(PCR y variantes).
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CURSO DE PRIMAVERA PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER Conceptos básicos sobre ADN y ARN Técnicas de amplificación (PCR y variantes) Aplicaciones principales Dr. Juan C. Cigudosa Madrid 29 y 30 de mayo, 2014 SEAP- IAP Material hereditario: ADN • Nuestra información genética está codificada en una macromolécula: el ADN (ácido dexoxirribonucléico). • El ADN con proteínas forma los cromosomas. El material básico de los cromosomas es la cromatina. • 46 cromosomas que se agrupan en parejas de cromosomas homólogos (uno heredado del padre y el otro de la madre) 2 metros de ADN en un núcleo de 0,005 mm diámetro Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb Cromatina=(ADN+proteinas) El ADN como material genético Características del material genético •Capacidad de almacenamiento de la información •Capacidad de replicación •Capacidad de expresión de la información •Capacidad de variación por mutación El ADN como material genético Características del material genético •Capacidad de almacenamiento de la información •Capacidad de replicación •Capacidad de expresión de la información •Capacidad de variación por mutación ADN 1. Acido Desoxiribonucleico: información genética. 2. Polímero formado por subunidades: nucleótidos. 3. Nucleótido está constituído: azúcar pentosa(desoxiribosa)+base nitrogenada (A,T,C,G)+ grupo fosfato. 4. T y C pirimidinas; A y G purinas. 5. T es complementaria a A C es complementaria a G 6. Estructura de doble hebra ¿Qué es una secuencia de ADN? • ADN: 4 caracteres A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina). • Las moléculas de ADN están compuestas por una secuencia de millones de estos caracteres, de la misma manera que si tuviéramos un collar en los cuales cada perla es de un color de cuatro posibles. • El orden de las bases en la secuencia es la manera de almacenar la información: el ADN es la memoria química de los organismos vivos. • La lectura de esta secuencia de bases secuenciación. es lo que denominamos GENOMA/GEN • GENOMA: todo el ADN contenido en el núcleo que hay ADN en mitocondrias). (no olvidar • La unidad de información en el ADN es el GEN (formado por nucleótidos) que es una secuencia de ADN que contiene la información para la producción de proteínas, así como las instrucciones regulatorias para determinar cuándo y en qué cantidad se producirán esas proteínas. • 20000 genes aproximadamente • 20-30 kb tamaño medio de un gen (nº exones muy variable (media de 7-8) Estructura de un GEN Región codificante EXOMA Región no codificante El ADN como material genético Características del material genético •Capacidad de almacenamiento de la información •Capacidad de replicación •Capacidad de expresión de la información •Capacidad de variación por mutación Replicación del ADN DEFINICION: una molécula original de ADN de doble cadena es convertida en dos moléculas hijas de ADN idénticas. El ADN como material genético Características del material genético •Capacidad de almacenamiento de la información •Capacidad de replicación •Capacidad de expresión de la información •Capacidad de variación por mutación DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Complementariedad de bases nitrogenadas ARN 1. Acido Ribonucleico. 2. Polímero formado por subunidades: nucleótidos. 3. Nucleótido está constituído: azúcar (ribosa)+base nitrogenada (A,U,C,G)+ grupo fosfato. 4. U y C pirimidinas; A y G purinas. 5. U es complementaria a A C es complementaria a G 6. Estructura monocatenaria Severo Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cómo se sintetizaba el ARN CODIGO GENÉTICO 43 = 64 codones 20 Aa 1er Aa SIEMPRE ATG/ Met Codones STOP TAA/TAG/ TGA Splicing alternativo Modificaciones post-traduccionales Los GENES se anotan en mayúscula y cursiva P53, BCR-ABL, EGFR, etc Las PROTEINAS se anotan en minúscula p53, Bcr-Abl, Egfr, etc El ADN como material genético Características del material genético •Capacidad de almacenamiento de la información •Capacidad de replicación •Capacidad de expresión de la información •Capacidad de variación por mutación El ADN