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EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL EXTRACTO DE ALCALOIDES DE
DENDROBATES TRUNCATUS (ANURA: DENDROBATIDAE) SOBRE
UNIÓN NEUROMUSCULAR DE MAMÍFERO
CATALINA CELIS BORRERO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar al título de:
BIOLOGA
DIRECTOR: GABRIEL PASCUAL AMAYA
ASESOR: FABIO RUÍZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
BOGOTÁ D. C., DICIEMBRE DE 2005
ADVERTENCIA: “La Universidad no se hace responsable
por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos
de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al
dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se
vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
Bogotá D. C. Marzo de 2006
Señores
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Cuidad
Estimados Señores:
Nosotros, Gabriel Pascual A., Fabio Ruiz y Catalina Celis Borrero, identificados
con C.C. No.
,
, y 52 809 666, autores del trabajo de grado
titulado Evaluación del Efecto del Extracto de Alcaloides de Dendrobates
truncatus
(Anura:
Dendrobatidae)
Sobre
Unión
Neuromuscular
de
Mamífero, presentado como requisito para optar al título de Bióloga en el año
2006; autorizamos a la Universidad a:
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para
la consulta en la Biblioteca General______
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web
de la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las cuales
tenga convenio la Universidad Javeriana______
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea
seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado______
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades
educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de información,
para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de documentación de
las respectivas entidades_____
e) Todos los usos que tengan finalidad académica_______
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo
establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión
Andina
351
de
1993,
los
cuales
son
irrenunciables,
imprescriptibles,
inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la
obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a sus autores.
Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que los autores pacten
con la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de
propiedad industrial que puedan surgir de la actividad académica.
______________________
Gabriel Pascual A.
C.C
______________________
Fabio Ruiz
C.C
______________________
Catalina Celis Borrero
C.C
FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO
AUTORES
Celis Borrero Catalina
Pascual A. Gabriel
Ruiz Fabio
DIRECTOR
Pascual A. Gabriel
ASESOR
Ruiz Fabio
TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE:
Bióloga
TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO:
Evaluación del Efecto del Extracto de Alcaloides de Dendrobates truncatus
(Anura: Dendrobatidae) Sobre Unión Neuromuscular de Mamífero.
FACULTAD:
Ciencias
PROGRAMA:
Carrera (pregrado)
NOMBRE DEL PROGRAMA:
Biología
CIUDAD:
Bogotá, D. C. 2006
NÚMERO DE PÁGINAS:
80 pp.
TIPO DE ILUSTRACIONES:
Ilustraciones
Tablas
Gráficos y diagramas
Fotografías
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVES:
Bloqueo
neuromuscular;
Dendrobates
truncatus;
Unión
neuromuscular;
Preparación frénico- diafragma de rata; Alcaloides.
RESUMEN DEL CONTENIDO:
Las ranas venenosas (Dendrobatidae) del neotrópico contienen una alta
variedad de alcaloides lipofílicos, acumulados en las glándulas de la piel a partir
de recursos aparentemente ingeridos en la dieta. La investigación referente a la
naturaleza, origen, efectos específicos en tejidos, moléculas receptoras, perfil
tóxico y potencial terapéutico de los alcaloides hallados en la piel de
Dendrobates truncatus (Cope, 1861) -endémica de Colombia-, a nivel nacional e
internacional, es incipiente. No se conoce si realmente existe un efecto central o
periférico que lo explique, pues no se ha determinado en la unión neuromuscular
de mamífero. Con este estudio se buscó dilucidar el efecto del extracto de
alcaloides de esta rana en la preparación frénico diafragma de rata (Bülbring,
1946),
y evidenciar si es de predominio en la unión neuromuscular o en el
músculo. Para tal fin se llevaron a cabo curvas dosis respuesta, extracciones de
alcaloides, cromatografías y pruebas biológicas (n=12). Se observaron dos
grandes efectos: Excitatorio e inhibitorio, este último efecto se puede entender
con la evidencia actual de la acción de la histrionicotoxina como antagonista no
competitivo de la acetilcolina. El efecto excitatorio se debe posiblemente a la
actividad de una pumiliotoxina, que no ha sido documentada para esta especie.
Se requieren estudios adicionales que permitan determinar las fracciones de
alcaloides halladas en la piel de D. truncatus y la actividad biológica de cada
una.
EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL EXTRACTO DE ALCALOIDES DE
DENDROBATES TRUNCATUS (ANURA: DENDROBATIDAE) SOBRE
UNIÓN NEUROMUSCULAR DE MAMÍFERO
Catalina Celis Borrero
APROBADO
________________________
Gabriel Pascual Amaya
Director
________________________
Isabel Riveros
Jurado
_______________________
Fabio Ruiz
Asesor
_______________________
Noemí Téllez
Jurado
EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL EXTRACTO DE ALCALOIDES DE
DENDROBATES TRUNCATUS (ANURA: DENDROBATIDAE) SOBRE
UNIÓN NEUROMUSCULAR DE MAMÍFERO
Catalina Celis Borrero
APROBADO
________________________
_______________________
Angela Umaña. M. Phil
Cecilia Espíndola
Decana Académica
Director de Carrera
Por el espíritu siempre dispuesto, por otorgarme la confianza, el apoyo
incondicional y la inspiración de este trabajo, hago este reconocimiento con
inmensa gratitud…
A mi madre
A los doctores Gabriel Pascual, Darío Riascos y Henry Aceros
AGRADECIMIENTOS
Al Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Pontificia
Universidad Javeriana; especialmente a los doctores Esperanza Holguín y
Armando Sánchez.
Al Dr. Fabio Ruiz (Departamento de Morfología, Facultad de Medicina, Pontificia
Universidad Javeriana).
Al Dr. Juan Manuel Renjifo (Universidad del Magdalena)
A mi familia
A mis amigos
TABLA DE CONTENIDOS
1. Introducción................................................................................................... 1
2. Marco teórico ................................................................................................. 3
2.1. Compuestos biológicamente activos producidos por anfibios ....................... 3
2.1.1. Familia Dendrobatidae ....................................................................... 5
2.1.2. Componentes químicos de las toxinas (Dendrobatidae) .................... 6
2.1.3. Clasificación de los alcaloides en la familia Dendrobatidae ............... 8
2.2. Dendrobates truncatus (Cope, 1861).......................................................... 17
2.2.1. Componentes químicos de las toxinas (D.truncatus)........................ 18
2.2.2. Estudios previos con D. truncatus (D.truncatus)............................... 23
2.3. Mecanismos de la transmisión sináptica..................................................... 25
2.3.1. Sinápsis química.............................................................................. 25
2.3.2. Transmisión sináptica en la unión neuromuscular............................ 27
2.3.3. Receptores colenérgicos ionotropos ............................................... 29
2.3.4. Músculo esquelético: acople excitación – contracción...................... 30
2.4. Experimentos con órgano aislado............................................................... 31
3. Formulación de problema y justificación................................................... 32
3.1. Formulación del problema .......................................................................... 32
3.2. Preguntas de investigación......................................................................... 33
3.3. Justificación ................................................................................................ 33
4. Objetivos ...................................................................................................... 34
4.1. General....................................................................................................... 34
4.2. Específicos ................................................................................................. 34
5. Hipótesis ...................................................................................................... 34
5.1. Predicciones ............................................................................................... 35
6. Materiales y métodos .................................................................................. 35
6.1 Diseño de la investigación ........................................................................... 35
6.1.1. Población de estudio y muestra ....................................................... 36
6.1.2. Variables.......................................................................................... 36
6.2. Métodos y recolección de la información .................................................... 36
6.2.1. Extracción de alcaloides .................................................................. 37
6.2.2. Detección de alcaloides en el extracto de la piel de D. truncatus ..... 39
6.3. Curva dosis respuesta ................................................................................ 40
6.4. Preparación frénico-diafragma de rata........................................................ 41
6.4.1. Estimulación indirecta ...................................................................... 44
6.4.2. Estimulación directa ......................................................................... 44
6.4.3. Aplicación del extracto y registro de la contracción .......................... 45
6.5. Análisis de la información ........................................................................... 45
7. Resultados ................................................................................................... 46
7.1. Extracción de alcaloides ............................................................................. 46
7.2. Detección de alcaloides en el extracto de la piel de D. truncatus................ 47
7.3. Curva dosis- respuesta............................................................................... 47
7.4. Preparación frénico - diafragma de rata...................................................... 49
7.4.1. Estimulación indirecta ...................................................................... 49
7.4.2. Estimulación directa ......................................................................... 51
7.4.3. Comparación de la contracción con estímulo indirecto y directo ...... 53
7.4.4. Tiempo de latencia y tiempo del efecto máximo observado ............. 56
8. Discusión ..................................................................................................... 58
9. Conclusiones ............................................................................................... 70
10. Recomendaciones ..................................................................................... 72
11. Literatura citada......................................................................................... 73
TABLAS Y FIGURAS
Figura 1: Estructura química de las histrionicotoxinas ...................................... 11
Figura 2: Estructura química de las pumiliotoxinas. .......................................... 13
Figura 3: Estructura química de las batracotoxinas........................................... 14
Figura 4: Estructura química de las epibatidinas............................................... 15
Figura 5: Dendrobates truncatus (Cope, 1861). ................................................ 17
Figura 6: Estructura química de las decahidroquinolinas. ................................. 21
Figura 7: Estructura química de las 5,6,8- Indolizidinas trisustituídas. .............. 21
Figura 8: Estructura química de las 5, 8 -Indolizidinas disustituídas. ................ 22
Figura 9: Estructura química de las 3, 5- Pirrolizidinas disustituídas................. 23
Figura 10: Unión neuromuscular....................................................................... 26
Figura 11: Extracción de alcaloides (Fase acuosa)........................................... 38
Figura 12: Extracción de alcaloides (Cloroformo). ............................................ 38
Figura 13: Extracción de alcaloides (Residuo final). ......................................... 39
Figura 14: Preparación frénico- diafragma de rata (Bloque In situ) . ................. 41
Figura 15: Preparación frénico- diafragma de rata (Hemidiafragma y nervio). .. 42
Figura 16: Preparación frénico- diafragma de rata............................................ 42
Figura 17: Preparación frénico- diafragma en soporte de vidrio........................ 43
Figura 18: Cámara de órgano aislado............................................................... 43
Figura 19: Preparación frénico-diafragma de rata (Estimulación indirecta) ....... 44
Figura 20: Preparación frénico diafragma de rata (Estimulación directa). ......... 44
Tabla 1. Proceso de extracción química de alcaloides ...................................... 46
Figura 21: Cromatografías en capa delgada ascendente.................................. 47
Figura 22: Curva dosis- respuesta (Estímulo indirecto)..................................... 48
Figura 23: Curva dosis- respuesta (Estímulo indirecto ).................................... 48
Figura 24: Curva Dosis- Respuesta (Estímulo directo) ..................................... 49
Tabla 2. Contracción muscular inducida con estímulo indirecto ........................ 50
Figura 25: Efecto sobre la contracción del diafragma (estímulo indirecto) ........ 50
Figura 26: Trazado representativo (Preparación con estímulo indirecto). ......... 51
Tabla 3. Contracción muscular inducida con estímulo directo ........................... 52
Figura 27: Efecto sobre la contracción del diafragma (estímulo directo) ........... 52
Figura 28: Trazado representativo (Preparación con estímulo directo). ............ 53
Figura 29: Efecto sobre la contracción del diafragma (Estímulo indirecto
y
directo).................................................................................................................54
Figura 30: Trazado representativo del efecto de 2 μg/ml de extracto de
alcaloides sobre la amplitud de contracción del diafragma inducida por estímulo
indirecto y directo. ............................................................................................. 55
Figura 31: Trazado representativo del efecto de 20 μg/ml de extracto de
alcaloides sobre la amplitud de contracción del diafragma inducida por estímulo
indirecto y directo. ............................................................................................. 55
Tabla 4. Tiempo de latencia y tiempo del efecto máximo observado en la
contracción del diafragma generada por estímulo indirecto y directo................. 56
Tabla 5. Información de los especimenes de D. truncatus colectados para la
extracción de alcaloides. ................................................................................... 79
1. Introducción
Los venenos animales y vegetales son y seguirán siendo una fuente de
sustancias de aplicación terapéutica en humanos; esto se observa en algunos
miembros de la familia de anuros venenosos Dendrobatidae, los cuales secretan
a través de la piel alcaloides tóxicos. Dicha toxicidad particular ha permitido que
estos componentes aislados en los extractos de piel, se destaquen en la
actualidad como sustancias importantes para el tratamiento del dolor en
enfermedades como el cáncer, entre otras, y cuyo poder es comparable al de la
morfina, con propiedades analgésicas mucho más intensas y al parecer no
adictivas.
Un ejemplo claro es la Epibatidina, alcaloide encontrado en los exudados de piel
de la rana ecuatoriana Epipedobates tricolor (Boulenger, 1899), el cual posee
propiedades analgésicas, se estima que es aproximadamente de 200 a 400
veces más potente que la morfina.
Ahora bien, al igual que Epipedobates tricolor, Dendrobates truncatus (Cope,
1861) es una especie de la clase Anfibia (orden Anura o Salientia), perteneciente
a la familia Dendrobatidae. Es endémica en Colombia y se encuentra
ampliamente distribuida por el territorio nacional. Dentro de sus características
más conspicuas, se observa un patrón de coloración aposemático relativo al
grado de toxicidad que presenta.
Se conocen informes sobre los componentes y estructuras químicas de las
toxinas de esta especie, determinando la presencia de las clases de alcaloides
histrionicotoxinas, indolizidinas, pirrolizidinas y decahidroquinolinas; estos
estudios fueron realizados hace aproximadamente treinta años y no se han
retomado desde entonces.
Además, el estudio específico de la actividad
biológica de los extractos de piel de Dendrobates truncatus no se realizó ni se
ha realizado. Por lo tanto, se desconoce de manera precisa el efecto de estos
extractos sobre la fisiología de la unión neuromuscular en mamíferos y no hay
información suficiente para asegurar un efecto neurotóxico periférico, que
simplemente se podría presumir.
Los resultados de un estudio realizado en Colombia (Zambrano, 2000) con
extracto de piel de D. truncatus en ratones, sugirieron un posible efecto
neurotóxico
cuyas
manifestaciones
fueron
clasificadas
en
motoras
y
neurovegetativas. Sin embargo, el estudio con animal total no permite especificar
el sitio de acción para explicar los efectos observados, ya que las acciones
neurohumorales moduladoras constituyen variables de confusión.
Por lo tanto, la investigación referente a la naturaleza, origen, efectos específicos
en tejidos, moléculas blanco, perfil tóxico y potencial terapéutico de los
alcaloides hallados en la piel de D. truncatus, a nivel nacional e internacional, es
incipiente. La actividad biológica del extracto de piel de D. truncatus no se ha
determinado de manera precisa y completa.
Frente a tales antecedentes, el presente trabajo aborda el estudio de la actividad
biológica de los extractos de piel de D. truncatus en un sistema in vitro de
preparación muscular de mamífero (frénico-diafragma de rata), con el fin de
confirmar o descartar un posible efecto neurotóxico periférico con claridad. Este
estudio permite evidenciar un efecto inhibitorio o excitatorio en la unión
neuromuscular, lo cual es una primera aproximación al mecanismo y sitio de
acción del extracto de alcaloides de D. truncatus (efecto en la unión
neuromuscular o en la fibra muscular).
El presente estudio aporta información actual valiosa referente a la actividad
biológica en el sistema neuromuscular del extracto de alcaloides de la piel de D.
truncatus, permite correlacionar los hallazgos encontrados con el perfil químico
descrito hace treinta años, comparar las respuestas con las informadas en la
literatura para los alcaloides aislados de otras especies de dendrobátidos, y,
finalmente, sin duda, aporta conocimiento importante y reciente sobre D.
truncatus, una especie endémica de Colombia de la cual existe un gran vacío de
información tanto a nivel nacional como internacional.
2. Marco teórico
2.1. Compuestos biológicamente activos producidos por anfibios
El uso de venenos como mecanismo de defensa es común en la naturaleza. Se
encuentran ampliamente documentados en el caso de las plantas ante la
herbivoría (consumo de plantas por parte de animales). No obstante, dentro del
reino animal y aunque menos conocidos, también se destacan muchas
sustancias involucradas con la protección (Daly, 1995).
Entre los vertebrados, los anfibios sobresalen por la producción de sustancias
tóxicas en glándulas granulares de la piel. Dichas glándulas se encuentran
embebidas en el stratum spongiosum y se observan delineadas en secciones
por una capa de melanóforos que rodean las glándulas a nivel lateral y
superficial. Se abren al exterior por un ducto para excretar una amplia variedad
de compuestos farmacológicamente activos (Neuwirth et al, 1979).
Una diversa cantidad de componentes biológicamente activos ha sido
descubierta y aislada de la piel de los anfibios. Más de 800 alcaloides han sido
aislados de la piel de estos animales, y la mayoría han sido asignados a 24
clases estructurales diferentes. Dichos alcaloides incluyen: samandarinas
esteroideas
gefirotoxinas
aisladas
y
(Dendrobatidae),
de
salamandras,
epibatidina
de
pumiliotoxinas,
decahidroquinolinas de
ciertos
las
batracotoxinas,
ranas
venenosas
alopumiliotoxinas,
géneros de
histrionicotoxinas,
del
neotrópico
homopumiliotoxinas
anuros
de
y
cuatro familias
(Dendrobatidae, Mantellidae, Bufonidae y Myobatrachidae), una variedad de
izidinas (pirrolizidinas, indolizidinas, quinolizidinas, lehmizidinas), pirrolidinas,
piperidinas, varios tricíclicos (relacionado en estructura con las coccinelinas),
espiropirrolizidinas en tres de las anteriores familias (Dendrobatidae, Mantellidae
y Bufonidae ), seudofrinaminas de un género de rana australiana, y una variedad
de alcaloides sin clasificar
con estructura indefinida hasta ahora Daly et al,
2005).
