vacuna podría ser útil para estimular el sistema
inmunitario de personas expuestas a las
variantes mayoritarias del VIH de diferentes
continentes: África, Asia y Europa.
Hipótesis
La proteína candidata a formar parte de
una vacuna identificada por IrsiCaixa,
no se ve modificada en la gran mayoría
de variantes de VIH que existen en todo
el mundo. Por lo tanto, una vacuna
dotada de esta proteína debería ser
igualmente eficaz para combatir la
mayoría de las variantes de VIH que
existen.
6
Metodología
Trabajaremos con muestras de ADN de las tres
variantes del VIH más comunes en tres continentes: África, Asia y Europa.
ADN
Proteína candidata
También dispondremos de una muestra de
ADN que contiene la información necesaria
para producir la proteína candidata a vacuna de
IrsiCaixa. Con estas muestras investigarás si las
distintas variantes del VIH contienen la secuencia de ADN candidata.
ADN
Variante mayoritaria de VIH europeo
ADN
Variante mayoritaria de VIH africano
ADN
Variante mayoritaria de VIH asiático
7
Para llevar a cabo esta investigación tendremos
que desarrollar las siguientes tareas:
(A) Cortamos las cadenas de ADN de los virus
de los tres continentes: Para ello, utilizaremos
las llamadas enzimas de restricción, proteínas
conocidas por los investigadores por su capacidad de cortar el ADN en zonas específicas. La
enzima que utilizaremos corta específicamente
el gen responsable de sintetizar la proteína
candidata, pero no corta si ésta presenta alguna
variación en la región de ADN en estudio. Por
tanto, las muestras de ADN solo serán cortadas
si tienen este gen conservado.
(B) Separamos los fragmentos de ADN: Con
la ayuda de una técnica llamada electroforesis,
vamos a separar los fragmentos de ADN resultantes de la digestión por las enzimas.
(C) Visualizamos los fragmentos de ADN:
Visualizamos qué muestras de ADN han sido
cortadas, y por tanto, qué variantes tienen la
proteína candidata.
A
B
T
C
G
T
T
T
A
C
G
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T
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A A
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A
A
A
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C
A
A
A
T
G
G
A
G
T
G
A
A
A
C
8
Resultados y conclusiones
Compararemos las secuencias genéticas de las
distintas variantes de VIH, analizando el efecto
de la enzima de restricción, y así identificaremos
las diferencias entre sus ADN. Con esta información, podremos reflexionar sobre la inmensa
variabilidad del VIH.
Con los resultados obtenidos podremos concluir
si la proteína candidata de IrsiCaixa podría ser
útil para proteger a la población de los distintos
continentes, o si habrá que desarrollar diferentes vacunas, cada una adaptada a la secuencia
del virus presente en cada área geográfica.
9
Instrumentos y
materiales necesarios
Instrumentos y material de laboratorio Pipetas de 10 y 20 µl
Gradillas
Baño de agua y soporte para los tubos
Fuente de alimentación
Gel de agarosa
3 contenedores (para teñir y limpiar el gel)
Enfriador
Cubeta de electroforesis
Cronómetro
Rotulador para vidrio
10
Material fungible
Guantes y batas
Puntas de pipeta
Tubos de 1,5 ml y/o 0,5 ml
ADN de virus de distintos
orígenes
Enzima de restricción Nhel
+ tampón (1)
Marcador de peso
molecular (2)
Tampón TAE
500 ml de TAE 0,5x (3)
Tampón
de carga (4)
Líquido para teñir el ADN
(Stain Fast 100x)
Reactivos y disolventes *
Agua destilada: 3 frascos de vidrio de 500 ml
y un tubo de 1,5 ml.
(1) El tampón se usa para obtener
un medio adecuado para la
actuación de la enzima.
(2) El marcador lleva una etiqueta
donde se indica: medidas de los
diferentes fragmentos de entre
100 y 3.000 pares de bases.
(3) Para mantener el pH; también
contiene sales para facilitar el
paso de la corriente eléctrica (en
concentración 0,5x para llenar la
cubeta).
(4) Para dar color y densidad a las
muestras y facilitar así su carga.
*Si queréis hacer este experimento en vuestro centro educativo o museo, poneos en contacto con divulgacio@irsicaixa.es para
que os faciliten los reactivos necesarios.