como material genético • El material genético debe ser capaz de proporcionar una fuente de variabilidad a través del proceso de mutación. • Mutación: cambio que afecta a la composición del ADN que tendrá su reflejo final en la proteína resultante. • Mutación línea germinal: afecta a los gametos, pasará a la descendencia. • Mutación somática: Alteración o cambio en la información genética (ADN) que ocurre después de la concepción. • Este cambio podrá ser beneficioso, neutral o perjudicial. Tipos de mutaciones Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leída durante la traducción, resultando en una proteína completamente diferente, que no suele ser funcional. Tipos de mutaciones Tipos de mutaciones • Mutaciones no sinónimas: sustituciones nucleotídicas que cambian un aminoácido por otro (MISSENSE). • Mutación sinónima: mutación que altera la base situada en la tercera posición del codón pero no causa sustitución aminoacídica (SILENT) • Mutación sin sentido: mutación por la cual un codón que especifica un aminoácido es cambiado a un codón de terminación, dando lugar a una proteína truncada (NONSENSE). Polimorfismos Definición: variación en la secuencia de un lugar determinado del DNA entre los individuos de una población. Debe aparecer por lo menos en el 1% de la población. La mayor contribución a la variación genética son los SNP (85%) Cada 1000 b un SNP SNPs •Alrededor de 8 millones de SNPs en todo el genoma. •Algunos pueden producir cambios en proteína: - susceptibilidad a padecer enfermedades - resistencia a tratamientos específico PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCION ACIDOS NUCLEICOS Y CONSERVACION DE MUESTRAS Muestras Biológicas 1.- Tejido – Biopsa en fresco - Biopsia enparafina 2.- Fluidos: - Médula ósea - Sangre Periférica - Saliva Heparina EDTA - Líquido Cefalorraquídeo - Líquido Pleural - Líquido Pericárdico - Líquido Ascítico - Líquido Sinovial Citrato Sódico Muestras Biológicas 1) Citogenética Convencional CARIOTIPO 2) Citogenética Molecular FISH 3) BIOLOGIA MOLECULAR Mínimo 5 ml MO/SP Para RQ-PCRm, 10 ml de SP 3 ml de MO/SP HEPARINA Corte OCT o Parafina EDTA OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS METODOS DE EXTRACCION DE ARN 1) 2) 3) 4) Extracción con Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo Trizol: reactivo comercial Columnas de silicagel (Rneasy Mini Kit-Qiagen) Purificación por afinidad con Oligo-dT (para mRNA) Métodos Extracción de ADN 1) Extracción con Fenol-Cloroformo-Isoamílico 2) Columnas de silicagel (DNAmp Mini Kit- Qiagen) Métodos automatizados AC. NUCLEICO [AC. NUCLEICO] (mg/ml) PUREZA (Valor óptimo) ADN A260 x 50 x dilución A260/A280 (1,80) ARN A260 x 40 x dilución A260/A280 (2,00) Extracción ADN, ARN y proteína LISAR Y HOMOGENEIZAR LAVAR PRECIPITAR ELUIR PRECIPITAR DISOLVER LAVAR ELUIR CURSO DE PRIMAVERA PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER Conceptos básicos sobre ADN y ARN Técnicas de amplificación (PCR y variantes) Aplicaciones principales Dr. Juan C. Cigudosa Madrid 29 y 30 de mayo, 2014 SEAP- IAP Tipos de PCR PCR Sencilla: RFLP PCR Anidada (Nested): Amplificación de una secuencia dentro de otra previamente amplificada RT-PCR PCR Múltiple: Varios targets diferentes en forma simultánea Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa PCR MSP: metilación PCR Digital (2011) Variantes de PCR: secuenciación y pirosecuenciación Tipos de PCR: PCR sencilla Primers externos para amplificación de una secuencia Fragmento de amplificación Tipos de PCR: PCR anidada Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers Reacción 1 Primers externos para amplificación de una secuencia extensa Reacción 2 Primers internos para amplificación de una región especifica SEGUNDA PCR Aumentar ESPECIFICIDAD Aumentar SENSIBILIDAD (10-6) Tipos de PCR: RT-PCR Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA mRNA Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa cDNA PCR Enzima Taq polimerasa Tipos de PCR: PCR Múltiple • Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en un único tubo diferentes secuencias diana. • Aplicación. 