Con excepción de las samandarinas y las seudofrinaminas, todos los alcaloides
parecen estar derivados de la dieta, pues ya han sido detectados algunos
artrópodos
como
supuestas
fuentes
de
ciertas
clases
de
alcaloides:
batracotoxinas y tricíclicos de tipo coccinelinas (escarabajos), pumiliotoxinas
(hormigas y ácaros), las decahidroquinolinas, izidinas y piperidinas (hormigas), y
las espiropirrolizidinas (milípedos). Las hormigas parecen ser el recurso para las
histrionicotoxinas, lehmizidinas y gefirotoxinas tricíclicas (Daly et al 2005).
No obstante, los alcaloides producidos por anfibios con mayor diversidad son
encontrados en el orden Anura (ranas y sapos) (Saporito et al, 2004).
Presumiblemente, cumplen una función de defensa química pasiva ante la
depredación y/ o los microorganismos, anteriormente se pensaba que estos
alcaloides eran producto del metabolismo de los anuros (Saporito et al, 2004).
Se sabe que los anuros poseen compuestos biológicamente activos, incluyendo
aminas biógenas (serotonina, histamina, tiramina y derivados), proteínas,
péptidos vasoactivos (bradiquinina, sauvagina, fisalemina, bombesina) de los
cuales se ha descrito también actividad antimicrobiana; bufadienolinas,
tetrodotoxinas, y alcaloides lipofílicos; los últimos han sido detectadas en los
extractos de piel de cuatro géneros de la familia Dendrobatidae (Daly et al,
1987), en el género Melanophryniscus de la familia Bufonidae en el sureste de
América del Sur, en el género Mantella de la familia Mantellidae, localizada en
Madagascar y en el género Pseudophryne de la familia Myobatrachidae de
Australia (Daly et al, 1999).
Las epibatidinas representan una importante clase sin ninguna fuente supuesta a
partir de la dieta.
Las estructuras de varios de estos alcaloides, han sido rigurosamente
establecidas, mientras que las estructuras de otros representan propósitos
tentativos, basados únicamente en espectro de masas y FTIR (por las siglas en
inglés Fourier Transform InfraRed) espectro de datos, a través de analogías con
las estructuras de otros alcaloides bien definidos (Daly et al, 2005).
La evidencia actual indica que las ranas venenosas, básicamente poseen un
sistema eficiente que acumula alcaloides de la dieta (artrópodos que contienen
alcaloides).
Los
dendrobátidos
(géneros
Dendrobates,
Epipedobates,
y
Phyllobates) y mantélidos (género Mantella) mantenidos en cautiverio, no
poseen alcaloides detectables, aparentemente poseen la habilidad de acumular
selectivamente los alcaloides a través de la dieta, al igual que los bufónidos
(género
Melanophryniscus).
Myobatraquidos
(género
Pseudophryne)
de
Australia aparentemente secuestran las toxinas del recurso dietario (Saporito et
al, 2004)
2.1.1. Familia Dendrobatidae
En Colombia existen cinco géneros de los nueve conocidos a nivel mundial para
la familia Dendrobatidae, exclusiva de Sur y Centroamérica. Los dendrobátidos
son ranas pequeñas cuya longitud rostro-cloacal puede variar desde menos de
un centímetro a cinco centímetros; además, la mayoría de las hembras son de
mayor tamaño que el macho, aspecto asociado con la reproducción, pues
muestran un “amplexus” o abrazo sexual, durante el cual el macho, sobre la
zona dorsal de la hembra hace presión en la parte lateral del abdomen para
llevar a cabo la fecundación externa (Myers & Daly, 1983), de acuerdo con esto,
muchos machos se relacionan con altos niveles de territorialidad e inversión de
tiempo y energía durante el periodo reproductivo.
Se
reconocen
diferentes
patrones
de
coloración
tanto
intra
como
interespecíficos, pues esta familia de hábitos diurnos, incluye tanto especies
aposemáticas
aparentemente
relacionadas
con
niveles
de
toxicidad
(Dendrobates, Phyllobates y algunas Epipedobates) como crípticas (Colostethus)
(Santos, et al 2003).
Los tipos de sustancias biológicas activas encontradas en anfibios parecen tener
un importante significado filogenético. Se reconoce que las ranas venenosas de
la familia Dendrobatidae, corresponden a un grupo monofilético distribuido en la
zona tropical de Sur y centro América (Summers, 2001).
Cabe mencionar que los alcaloides detectados en los extractos de la piel de los
dendrobátidos, son notablemente tóxicos. Los nativos del occidente de Colombia
aun usan las secreciones de la piel de tres especies de dendrobátidos
colombianos (género Phyllobates) para envenenar las puntas de los dardos
utilizados en la cacería (Smith & Jones, 2004).
Por otro lado, y conforme a los hallazgos descritos en diferentes estudios
realizados desde 1970, se postula que los precursores básicos para la síntesis
de los alcaloides de las ranas, se dan en función de la presencia de factores
adquiridos en la dieta; esto ocurre básicamente para todas las especies
venenosas de la familia Dendrobatidae (Myers, 1983).
Así mismo, existe evidencia de la aparición de una especialización en la dieta,
directamente asociada con múltiples orígenes de la coloración llamativa y la
toxicidad (Santos et al, 2003).
Los géneros venenosos poseen sistemas muy eficientes para acumular
selectivamente en la piel una variedad de alcaloides mediante la alimentación,
sin embargo, los individuos en condiciones de cautiverio pierden su toxicidad al
igual que su progenie (Daly et al, 1997).
2.1.2. Componentes químicos de las toxinas (Dendrobatidae)
Los primeros trabajos sobre la farmacología de los alcaloides en dendrobátidos,
han determinado propiedades biológicas que pueden ser clasificadas como
altamente tóxicas y casi inactivas. En la mayoría de los estudios, la presencia de
estos compuestos depende del sitio de captura de las ranas, y una hipótesis
dietaria ha sugerido que los anuros secuestran directamente los compuestos
básicos (Smith & Jones, 2004).
Dentro de los componentes químicos de las toxinas de los dendrobátidos, se
encuentran pirrolidinas, decahidroquinolinas, pirrolizidinas, varias indolizinas,
quinolizidinas
y
gefirotoxinas,
oximas
pirrolozidina,
pseudofrinaminas,
coccinelinas y ciclopentaquinolizidinas. Por ahora se sostienen diferentes
hipótesis respecto al origen de los precursores de las toxinas como se mencionó
anteriormente, destacándose principalmente la idea de ser aportados por la
cadena alimenticia y la adquisición se realice por pequeños artrópodos
herbívoros que finalmente son consumidos por las ranas (Daly et al.1997).
Durante los últimos 20 años, los alcaloides presentes en algunas hormigas han
sido detectados en extractos de la piel de las ranas, y así mismo, compuestos
previamente determinados en ranas, han sido encontrados en hormigas. Por
ejemplo, las pirrolidinas y piperidinas, así como las inolizidinas y pirrolizidinas,
descritas anteriormente para hormigas, fueron detectados también en los
extractos de la piel de las ranas; y viceversa, decahidroquinolinas, previamente
descritas en ranas fueron detectadas en un grupo de pequeñas hormigas
[Solenopsis (Diplorhoptrum) spp.]
Más específicamente, una mezcla de decahidroquinolinas y una quinolizidina fue
encontrada tanto en la rana como en la hormiga, al igual que varios
estereoisómeros posibles, este compuesto al menos posee la misma
estereoquímica en los dos animales (Saporito et al, 2004).
Los género
Brachymyrmex y Paratrechina son pequeñas hormigas de la
subfamilia Formicinae una subfamilia que no se reconocía como productora de
alcaloides, sin embargo, en algunos estudios se determinó una producción
irregular de pumiliotoxinas aparentemente regida por distintos periodos de
tiempo. Esto sugiere que las hormigas tal vez no sean la principal fuente de
pumiliotoxinas. Es posible que estos alcaloides sean producidos por simbiontes
microbianos, algunos de los cuales se encuentran ampliamente en las hormigas.
Por ejemplo hormigas pseudomyrmicines del género Tetraponera produce
inconsistentemente alcaloides tricíclicos: ‘ ‘tetraponerinas’’, y puede ser que una
bacteria fijadora de nitrógeno encontrada en una bolsa especializada del
intestino de éstas hormigas acumule los compuestos. Por otro lado, el flujo
interespecífico de alcaloides provenientes de diferentes plantas a través de
áfidos y escarabajos, ha sido demostrada, y las pumiliotoxinas pueden
simplemente tener un origen dietético Brachymyrmex y una tendencia con áfidos
de Paratrechina (Saporito et al, 2004).
En contraste con el acetato derivado de los alcaloides de hormigas mirmícinas,
las estructuras de carbón ramificado ‘‘isoprenoide’’ de las pumiliotoxinas pueden
favorecer esta alternativa (Saporito et al, 2004).
2.1.3. Clasificación de los alcaloides en la familia Dendrobatidae
De acuerdo con lo anterior, ésta amplia gama de toxinas y su origen, generó un
amplio interés en la investigación. Se han clasificado los alcaloides encontrados
en los extractos de piel de los dendrobátidos como clases mayores y menores
según la cantidad encontrada, clasificación que a continuación se expone (Daly,
et al. 1987):
CLASES MAYORES: Contienen gran número de alcaloides y/o algunos
miembros aparecen como alcaloides principales en las secreciones de varias
especies de ranas (Daly, et al. 1987).
Batracotoxinas (BTX)
Histrionicotoxinas (HTX)
Indolizidinas (I)
Pumiliotoxinas (PTX)
Subclase alopumiliotoxina
Subclase homopumiliotoxina
Decahidroquinolinas (DHX)
CLASES MENORES: Contienen pocos alcaloides, y también aparentemente
tienen una distribución taxonómica limitada, apareciendo principalmente como
trazas de alcaloides en dendrobátidos (Daly, et al. 1987):
Gefirotoxinas (GTX)
2,6- Piperidinas disustituidas (PIP)
Alcaloides pirrolidínicos (PYR)
Alcaloides piridínicos (Epibatidina) (Daly et al, 1993 y 2005)
Alcaloides Indoles
Azatriciclodudecenas
Alcaloides amidínicos (AMI)
Miscelánea de alcaloides basados en piperidina
Miscelánea de alcaloides de ranas no dendrobátidas
Dentro de todos los alcaloides arriba mencionados, se destacan la pumiliotoxina,
histrionicotoxina, batracotoxina y epibatidina, pues ya han sido investigados
farmacologicamente (Daly et al, 1997).
Histrionicotoxinas
Este alcaloide fue aislado inicialmente por Daly y colaboradores en 1971 de los
extractos de la piel de Dendrobates histrionicus, una rana con coloración brillante
extremadamente variable del bosque lluvioso del sur occidente del Amazonas en
Colombia (Rapier et al, 1987). Las histrionicotoxinas han sido detectadas
únicamente en dendrobátidos del neotrópico, a excepción de un mantélido (Daly
et al, 2005)
Las histrionicotoxinas poseen un anillo espiro anular con cadenas laterales
insaturadas de 4 y 5 carbonos, tanto en la posición 7 como en la 2. La naturaleza
y longitud de los lados de las cadenas distinguen a los diferentes miembros de la
familia de las histrionicotoxinas (Smith et al, 2002).
La estructura y configuración absoluta de la histrionicotoxina (283A) e
isodihidrohistrionicotoxina (285A) fueron determinadas en 1971. Actualmente, 16
histrionicotoxinas han sido detectadas. El espectro de masa de estos alcaloides
usualmente está caracterizado por un clivaje-R del lado R1 de la cadena. La
octahidrohistrionicotoxina (291A) es una excepción, el espectro de masa
muestra una pérdida del grupo propenil (C3H5) (Daly et al, 2005).
Las hormigas mirmícinas pueden ser la fuente de las histrionicotoxinas como
recurso captado en la dieta. Las histrionicotoxinas pueden aparecer en la piel de
los dendrobátidos en niveles sobre 200 µg/ rana (Daly et al, 2005).
Estos alcaloides poseen una relativa baja toxicidad; incluso 1000 µg en un ratón
no son letales, sin embargo, pueden ser nocivos para un predador, debido a su
sabor amargo y al bloqueo de los canales ionotrópicos ( Burgermeister, 1977).
Las
histrionicotoxinas,
como
sus
análogos,
dihidroisohistrionicotoxina
y
decahidroisoistrionicotoxina, actúan como bloqueadores reversibles de la unión
neuromuscular y también han demostrado bloquear no competitivamente la
despolarización producida por carbamilcolina en electroplax aislado de
Electrophorus electricus ( Burgermeister, 1977).
Adicionalmente, ésta toxina reduce la descarga espontánea inducida por
aplicación local de acetilcolina en corteza cerebral y espina cordal de gato
(Rapier, 1986).
Las histrionicotoxinas son potentes bloqueadores no competitivos de los canales
nicotínicos musculares, ganglionares y centrales (Smith et al, 2002).
A nivel de músculo esquelético, la acción en los colinoceptores nicotínicos
bloquea sus efectos despolarizantes (Daly et al, 1993), gracias a esto, ha sido
posible modificar los compuestos para su empleo como radiomarcadores en el
estudio de interacciones de algunos compuestos con los colinoceptores
nicotínicos en la placa neuromuscular (Daly et al, 1997).
Farmacológicamente, las histrionicotoxinas afectan al menos tres clases de
canales en el nervio y el músculo (Daly et al, 1993).
La primera clase de canales son los canales receptores reguladores, en
particular,
el
canal
receptor
nicotínico
de
acetilcolina,
donde
las
histrionicotoxinas, en tiempo estimulo- dependiente, bloquean la conductancia y
aceleran la inactivación del canal (Daly et al, 1993). Las sustancias generadoras
de este tipo de efectos se conocen como bloqueadores no competitivos, y de
hecho, las histrionicotoxinas, como ya se ha mencionado, representan este tipo
de efecto de bloqueador no competitivo para complejos de canales-receptores
nicotínicos (Daly et al, 1993).
La segunda clase de canales son los canales de sodio voltaje dependientes, en
los cuales las histrionicotoxinas reducen las conductancias de forma similar a
anestésicos locales (Daly, 1993).
La tercera clase de canales son los de potasio voltaje dependientes, en los
cuales la histrionicotoxina reduce las conductancias en tiempo y estímulo
dependiente (Daly, 1993).
Aparentemente, solo existe un sitio de alta afinidad de unión por cada molécula
de receptor nicotínico de acetilcolina, y varios sitios de unión de baja afinidad,
que son insensibles a la histrionicotoxina. Los sitios de unión de alta afinidad se
unen con todos los antagonistas no competitivos, y pueden estar más
relacionados directamente con el canal iónico. Este es el sitio de acción de la
acetilcolina. Se ha postulado que los sitios de unión de baja afinidad se
encuentran más distantes del canal, posiblemente en la interfase de proteína
lípido (Hucho, 1986).
Estos alcaloides han sido ampliamente usados en investigaciones como
bloqueadores no competitivos del receptor del canal ionotrópico (Daly et al,
2005).
Las propiedades farmacológicas de estos alcaloides, han sido estudiadas con
aproximaciones
electrofisiológicas
y
bioquímicas
en
preparaciones
neuromusculares de mamíferos y anfibios (Smith et al, 2002).
Figura 1: Estructura química de las histrionicotoxinas, clase de alcaloide aislado de la
piel de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
Pumiliotoxinas
Posiblemente la clase de alcaloides más extendida entre los sapos y ranas son
las 180 pumiliotoxinas encontrados en virtualmente todos los anfibios que
poseen algún tipo de compuesto defensivo en la piel (Smith & Jones, 2004).
Las pumiliotoxinas se encuentran ampliamente distribuidas en anuros con
presencia
de
Epipedobates,
alcaloides
Minyobates,
Melanophryniscus),
del
neotrópico
Phyllobates)
Madagascar
(Dendrobatidae:
en
Sur
(Mantellidae:
Dendrobates,
América
Mantella),
(Bufonidae:
y
Australia
(Myobatrachidae: Pseudophryne) (Daly et al, 2005).
Dos pumiliotoxinas fueron reportadas en 1967 como alcaloides mayores de una
población de dendrobátidos en Panamá: Dendrobates pumilio, de allí se deriva el
nombre de esta clase.
La principal razón para el estudio de las pumiliotoxinas es su marcada
bioactividad. Estos compuestos son potentes agentes miotónicos y cardiotónicos
con efectos modulatorios en los canales de sodio. La pumiliotoxina B (323A),
aislada de la rana neotropical Dendrobates pumilio posee marcada actividad
miotónica y cardiotónica, la Pumiliotoxina B (323A) libera iones de calcio
almacenados, y por lo tanto, potencia la contracción muscular. La pumiliotoxina
A (307A) es mucho menos potente como agente inotrópico positivo.