11
Procedimiento
A
"Cortamos" las cadenas de ADN de los virus de los tres continentes +
Introducción
Cortaremos los ADN de las tres variantes de
VIH utilizando las llamadas enzimas de restricción, proteínas conocidas por los investigadores por su capacidad de cortar ADN en zonas
específicas. La enzima que utilizaremos corta
específicamente el gen responsable de sintetizar la proteína candidata, pero no corta si éste
presenta alguna variación en la región de ADN
en estudio. Por tanto, las muestras de ADN solo
serán cortadas si tienen este gen conservado.
T
C
G
T
T
T
A
C
G
T
C
A
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T
T
T
T
C
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T
T
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A
A
A
G
C
A
A
A
T
G
G
A
G
T
G
A
A
A
12
Procedimiento A
1
2
Tapamos el tubo y sacudimos suavemente con el dedo
Preparamos con la pipeta los componentes de la reacción de digestión en cuatro
tubos de 1,5 ml debidamente rotulados.
Añadamos a cada tubo:
• Agua destilada
• Tampón para optimizar
la actuación de la enzima
de restricción (color verde) • Enzima de restricción (en frío) • Una de las cuatro muestras de ADN
(una de la proteína candidata y 3 de
cada una de las variantes de VIH) 3
16 µl
3 µl
1 µl
10 µl
Incubamos el tubo a 37 ºC durante 5
minutos para que la enzima de restricción corte el ADN
4
Pasados los 5 minutos, colocamos el
tubo en el enfriador para detener la
reacción de digestión
13
B
Separamos los fragmentos de ADN cortados
Introducción
Para separar los fragmentos de ADN utilizaremos la llamada electroforesis, una técnica muy
utilizada en el laboratorio que nos permite separar los fragmentos de ADN según su longitud.
Para ello, las muestras de ADN se colocan
sobre un gel poroso fabricado con una gelatina
que se extrae de algas marinas. Para facilitar la
colocación de las muestras y ver cómo se desplazan, se añade un "tampón de carga" que les
da densidad y color. El gel también se carga con
un "marcador de ADN", que contiene fragmentos de ADN de medidas conocidas, para poder
así deducir la longitud de los fragmentos de las
muestras en estudio.
El gel se somete a una corriente eléctrica, de
manera que en un extremo se queda concentrada la carga negativa y en el otro la carga
positiva. Como los fragmentos de ADN de
forma natural tienen carga negativa, cuando los
colocamos en un extremo del gel se desplazan
atraídos por la carga positiva. La distancia que
recorren los fragmentos a través del gel es proporcional a su longitud, de modo que los fragmentos más pequeños podrán avanzar más que
los fragmentos más grandes, que tendrán más
dificultades para atravesar los poros del gel.
14
Procedimiento B
1
2
Colocamos el gel en el centro de la
cubeta de electroforesis y con los
pocillos en el extremo negativo. A
continuación, llenamos la cubeta
con la solución tampón TAE 0,5x,
haciendo que caiga por los laterales
para no romper el gel, hasta cubrirlo
completamente.
Preparamos las muestras de ADN
con tampón de carga: no hará falta
añadir tampón de carga a las muestras
digeridas con la enzima de restricción,
porque el tampón de la enzima que
hemos añadido antes ya llevaba
incorporado un tampón de carga de color
verde. Tomamos, pues, 3 tubos de 0,5 ml
y les añadimos con la pipeta 2 µl del
tampón de carga de color verde y 20 µl
de la muestra original sin digerir. Estas
muestras nos servirán de control.
3
4
Tapamos la cubeta y la conectamos
a la fuente eléctrica a 130 V y 200 mA
durante aproximadamente 20 minutos.
Cargamos las muestras en los pocillos con
la pipeta, en este orden:
• el primer pozo para el marcador de ADN (25 µl)
• los tres siguientes para las muestras de ADN
de las variantes no digeridas (20 µl)
• y los cuatro siguientes para las muestras
digeridas (primero el ADN del candidato y a
continuación las muestras de las 3 variantes
de VIH) (25 µl)
15
Mientras el gel corre, practica: mapa de restricción
1. Identifica la/las secuencia/s diana de la enzima de restricción Nhel dentro de la secuencia
completa del ADN de la proteína candidata
Secuencia completa del ADN candidato a vacuna:
1 ...
