Curso de verano Universidad de Salamanca Marcador es moleculares para la caracterización de Phytophtltorn Prof. Dr. A ltino Branco Choupina Instituto Politécnico de Bragan~a, EscoJa Superior Agrária, Campus Santa Apolónia. Apartado 1172, 5301 -855 Braganc;:a- Portugal En ia actualidad se dispone de varias técnicas que penniten revelar vru.iablilidades a nivel de DKA. Características del DNA que diferencian dos o más individuos y que se heredan genétic-amente, son conocidas como maracadores moleculares. Los principales tipos de marcadores moleculares pueden ser clasificados en dos grupos, según la merodología utilizada para identificarlos: Hibridación o amplificación del D)IA. Entre los identificados por hibridación están los marc adores RFLP ("R estnctwn Fragrnent Length Polymorphism'') y :..1inisatélites o locus VNTR ("Variable 1\umber of Tandem Repeats"). Aquellos revelados por amp lificación incluyen los marcadores del tipo RAPD ("Random Amplified Polyrnorphic DNA"); SCAR ('"Sequence Characte1ized .A.mplified Regions") o ASA (Amplified Specific Amplicon); :-.1icrosatélites (o SSR - "Simple Sequence Repeats"); y AF LP (Amplified Fragmem Length Pol)''lllOrphi sm). Las tecnolo gías de los marcadores moleculares están e,·olucionando rápidamente y ya existen modificaciones para algunas de las técmcas anteriormente mencionadas. Con todo, Jos tipos de marcadores aquí listados son los que están siendo uti lizados para la caracteiización de cultivos. Puede encontrarse la desc1ipción de cada uno de los tipos de marcadores mencionados en Milach (1998a) e Feneira & Granapaglia ( 1995). La técnica de RFLP es laboriosa, emplea más tiempo para la obtención de resultados que otras técnicas, el coste es relati\'amente alto y pone de manifiesto un grado de polimorfismo de íntem1edio a bajo, según la especie. A pesar de ello, los RFLPs han sido utilizados en un gran número de estudios de caracteri zación (Gebhardt er al., 1989; O ' Donoughue et al., 1994; Autrique et al., 1996). Todo ello debido principalmente a su alta fiabilidad y reproductivilidad en la obtención de resultados. Los minisatélites o locus VT:'-l'R son secuencias repetidas de DKA, adyac entes y e.n número variab le (J effreys et al. , 1985). Esta técnica es similar a la de RFLP, variando básicamente en el tipo de sonda utilizada y presentando las ventajas y desventajas de la técnica anterior. Una Yeutaja adicion al de los minisatélites es el alto grado de polimorfismo presentado, dependiendo de la variación de la distribución de los sitios de restricción, de las sondas utilizadas, y del número y tipos de secuencias repetidas. De hecho, utilizando una única sonda de minisaté1ites, :Nyb om y c-olaboradores ( 1990) caracterizaron cuatro cultivos de Malus sp., cuatro de Prwms sel'otina y ocho d e Rubus sp. Entre las técnicas presentadas, la RAPD es la de menor costo, número de etapas y tiempo de obtención de resultados, y es fácil de implementar. Aún con todo. una de las desventajas es su baja reproductibilidad y poca fiabilidad de un laboratorio a o tro, Jo que dificulta la comparación de datos obtenidos en diferentes zonas. Así mismo deben de tomarse precauciones para la caracterización de los cu ltivos. El nivel de polimorfismo obtenido con RA..PDs varía mucho con la especie en cuestión y ha sido utilizada con éxito p ara la caracterización de vari edades de cebada (Tinker et al., 1993; Penner et al., 1998) y anoz (MacKill, 1995), entre otras. Los m arcadores SCAR son amplificados con "primers" específicos, diseñados en base a secuencias ya mapeadas o caracterizadas (Paran & Michelmore, 1993). Muchos de Jos "primers" se oblienen de la conversión de marcadores RAPD en SCAR. Esta transfom1ación. en general resulta en la disminución del ni\'e1 de polimorfismos obtenidos por SCAR. Con todo, esto puede atenuarse con la digestión de enzimas de restricción de los productos amplificados. y con la secuenciación de las bandas monomórficas y subsecuente diseño de "primers" que amplifiquen secuencias más va1iables ~ntre los genotipos. La técnica de SCAR es muy semejante a la de RAPD, con la \·emaja de ser más fiable y con la desventaja de implicar la utilización de "primers" de elendo coste. Los microsatélites implican el diseño de "primers" específicos, Jo cual es un proceso laborioso y caro. Pero una vez que se disponga de estos, el costo de esta técnica se asemeja a la de RAPD, con la excepción de que los geles p ara separaT los fragmentos de DNA deben de ser de poliacdlamida, los cuales son de ele vado costo. La gran ventaja de esta técnica es el a lto polimorfismo revelado, que le Yttelve una de las mejores opciones para el uso de la caracterización de cultivos, principalmente en gem10plasma emparentado y de baja variabilidad. Por fin, la téc.nica de .AFLP posee una gran c apacidad para la detección de variabilidad genética y para la caracterización de culti vos. De h echo, ha sido utilizada con éxito para esta finalidad (Hongtrakul er al, 1997). Entre las ventajas de su uso, está el alto grado de polimorfismo y el alto número de maTcadores detectados por gel analizado. AFLP es la técnica más laboriosa entre las técnicas de PCR, necesita geles de poliacri lamida para la separación de los fragmentos y e stá protegida por patente. Algunas de estas técnicas hru1 sido ut ili zadas con éxito para la i dentificación y caracterización de especies de Phytophthora, un hongo de interés fitopatógeno. Los métodos moleculares de identificación de Phytopl11hora basados e n la amplificación p or PCR de la región del genoma que codifica para los rR..:"\fAs, y concretamente, las regiones ITS 1, 5.8S y ITS2, h an pemütido la identificación objetiva de especies de este género (Cook er. al. , 2000). En la EscoJa Superior Agraria de Braganrya, y en colaboración con la Cniversidad de Salamanca hemos puesto a punto un SCAR capaz de identificar Plzywphlhora cinnamomi con D"NA obtenido a partir de muestras de distintos sustratos. Bibliografia C t\0, D.. OARD, J.H 1997 l'edigrce ar.~ RAPD-ba><d 0:--IA t:Jei)'$1S of cc-mmcrc.al li.S. rice .-:u:1hars. C:o;> Sci. 37:: 6~ 0-163 ~. COOK D. E. L.. Dr<nt1:, A.• D:~ca:n, J ..\L \\'agds, G. & Brasier, C. ;\{, (200Ji A nl'llecür Ph)·loge:Jy of l'h;,:op!:rl-.o:·r. ané :elme<i tJc n·.y~etes Fung~l ge!l:tics ~:"'C Bio!og}: 30: 17-3;; GSB'-1.->..RDT. C ; BLOJ-fEJ\DAHL. C., SCHACHTSCHABEL, t: . DC.BE:'lER, T; S..,LA\JNI, F.; RITTER, E 19~9. Et:mt\clti=':l of :?r. brecCing t-::1~~ a:tt.! 41: \'t.:ietks o! po~.ato r_Solanun: tube:"Osun:, sip wberorumj wif1 RFLP-fbg~rp---::us T.1~,::,r .\~~- Ge~e :. 78:16-22 HO:-.IGTRAKUI.. \'., Ht:EST1S. G.::V!., 1-J\APP, SJ. :997. 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