Curiosamente la pumiliotoxina 251D actúa como depresor cardiaco (Smith &
Jones, 2004).
Aun no se conoce claramente la fuente natural de las pumiliotoxinas, lo cual es
significativo, al considerar su alta frecuencia de aparición en las ranas
venenosas y su actividad fisiológica. (Smith & Jones, 2004).
Aparentemente
las
pumiliotoxinas
A
y
B
(alopumiliotoxinas
y
homopumiliotoxinas) poseen un sistema anular bicíclico con cadenas laterales
(Daly et al, 1997).
Figura 2: Estructura química de las pumiliotoxinas, clase de alcaloide aislado de la piel
de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
Batracotoxinas
Las tres clases de alcaloides son batracotoxinas, homobatracotoxinas y
batracotoxinina-A (Daly et al, 1980).
Durante los últimos años, un número de congéneres de las batracotoxinas han
sido detectados en los extractos de la piel y plumas de dos géneros de aves de
la familia Passeridae (Pitohui, Ifrita) (Dumbacher et al, 2000 & 2004). Dichos
congéneres fueron inicialmente; un acetato, crotonatos y un 4-hidroxipentanoato.
Más recientemente, batracotoxinas, homobatracotoxinas y batracotoxininas-A y
congéneres, incluyendo crotonatos, fueron también hallados en escarabajos
(Melyridae, Choresine) (Dumbacher et al, 2004)
Los escarabajos representan la fuente principal de las batracotoxinas obtenidas
en la dieta de las ranas (Dendrobatidae) y las aves (Passeridae). Las ranas
venenosas mantenidas en cautiverio bajo una dieta libre de alcaloides, no
presentan batracotoxinas o algún otro tipo de alcaloide en la piel. Las ranas
venenosas poseen canales de sodio resistentes a la batracotoxina, lo que les
permite consumir escarabajos que contienen batracotoxinas, sin ningún efecto
perjudicial. Para el caso de las aves con batracotoxinas, los canales de sodio
aun no han sido estudiados, y tampoco se han mantenido aves bajo condiciones
de cautiverio con una dieta libre de alcaloides (Daly et al, 2005).
Únicamente tres especies colombianas de las cinco halladas en el neotrópico del
género Phyllobates tienen altos niveles de batracotoxinas, y las tres han sido
usadas para envenenar dardos para la cacería. Las dos especies de América
Central muestran bajos niveles, y para algunas poblaciones de Phyllobates
lugubris no ha sido detectado ningún nivel de batracotoxina.
La rana más tóxica colombiana (P. terribilis) (Myers et al, 1978) tiene cerca de
1000µg de batracotoxinas por piel de rana, mientras que las otras dos ranas
venenosas P. bicolor y P.aurotaenia, contienen de 100 a 200 µg por piel de rana.
Los dos dialquilpirrol carboxilatos, llamados batracotoxina y homobatracotoxina,
cuya presencia es rápidamente detectada por la reacción de Ehrlich, son cerca
de 250 veces más tóxica que el alcohol batracotoxinina -A. La toxicidad se debe
a la despolarización de la membrana muscular y nerviosa por estabilización
selectiva de los canales de sodio en forma abierta y activa por las
batracotoxinas. (Daly et al, 2005)
Su estructura es cíclica esteroidea y algunas de estas poseen un componente
carboxilo pirrólico. Se clasifican dentro de los venenos más tóxicos no proteicos.
Su acción es sobre el sistema nervioso central y son activadores selectivos de
alta afinidad de canales de Sodio. Aumenta la permeabilidad del canal de Sodio
induciendo una despolarización persistente (Goodman & Gilman, 10 Ed 2001).
Se han logrado desarrollar marcadores característicos para cada canal, los
cuales son muy empleados en la búsqueda y caracterización de canales de
Sodio (Daly et al, 1997).
Figura 3: Estructura química de las batracotoxinas, clase de alcaloide aislado de la piel
de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
Epibatidina
Presenta formas exo y endo con actividad intrínseca selectiva de receptores
nicotínicos
neuronales tanto en el sistema nervioso central como periférico
(Elguero et al. 1996, Goodman & Gilman 10 Ed 2001). Dicha acción,
posiblemente es la base de la comprobada potente actividad analgésica,
facilitando de este modo, el estudio de los receptores nicotínicos y su función
(Daly et al. 1997)
Figura 4: Estructura química de las epibatidinas, clase de alcaloide aislado de la piel de
la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
La epibatidina se puede considerar como el primer ejemplo descrito de un
compuesto que al mismo tiempo que actúa sobre los receptores nicotínicos,
muestra también una potente actividad analgésica en modelos animales (Elguero
et al, 1996).
Este hallazgo tuvo sus inicios en investigaciones con Epipedobates tricolor,
dendrobátido del suroeste del Ecuador, pues se determinó que en la piel de
estas ranas, existe una amplia gama de componentes biológicamente activos,
entre los cuales sobresalen los alcaloides (Badio et al, 1994). Dichas
investigaciones concluyeron con el descubrimiento de un potente alcaloide
analgésico, la epibatidina, antiguamente llamado alcaloide 208/210, cuya
determinación de la estructura y definición propone una potente actividad
agonista de los receptores ionotrópicos neuronales (Badio et al, 1994).
En 1974, durante un viaje al Ecuador, Daly y colaboradores colectaron algunos
ejemplares de estas ranas. Se observó que extractos de la piel contienen cierta
cantidad de alcaloides que después de una inyección subcutánea generaban la
reacción de Straub en ratones. Se sabe que esta reacción es característica de la
respuesta a sustancias opioides, por lo que se esperaba que el extracto de la
piel contuviera un opioide nuevo y muy potente (Badio et al, 1994).
En 1976 se llevó a cabo otro viaje para recolectar individuos de las tierras altas
ecuatorianas. Fue posible realizar un extracto de 750 pieles, obteniendo 21 mg
de pumiliotoxina como alcaloide mayoritario y 208/210 en una proporción 20
veces menor, pero que inducían los efectos característicos de opioides en la
prueba de Straub. También se demostró una actividad analgésica que no era
bloqueada por un antagonista de los receptores de opiáceos como la naloxona
(Badio et al, 1994). Sin embargo, al igual que otras especies de dendrobátidos,
en la piel de las ranas en cautiverio no se detecta el alcaloide analgésico.
Una cromatografía en columna, permitió la caracterización del alcaloide (Badio et
al, 1994). La estructura fue establecida en 1992, como exo-2-(6-cloro-3-piridil)-7azabiciclo
(2.2.1)
heptano,
como
consecuencia
del
desarrollo
de
la
instrumentación analítica y de la sensibilidad de Resonancia Magnética Nuclear
de protón (Elguero et al, 1996). La preparación de la epibatidina ha sido llevada
a cabo por al menos catorce grupos de trabajo (Elguero et al, 1996).
Se sabía que el efecto de la epibatidina no era bloqueado por un antagonista
selectivo de receptores de opiáceos como la naloxona, sin embargo, estudios
posteriores (Badio et al, 1994) demostraron que el efecto analgésico podía ser
bloqueado por mecamilamina (ganglio bloqueador) que bloquea el canal de los
receptores ionotrópicos neuronales en ganglios autónomos y atraviesa la barrera
hematoencefálica. Por el contrario, el hexametonio, aún siendo antagonista de
los receptores ionotrópicos ionotrópicos ganglionares, no atraviesa dicha barrera
y no es capaz de bloquear el efecto analgésico de la epibatidina.
De la misma manera, también se ha demostrado que otros antagonistas ganglio
bloqueadores como la pempidina y clorisondamina, a dosis elevadas, bloquean
los efectos analgésicos de la epibatidina. Dichos antagonistas, actúan mediante
el bloqueo de canales iónicos, por lo que su acción no depende de la capacidad
de competir directamente por el sitio de unión con el receptor (Elguero et al,
1996).
Por otro lado, también se ha demostrado que otros alcaloides, como la
batracotoxina, han contribuido al estudio de canales de Sodio en las áreas de
neurofisiología y neurofarmacología, facilitando la comprensión de la acción de
anestésicos locales (Pennisi, 1992).
En conclusión, todo el proceso llevado a cabo para la epibatidina representa en
la actualidad una nueva línea para el diseño de nuevos analgésicos no opioides
y resalta la importancia de la búsqueda e investigación en Colombia de
organismos que potencialmente puedan aportar información valiosa a partir de
sus propiedades químicas, como D. truncatus, objeto de este estudio.
2.2. Dendrobates truncatus (Cope, 1861)
Figura 5: Dendrobates truncatus (Cope, 1861), especie productora de alcaloides
endémica de Colombia. Melgar (Tolima).
Dentro del género Dendrobates se encuentra D. truncatus, especie anura
miembro del grupo tinctorius (D. auratus, D. azureus, D.galactonotus, D.
tinctorius y D. truncatus) (Silverstone, 1975).
En cuanto a las características morfológicas de la especie, en ejemplares adultos
se ha determinado una longitud rostro- cloacal de 23.5- 31 mm en promedio; la
piel es suavemente granular en el dorso y lisa ventralmente, excepto en la parte
posterior del vientre y en la superficie ventral del muslo, donde es granular. El
tubérculo tarsal está ausente (Silverstone, 1975).
El tímpano es redondo y tiene un diámetro igual a la mitad del diámetro ocular. El
disco del segundo, tercero y cuarto dedo de las patas anteriores, en promedio es
más ancho los machos que en las hembras (Silvesrtone, 1975).
En vivo, el color del dorso es negro con líneas amarillas completas
dorsolaterales e incompletas lateralmente, mientras que el vientre y los flancos
son negros con retículo grueso azul pálido (Silverstone, 1975).
En cuanto al habitad y distribución, D. truncatus es endémica de Colombia, con
distribución registrada en regiones que van de 10 a 1100m de altura, desde
Chaparral en el departamento del Tolima hasta la costa Caribe y en tierras bajas
al norte de las Cordilleras Central y Occidental al oeste del golfo de Urabá.
Habita en el bosque húmedo y algunas zonas de bosque seco tropical
(Zambrano, 2000).
La dieta se compone principalmente por pequeños invertebrados de los suelos o
de la hojarasca; siendo las hormigas las más abundantes. Sin embargo, y
conforme a los hallazgos obtenidos en estudios de contenido estomacal, se han
determinado tres órdenes de Hexapoda: Hymenoptera, Coleoptera y Colembolla
(Zambrano, 2000).
2.2.1. Componentes químicos de las toxinas (D.truncatus)
La clasificación única y preliminar establecida para los alcaloides hallados en la
piel de D. truncatus, se realizó a partir de ejemplares colectados en Enero de
1970 en el municipio de Mariquita (Tolima). Con base en estos, se determinó el
perfil de alcaloides para la especie, sin embargo, no se realizó ni se ha realizado
un estudio farmacológico que permita reconocer la actividad biológica de estas
sustancias; tampoco se ha continuado una investigación referente al estudio de
las toxinas desde aquel entonces que permita monitorear un posible cambio en
los niveles de toxicidad y determinar posibles sustancias nuevas producidas en
la piel de D. truncatus.
El único informe de alcaloides para ésta especie, se
encuentra en las
publicaciones de Daly (1978 y 1987) y se puede resumir en el siguiente
esquema:
ALCALOIDES DE CLASES MAYORES
Histrionicotoxinas:
HTX 259
HTX 283A
Alodihidrohistrionicotoxina 285C
Decahidroquinolinas:
DHQ 219 A
ALCALOIDES DE CLASES MENORES
Histrionicotoxinas:
(HTX) 235 A
Neodihidrohistrionicotoxina 285 B
Octahidrohistrionicotoxina 291 A
Decahidroquinolinas:
DHQ 243A
TRAZAS DE ALCALOIDES
Indolizidinas:
5, 8 -Indolizidinas Disustituídas: 223D
5, 6, 8-Indolizidinas Trisustituídas: 223A y 223C
Decahidroquinolinas:
DHQ 269AB
Pirrolizidinas:
3, 5- Pirrolizidinas Disustituídas: 223 B
De acuerdo con el anterior perfil, a continuación se hará una breve descripción
sobre las clases de alcaloides encontradas en D. truncatus diferentes a las
histrionicotoxinas mencionadas en la sección anterior.
Decahidroquinolinas
Esta clase de alcaloides, inicialmente fue asignada con el nombre de
“pumiliotoxina C”, sin embargo, ya no es empleado por una posible confusión
con las pumiliotoxinas verdaderas, teniendo en cuenta la baja toxicidad de las
decahidroquinolinas (Daly et al, 1987).
Actualmente, cerca de 50 alcaloides, incluyendo en algunos casos cuatro
estereoisómeros, son considerados miembros de la clase 2,5-decahidroquinolina
disustituída. La estructura de varios de éstos se encuentra claramente
establecida por RMN análisis espectroscópicos y/o síntesis, mientras que otros
están basados en espectro de masas (Spande et al, 1999).
En algunos casos hay una perdida de C-5 sustituyente por un proceso
concertado, como el que se ha propuesto para 269AB. (Spande et al, 1999).
Las decahidroquinolinas son alcaloides comunes presentes en dendrobátidos del
neotrópico. Pero en mantélidos (Mantella) y bufónidos (Melanophryniscus),
dichos alcaloides son extremadamente raros, con la única excepción de la
decahidroquinolina 195A. Al igual que con la histrionicotoxina el carbono 15-, 17,
y 19- decahidroquinolinas con cadenas laterales altamente insaturadas parecen
estar restringidas al neotrópico (Spande et al, 1999).
Una aparente fuente de este alcaloide a través de la dieta ha sido establecida en
hormigas mirmícinas para decahidroquinolinas. Algunas de las principales
decahidroquinolinas como 195A, 219A, 243A, y 269AB, pueden aparecer en las
pieles de dendrobátidos en niveles de 50µg por rana. Ha habido informes
limitados sobre la toxicidad de las decahidroquinolinas (Daly et al, 2005).
Figura 6: Estructura química de las decahidroquinolinas, clase de alcaloide aislado de la
piel de la familia Dendrobatidae (Daly, 2003).
5,6,8- Indolizidinas Trisustituídas
Actualmente existen 70 alcaloides asignados para ésta clase. La estructura del
primer miembro (223A) se propuso en 1997 (Garraffo et al, 1997), de material
aislado de Dendrobates pumilio. 223A y 231B son relativamente común en los
dendrobátidos Se estima que los niveles pueden estar sobre los 50µg por rana.
La mayoría de los demás alcaloides de esta clase se encuentran como trazas de
alcaloides. Dichos alcaloides también se encuentran en mantélidos (Mantella) y
raramente en bufónidos (Melanophryniscus). Un tipo de 5,6,8- Indolizidinas
Trisustituídas, ha sido detectado en hormigas (resultados sin publicar Daly,
2005) y otra indolizidina en un ácaro oribátido, por lo tanto, las hormigas y los
ácaros representan aparentemente la fuente dietética para esta clase de izidinas
en los anuros. No se ha informado toxicidad o actividad biológica para estos
alcaloides.
Figura 7: Estructura química de 5,6,8- Indolizidinas Trisustituídas clase de alcaloide
aislado de la piel de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
5, 8 -Indolizidinas Disustituídas.
Las estructuras de 5, 8 -Indolizidinas Disustituídas , fueron decritas en 1987
gracias a análisis de espectroscopia de RMN. Actualmente, 5, 8 -Indolizidinas
Disustituídas, con cerca de 80 muestras (incluyendo estereoisómeros),
representan la clase más grande de alcaloides encontrados en la piel de anuros.
Se encuentran comúnmente en dendrobátidos y mantélidos (Mantella). Son
bastante poco comunes en sapos bufónidos (Melanophryniscus). En algunos
extractos, cantidades de 5, 8 -Indolizidinas Disustituídas, pueden alcanzar
niveles de 100µg por rana, sin embargo, en la mayoría de casos, se encuentran
como clases menores de alcaloides. Una fuente alimenticia aun no ha sido
identificada claramente. Pero aparentemente también pueden venir de la dieta
con hormigas y ácaros, al igual que 5,6,8-Indolizidinas Trisustituídas. Datos de
toxicidad para ésta clase no han sidoreconocidos aun. Varios han sido referidos
como
potentes
bloqueadores
no
competitivos
de
los
colinoreceptores
ionotrópicos. 235B ha sido indicado particularmente como un bloqueador
selectivo del receptor nicotínico neuronal alfa4 beta2.
Figura 8: Estructura química de las 5, 8 -Indolizidinas Disustituídas, clase de alcaloide
aislado de la piel de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2005).
3, 5- Pirrolizidinas Disustituídas
La aparcición de 3, 5- Pirrolizidinas Disustituídas, fue reconocida inicialmente en
1993 para un sapo bufónido (Melanophryniscus). Se sabe que dichas
pirrolizidinas se encuentran en hormigas mirmícinas desde 1980. Actualmente
cerca de 26 alcaloides, incluyendo estereoisómeros son asignados a ésta clase.
Estos alcaloides se
encuentrancon frecuencia
en
la
mayoría
de
los
dendrobátidos, mantélidos y bufónidos productores de alcaloides, pero solo
como en menores cantidades. La fuente alimenticia es indiscutiblemente
hormigas mirmícinas. La toxicidad aparentemente aun no ha sido investigada.
Figura 9: Estructura química de las 3, 5- Pirrolizidinas Disustituídas, clase de alcaloide
aislado de la piel de la familia Dendrobatidae. (Daly, 2003).