300
310
320
A
T
G
G
G
A
T
C
G
A G
C
T
A
T
A G
C
T
A
T
A G
G
G
G
T
A
C
C
C
T
A
G
C
T
G
A
T
A
T
G
A
T
A
T
C
C
C
C
330
C
C
340
350
T
C
G
T
C
G
C
C
C
A
T
C
G
T
C
A C
T
G
T
A C
T
G
A
A
T
A
T
G
A
G
C
A
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C
G
G
G
T
A
G
C
A
G
T
A
C
A
T
A
C
T
T
A
T
A
C
G
360
G
370
380
C
T
G
T
A G
C
T
A G
G
C
C
T
A
T
A
A
A
A
A
A
T
T
C
G
T
T
C
G
G
A
C
A
T
C
G
A
T
C
C
G
G
A
T
A
T
T
T
T
T
T
A
A
G
C
A
A
G
C
390
400
410
A
T
G
C
G
T
A G
C
C
G
A
T
G
A G
C
T
A G
C
G
A
T
C G
G
G
A C
T
A
C
G
C
A
T
C
G
G
C
T
A
C
T
C
G
A
T
C
G
C
T
A
G
C
C
C
T
T
A C
A C
T
A
T
T
A
G
... 1.400 pares de bases
G
G
Secuencia diana de la enzima de restricción:
C
G
A
T
C
G
G
C
T
A
G
C
16
2. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendremos si la enzima encuentra su diana y corta el ADN?
¿De qué medida?
3. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendremos si la enzima NO encuentra su diana y NO corta
el ADN? ¿De qué medida?
4. ¿Cómo crees que el marcador de ADN te ayudará a identificar las medidas de los
fragmentos que obtendrás?
5. Identifica la/las secuencia/s diana de la enzima de restricción EcoRV dentro de la
secuencia completa del ADN de la proteína candidata:
C
T
A
T
A
G
G
A
T
A
T
C
6. ¿Cuántos fragmentos de ADN obtendríamos si hubiéramos utilizado esta otra enzima?
¿De qué medida?
(En el experimento hemos utilizado la enzima Nhel porque la zona donde corta es la que nos interesa
estudiar, dado que es la que es más efectiva a la hora de estimular el sistema inmunitario)
17
Practica: observa cómo está corriendo el gel de electroforesis
7. ¿Por qué se separan los fragmentos? ¿Cómo separa los fragmentos la agarosa?
8. ¿Qué carga tiene el ADN? ¿Qué hubiera pasado si hubieras conectado los electrodos al
revés?
9. ¿Qué visualizas? ¿Por qué has añadido el tampón de carga?
18
C
Visualizamos los fragmentos de ADN
Introducción
En esta etapa teñiremos los fragmentos de ADN
para poderlos visualizar y observar así si han
sido cortados. Solo aquellos que hayan sido
cortados tendrán el gen responsable de sintetizar la proteína candidata de IrsiCaixa con la
secuencia original, es decir, sin mutación.
3.000 pb
1.000
500
100
C
19
Procedimiento C
1
Sacamos el gel de sus apoyos y lo
sumergimos en una solución que lo
teñirá (Stain Fast Blast) en un "contenedor" de tamaño apropiado durante
unos 2 minutos.
2
Transferimos el gel
a un "contenedor"
más grande que
contenga 500 ml de
agua. Con cuidado,
movemos
el gel durante
unos 10 segundos
para "aclararlo".
3
Ahora tenemos
que lavar el gel:
Transferimos el
gel a un tercer
"contenedor"
con 500 ml de
agua limpia y
movemos el gel
con cuidado una
vez cada minuto,
durante un total
de 5 minutos.
4
Hacemos un segundo lavado tal y
como se describe en el apartado
anterior.
5
Las bandas de ADN tienen que aparecer ya en el gel, aunque se verán bastante borrosas. Si esperamos entre 5 y
15 minutos, se verán con más nitidez. *
*Para
conseguir
un mayor
contraste,
es necesario
hacer más
lavados con
agua.
20
Resultados y conclusiones
10. Observa las bandas de ADN que has obtenido con cada muestra de cada variante y dibuja los
resultados a continuación. Indica también la longitud de los segmentos del marcador de ADN.
11. ¿Cuál ha sido el efecto de las enzimas de restricción en cada una de las variantes?
Virus africano
Virus europeo
Virus asiático
21
12. ¿Hay alguna variante del VIH en la que la enzima no haya actuado?