1) Multiplex-PCR control calidad de una muestra: amplificación de 4 genes constitutivos distintos. 2) Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificación de una de las 4 posibles translocaciones que estudiamos. 3) ARMS-PCR: Amplificación por PCR de Alelos Específicos. Tipos de PCR: PCR Múltiple Amplificación 4 genes simultáneamente BCR (377 pb) b2MG (287 pb) ABL (193 pb) PBGD (128 pb) Tipos de PCR: PCR Múltiple Amplificación 4 translocaciones simultáneamente LAL-B infantil t(4;11) MLL-AF4 t(1;19) E2A-PBX1 t(12;21) TEL-AML1 Controles Positivos t(9;22) BCR-ABL ADNc individuo con la t(9;22) e1a2 POSITIVO Tipos de PCR: Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa - CUANTIFICACIÓN de la expresión de genes o reordenamientos. - Más rápida y menos laboriosa. Tipos de PCR: RQ-PCR Medida de señal de fluorescencia en la fase exponencial del proceso de PCR a tiempo real Fundamento 1.Detección y cuantificación de la señal, emitida por un reporter fluorescente, que aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR 2.Termociclador con sistema de detección capaz de cuantificar la señal emitida por el reporter Tipos de PCR: RQ-PCR CUANTIFICACION RELATIVA Expresión de un gen en una muestra problema en relación a la expresión de dicho gen en controles normales. CUANTIFICACION ABSOLUTA Detección del Nº Copias “exacto” de un gen o de un gen de fusión mediante la comparación con estándares de concentración conocida. Tipos de PCR: RQ-PCR • Química de la Reacción. Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN. • Ciclos Térmicos. – Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C). – Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers con su secuencia complementaria y actividad de la TaqPolimerasa (60ºC). Tipos de PCR: RQ-PCR • Química de la Reacción. Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN. • Ciclos Térmicos. – Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C). – Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers con su secuencia complementariay actividad de la TaqPolimerasa (60ºC). Tipos de PCR: RQ-PCR Fundamento QUIMICO Ag. Intercalantes (SYBR Green) REACTIVOS FLUORESCENTES Sondas de Hidrólisis (TaqMan) Sondas de Hibridación Sondas de Horquilla (Molecular Beacons) Tipos de PCR: RQ-PCR Fundamento QUIMICO SYBR Green Fase annealing Fase extensión (I) Fase extensión (II) Fin del ciclo de PCR Tipos de PCR: RQ-PCR Fundamento QUIMICO SYBR Green Ventajas - simple y económico - fácil de usar - sensible (10-6) - versátil (no se necesitan sondas específicas) Desventajas - sobrestimación de la cantidad de molde por la unión del SYBR Green a dímeros de primer y a otros productos inespecíficos - necesario hacer una curva de melting Tipos de PCR: RQ-PCR Fundamento QUIMICO Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan) Fase annealing Fase extensión (I) Fase extensión (II) Fin del ciclo de PCR Tipos de PCR: RQ-PCR Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan) Ventajas -especificidad -librerías de cebadores y sondas en las casas comerciales Desventaja - diseño de cebadores y sonda para genes que no se han estudiado (Primer Express) Tipos de PCR: RQ-PCR • Química de la Reacción. Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN. • Ciclos Térmicos. – Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C). – Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers con su secuencia complementaria y actividad de la TaqPolimerasa (60ºC). Tipos de PCR: RQ-PCR FUNDAMENTO TERMICO RQ-PCR Tipos de PCR: RQ-PCR Producto de amplificación Fase de plateau o saturación Fase exponencial Ciclo umbral (CT) Ruido de fondo CT (ciclo umbral):ciclo en el que la intensidad de emisión del fluorocromo aumenta significativamente con respecto al ruido de fondo Tipos de PCR: RQ-PCR INTERPRETACION RESULTADOS RQ-PCR (I) PRESENCIA (Nº COPIAS)/AUSENCIA CT muestra Log dilución Tipos de PCR: RQ-PCR -Amplificación robusta y fiable -Alta especificidad y sensibilidad -Alta precisión y exactitud -Cuantifica producto de PCR en cada ciclo -Capacidad de realizar mayor número de reacciones al día -No requiere análisis posterior a la PCR (electroforesis) -Mayor control de contaminación -Amplio rango de aplicación: reordenamientos IgH o TCR fusión de genes a nivel DNA fusión de genes a nivel cDNA genotipado expresión génica Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR) 2ª 1ª 3ª “X” target copies Hacer gotas PCR Cualitativa PCR gotas Leer gotas Real-time PCR Cuantificación relativa Cuantificación Droplet Digital PCR Cuantificación absoluta Droplet Digital PCR (ddPCR™) – 3ª Generación Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR) Ventajas Aumento de señal / ruido. DNA de alto número de copias y background se diluyen, enriqueciendo los DNA escasos y permite un ± 10 % de precisión Eliminación de los sesgos de la PCR. Las tasas de error se reducen mediante la eliminación de la dependencia de amplificación de la eficiencia, permitiendo detección de pequeñas diferencias (1,2 X) Simplificación de la cuantificación. Con ddPCR no necesitamos estándares para la cuantificación absoluta ó relativa. Reducción del coste del reactivo. reacción son picolitros-nanolitros en volumen, reduciendo muestra reactivo y entrada Desventajas Precio de la plataforma SENSIBILIDAD 10-7 Secuenciación (PCR modificada) • ¿Qué es la secuenciación? • Metodología Terminadores/Sanger Pirosecuenciación Nueva generación de secuenciadores • Análisis de secuencias • Ejemplos de secuenciación Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441–448 Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4 M Ronaghi et al. Analytical Biochemistry. 1996;242:84-85 Shenduret et al. Nat Biotecnology. 2008: 26 Secuenciación (PCR modificada) 1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger (marcaje fluorescente de las moléculas de ADN amplificadas por PCR) 2) Separación de moléculas marcadas: - electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante - electroforesis capilar Secuenciación (PCR modificada) La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN, corresponde a la emisión de fluorescencia del nucleótido incorporado en 3´ Secuenciación (PCR modificada) 1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger (marcaje fluorescente de las moléculas de ADN amplificadas por PCR) 2) Separación de moléculas marcadas: - electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante - electroforesis capilar Secuenciación (PCR modificada) Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con los picos de colores y su correspondiente base. Secuenciación (PCR modificada) Método enzimático/Teminadores/Sanger Purificación de los productos de secuenciación Secuencia correcta CROMATOGRAMA Terminadores Secuenciación (PCR modificada) Método enzimático/Teminadores/Sanger Revisión visual de los electroferogramas. Longitud de secuencia adecuada Valores de calidad mínimos Uso de programas informáticos para el análisis. Comparar secuencias en ambas direcciones. Comparar las muestras con una secuencia de referencia (sin mutaciones) Secuenciación (PCR modificada) Tipos de discrepancias con la secuencia de referencia: 1.Polimorfismos - Mutaciones Puntuales - Deleciones - Inserciones - Translocaciones - Inversiones 2. Artefactos de la secuenciación Secuenciación (PCR modificada) Método enzimático/Teminadores/Sanger Ventajas Desventajas Experiencia Baja capacidad Gold estándar Sensibilidad baja “Único Método”?? No es cuantitativo Coste por base Secuenciación Masiva (PCR modificada) Tipos de PCR: RT-PCR • oligo(dT)n Primer (n = 10 – 20) poly(A) tail mRNA TTTTTTTTTTTTTTT cDNA • Random Primer p(dN)x (x = 6 -9) poly(A) tail mRNA cDNA NNNNNN NNNNNN NNNNNN • Gene-specific Primer – Unión específica a la secuencia homóloga – for 1-step RT-PCR Tipos de PCR: PCR Múltiple ARMS-PCR (Amplificación por PCR de Alelos Específicos) C3 C1 G 1849G>T T C4 C2 Control 463 pb Mutante 279 pb Normal 229 pb C3+C2: Amplificación del alelo normal C1+C4: Amplificación del alelo mutado C1+C2: Amplificación Control Interno Tipos de PCR: PCR Múltiple C3 C1 JAK2 Mutación V617F G 1849G>T T C4 Control 463 pb Mutante 279 pb C2 ADN de pacientes con la mutación Normal 229 pb Control Interno Alelo Mutado Alelo Normal ADN pacientes sin la mutación Mutación en homocigosis o heterocigosis: no se conoce la implicación clínica Tipos de PCR: PCR MSP