(El número corresponde al peso molecular nominal. El código con letras
distingue las masas nominales, Daly 1978 y Daly 1987).
2.2.2. Estudios previos con D. truncatus
Además del estudio ya mencionado llevado a cabo por Daly (1970), que señala
los tipos de alcaloides encontrados en D. truncatus, sus estructuras y
composición química (Daly et al, 1978 y 1987), y de un trabajo de grado
realizado en Colombia (Zambrano, 2000) respecto a la relación dieta – toxicidad
de los alcaloides con una aproximación a la actividad biológica de estas
sustancias, no existen estudios
con D. truncatus encaminados a valorar la
actividad biológica de los extractos obtenidos de la piel de esta especie, por lo
que su farmacología específica es desconocida.
Los resultados encontrados en el estudio realizado por Zambrano (2000)
sugieren que los efectos de las toxinas son neurotóxicos, y de acuerdo con los
autores, se pueden clasificar en motores y neurovegetativos. Estos experimentos
se llevaron a cabo en ratones de la cepa ICR (Institute Cancer Research) con
pesos entre 18 y 20g.
Inicialmente se observó que después de la inoculación de los extractos
obtenidos por el protocolo de aislamiento con metanol (Daly & Myers, 1967), la
marcha de los ratones se tornó insegura con disminución de la amplitud y
aumento en la frecuencia de los movimientos de las extremidades. También
observaron una tendencia a disminuir la extensión de los miembros posteriores
con pérdida variable de la coordinación de movimientos entre los segmentos
corporales y parálisis de cintura pélvica y escapular (tren posterior y anterior).
Los efectos autonómicos fueron evidentes por el incremento de la frecuencia
respiratoria,
arritmia
respiratoria
y
grados
variables
de
piloerección,
hipersecreción lacrimal y sialorrea (Zambrano, 2000). Además se evidenció un
incremento en los patrones rítmicos de movimientos de aseo y lamido, pedaleo,
disminución de la actividad exploratoria, falta de previsión de obstáculos para el
movimiento, aparición de banda toraco abdominal, aparentemente asociada con
disminución de tono muscular de la pared abdominal y disminución de los
reflejos (palpebral y fotomotor) (Zambrano, 2000).
Los efectos observados en el estudio con animal total, permiten deducir un
posible efecto neurotóxico, sin embargo, este diseño experimental no es
adecuado para identificar de manera exacta el sitio de acción de las toxinas que
explique los efectos observados, además, no permite dilucidar efectos reflejos ni
directos, por lo tanto, los efectos autonómicos descritos podrían explicarse como
respuestas adaptativas al bloqueo neuromuscular y no necesariamente a un
efecto de la toxina en el sistema nervioso autónomo.
Todo esto justifica la relevancia de realizar un estudio que permita dilucidar de
manera más específica el sitio de acción de las toxinas y concretar con mayor
certeza un efecto neurotóxico en la unión neuromuscular.
2.3. Mecanismos de la transmisión sináptica
La mayor parte del conocimiento sobre la fisiología sináptica de la unión
neuromuscular y la identificación de sus diversos componentes moleculares, ha
sido descrita a partir de experimentos con agentes farmacológicos y toxinas
naturales que permiten una disección funcional del sistema (Boron & Boulpaep,
2003).
2.3.1. Sinapsis química
Este tipo de sinapsis propaga el estímulo en una dirección: desde la célula
presináptica liberando el transmisor a la célula postsináptica que contiene los
receptores que reconocen y permiten la unión del transmisor; sin embargo, de
acuerdo con la naturaleza del proceso de la transmisión sináptica, la célula
postsináptica puede ejercer -en algunos casos-cierta influencia sobre la célula
presináptica en la formación o liberación del transmisor.
Estudios de la regulación y desarrollo de la sinapsis han mostrado que las
células postsinápticas también desempeñan un papel activo en el proceso
sináptico. En el sistema nervioso central, las células postsinápticas pueden
producir también moléculas mediadoras como el óxido nítrico (NO), que se
difunden hacia la terminal presináptica modulando la actividad de la conexión
sináptica.
Además, la membrana presináptica en algunas sinapsis contiene receptores que
pueden inhibir o facilitar la liberación del transmisor por mecanismos propios. Por
lo tanto, la sinapsis puede ser considerada como una vía unidireccional por la
propagación de la señal que puede ser modulada por una comunicación química
bidireccional entre dos células que interactúan (Boron & Boulpaep, 2003).
El proceso de transmisión química se puede resumir en la siguiente serie de
pasos:
Figura 10: Se muestra la secuencia de eventos involucrados en la transmisión química.
A.
Un potencial de acción que involucra canales de sodio y potasio voltajedependiente llega a la terminal nerviosa presináptica.
B. La despolarización de la membrana abre los canales voltaje- dependiente de
calcio, permitiendo la entrada de calcio a la terminal presináptica.
C. El aumento de concentraciones de calcio intracelular conduce
D. Mitocondria.
E. Vesícula de acetilcolina.
F. Fusión de la vesícula de acetilcolina con la membrana presináptica.
G. Las moléculas transmisoras se difunden a través de la hendidura sináptica
uniéndose a los receptores específicos de la membrana de la célula
postsináptica.
H. Canales de sodio.
I.
Canales de potasio.
J.
Despolarización de la región de la triada que activa los canales de calcio.
K. Túbulos T.
L. Receptor de dihidropiridina.
M. Receptor de rianodina.
N. Aparato contráctil.
2.3.2. Transmisión sináptica en la unión neuromuscular
El cuerpo celular de las neuronas motoras se encuentra ubicado en la médula
espinal, astas motoras o ventrales, mientras que los axones se ramifican
extensamente cerca al punto de contacto con el músculo inervado; cada
terminación axónica, inerva, de forma separada una fibra del músculo
esquelético. El ensamblaje completo de una neurona motora y de las fibras
musculares inervadas por las ramificaciones del axón se reconoce como unidad
motora. Generalmente, la terminación axónica tiene un único punto de contacto
sináptico con una fibra muscular esquelética (Boron & Boulpaep, 2003).
Dicha región sináptica especializada es llamada unión neuromuscular. Una
placa terminal individual consiste en un pequeño parche en la ramificación del
proceso amielínico del nervio. Dicha terminal nerviosa, que finalmente hace
contacto con la fibra muscular se reconoce como botón. Las células de
Schwann se encuentran íntimamente asociadas con la terminal nerviosa, y
forman una capa sobre la superficie de la membrana del nervio que se encuentra
localizada lejos de la membrana del músculo. La membrana postsináptica de la
fibra del músculo esquelético que se localiza directamente debajo de la terminal
nerviosa, se caracteriza por presentar extensas invaginaciones conocidas como
pliegues de la membrana postsináptica. Dichas invaginaciones incrementan
significativamente el área del sarcolema en la región postsináptica (Boron &
Boulpaep, 2003).
El espacio intermedio entre la membrana presináptica, y la membrana
postsináptica se reconoce como hendidura sináptica. Dicho espacio es de
aproximadamente 50 nm, está compuesto por proteínas y proteoglicanos que
son parte de la matriz extracelular. Una región particular de la hendiduda
sináptica adyacente a la membrana muscular, llamada lámina sináptica basal
contiene varias proteínas (colágeno, laminina, agrina) que median la adhesión
de la unión neuromuscular y juegan un papel importante en el desarrollo y
regeneración de la sinapsis (Boron & Boulpaep, 2003).
La lámina sináptica basal también contiene una alta concentración de
acetilcolinesterasa (AChE), que finalmente controla la transmisión sináptica por
la rápida hidrólisis de acetilcolina (1ms), liberando colina y acetato (Boron &
Boulpaep, 2003).
Microfotografías en la región del botón sináptico, han demostrado la presencia
de numerosas vesículas sinápticas esféricas, cada una con un diámetro de 50 a
60 nm. El cuerpo celular de las motoneuronas en la médula espinal produce
estas vesículas, que son transportadas rápidamente por los microtúbulos a
través del proceso axónico hasta la terminal nerviosa. Cuando llega un estímulo
hay fusión individual de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática de
la terminal presináptica. Cada vesícula sináptica contiene 6000 a 10000
moléculas de acetilcolina. La concentración de este neurotransmisor en las
vesículas es aproximadamente de 150mM. La acetilcolina es sintetizada en la
terminal
nerviosa
a
partir
de
colina
y
acetil
coenzima
A
por
colinacetiltransferasa. La acetilcolina se mueve en la vesícula sináptica por un
intercambiador específico ACh- H+ estereoisómeros, acoplando el influjo de Ach
con la salida de H+; energéticamente, este proceso está conducido por una
bomba de protones dependiente de ATP ubicada en la membrana vesicular. La
terminal nerviosa también contiene una gran cantidad de mitocondrias que
producen el ATP necesario como fuente energética del metabolismo (Boron &
Boulpaep, 2003).
El proceso de fusión de las vesículas sinápticas y la liberación de ACh ocurre en
diferentes regiones de la membrana presináptica llamada zonas activas. En
microfotografías, dichas zonas aparecen como manchas densas sobre las cuales
las vesículas sinápticas están cercanas a la membrana (Boron & Boulpaep,
2003).
2.3.3. Receptores colenérgicos ionotropos
Los colinoreceptores ionotropos son glucoproproteínas transmembranales de
estructura pentamérica (2α, β, γ, δ), cada subunidad tiene una masa molecular de
aproximadamente 50KDa y dos de éstas son cadenas peptídicas idénticas, sin
embargo, aunque son homólogas, no son equivalentes (Boron & Boulpaep,
2003).
Cada subunidad tiene cuatro regiones hidrofóbicas (M1-M4) que corresponden a
segmentos de la membrana. El sitio de unión para el agonista (acetilcolina) es un
dominio extracelular N- terminal de la subunidad α .Para cada una de las
subunidades, el segmento transmembranal M2 toca el poro acuoso del canal de
la proteína pentamérica. A través de este poro Na+ y K + cruzan la membrana a
favor del gradiente electroquímico (Boron & Boulpaep, 2003).
En un adulto normal, las fibras musculares se encuentran en gran densidad en
los pliegues de unión de la membrana postsináptica, sin embargo, en fibras
musculares en desarrollo, y en fibras desnervadas de músculo esquelético de
adulto, los receptores también están ampliamente distribuidos en la membrana
externa de la región de la placa terminal.
Los receptores de acetilcolina son parte de la superfamilia de canales iónicos
ligando-
dependientes,
la
cual
incluye
glicina,
GABA
(ácido
gamma-
aminobutírico) y serotonina (5 hidroxitriptamina). Los receptores de acetilcolina
se encuentran
distribuidos en el cuerpo, modulando la función del Sistema
Nervioso Central (SNC), Sistema Nervioso Periférico (SNP), incluyendo el
sistema nervioso autónomo, sistema cardiovascular y sistema inmune.
En el sistema nervioso central, éstos receptores, se localizan principalmente en
la región presináptica, regulan la actividad sináptica por la liberación del
neurotransmisor (Dwoskin et al, 2001).
Para el caso de éste receptor (ionotrópico), la apertura de un canal permite el
aumento en permeabilidad a canales de Na+ y K +, que directamente produce
una breve despolarización que activa la fibra muscular.
2.3.4. Músculo esquelético: Acople excitación – contracción
El proceso mediante el cual la excitación permite un aumento de la
concentración de calcio, se reconoce como acople excitación – contracción.
Diferentes tipos de miocitos tienen mecanismos especializados que regulan la
entrada de calcio en el citoplasma, y la salida de calcio una vez ha terminado el
estímulo para la contracción muscular. El calcio puede entrar al citoplasma
desde el espacio extracelular a través de canales iónicos voltaje dependiente o
ligando dependientes, o alternativamente, el calcio puede ser liberado en el
citoplasma desde el retículo sarcoplásmico. Por lo tanto, procesos extracelulares
e intracelulares contribuyen al aumento de la concentración de calcio (Boron &
Boulpaep, 2003).
Las invaginaciones de la membrana plasmática de las células musculares se
reconocen como túbulos T; éstos se asocian con dos cisternas que son
regiones especializadas del retículo sarcoplásmico (organelo que almacena el
calcio en el músculo). La combinación de las membranas del túbulo T y las dos
cisternas cercanas se reconoce como triada, dicha estructura juega un papel
fundamental en el acople excitación- contracción del músculo esquelético y
cardiaco (Boron & Boulpaep, 2003).
En el músculo esquelético, los potenciales de acción se originan a partir de la
despolarización de la placa terminal, y se propagan a través del sarcolema hacia
los túbulos T. La despolarización de la región de la triada activa los canales de
calcio tipo L, que se encuentran agrupados en cuatro (tétradas). Estos canales
voltaje dependientes, son importantes para el acople de la excitación eléctrica a
la contracción porque cumplen una función de sensor de voltaje. Cada uno de
los cuatro canales voltaje- dependiente en una tétrada son proteínas
heteropentaméricas. Cada uno de los cuatro canales de calcio también es
llamado receptor de dihidropiridina. La despolarización de la membrana del
túbulo T genera un cambio conformacional en cada uno de los canales de calcio
tipo L y tiene dos efectos: 1) el cambio conformacional permite la entrada de
calcio por los cuatro poros de los canales y 2) el cambio conformacional en los
cuatro canales de calcio tipo L induce un cambio conformacional en cada una de
las cuatro subunidades de otro canal: el canal liberador de calcio, localizado en
la membrana del retículo sarcoplásmico (Boron & Boulpaep, 2003).
El canal liberador de calcio, tiene una estructura homotetramérica. Este canal
también se reconoce como receptor de rianodina. Estos canales se encuentran
en grupos en la porción de la membrana del retículo sarcoplásmico que se
enfrenta al túbulo T. Cada una de las cuatro subunidades de este canal tiene
una extensión larga llamada “pie”. Cada una de estas prolongaciones, es
complementaria con la proyección citoplásmica de uno de los cuatro canales de
calcio tipo L en una tétrada del túbulo T (Boron & Boulpaep, 2003).
La proximidad física de estas dos proteínas, y la habilidad de los receptores de
dihidropiridina y rianodina para bloquear la contracción muscular, sugiere que la
interacción entre estos dos tipos de canales permite el acople excitacióncontracción (Boron & Boulpaep, 2003).
Los canales de calcio tipo L de la membrana del túbulo T mecánicamente abren
el canal liberador de calcio en el retículo sarcoplásmico, el calcio secuestrado
allí, rápidamente sale por los canales liberadores de calcio. El aumento de la
contracción de calcio resultante activa a la troponina C, iniciando la función de
las proteínas contráctiles. Todo el proceso desde la despolarización de la
membrana del túbulo T hasta la iniciación del ciclo de puentes cruzados se
reconoce como acople excitación- contracción (Boron & Boulpaep, 2003).
2.4. Experimentos con órgano aislado
Las preparaciones de órgano aislado constituyen un refinamiento del estudio
farmacológico que permiten evidenciar la actividad biológica de una sustancia en
un órgano específico sin la intervención de factores neurohumorales reguladores
(que están presentes en un estudio con animal total). La respuesta observada
en un diseño experimental que utiliza éste tipo de preparaciones se puede
atribuir con mayor seguridad a una modificación de la actividad del órgano en
cuestión.
Las preparaciones de órgano permiten medir la actividad biológica real de
alguna sustancia, en contraste con los ensayos químicos, pues no es posible
determinar tal actividad ya que se mide la cantidad de un compuesto específico o
una parte estructural presente en una muestra dada (Riascos et al, 2005)
La preparación frénico diafragma de rata según Bülbring, es una preparación de
órgano aislado estandarizada, útil para valorar el efecto de sustancias en la
unión neuromuscular de mamífero, y por lo tanto permitiría evidenciar un efecto
neurotóxico periférico de sustancias problema (extractos de piel de D. truncatus).
3. Formulación de problema y justificación
3.1. Formulación del problema
La investigación referente a la naturaleza, origen, efectos específicos en tejidos,
moléculas receptoras, perfil tóxico y potencial terapéutico de los alcaloides
hallados en la piel de D. truncatus, a nivel nacional e internacional, es incipiente.
Se conocen informes sobre los componentes químicos de las toxinas de esta
especie, determinando la presencia de trece alcaloides de las clases de las
histrionicotoxinas, decahidroquinolinas, indolizidinas y perrolizidinas; estos
estudios fueron realizados hace aproximadamente treinta años y no se han
retomado
desde
entonces.
Teniendo
en
cuenta
que
estos
alcaloides
aparentemente se sintetizan a partir de precursores en la dieta de los
dendrobátidos y que éste proceso puede modificarse en el tiempo y de acuerdo
con la región de recolección, los estudios químicos permiten presumir un efecto
neurotóxico, pero no son adecuados para demostrarlo, pues ningún estudio
químico puede reemplazar una prueba biológica.
La actividad biológica del extracto de piel de D. truncatus no se ha determinado
de manera precisa y completa. A partir de un estudio realizado en ratones se
puede presumir un posible efecto neurotóxico, sin embargo, el diseño del estudio
no es adecuado para confirmarlo debido a la influencia marcada de la regulación
neurohumoral presente en un animal total. Por lo tanto, aunque se presume una
acción neurotóxica del extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus, no se
conoce si realmente existe un efecto central o periférico que lo explique, pues no
se ha determinado en la unión neuromuscular de mamífero.