13. Por lo tanto, ¿cuál es la conclusión de tu investigación? (haz referencia a la hipótesis inicial).
22
Sobre Irsicaixa
¿Qué es Irsicaixa?
El Instituto de Investigación del Sida IrsiCaixa
es un instituto de referencia internacional que
tiene como objetivo contribuir a mejorar los
conocimientos, la prevención y los tratamientos
de la infección por el VIH y el sida, con la
finalidad última de erradicar la epidemia.
Impulsado por la Fundación "la Caixa" y el
Departament de Salut de la Generalitat de
Catalunya, IrsiCaixa se constituyó en 1995 como
fundación privada sin ánimo de lucro, y está
situado en el Hospital Universitario Germans
Trias i Pujol de Badalona.
Dirigido por el Dr. Bonaventura Clotet, IrsiCaixa
reúne a más de cincuenta investigadores que se
dedican principalmente a la investigación básica
para comprender los mecanismos de infección
por el VIH y así poder desarrollar nuevas
terapias y vacunas. Al mismo tiempo, IrsiCaixa
participa en estudios clínicos para evaluar las
nuevas estrategias terapéuticas y coopera con
los países en vías de desarrollo en la lucha
contra la pandemia a escala mundial.
La investigación científica del Instituto de
Investigación del Sida IrsiCaixa se desarrolla
en coordinación con los más reputados
centros de investigación internacionales, y las
publicaciones que se derivan se encuentran
entre las que registran los más altos índices de
impacto en este campo.
23
Anexo
Precauciones de seguridad
Infórmate
Localiza los elementos de seguridad del laboratorio o el espacio habilitado para experimentar
(extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee
atentamente las instrucciones antes de hacer
un experimento. No olvides leer las etiquetas de
seguridad de reactivos y aparatos.
Eliminación de residuos
Deposita en contenedores especiales y debidamente señalizados los residuos sólidos y
líquidos que así lo requieran. Si tienes alguna
duda consulta al educador. En ningún caso se
verterán residuos sólidos por el fregadero.
Utiliza vestimenta adecuada
Guantes, bata y gafas de protección.
Recuerda
En caso de accidente, avisa inmediatamente al
educador.
Normas generales
Está prohibido fumar, comer o beber en el
laboratorio o en el espacio habilitado para
experimentar. Trabaja con orden, limpieza y sin
prisas. Si se vierte un producto, recógelo inmediatamente. Deja siempre el material limpio y
en orden. No uses nunca un equipo o aparato
sin conocer perfectamente su funcionamiento.
Lávate las manos antes de abandonar el laboratorio.
Manipulación del vidrio
Protege tus manos cuando manipules material
de cristal y presta atención a su temperatura, ya
que el cristal caliente no se distingue del frío.
No uses cristal agrietado.
Productos químicos
No uses ningún frasco de reactivos al que le falte la etiqueta o que no esté debidamente identificado. No huelas, inhales, pruebes o toques los
productos químicos. No pipetees nunca con la
boca. Ponte guantes y lávate las manos a menudo si usas productos tóxicos o corrosivos. En
caso de contacto con los ojos, lávatelos inmediatamente con agua abundante. No acerques
envases de reactivos a una llama. No calientes
líquidos inflamables. Transporta las botellas
cogidas por el fondo, nunca por la boca.
Precauciones específicas para este
taller
En esta práctica manipularás reactivos químicos, disolventes e instrumentos que presentan
los siguientes grados de peligrosidad:
Tampón TAE: Es nocivo por ingestión y puede
provocar irritación ocular grave. Requiere ser
eliminado como residuo especial.
Gel de agarosa: Requiere ser eliminado como
residuo especial. Como contiene tampón TAE,
hay que seguir las indicaciones antes especificadas.
Solución de tinción del ADN (DNA stain Fast
Blast): Es nociva por ingestión. No hace falta
eliminarla como residuo especial pero sí diluida
con mucha agua.
Electroforesis: Hay que prestar especial atención al riesgo eléctrico.
24
¡Sigue investigando en Xplore Health!
Investigadores que han contribuido con contenidos: Marta Curriu, investigadora de IrsiCaixa.
desarrollado por
Esta obra está bajo una licencia Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0
Unported de Creative Commons. Para ver una copia de esta licencia, visita
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