3.2. Preguntas de Investigación
¿Existe algún efecto inhibitorio o excitatorio del extracto de alcaloides totales de
la piel de D. truncatus en la preparación frénico diafragma de rata? Si existe tal
efecto, ¿la acción es en la unión neuromuscular o en el músculo?
3.3. Justificación
La investigación del efecto del extracto de piel de D. truncatus en una
preparación aislada de unión neuromuscular de mamífero, es relevante y
necesaria porque permitirá evidenciar un efecto neurotóxico con claridad, sin la
intervención de efectos neurohumurales moduladores presentes en un animal
total que constituyen variables de confusión. El hecho de determinar si existe o
no un efecto tóxico en la preparación neuromuscular es fundamental porque
permitirá confirmar o descartar un mecanismo periférico de toxicidad, y realizará
una primera aproximación al mecanismo y sitio de acción del extracto de
alcaloides de D. truncatus (unión neuromuscular o músculo).
Estos aportes
constituirán el inicio de una línea de investigación que finalmente permita
vislumbrar posibles aplicaciones terapéuticas en un futuro. Además, el desarrollo
de esta investigación aportará datos relevantes acerca del perfil tóxico y la
actividad biológica del extracto de alcaloides de una especie particular como es
D. truncatus -endémica de Colombia- de la que existe un gran vacío de
información como ya se había mencionado.
Además se podría reiterar una vez más el potencial terapéutico que está
implícito en la naturaleza, la enigmática existencia de las diversas especies que
habitan en nuestro país, y por supuesto la gran expectativa que surge respecto
al estudio realizable y de tan grandes dimensiones en cuanto a la elaboración de
posibles repuestas a los problemas que se enfrenta hoy en día la humanidad.
4. Objetivos
4.1. General
Determinar el efecto del extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus en la
preparación frénico diafragma de rata, con el fin de dilucidar un efecto
neurotóxico periférico, y si se presenta, evidenciar si es de predominio en la
unión neuromuscular o en el músculo.
4.2. Específicos
Determinar el efecto del extracto de piel de D. truncatus en la amplitud de la
contracción muscular de la preparación frénico-diafragma de rata, inducida por
estimulación directa.
Evidenciar el efecto del extracto de piel de D. truncatus en la amplitud de la
contracción muscular de la preparación frénico-diafragma de rata, inducida por
estimulación indirecta.
Determinar el tiempo de latencia del efecto neurotóxico en la contracción
muscular de la preparación frénico-diafragma de rata, inducida tanto por estímulo
directo como indirecto.
5. Hipótesis
El extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus modifica la amplitud de la
contracción muscular inducida por estímulo indirecto en la preparación frénicodiafragma de rata.
El extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus modifica la amplitud de la
contracción muscular inducida por estímulo directo en la preparación frénicodiafragma de rata.
La modificación de la amplitud de la contracción muscular inducida por estímulo
directo es diferente a la modificación de la amplitud de la contracción muscular
inducida por estímulo indirecto, cuando la preparación frénico-diafragma de rata
es expuesta al extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus.
5.1. Predicciones
La evidencia mostrada posteriormente a la inyección intraperitoneal de extracto
de piel de D. truncatus en animal total, manifestadas en alteraciones de la
marcha, movimiento de las extremidades, incoordinación, parálisis del tren
posterior y anterior, aunque no permite concluir, sí permite plantear la hipótesis
de un efecto neurotóxico periférico que explique tales hallazgos.
Un efecto en unión neuromuscular de ciertos alcaloides como histrionicotoxinas
aislados de otras especies de dendrobátidos ha sido evidenciado, y aunque la
actividad biológica del extracto de alcaloides de D. truncatus no se ha estudiado,
el hecho de pertenecer a la misma familia dendrobatidae permite plantear la
hipótesis de un posible efecto neurotóxico periférico en unión neuromuscular.
6. Materiales y métodos
6.1 Diseño de la investigación
Estudio experimental in Vitro.
Factor de diseño: Concentración del extracto de alcaloides de piel de D.
truncatus.
Niveles: Concentración 1 (2μg/ml) y Concentración 2 (20 μg/ml) de extracto de
alcaloides totales aislado de la piel de D. truncatus.
Variable respuesta: Amplitud de la contracción muscular y tiempo de latencia.
Unidad de respuesta: Preparación frénico- diafragma de rata in vitro.
6.1.1. Población de estudio y muestra
Extracción del veneno: Piel inmersa en metanol de 16 ejemplares de D.
truncatus adultos con longitud rostro-cloacal (LRC) entre 25- 35 mm. Se
colectaron en Melgar (Tolima) (Anexo Tabla 5).
Unidad de análisis: Preparación frénico-diafragma (Bülbring, 1946) extraída de
ratas Wistar macho con un peso entre 250g -350g.
Se dividieron en dos grupos: Estimulación directa e indirecta con dosis de
extracto, garantizando un número de 6 preparaciones en cada grupo.
6.1.2. Variables
Variable independiente (cuantitativa continua): Concentración del extracto de
alcaloides de piel de D. truncatus, resulta de la relación de la dosis conocida
aplicada y el volumen de la cámara de órgano aislado (constante de 30 ml).
Variable dependiente (cuantitativa continua): Amplitud de la contracción
muscular de la preparación frénico-diafragma inducida por estímulo directo o
indirecto, medida por medio de un transductor de tensión Grass FT 03C
conectado a un polígrafo digital AD instruments PowerLab/800, software Chart 4
para Windows.
Variable dependiente (cuantitativa continua): Tiempo de latencia (tiempo
transcurrido desde el momento de la aplicación del extracto hasta el inicio del
efecto), medido en el registro continuo de tiempo del polígrafo digital AD
instruments PowerLab/800, software Chart 4 para Windows.
6.2. Métodos y Recolección de la información
El comité de ética de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad
Javeriana aprobó el desarrollo de este proyecto.
6.2.1. Extracción de alcaloides
La autoridad ambiental del departamento del Tolima (CORTOLIMA), expidió un
permiso de estudio con fines de investigación científica en diversidad biológica
para caza científica de especimenes de D. truncatus.
Se colectaron 16
ejemplares de D. truncatus en dos localidades diferentes
(Anexo Tabla 5) utilizando la técnica de Relevamiento por Encuentros Visuales
(VES) (Lips et al, 2001).
De acuerdo con la revisión bibliográfica, se ha determinado que los alcaloides no
ionizados de la familia de anuros venenosos Dendrobatidae son solubles en
disolventes orgánicos, e insolubles en disolventes acuosos y que gracias a esta
característica, el método más efectivo de extracción, es solubilizar los alcaloides
en metanol (Daly et al, 1967).
Es necesario aclarar que el protocolo para la extracción y análisis de los
alcaloides de extractos de piel ha sido desarrollado y refinado durante años. Se
siguió el determinado por Daly et al (1992 y 1993), modificado del protocolo
inicial:
Para el presente estudio se obtuvieron cuatro extractos de alcaloides de las
pieles de 16 ejemplares de D. truncatus (Tabla 5); para cada uno se siguió el
procedimiento que a continuación se expone:
Se retiraron las pieles de los ejemplares y se incorporaron en metanol (1 parte
de piel / 2 o más partes de metanol). Las pieles fueron maceradas con porciones
separadas de metanol (1 parte de piel/ 4-20partes de metanol). Los extractos
combinados de metanol fueron diluidos con un volumen equivalente de agua (25
ml aprox.). El extracto acuoso con el metanol y el macerado de las pieles, se
extrajo cuatro veces con cloroformo (30ml, 20ml, 10ml y 5ml) (Figura11: A). Las
capas de cloroformo combinado se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se
concentraron a un volumen pequeño (1-10ml) (Figura 11: B).
A
B
Figura 11: Extracción de los alcaloides de las pieles de D. truncatus. A. Fase combinada
de metanol (pieles)- agua destilada –cloroformo. B. Filtración de las capas de cloroformo
sobre Na2SO4 anhidro.
El cloroformo concentrado fue reconstituído al volumen original con n-hexano. El
n-hexano, que ahora contiene una pequeña cantidad de cloroformo, se extrajo
tres veces, con un volumen de 20ml, 10ml y 5ml de HCl 0.1 N, permitiendo el
paso de alcaloides a su forma ionizada e hidrosolubles (Figura 12).
Figura 12: Extracción de cloroformo con HCl 0.1N.
Las fracciones combinadas de HCl 0.1 N se ajustaron a un pH de 9, controlado
por un potenciómetro con 1N de hidróxido de amonio (NH4OH), seguido de la reextracción de los alcaloides con cloroformo (como forma no ionizada), cada vez
con la mitad del volumen de cloroformo. Las fracciones combinadas en
cloroformo se secaron sobre Na2SO4 anhidro y luego se evaporaron sin
calentamiento (Figura 13).
A
B
Figura 13: A. Capas combinadas de cloroformo secadas sobre Na2SO4 anhidro y papel
de filtro. B. Residuo final de la extracción de alcaloides.
Esta fracción contiene principalmente alcaloides, pero rastros de ésteres
metílicos de ácidos grasos, esteroides y componentes ambientales, también
están presentes como contaminantes menores (Daly et al, 1992).
6.2.2. Detección de alcaloides en el extracto de la piel de D. truncatus
Cromatografía en capa delgada ascendente
Para determinar la presencia de alcaloides en el extracto de piel de D. truncatus,
se realizó una cromatografía en capa delgada.
Esta técnica es útil para identificar y aislar alcaloides individuales y comparar las
fracciones de alcaloides en un extracto, pues da una idea visual de las
diferencias cualitativas y cuantitativas de los alcaloides hallados en una especie
de rana (Myers & Daly, 1976).
Para tal fin, se utilizó una placa cromatográfica de sílica gel de 20 * 20 cm con
0.25 mm (Merck Darmstadt) y como fase móvil una solución 9:1 de cloroformometanol (Myers & Daly, 1976).
Una muestra de pilocarpina, fármaco utilizado como control de presencia de
alcaloides y dos muestras del extracto metanólico de alcaloides aislado de la piel
de D. truncatus se aplicaron con una micropipeta capilar (10µL equivalente a
25µg de extracto) en el origen de la placa cromatográfica previamente activada
bajo calor (100°C durante una hora). Cuando las muestras se secaron, la placa
se
introdujo verticalmente
en una
cámara
de cromatografía
saturada
previamente con la solución 9:1 cloroformo– metanol. El desarrollo de las
muestras se dejó transcurrir 18 cm de la placa cromatográfica desde el origen. Al
concluir el proceso de elusión, la placa se retira de la cámara y se deja secar,
para posteriormente revelarla con el reactivo para alcaloides Dragendorff, que
permite la detección de alcaloides como manchas amarillo- naranja y observar a
la luz UV y vista con vapor de yodo.
La migración de los alcaloides en una cromatografía, es una propiedad
físicoquímica constante y única para cada compuesto en las mismas condiciones
y se determina por el valor del Rf (del inglés Rate of flow), lo que permite
determinar -de acuerdo con las manchas presentes- el número posible de
alcaloides -y si se tienen referencias- el tipo de alcaloide observado en cada
mancha, sin embargo, algunos valores de Rf de diferentes alcaloides pueden
ser muy parecidos, por lo que ésta técnica no es suficiente para determinar la
identidad de un compuesto desconocido (Myers & Daly, 1976).
El valor de Rf se obtiene dividiendo la distancia que el centro de la mancha ha
migrado desde su punto de origen (siembra) sobre la distancia total recorrida por
el eluente.
6.3. Curva dosis respuesta
Dado que no existen estudios previos del efecto del extracto de alcaloides de D.
truncatus en la unión neuromuscular de mamífero, se desconocía la naturaleza y
la cinética del efecto esperado, por lo tanto, era necesario realizar estudios
preliminares con el fin de seleccionar las dos concentraciones a valorar durante
dos horas, tiempo suficiente que nos permite asegurar una respuesta eficiente
de la preparación sin que se deba a la fatiga.
De acuerdo con lo anterior, antes de iniciar el protocolo experimental, se
realizaron curvas dosis-respuesta con concentraciones progresivas del extracto
(escala logarítmica) con el fin de identificar las concentraciones que en los
estudios
previos
producían
los
efectos
más
evidentes.
Estas
dos
concentraciones serían, posteriormente, sometidas a las repeticiones rigurosas
para asegurarnos que evidenciamos un efecto con significancia estadística.
De acuerdo con esto, se realizaron tres preparaciones de frénico diafragma
aislado de rata (bajo las condiciones que se describirán en la próxima sección);
dos experimentos con estímulo indirecto (macho y hembra) y un experimento
con estímulo directo (macho) Se utilizaron cuatro concentraciones: 0,02µg/ml,
0.2µ/ml, 2µg/ml y 20µg/ml, teniendo en cuenta la cantidad del extracto
disponible, la dosis mínima posible y el volumen de la cámara para mantener la
concentración.
6.4. Preparación frénico-diafragma de rata
El siguiente protocolo se llevó a cabo para la realización de 12 experimentos:
Se obtunde y decapita una rata Wistar macho con peso entre 250g – 350g para
realizar la extracción del hemidiafragma y nervio frénico izquierdos, objetivo del
protocolo.
Se realiza una incisión que permite ingresar a cavidad abdominal en sentido
céfalo- caudal sobre la línea media hasta el apéndice xifoides. Allí se separan las
vísceras abdominales hacia abajo y se cortan los pilares posteriores. La incisión
se extiende hasta el tórax por la línea paraesternal derecha. Se retira la piel
sobre el tórax izquierdo del animal para extraer rápidamente el bloque de las
vísceras desde la tráquea hasta el diafragma (incluyéndolo) (Figura 14).
A
B
Figura 14: Se observa parte del bloque de las vísceras in situ: A) diafrágma B) nervio
frénico de una rata Wistar macho (250-350 g).
La extracción del hemidiafragma izquierdo y el nervio se realiza sobre una caja
de petri con solución de Tyrode, medio nutriente que asegura las condiciones
óptimas para mantener la preparación estable (Composición en mM/L: NaCl
136.7; KCl 2.7; CaCl2 1.8; NaHCO3 11.9; MgCL2 1.05; NaH2PO4 0.4; D-glucosa
5.5). Se dispone un flujo continuo de Oxígeno al 100%. Bajo estas condiciones el
pH de la solución a 37°C se mantiene dentro de los rangos fisiológicos (pH de
7.4), controlado con un Termo Orion model 290 A portable pH meter (Figura 15).
A
B
Figura 15: En el bloque aislado de una rata Wistar dispuesto sobre una caja de petri con
solución nutriente, se señala A) el nervio frénico y B) el hemidiafragma izquierdo con un
corte en triángulo (1*1 cm aprox.).
Una vez el bloque está afuera, se realiza la disección del nervio y de una porción
del hemidiafragma izquierdo, retirando los órganos y tejidos adyacentes. El
nervio se marca y la preparación se fija por una punta de tendón del músculo con
seda 4-0 (Figura 16).
A
C
B
D
Figura 16: Órgano aislado frénico- diafragma de rata. A) preparación fija por el tendón,
B) porción de hemidiafragma izquierdo, C) parte de costilla por donde va a ser fijada al
soporte, D) nervio frénico aislado y marcado.
La preparación se fija desde la costilla a un soporte de vidrio que permite ubicar
la preparación en forma vertical dentro de la cámara de órgano aislado,
aportando un punto fijo para la tracción ejercida por el músculo (Figura 17).
B
A
Figura 17:A) Preparación frénico- diafragma fijada a un B) soporte de vidrio.
La preparación se sumerge en una cámara de órgano aislado con un volumen
total de 30 ml de solución de Tyrode, temperatura constante de 37 °C y flujo
continuo de oxígeno (Figura 18).
A
Figura 18: Se observa la preparación frénico- diafragma de rata sumergida en la cámara
de órgano aislado (30 ml). A) Entrada de oxígeno que permite el flujo constante.
A la preparación se le pone un contrapeso de 3g para mantener una precarga
constante que permite tener una tensión de base. Antes de comenzar el registro
de las contracciones musculares, se permite la adaptación y estabilización de la
preparación. El transductor de tensión fue calibrado a gramos fuerza con una
pesa estándar de 5g.
6.4.1. Estimulación indirecta
Se realizaron seis experimentos bajo estimulación indirecta. En cada uno, el
nervio frénico se estimuló mediante un electrodo con punta de platino conectado
a un estimulador Grass S44, regulado para descargar estímulos de 2 voltios, 2
ms duración y una frecuencia de 0.2 Hz. Se inició el registro con el voltaje y
frecuencia antes descritos para obtener un trazado de control adecuado.
A
Figura 19: Se muestra la disposición típica de una preparación frénico- diafragma de
rata con estimulación indirecta. A) El nervio se ubica sobre el electrodo, de tal forma que
el estímulo se genera desde el nervio.
6.4.2. Estimulación directa
Se realizaron seis experimentos bajo estimulación directa. Cada preparación se
pretrató con d- Tubocurarina (15µM) para bloquear la acción del nervio. La
estimulación se generó a través de un electrodo con punta de platino ubicado en
contacto directo con el músculo diafragma.
El electrodo se conectó a un
estimulador Grass S44 regulado para un estímulo de
15 voltios, 2 ms de
duración y una frecuencia de estímulo de 0.2 Hz. Se inició el registro con el
voltaje y frecuencia antes descritos para obtener un trazado de control adecuado
(trazado basal).
A
B
Figura 20: Se muestra la disposición típica de una preparación frénico- diafragma de
rata con estimulación directa. A) El músculo se encuentra en contacto con el electrodo,
B) Nervio frénico libre.
Las contracciones isotónicas del hemidiafragma obtenidas tanto por estímulo
directo como indirecto se registraron por medio de un transductor de tensión
Grass FT 03C conectado a un polígrafo digital AD instruments PowerLab/800,
software Chart 4 para Windows.
6.4.3. Aplicación del extracto y registro de la contracción
Las concentraciones predeterminas se administraron en dos dosis a la cámara
de órgano aislado con solución de Tyrode (30ml), en la cual la preparación se
encuentra previamente inmersa y estable. Antes de aplicar el extracto de
alcaloides, se tomó un registro de control o basal equivalente a las contracciones
durante 10 minutos. En los experimentos con estímulo directo, el registro basal
fue el obtenido después de aplicar d- Tubocurarina 15µM. Se registraron los
cambios durante dos horas en la amplitud de la contracción muscular del
diafragma inducida tanto por estímulo indirecto como directo, el tiempo en que
aparecieron los cambios después de aplicado el extracto, así como el tiempo en
el que se registró el efecto máximo para cada concentración. En los
experimentos con estímulo indirecto adicionalmente se aplicó fisostigmina 6µM
después de las dosis del extracto de alcaloides. Finalmente, se registraron los
cambios de la contracción de la preparación después del lavado con solución de
Tyrode.
6.5. Análisis de la información
Se tabularon los datos obtenidos de amplitud de contracción antes y después de
la aplicación del extracto para cada concentración en los grupos de estimulación
directa e indirecta. Así mismo, se tabularon los datos obtenidos de tiempo de
latencia y tiempo del efecto máximo observado para cada concentración del
extracto en los grupos de estimulación directa e indirecta.
Se calcularon los promedios de amplitud antes y después de la intervención. Con
base en los datos de amplitud se calculó el porcentaje de contracción o
relajación, teniendo como 100% la amplitud de la contracción durante el trazado
de control. Así mismo, se calculó la media y el error estándar de la contracción
en gramos fuerza y normalizada en porcentaje de contracción, antes y después
de la aplicación de cada dosis de extracto.
Se realizó la comparación del promedio y del porcentaje de contracción o
relajación del grupo de estudio y del grupo control tanto en estimulación directa
como indirecta mediante un análisis no paramétrico de mediciones repetidas
Kruskal Wallis, y una comparación del porcentaje de cambio entre dos
concentraciones de extracto en el grupo de estudio de estimulación directa o
indirecta o entre ellos, mediante el análisis no paramétrico entre dos muestras
independientes Mann Whitney. Se aceptó una diferencia con una significancia
del 95% (p < 0.05). Se escogieron pruebas no paramétricas, puesto que se trata
de un estudio in vitro y el número de unidades de análisis es menor de 30.
7. Resultados
7.1. Extracción de alcaloides
Tabla 1. Resultados del proceso de extracción química de
alcaloides
Extracto
No.
No de
pieles
utilizadas
Peso
seco de
las pieles
(mg)
Peso
extracto final
de
alcaloides
(mg)
mg de
extracto
obtenidos por
mg de piel
(mg/mg)
1
5
72.5
2.7
0.037
0.54
2
3
91.70
3.3
0.035
1.1
3
2
133.05
1.6
0.012
0.8
4
6
178.2
7.5
0.042
1.25
0.035
0.94
PROMEDIO
Extracto
obtenido
por piel de
rana
(mg/piel)
Se observa la relación del peso seco de cada una de las pieles de D. truncatus utilizadas
en los cuatro extractos, con el peso del extracto final de alcaloides y la cantidad obtenido
por piel de rana (Tabla 5).
7.2. Detección de alcaloides en el extracto de la piel de D. truncatus
Cromatografía en capa delgada ascendente del extracto de alcaloides y
pilocarpina como control de presencia de alcaloides
Rf =0.81
Rf =0.72
Rf =0.47
Rf =0.48
Rf =0.47
Rf =0.48
Rf =0.38
Rf =0.27
Rf =0.23
Rf =0.16
Rf =0.11
1
2
3
A)
1
2
3
B)
Figura 21: Se observan dos cromatografías en capa delgada ascendente. A) Placa
revelada con reactivo Dragendorff, se señalan las manchas naranja- amarillo. B) Placa
revelada con vapor de yodo, se señalan las manchas café- amarillo. En la parte superior
de las placas cromatográficas se puede apreciar la posición final del eluente, a una
distancia de 18 cm desde el punto de siembra de las sustancias. 1. y 2. Punto de
siembra de extracto de alcaloides aislado de D. truncatus (10µL). 3. Punto de siembra de
Pilocarpina (10 µL). en A). Se determinaron los Rf promedio para cada grupo de
manchas.
7.3. Curva Dosis- Respuesta
En los tres experimentos preliminares, con la concentración de 2µg/ml del
extracto de alcaloides, se obtuvo una respuesta excitatoria con un efecto
inmediato además de la máxima contracción muscular registrada para cada
experimento (Figuras 22, 23 y 24).
De la misma manera, con la concentración
de 20µg/ml se observa un efecto inhibitorio en los tres experimentos (Figuras 22,
23 y 24).
De acuerdo con lo anterior, se observa que el efecto del extracto de alcaloides
aislados de la piel de D. truncatus sobre la contracción del diafragma inducida
por
estímulo
indirecto
y
directo,
aparentemente
se
genera
con
las
concentraciones de 2µg/ml y 20µg/ml, obteniendo una rápida respuesta
excitatoria e inhibitoria respectivamente, por lo cual dichas concentraciones se
utilizan en los experimentos subsecuentes.
Curva Dosis- Respuesta del Extracto de Alcaloides de la Piel de D.
truncatus en la Contracción del Diafragma Inducida por Estímulo Indirecto
de una Rata Wistar Macho
Figura 22: Se observa el efecto de cuatro concentraciones del extracto de alcaloides:
Con A. 0.02µg/ml. y B. 0.2µg/ml., no se evidencia ningún cambio en la amplitud de la
contracción. Mientras que con C. 2µg/ml, la contracción se estimula inmediatamente,
mostrando la amplitud máxima obtenida. Se evidencia un efecto inhibitorio con D.
20µg/ml hasta llegar al bloqueo. Con E. Fisostigmina 6 µM el bloqueo no se revierte. La
preparación se recupera después de F. Lavado.
Curva Dosis- Respuesta del Extracto de Alcaloides de la Piel de D.
truncatus en la Contracción del Diafragma Inducida Por Estímulo Indirecto
de una Rata Wistar Hembra
Figura 23: Se observa el efecto de cuatro concentraciones del extracto de alcaloides:
Con A. 0.02µg/ml no se evidencia ningún cambio en la amplitud de la contracción.
Mientras que con B. 0.2µg/ml se observa un aumento de la amplitud de la contracción,
manifestación de un efecto excitatorio que es máximo con la concentración C. 2µg/ml.
Finalmente la preparación se bloquea con D. 20µg/ml. y no logra revertirse con E.
Fisostigmina 6 µM. La preparación se recupera después de F. Lavado.
Curva Dosis- Respuesta del Extracto de Alcaloides de la Piel de D.
truncatus en la Contracción del Diafragma Inducida por Estímulo Directo de
una Rata Wistar macho
Figura 24: Se observa el efecto de cuatro concentraciones del extracto de alcaloides en
una preparación pretratada con d-Tubocurarina. Se obtiene el trazado basal (control) con
A. 15 µM de d- Tubocurarina. No se evidencia ningún cambio respecto a la amplitud de
la contracción con B. 0.02µg/ml. ni con C. 0.2µg/ml. Aunque con D. 2µg/ml, se obtiene el
efecto máximo excitatorio registrado para este experimento, mientras que con E. 20µg/ml
la contracción del diafragma se comienza a inhibir, sin embargo esta no llega al punto de
bloqueo.
En cuanto a la amplitud de la contracción muscular respecto a la amplitud basal,
en los dos tipos de preparaciones (con estimulación indirecta y directa), las
concentraciones más bajas (0.02µg/ml y 0.2µg/ml) no generan un efecto
significativo observable como resultado de un efecto máximo; pues en la
preparación frénico- diafragma aislado de hembra bajo estímulo indirecto, con
0.2µg/ml aunque se observa un efecto excitatorio gradual, no es hasta la
siguiente concentración (2µg/ml), con la que se consigue un efecto claro
exitatorio evidenciado en la amplitud máxima mostrada (Figura 23).
7.4. Preparación frénico - diafragma de rata
7.4.1. Estimulación Indirecta
En el grupo con estímulo indirecto, se observó un aumento de la contracción
muscular con la concentración de 2 µg/ml del extracto de alcaloides (151.8 %
respecto al basal, p= 0.002) y una disminución prácticamente total de la
contracción en presencia de 20 µg/ml del extracto de alcaloides (p= 0.001). Este
efecto inhibitorio no revirtió con la adición de fisostigmina 18 µM (tres dosis de
6µM) (p= 0.674). No obstante, la contracción muscular se recuperó después del
lavado de la preparación con el cambio de solución nutriente libre de extracto (no
hay diferencia significativa entre la contracción basal y la contracción después
del lavado. Los datos se presentan en la tabla 2 y los hallazgos observados en
las figuras 25 y 26.
Tabla 2. Contracción Muscular Inducida con Estímulo
Indirecto en la Preparación Frénico-Diafragma de Rata.
Contracción gramos
Porcentaje de
fuerza
contracción
n
(Media ± Error
estándar)
(Media ± Error estándar)
5.73 ± 1.39
100 ± 0
2 µg/ml de extracto
8.58 ± 1.92
151.80 ± 15.89
6
20 µg/ml de
0.08 ± 0.08
1.75 ± 1.75
6
2.712±1.744
2.71 ± 1.77
6
4.37 ± 1.68
77.91 ± 21.29
6
Basal
6
extrracto
Fisostigmina 18µM
(3 dosis de 6µM)
Lavado
Se muestra la media ± el error estándar de la contracción basal del diafragma, la
contracción en presencia de 2 y 20 µg/ml de extracto de alcaloides de la piel de D.
truncatus, después de adicionar fisostigmina al baño de órgano, y después de realizar el
lavado de la preparación
Efecto del Extracto de Alcaloides de la Piel de D. truncatus en la
Contracción del Diafragma Inducida por Estímulo Indirecto
160
*
% de Contracción
140
120
100
80
60
40
20
*
*
0
Basal
2 µg/ml
20 µg/ml
Fisostigmina
Lavado
Figura 25: Se presenta un trazado representativo de una preparación. Se observa el
efecto de dos concentraciones del extracto de alcaloides extraídos de la piel de D.
truncatus en el porcentaje de contracción del diafragma. Hay un efecto excitatorio
significativo en la contracción muscular con la primera concentración. Hay un efecto
inhibitorio con la segunda concentración. La inhibición alcanzada con la segunda
concentración no revierte con Fisostigmina 6 µM - 18 µM (no hay diferencia entre los dos
grupos, p=0.674). Después del lavado la preparación se recupera. Se muestra la media ±
error estándar. * Valor de p < 0.05 cuando se compara cada grupo con el basal.
Figura 26: Trazado representativo de una preparación frénico-diafragma de rata bajo
estímulo indirecto. A) Efecto máximo (excitatorio) generado por 2µg/ml. B) Efecto
máximo (inhibitorio) generado por 20µg/ml. C) Efecto máximo de lavado (Recuperación).
7.4.2. Estimulación Directa
En el grupo con estímulo directo, se parte de preparaciones pretratadas con dTubocurarina cuyo registro de contracción se toma como basal o control. Se
observó un aumento de la contracción muscular con la concentración de 2 µg/ml
del extracto de alcaloides (352.99% respecto al basal, p= 0.002) y una
disminución parcial de la contracción en presencia de 20 µg/ml del extracto de
alcaloides (58.68 % respecto al basal, p= 0.040).
La contracción muscular
mejoró después del lavado de la preparación con el cambio de solución nutriente
libre de extracto (134.86% respecto al basal y, no hay diferencia significativa
entre la contracción basal y la contracción después del lavado p= 0.550). Uno de
los experimentos no se lavó. Los datos se presentan en la tabla 3 y los hallazgos
observados en las figuras 27 y 28.
Tabla 3. Contracción
Muscular Inducida con Estímulo Directo
en la Preparación Frénico-Diafragma de Rata
Contracción
gramos fuerza
(Media ± Error
estándar)
Porcentaje de
contracción
(Media ± Error
estándar)
4.75 ± 84.14
194.86 ± 10.56
6
2.48 ± 0.48
100 ± 0
6
2 µgml de extracto
8.26 ± 1.59
352.99 ± 53.28
6
20 µg/ml de
1.11 ± 0.27
58.68 ± 23.17
6
3.62 ± 1.06
134.86 ± 22.69
5
Antes de d-
n
Tubocurarina
Basal (dTubocurarina
15µM)
extracto
Lavado
Se muestra la media ± el error estándar de la contracción basal del diafragma (antes de
d- Tubocurarina), la contracción del diafragma (pretratada con d-Tubocurarina 15µM) la
contracción en presencia de 2 y 20 µg/ml de extracto de alcaloides de la piel de D.
truncatus, y después de realizar el lavado de la preparación.
Efecto del extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus en la
contracción del diafragma Inducida por estímulo directo
450
400
% de Contracción
350
300
250
200
150
100
50
0
Basal
2 µ g/ml
20µg/ml
Lavado
Figura 27: Se observa un claro efecto excitatorio en presencia de 2 µg/ml de extracto.
Luego, cuando se aplica la dosis de extracto necesaria para lograr una concentración de
20 µg/ml la contracción disminuye por debajo del nivel basal (p= 0.04). Igualmente no
hubo una diferencia estadísticamente significativa en la contracción antes y después del
lavado, y entre el trazado basal y el trazado después del lavado (p>0.05). Después del
lavado la preparación se recupera (no hay diferencia estadísticamente significativa entre
basal y lavado, p=0.550). Se muestra la media ± el error estándar. Se parte de una
preparación pretatada con d-Tubocurarina 15 µM que se administra antes de obtener el
trazado basal con el fin de bloquear los receptores nicotínicos.
Figura 28: Trazado Representativo de una Preparación Frénico Diafragma de Rata con
Estímulo Directo. A) Efecto máximo (exitatorio) generado por 2µg/ml. B) Efecto máximo
(inhibitorio) generado por 20µg/ml. C) Efecto máximo del lavado (Recuperación).
7.4.3. Comparación de la contracción con estímulo indirecto y directo
Al comparar los grupos con estimulación indirecta y directa, se observó que con
2 µg/ml del extracto de alcaloides, el grupo con estímulo directo muestra un
aumento superior de la contracción muscular respecto al grupo con estímulo
indirecto (p= 0,006); en contraste con la concentración de 20 µg/ml del extracto
de alcaloides, donde se observa un efecto inhibitorio superior para las
preparaciones con estímulo indirecto respecto a las preparaciones con estímulo
directo (p= 0,005).
La contracción muscular para los dos casos mejoró después del lavado de la
preparación con el cambio de solución nutriente libre de extracto (no hay una
diferencia significativa entre los lavados para cada grupo con estimulación
directa o indirecta, p= 0,855). Los hallazgos se pueden observar en las figuras
29 y 30.
presencia de 2 μg/ml del extracto, y que el efecto inhibitorio en presencia de 20 μg/ml de extracto es significativamente mayor con el
estímulo indirecto que directo. En las comparaciones restantes no existen diferencias. Se muestra la media ± el error estándar. El
asterisco indica una p<0.01 en la comparación de los grupos.
Figura 29: Se observa de manera clara que existe un efecto excitatorio significativamente mayor con estímulo directo que indirecto en
Inducida por Estímulo Indirecto y Directo
Efecto del Extracto de Alcaloides aislados de la Piel de D. truncatus en la Contracción del Diafragma
A)
B)
Figura 30: Trazado representativo del efecto de 2 μg/ml de extracto de alcaloides de la
piel de D. truncatus sobre la amplitud de contracción del diafragma inducida por
estímulo indirecto y estímulo directo.
A)
B)
Figura 31: Trazado representativo del efecto de 20 μg/ml de extracto de alcaloides de la
piel de D. truncatus sobre la amplitud de contracción del diafragma inducida por estímulo
indirecto y estímulo directo.
7.4.4. Tiempo de latencia y tiempo del efecto máximo observado
En todos los experimentos realizados de preparación frénico diafragma de rata
para el presente estudio, se exhibió un marcado y rápido efecto de los extractos
de alcaloides aislados de la piel de D. truncatus. La actividad farmacológica fue
reversible indistintamente en los experimentos con estímulo directo e indirecto
Al comparar el tiempo de latencia y el tiempo del efecto máximo observado entre
los grupos con estimulación indirecta y directa en presencia de 2µg/ml de
extracto, se determinó para los dos grupos, que el efecto del extracto sobre las
contracciones del diafragma inicia de manera inmediata y que el extracto actúa
de forma similar. En presencia de 20µg/ml de extracto, aunque el tiempo
promedio necesario para alcanzar el efecto máximo inhibitorio observado es
mayor, con el estímulo directo que con el indirecto, el análisis estadístico no
evidencia una diferencia significativa (p=0.078). Por otra parte, bajo estímulo
directo, la contracción inicia la recuperación y llega a su amplitud máxima con
mayor rapidez que bajo estímulo indirecto, teniendo p=0.002 para el tiempo de
latencia del lavado y p=0.002 para el tiempo de recuperación después del
lavado.
Tabla 4. Tiempo de latencia y tiempo del efecto máximo observado en la
contracción del diafragma generada por estímulo indirecto y directo
TIEMPO
(minutos)
ESTÍMULO INDIRECTO
ESTÍMULO DIRECTO
2 μg/ml
20 μg/ml
Lavado
2 μg/ml
20 μg/ml
Lavado
Latencia
0
0,98±0,98
5,6±1,6
0
1,4±1,4
0,065±0,04
Efecto máximo
2,2±0,88
23±13
61±6,7
5,6 ±1,3
56±9,8
5,5±2,0
Se muestra la media ± el error estándar del tiempo de latencia y tiempo del efecto
máximo observado de la contracción del diafragma en presencia de 2 y 20 µg/ml de
extracto de alcaloides de la piel de D. truncatus, y después de realizar el lavado de la
preparación.
Figura 32: Se señala un efecto inmediato al aplicar 2μm/ml, al igual que con el lavado en los experimentos con
estímulo directo. Se muestra la media ± el error estándar.
El asterisco indica una p<0.005 en la comparación de los grupos (Latencia lavado p= 0.002 y recuperación
Lavado= 0.002).
generada por estímulo indirecto y directo
Tiempo de latencia y tiempo del efecto máximo observado en la contracción del diafragma
8. Discusión
Las preparaciones frénico diafragma de rata han proporcionado un sistema
adecuado para estudiar el efecto del extracto de alcaloides de la piel de D.
truncatus en la unión neuromuscular de rata, pues los resultados señalan efectos
claros, una aproximación al sitio de acción de los alcaloides y también permiten
suponer el tipo de alcaloide que genera tal efecto.
Los hallazgos obtenidos de la amplitud de la contracción muscular inducida por
estimulación indirecta y directa muestran que el extracto de alcaloides tiene un
efecto dual excitatorio e inhibitorio, evidenciado en el registro de la contracción
en el que se señala un aumento y disminución respectivamente.
Cabe mencionar que la comprensión de los efectos generados por el extracto de
la piel, se puede lograr a partir del conocimiento de la fisiología de la unión
neuromuscular y el músculo.
Los resultados encontrados al administrar 2 µg/ml del extracto de piel, muestran
que hay un rápido incremento en la amplitud de la contracción del diafragma,
con lo que se determina un efecto excitatorio inicial. Tal efecto, a pesar de
haberse encontrado en todos los experimentos, fue observado especialmente en
las contracciones musculares generadas por estimulación directa (Figuras 27,
28, 29 y 30).
Un aumento de la contracción muscular en respuesta a un efecto excitatorio se
podría explicar en diferentes puntos de la unión neuromuscular y el músculo:
Dicho efecto se podría entender como un posible incremento de acetilcolina en
la hendidura sináptica que finalmente genera una respuesta de excitación; tal
aumento en la concentración del neurotransmisor en la hendidura sináptica se
podría atribuir a un fenómeno presináptico (aumento de la síntesis, aumento del
almacenamiento o liberación de acetilcolina) o a un efecto en la hendidura
sináptica dado por una disminución de la actividad de la acetilcolinesterasa, sin
embargo, los resultados obtenidos en la preparación estimulada de forma directa
permiten aclarar este punto. Se debe recordar que las preparaciones frénico
diafragma bajo estímulo directo fueron tratadas previamente con d- Tubocurarina
15µM con el fin de bloquear el receptor nicotínico, además el estímulo eléctrico
se hizo sobre el músculo de tal forma que la contracción se generó sin la
participación de la unión neuromuscular, es decir, sin la mediación de
acetilcolina. En presencia de las condiciones anteriores, cuando se aplicó la
concentración de 2 µg/ml del extracto de alcaloides, se evidenció un aumento
claro de la contracción muscular (Figura 27 y 30) que inclusive fue superior al
observado en las preparaciones estimuladas en el nervio frénico (Figura 29).
Este evento permite descartar un efecto excitatorio a nivel presináptico y en la
hendidura sináptica.
Así mismo, también se podría pensar que el efecto excitatorio fuera generado
por algún alcaloide presente en el extracto que actuara como agonista del
receptor nicotínico y que hubiera desplazado de manera competitiva a dTubocurarina generando el aumento de la magnitud de la contracción que se
obtuvo (Hucho, 1986), sin embargo, nuevamente los hallazgos obtenidos con la
preparación directa eliminan esta posibilidad.
Se debe recordar que la misma concentración de agonista en presencia de una
concentración de antagonista, por ley de acción de masas, produce un efecto
menor que el observado en ausencia de antagonista, sin embargo, el efecto
excitatorio observado fue mayor en la preparación directa en presencia de
antagonista (d-Tubocurarina) que en la preparación indirecta en ausencia del
mismo (Figura 29); además, 15 µM de d- Tubocurarina es una concentración
suficiente (ya que produce un bloqueo completo de la transmisión neuromuscular
en una preparación estimulada de manera indirecta) para tener la certeza del
bloqueo en el receptor nicotínico y por lo tanto pensar que el efecto de excitación
observado ocurrió en un punto diferente de la unión neuromuscular.
Lo anterior permite descartar una posible actividad excitatoria del extracto a nivel
presináptico en la hendidura sináptica o en el receptor nicotínico, y propone que
el efecto excitatorio se debe atribuir a la acción del extracto en un punto de la
fibra muscular distinto al receptor.
Ahora bien, en el músculo, la acción excitatoria ejercida por 2 µg/ ml del extracto
de piel, pudo haberse dado por:
Aumento de las corrientes de despolarización de los canales de sodio rápidos
voltaje dependientes ubicados en el sarcolema, disminución de la actividad de
los canales de potasio en la fibra muscular, regulación a nivel de los canales de
calcio voltaje-dependientes (aumento de actividad)- receptor de dihidropiridina,
aumento de la actividad del receptor de rianodina, aumento en la afinidad del
calcio por las proteínas del aparato contráctil.
Una prueba biológica de preparación frénico diafragma de rata no permite
localizar el sitio específico de la acción del extracto de piel en el músculo,
aunque sí hace una aproximación real del tipo de efecto y restringe –hasta cierto
nivel- la zona de acción como en este caso. Para determinar el sitio del efecto
del extracto de piel en el músculo son necesarias pruebas electrofisiológicas que
no eran el objetivo de éste estudio.
Por otro lado, con la segunda concentración, se observó que la administración
de 20µg/ml del extracto de piel en la preparación frénico diafragma de rata,
induce disminución de la amplitud de la contracción muscular generada tanto por
estímulo directo como por estímulo indirecto, señalando de esta manera el
segundo efecto principal determinado en este trabajo: Inhibición.
De acuerdo con los resultados obtenidos, la respuesta inhibitoria de la
contracción muscular se presentó tanto en las preparaciones estimuladas de
manera directa como indirecta (Figuras 25, 27 y 31). Hecho que se podría
explicar por un efecto del extracto en la unión neuromuscular o el músculo
directamente, teniendo en cuenta que se presentó a pesar del bloqueo con dTubocurarina.
En la unión neuromuscular, el extracto de alcaloides, pudo haber actuado como
un generador de fenómenos que disminuyen los procesos de síntesis,
almacenamiento o liberación de acetilcolina, lo que reduce la disponibilidad del
neurotransmisor para el acople con los receptores específicos de las células
postsinápticas, evento necesario para generar el potencial de membrana como
preámbulo de la contracción muscular (Dwoskin & Crooks, 2001). Si éste fuese
el mecanismo que explica la inhibición en la unión neuromuscular, un aumento
de la concentración de acetilcolina en la hendidura sináptica revertiría parcial o
totalmente el efecto inhibitorio observado, sin embargo, la fisostigmina (inhibidor
de la acetilcolinesterasa), que aumenta las concentraciones del neurotransmisor,
aplicada a las preparaciones con estímulo indirecto no modificó el trazado. Esto
permite sugerir que un efecto presináptico no explica el efecto inhibitorio.
Otra posibilidad para sustentar el efecto inhibitorio observado, pudo ser el
aumento en la actividad y/o la cantidad de la acetilcolinesterasa en la hendidura
sináptica, que genera una baja disposición de la acetilcolina y en consecuencia
no se puede llevar a cabo la función del neurotransmisor en la contracción
muscular (Boron & Boulpaep, 2003).
Los dos mecanismos propuestos tienen en común la disminución de la
concentración de acetilcolina en la hendidura sináptica y podrían ser revertidos
aumentando la concentración del neurotransmisor al inhibir la acetilcolinesterasa,
enzima que lo hidroliza con alta eficiencia.
No obstante, en los experimentos con estimulación indirecta, el bloqueo total no
revierte con fisostigmina (Tabla2) demostrando que el efecto no ocurrió por un
aumento de la actividad de la acetilcolinesterasa ni por una disminución de la
liberación de la acetilcolina, ya que esta maniobra aumentaría la concentración
disponible de esta sustancia para activar los receptores; esto permite descartar
un efecto presináptico del extracto.
Así mismo, también se descarta que los alcaloides del extracto de piel actúen
como antagonistas competitivos de la acetilcolina, ya que cuando se inhibe la
acetilcolinesterasa, es de esperarse un aumento de la concentración de la
acetilcolina en la hendidura sináptica y que dicho evento permita que el agonista
endógeno desplace al antagonista exógeno, (en este caso las sustancias del
extracto de piel) y que como consecuencia de esto, la actividad contráctil del
diafragma se recupere, pero esto no sucedió. De hecho, la adición de
fisostigmina en dosis progresivas no tuvo ningún efecto en la inhibición inducida
por el extracto. Pero sí podría corresponder a un antagonista no competitivo del
receptor nicotínico, cuyo efecto inhibitorio no se modifica con la adición de
fisostigmina, como se observó en este trabajo.
Además, el tiempo necesario para que la preparación estimulada indirectamente
alcanzara el efecto inhibitorio máximo, fue menor que el necesario para alcanzar
el efecto inhibitorio en las preparaciones estimuladas directamente (Figura 32), y
aunque el análisis estadístico no revela un efecto significativo (p=0.07. Tabla 4)
es probable que ésta falta de significancia se deba al tamaño reducido de la
muestra (n=6), lo anterior, asociado a que la preparación indirecta se recuperó
mucho más lentamente que la directa, permite pensar que el efecto inhibitorio
ocurre con predominio en la unión neuromuscular antes que en el músculo.
En síntesis, un efecto inhibitorio de mayor magnitud con estímulo indirecto
(prácticamente inhibición completa) y de menor magnitud con estímulo directo, la
evidencia del tiempo registrado para alcanzar el efecto máximo, menor con
estímulo indirecto que directo y una recuperación de la inhibición mucho más
rápida con estímulo directo que indirecto son hechos que sugieren que el efecto
inhibitorio del extracto ocurre tanto en la unión neuromuscular como en el
músculo, pero predomina en la unión neuromuscular (Tabla 4 y Figura 32). Si el
efecto fuera solamente en la unión neuromuscular no se hubiera observado
efecto inhibitorio en la preparación directa. Si el efecto fuera solamente en el
músculo el efecto inhibitorio no hubiera sido menor en la preparación directa que
indirecta.
Una baja disponibilidad de acetilcolinesterasa en la hendidura sináptica genera
disminución en la degradación del neurotransmisor, y como consecuencia,
puede producir un aumento de la concentración de acetilcolina en la hendidura
sináptica, que por exceso, finalmente produce: 1) Despolarización sostenida que
inactiva los canales de sodio voltaje dependientes del sarcolema adyacente a la
placa terminal, lo que eventualmente ocasionará inhibición de la contracción
muscular.2) Desensibilización del receptor nicotínico. Sin embargo, se debe
aclarar que para que este mecanismo explique el efecto observado, se necesita
una elevada actividad anticolinesterásica presente en el extracto que no se
puede descartar.
De acuerdo con todo lo anterior, se podrían sugerir dos opciones en las que el
extracto pudo ejercer el efecto inhibitorio en las preparaciones indirectas: 1)
Actúa como un antagonista no competitivo del receptor nicotínico, donde
ejecutaría la acción de bloqueo reduciendo la duración de la apertura del canal
iónico, sin generar cambios mayores en la unión del agonista (Hucho, 1986) y 2)
Actúa como un inhibidor de la acetilcolinesterasa (poco probable).
Los dos mecanismos anteriores permiten explicar el efecto inhibitorio en la unión
neuromuscular pero no explican el efecto inhibitorio parcial observado con la
preparación directa. Cabe recordar que dicho efecto se generó también en las
preparaciones directas -aunque en menor magnitud-, por lo se podría explicar en
cualquier punto de la fibra muscular diferente al receptor nicotínico. Por ejemplo
a nivel de la disminución de las corrientes de despolarización de canales de
sodio rápidos voltaje dependiente, aumento de la actividad de los canales de
potasio, regulación a nivel de los canales de calcio voltaje- dependientes
(disminución de actividad)- receptor de dihidropiridina, disminución de la
actividad del receptor de rianodina y cambios en la afinidad del calcio por las
proteínas del aparato contráctil.
De manera similar al efecto excitatorio, estos posibles mecanismos sobre la fibra
muscular, necesitan estudios adicionales para corroborar el sitio en el que el
extracto de alcaloides posiblemente ejerza el efecto inhibitorio.
En consecuencia, el efecto inhibitorio generado por el extracto de alcaloides
observado y descrito, se puede correlacionar con estudios realizados
previamente con el extracto de piel de otros dendrobátidos.
El perfil de alcaloides propuesto para las ranas venenosas del neotrópico
(Dendrobatidae) (Daly, et al 1978, 1987), reconoce que D. truncatus excreta a
través de la piel, trece alcaloides tóxicos pertenecientes a cuatro clases:
histrionicotoxinas, decahidroquinolinas, indolizidinas y pirrolizidinas (Daly, et al
1978, 1987).
Con tal antecedente y la evidencia del efecto del extracto de alcaloides hallada
en éste trabajo, se podría entender mejor el mecanismo de acción del extracto,
aunque es muy posible que el efecto observado se deba a más de una sustancia
que explique estos efectos dependiendo de la concentración.
Cabe recordar que aún no se ha informado acerca de la toxicidad o actividad
biológica para todos los tipos de alcaloides encontrados en D. truncatus, no
obstante, por la literatura se sabe que varios alcaloides de tres de las cuatro
clases anteriormente mencionadas, actúan como bloqueadores no competitivos
de los canales nicotínicos y que presentan bajos niveles de toxicidad respecto a
otras clases de alcaloides encontrados en dendrobátidos (Daly et al, 2005),
aspecto que se abordará más adelante.
Los valores de Rf obtenidos en la cromatografía en capa delgada ascendente
revelada con el reactivo de Dragendorff (Figura 21A), se acercan a los
determinados por Myers & Daly en 1976, para dos clases de histrionicotoxinas
(Tetrahidrohistrionicotoxina Rf=0.48, histrionicotoxina 239 Rf= 0.15) y una
decahidroquinolina (DCH Rf= 0.267).
De acuerdo con lo anterior, el efecto inhibitorio observado bajo estímulo indirecto
se podría justificar por la acción de alguna de las histrionicotoxinas, indolizidinas,
pirrolizidinas y/o decahidroquinolinas que se reportan para D. truncatus en Daly
(1978 y 1987). Se sabe que farmacológicamente las histrionicotoxinas,
indolizidinas y decahidroquinolinas actúan como antagonistas no competitivos
del receptor nicotínico. Aunque sobre las indolizidinas y decahidroquinolinas ha
habido poca información sobre su toxicidad, y los estudios sobre la actividad
biológica son limitados (Daly, 2005), en cuanto a la clase de las pirrolizidinas, de
acuerdo a la literatura, la toxicidad aun no ha sido investigada (Daly, 2005); en
contraste con la información disponible de la actividad farmacológica de las
histrionicotoxinas, pues han sido ampliamente estudiadas desde 1975. Gracias a
esto, el efecto o la actividad de las histrionicotoxinas descritos en diferentes
estudios se puede confrontar con los resultados hallados en las pruebas
biológicas del presente estudio, pues se ha determinado un gran vacío de
conocimiento respecto a la actividad biológica de las otras tres clases
mencionadas.
Se sabe que las histrionicotoxinas afectan al menos tres tipos de canales en el
nervio y el músculo (Spivak et al,1982 y Daly et al, 1993). La primera clase de
canales son los receptores ionotrópicos, en particular, el canal receptor nicotínico
de acetilcolina, donde las histrionicotoxinas ejecutan la acción de bloqueo
reduciendo la duración de la apertura del canal iónico sin generar cambios
mayores en la unión del agonista (Daly et al, 1993).
La segunda clase de canales son los canales de sodio voltaje dependientes, en
los cuales las histrionicotoxinas reducen las conductancias de forma similar a
anestésicos locales (Daly et al, 1993).
La tercera clase de canales son los de potasio voltaje dependientes, en los
cuales las histrionicotoxinas reducen las conductancias en tiempo y estímulo
dependiente (Daly et al, 1993).
Por estudios electrofisiológicos se sabe que estas clases de alcaloides,
presentan un bajo nivel de toxicidad, no obstante, este tipo de estudios no son
convenientes para determinar el nivel de toxicidad; para este caso, los estudios
más apropiados serían los que determinan dosis letal cincuenta con animal total.
Los resultados presentados se pueden asociar a estudios electrofisiológicos,
pues se encuentran similitudes al evaluar el efecto de las histrionicotoxinas sobre
la corriente de la placa terminal del músculo de una rana, determinándose que la
acción de las histrionicotoxinas depende de la concentración y es reversible
después de lavar la preparación (Masukawa, 1978).
Una aproximación a los eventos ocurridos que expliquen el efecto inhibitorio
parcial observado en las preparaciones con estimulación directa, se podría
explicar con un estudio realizado sobre el efecto de algunas histrionicotoxinas en
preparaciones nervio- musculares de rana; pues se determinó un bloqueo de la
contracción muscular y depresión tanto en la amplitud del pico como en el tiempo
de caída constante de la corriente de placa terminal. Durante estimulación
repetitiva, la histrionicotoxina diminuyó progresivamente la tasa de aumento y
prolongó la fase de caída del potencial de acción del músculo, lo cual se debe en
parte al bloqueo de los canales de potasio voltaje-sensitivos (Spivak et al, 1982).
Lo anterior sugiere que las histrionicotoxinas actúan en los tres tipos de canales
de membrana, como ya se había mencionado, y que pueden demostrar un
efecto de inhibición en el músculo.
Entonces, la suposición más acertada respecto al efecto inhibitorio analizado
puede ser presumir la actividad de alguna histrionicotoxina, pues lo anterior,
confrontado con los resultados obtenidos señala la acción de un antagonista no
competitivo.
No obstante, justificar con certeza los resultados de inhibición con tal evidencia
no es conveniente ni significativo, ya que actualmente no se sabe qué ha pasado
con los alcaloides después de más de 30 años desde el informe del perfil tóxico
de esta especie, y si se tiene en cuenta que la toxicidad de la rana varía en
función del tipo de dieta (Daly et al, 1997), es poco probable, o más bien no se
sabe si presentan los mismos alcaloides y en la misma cantidad: en las pruebas
biológicas con extractos de piel, se podría estar observando la acción de otros
alcaloides y de otras sustancias.
Gracias a estudios sobre la actividad farmacológica de las histrionicotoxinas, se
sabe que básicamente su acción es generar inhibición, ya sea como antagonista
no competitivo del receptor nicotínico o como reductor de conductancias en los
canales de sodio y potasio (Anwyl & Narahashi, 1980). Por lo tanto, no se ha
señalado como un agente estimulante y por consiguiente, el efecto excitatorio
observado especialmente en las preparaciones bajo estímulo directo no se
podría atribuir precisamente a la acción de una histrionicotoxina, pues este
efecto se observó especialmente en el músculo.
Aunque, en 1975, con experimentos similares a los de éste estudio, se determinó
que en preparaciones de frénico- diafragma de rata, bajo estímulo directo e
indirecto, la isodihidrohistrionicotoxina (10-7 M) provoca un estímulo inicial de la
contracción muscular seguida del bloqueo después de 30 minutos (MensahDwumah & Daly, 1978). No obstante la isidihidrohistrionicotoxina se reconoce
como un bloqueador no competitivo y no podría explicar el efecto excitatorio
inicial encontrado en éstos experimentos.
De la misma manera, un efecto excitatorio generado por alguna de las otras
clases de las que se tiene información sobre la actividad farmacológica
reportadas para D. truncatus: decahidroquinolinas e indolizidinas, es improbable
puesto que también se reconocen como bloqueadores no competitivos del
receptor nicotínico (Daly et al, 2005), además estas sustancias se clasifican
como trazas de alcaloides, es decir se encuentran en muy baja cantidad, y
posiblemente no puedan ejercer la magnitud del efecto excitatorio especialmente
encontrado en los experimentos bajo estímulo directo, y además, como ya se
había mencionado anteriormente, la composición del perfil tóxico de D.
truncatus, pudo haber cambiado en más de 30 años.
Aunque por otro lado, dado que aun no se ha informado sobre la actividad
biológica del alcaloide de la clase de las pirrolizidinas, se podría suponer que el
efecto inhibitorio es generado por algún alcaloide de esta clase, aunque también
se encuentran como una traza en el perfil tóxico de D. truncatus (Daly et al, 1978
y 1987), pero puede ser una opción y no se puede descartar.
Otra posibilidad, es que el efecto excitatorio -determinado especialmente en las
preparaciones con estímulo directo- se deba al efecto de un alcaloide u otra
sustancia que no ha sido identificada para la especie D. truncatus, sin embargo,
para corroborar dicha afirmación es necesario realizar otro tipo de estudios que
separen y permitan aislar los componentes tóxicos del extracto de piel, para
posteriormente realizar pruebas farmacológicas en las que se pueda valorar la
actividad biológica de dichas sustancias.
Por otro lado, existe otra clase de alcaloides aislada de la piel de los
dendrobátidos: Pumiliotoxinas; de hecho esta clase representa la mayor cantidad
de alcaloides con amplia distribución, pues se encuentran virtualmente en todos
los anuros que poseen algún tipo de defensa química por la presencia de
alcaloides lipofílicos (Saporito et al, 2004).
La actividad farmacológica de estos alcaloides se encuentra bien documentada,
pues se sabe que actúan como potentes agentes cardiotónicos y miotónicos
(Smith & Jones, 2004).
En estudios farmacológicos con preparaciones frénico- diafragma, se determinó
que la pumiliotoxina B causa una estimulación marcada y dosis- dependiente de
la contracción muscular generada por estímulo directo e indirecto, y que además
tal efecto fue rápidamente revertido con el lavado (Mensah-Dwumah & Daly,
1978).
Estudios subsecuentes de la actividad de la pumiliotoxina B, en preparaciones
neuromusculares, fueron interpretados como una aparente facilitación de la
translocación del calcio desde sitios internos de almacenamiento (Daly et al,
1993).
Otros estudios han revelado que la pumiliotoxina B interactúa con canales de
sodio voltaje dependientes para generar un aumento en el flujo de los iones de
sodio (Daly et al, 1993).
El efecto de la pumiliotoxina B en una preparación neuromuscular ha sido
interpretado como generador principal de efectos en los canales de sodio,
aunque algunos efectos directos en la movilización del calcio pueden ocurrir.
También se ha propuesto que la pumiliotoxina B aumenta la tasa de activación
de canales de sodio. Una característica del efecto de la pumiliotoxina B, es
generar repetidos disparos en las neuronas, aparentemente por sus efectos en
la función de los canales de sodio (Daly, 1995).
A pesar de que el perfil tóxico reportado para D. truncatus, no incluye la
presencia de la clase de las pumuliotoxinas, si los resultados experimentales se
correlacionan con los eventos mencionados correspondientes a la bioactividad
de esta clase de alcaloides, se determina como una posible explicación para el
efecto excitatorio, de mayor magnitud en las preparaciones con estímulo directo
que hasta ahora no podría entenderse si se observa desde el punto de vista de
las demás clases de alcaloides ya comentadas.
De la misma manera, recordando la cromatografía en capa delgada ascendente
que se reveló con vapor de yodo, se encuentra que uno de los valores de Rf
determinados para los 6 grupos de manchas café- amarillas (Rf = 0.23 Figura
21B), hace referencia a una pumiliotoxina B (Rf=0.20 registrada en Myers & Daly,
1976), sin embargo, se debe aclarar que el vapor de yodo es un revelador
sensible a diversos tipos de sustancias, más no específico para alcaloides,
aunque para este tipo de trabajo es de gran utilidad porque permite determinar la
presencia sustancias en un extracto (Myers & Daly, 1976).
Aunque sí se puede plantear la hipótesis que la magnitud del efecto excitatorio
observado en los experimentos con estímulo directo, que ahora asumimos como
de predominio en el músculo, se puede deber al efecto de un alcaloide de la
clase de las pumiliotoxinas de actividad miotónica que no ha sido reportado en la
literatura para D. truncatus.
Tal afirmación no se puede confirmar en este estudio, pero la evidencia indica un
efecto que no se puede explicar con la actividad biológica indicada para las
clases de alcaloides presentes en D. truncatus.
En conclusión, con los experimentos realizados, se observaron dos grandes
efectos: Un efecto excitatorio que se ubica en la fibra muscular en un punto
diferente del receptor nicotínico, cuya localización precisa requiere de estudios
adicionales; pues tal efecto excitatorio no se puede explicar con el conocimiento
actual de las sustancias descritas para D. truncatus.
El efecto inhibitorio observado tanto en la unión neuromuscular como en el
músculo pero de mayor magnitud en la unión neuromuscular, se puede entender
con la evidencia actual del efecto de la histrionicotoxina como antagonista no
competitivo de la acetilcolina.
9. Conclusiones
Se estandarizó el protocolo de preparación de órgano aislado (frénico diafragma
de rata según Bülbring) como una herramienta útil para valorar el efecto del
extracto de alcaloides aislados de la piel de D. truncatus sobre la unión
neuromuscular de mamífero.
Los ensayos biológicos permiten evaluar el efecto de venenos producidos por
animales y de acuerdo al tipo de preparación in Vitro que se realice, es posible
hacer una aproximación al sitio de acción de la muestra de interés.
Con este trabajo queda abierta una nueva línea de investigación en Colombia,
encaminada a evaluar la actividad farmacológica de extractos de alcaloides de la
piel de dendrobátidos y de animales productores de venenos en general, sobre
órganos aislados de animales utilizando técnicas de pruebas biológicas in Vitro.
Se determinó el efecto del extracto de alcaloides aislados de la piel de D.
truncatus en la preparación frénico diafragma de rata, corroborando una acción
neurotóxica periférica presumida en otros estudios y determinando el sitio de
acción (unión neuromuscular y /o fibra muscular). Adicionalmente, se presentó
una aproximación a la clase de toxina que probablemente generó los efectos
observados, pese a que éste no era el objetivo de la investigación.
El extracto de alcaloides aislados de la piel de D. truncatus, tiene un efecto
excitatorio e inhibitorio evidenciado en la amplitud de la contracción muscular
inducida tanto por estímulo directo como indirecto, en función de la
concentración (2µg/ml y 20µg/ml de extracto de alcaloides) y el sitio de acción
(unión neuromuscular y fibra muscular) .
El efecto inhibitorio del extracto de alcaloides es de mayor magnitud en las
preparaciones con estimulación indirecta, lo que sugiere que su acción se debe
a algún mecanismo de predominio en la unión neuromuscular. De acuerdo a los
resultados obtenidos, el efecto inhibitorio se puede explicar por un bloqueo no
competitivo en el receptor nicotínico o una actividad anticolinesterásica elevada.
El efecto excitatorio fue de mayor magnitud cuando la preparación se estimuló
directamente en el músculo y en presencia de d-tubocurarina, esto permite
ubicarlo en la fibra muscular en un punto distinto al receptor nicotínico.
Se determinó que el extracto de alcaloides tiene un efecto dual de acuerdo al
sitio de acción (unión neuromuscular y músculo), que puede ser excitatorio e
inhibitorio sobre la amplitud de la contracción muscular.
Es importante conocer las propiedades farmacológicas de los dendrobátidos
(Dendrobatidae), con especies endémicas de Colombia y realizar investigaciones
como un primer paso, ya que un futuro los componentes aislados se podrían
utilizar como sustancias importantes para el tratamiento de enfermedades.
10. Recomendaciones
Desarrollar investigaciones con técnicas específicas que permitan separar y
aislar los componentes tóxicos del extracto de alcaloides aislado de la piel de
D.truncatus, para que posteriormente se puedan realizar pruebas farmacológicas
en las que se pueda valorar la actividad biológica de dichas sustancias.
Determinar la actividad biológica de las fracciones de alcaloides aislado de D.
truncatus en preparación frénico – diafragma de rata y corazón aislado.
Se sabe que las pumiliotoxinas, con dosis pequeñas generan una marcada
acción cardiotónica generada por el tiempo prolongado de apertura de los
canales voltaje dependiente de sodio. Sería de gran valor desarrollar estudios
del efecto del extracto de alcaloides de D. truncatus sobre aurícula aislada, para
cerciorar la presencia alguna pumiliotoxina que no ha sido encontrada el perfil de
alcaloides de D. truncatus.
Para determinar si el efecto excitatorio generado por el extracto de alcaloides
aislados de la piel de D. truncatus se debe a la acción de alguna pumiliotoxina,
se sugiere desarrollar una prueba biológica con la preparación frénico diafragma
de rata aplicando 2µg/ml de extracto de alcaloides generando el efecto
excitatorio registrado en este estudio, para después aplicar tetrodotoxina, pues
se sabe que estas toxinas bloquean el efecto de las pumiliotoxinas.
Continuar con esta línea de investigación encaminada al conocimiento del efecto
de los alcaloides o tóxicos producidos por animales en general, pues con base
en estos, se pueden derivar sustancias importantes con posible aplicación
terapéutica.
11. Literatura Citada
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alkaloids (2)-histrionicotoxin 259A, 285C and 285E†. The Royal Society of
Chemistry 2002 CHEM. COMMUN.1214–1215
44. Spande,T., P. Jain, H. M. Garraffo, L.K. Pannell, H.C. Yeh & J. W. Daly.
1999.
Occurrence
and
Significance
of
Decahydroquinolines
from
Dendrobatid Poison Frogs and a Myrmicine Ant: Use of 1H and 13C NMR
in Their Conformational Analysis. J. Nat. Prod. 62, 5-21.
45. Spivak CE, MA Maleque, AC Oliveira, LM Masukawa, T Tokuyama , JW
Daly, X Albuquerque . 1982. Actions of the histrionicotoxins at the ion
channel of the nicotinic acetylcholine receptor and at the voltage-sensitive
ion channels of muscle membranes. Mol Pharmacol. 21(2):351-61.
46. Summers, K. & M. E. Clough. 2001. The evolution of coloration and
toxicity in the poison frog family (Dendrobatidae). PNAS 98 (11): 6227–
6232.
47. Warashina O. T. 1987. Effects of histrionicotoxin derivatives on ion
channels and acetylcholine receptor-channel complexes in bullfrog
sympathetic ganglia. Comp Biochem Physiol C. 88(2):249-54.
48. Zambrano, G. 2000. Determinación de la dieta en dos poblaciones de
Dendrobates truncatus, Anura: Dendrobatidae, y su relación con los niveles
de toxicidad Giselle Zambrano González; dir. Vladimir Corredor; cod. Mar
Tesis (Biólogo) -- Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias.
Departamento de Biología, Bogotá. 99p.
12. Anexo
Tabla 5. Información de los especimenes de D. truncatus
colectados para la extracción de alcaloides.
Designación
Fecha y
Nombre
única de la
hora de
del
muestra
colecta
colector
CCB- 012
Agosto 15 de
Jorge
Colombia (Tolima)
2005. Horas
Gualdrón
Municipio de Melgar, vía
de la
Jorge
2005. Horas
Gualdrón
CCB- 016
CCB- 017
CCB- 018
Extracto
adicional
No.
32
En platanales.
1
Hembra
Colombia (Tolima)
29
En platanales.
1
Hembra
Municipio de Melgar, vía
Icononso, vereda Alto de
la Paloma. 600m
mañana
CCB- 015
Información
la Paloma. 600m
Agosto 15 de
de la
CCB- 014
LRC
(mm)
Icononso, vereda Alto de
mañana
CCB- 013
Localidad
Agosto 15 de
Jorge
2005. Horas
Gualdrón
Colombia (Tolima)
31
Icononso, vereda Alto de
mañana
la Paloma. 600m
Agosto 15 de
Jorge
Colombia (Tolima)
2005. Horas
Gualdrón
Municipio de Melgar, vía
de la
Icononso, vereda Alto de
mañana
la Paloma. 600m
Agosto 15 de
Jorge
Colombia (Tolima)
2005. Horas
Gualdrón
Municipio de Melgar, vía
de la
Icononso, vereda Alto de
mañana
la Paloma. 600m
1
Hembra
Municipio de Melgar, vía
de la
En platanales.
27
En platanales.
1
26
En platanales
1
En Cafám
2
Octubre 8 de
Catalina
Colombia (Tolima)
2005. 6: 30
Celis
Municipio de
25
Melgar, zanja
AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf
Octubre 9 de
Catalina
Colombia (Tolima)
2005. 6:40
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf.
Octubre 9 de
Catalina
Colombia (Tolima)
2005. 8:05
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf.
Octubre 15
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de Melgar, Km
10:30 AM
Borrero
29
En Cafám
2
Hembra
CCB- 019
27
En Cafám
2
Hembra
CCB- 020
6,75 vía Icononso,
vereda Alto de la Palma.
31
Quebrada
3
600m
CCB- 021
Octubre 15
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de Melgar, Km
11:00 AM
Borrero
30
Sobre hojarazca
3
En Cafám
4
6,75 vía Icononso,
vereda Alto de la Palma.
600m
CCB- 022
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
8:10AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf.
26
Hembra
CCB- 023
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
9:10AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf.
29
En Cafám
4
Hembra
CCB- 024
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
30
Melgar, zanja
En Cafám
9:30AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf.
4
Hembra
CCB- 025
CCB- 026
CCB- 027
25
En Cafám
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
11:05AM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
2:15 PM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf
Octubre 23
Catalina
Colombia (Tolima)
de 2005.
Celis
Municipio de
Melgar, zanja
2:40PM
Borrero
Melgar,Cafam. 600m
campo de golf
28
26
En Cafám
En Cafám
4
4
4
Se observan algunos datos de campo referentes a los 16 ejemplares colectados en
Melgar (Tolima), y su participación en cada extracto.