Aplicaciones de las Técnicas de Detección de Ácidos Nucléicos en

Aplicaciones de las
Técnicas de Detección de
Ácidos Nucléicos en
Medicina Transfusional
BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI
FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
lilianadt2003@yahoo.com.ar
HIV: screening y diagnóstico de
laboratorio, Breve repaso…
Los métodos de screening se basan principalmente en la
búsqueda de anticuerpos anti-HIV (O,1,2). (ELISA o EIA:
1°, 2°, 3° generación)
 Existe el test de detección del antígeno HIV: detección del
Ag p24 (ELISA 4° generación)
 Ensayos combinados antígeno-anticuerpo.
 Al igual que con otros retrovirus, los portadores de
anticuerpos son portadores del virus.
 Los anticuerpos anti-HIV y ag p24 aparecen de manera
temprana: existe un período de ventana serológico de 21
días hasta la seroconversión.
 Los anticuerpos permanecen durante toda la vida.
 El diagnóstico comprende 2 etapas: tamizaje y confirmación
por Inmunoblot (Western Blot)
 Screening/ Diagnóstico molecular: NAT: TMA o PCR;CV;
genotipificación; test de resistencia

2
Recomendaciones de la OMS para
ITT en donantes de Sangre (1)
……”Los métodos utilizados para identificar la
presencia HIV emplearán los siguientes targets”…
Marcadores Serológicos
1. Anticuerpos anti-HIV-1, incluyendo grupo O, + antiHIV-2 (EIA, CLIA)
2. Antígeno del HIV p24 (p24 Ag) (EIA, CLIA)


Ácido nucléico viral: HIV RNA.
Fuente:Screening Donated Blood for Transfusion Transmissible
Infections. Recommendations. WHO Library Cataloguing-inPublication Data 2009
3
HIV
Evolución clínica de la Infección
4
Período Ventana
Model Testing Data
Fuente: -Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.
-Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29
5
OBJETIVO DE NAT:
Disminución del período de ventana
HIV-1 : 5-6 días
HIV-1 : 19 días
NAT REACTIVO
Virus
Eclipse
Período Ventana
Reactividad Serológica
Reacción inmune
Infección
Tiempo
Detección más temprana
6
7
Ácidos Nucléicos
Definiciones
DNA y RNA son polímeros que almacenan
transmiten información del código genético
y
Nucleótidos son subunidades de DNA o RNA que
consisten en un azúcar, un grupo fosfato y una
base A, G, C, T or U
Las Bases se aparean y se mantienen unidas por
puentes de hidrógeno
C se une a G
A se une a T (sólo DNA) A se une a U (sólo RNA)
8
Ácidos Nucléicos
Definiciones
Oligonucleótidos:




Polímeros sintéticos
Simple hebra
Dos o más nucleótidos
De Captura, Cebadores (Primers), o Sondas
(target)
Target
Oligonucleotide
9
Ácidos Nucléicos
Definiciones
Sondas:


Oligonucleótidos con un molécula detectora acoplada
Detector: molécula de Éster de Acridinio (AE), SYBR
Green, Molecular Beacons , etc.
Blanco (Target)
Molécula Detectora
Sonda de
oligonucleótidos
10
Ácidos Nucléicos
Definiciones
Amplicones:

Copia sintética de una secuencia de DNA o RNA

Durante la amplificación, hay un incremento exponencial
del número de copias hecho a partir de un fragmento de
RNA o DNA
11
TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR
 Involucran tres etapas:
1. Extracción o captura del genoma viral
2. Amplificación
3. Detección
Ejemplos:


PCR(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR (Real Time PCR)

NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)

TMA (Transcriptional Mediated Amplification)
12
REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

PCR es un proceso enzimático en el que una
región específica del DNA se replica para
producir muchas copias de una secuencia
particular. Utiliza ciclos repetidos, cada uno de
los cuales consiste de tres pasos:
1.
Extracción y purificación de los ácidos nucléicos del
microorganismo de la muestra biológica.
2.
Amplificación de un segmento seleccionado del genoma
del microorganismo mediante reacción en cadena de la
polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha.
3.
Detección de los fragmentos amplificados en la PCR
(amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y
tinción con bromuro de etidio
13
PCR - Conceptos básicos
Especificidad
Generación de un único producto de
amplificación
 Eficiencia
Máxima producción de amplificación en
función del número de ciclos.
 Fidelidad
Número de errores que comete la DNA
polimerasa durante la copia.
 Sensibilidad
Mínima cantidad de ADN que se necesita
para obtener una gran cantidad de copias

14
Ciclos de la PCR
15
Perfil básico de la PCR
Los ciclos (30-35) comprenden tres etapas:
 Desnaturalización
 Alineamiento (annealing)
 Extensión
16
17
18
PCR Real Time

Los procesos de amplificación y detección de
una PCR convencional se producen de
manera simultánea en un mismo vial
cerrado.

Mediante detección por fluorescencia se
puede medir durante la amplificación la
cantidad de ADN sintetizado en cada
momento.

La emisión de fluorescencia producida en la
reacción es proporcional a la cantidad de
ADN formado. Esto permite registrar la
cinética de la reacción de amplificación.
19
PCR Real Time

Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a
tiempo real incorporan un lector de fluorescencia
y están diseñados para poder medir, en cualquier
momento, la fluorescencia emitida en cada uno
de los viales donde se realice la amplificación.

Los sistemas de detección por fluorescencia
empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de
dos tipos:


agentes intercalantes
sondas específicas marcadas con fluorocromos
20
21
TMA: Transcription Mediated Amplification

1.
2.
3.
El ensayo de TMA comprende tres etapas
principales que tienen lugar en un sólo tubo:
Preparación de la muestra: captura
selectiva del target
Amplificación selectiva del ARN del HIV-1 y
del HCV así como del ADN del HBV por
amplificación mediante transcripción (TMA)
Detección de los productos de la
amplificación (amplicón) por el ensayo de
protección de la hibridación.
22
Pasos Principales del Ensayo
Detección
Amplificación
Captura del blanco
o diana (target)
Paso de Amplificación- TMA
Transcripción-mediada
por amplificación (TMA):
produce amplicones RNA
Transcription-mediated amplification
(TMA)
(1)
Target
Promoterprimer
(2)
(3)
 Transcriptasa
Reversa
hace copias de DNAc del
IC y del ácido nucléico
viral
 RNA Polimerasa inicia la
transcripción
para
producir productos de
amplificación
(amplicones)
RNAse H
activities
(4)
DNA
RNA
DNA
(5)
Primer
2
(6)
(7)
Promoterprimer
RNA
polymerase
100-1000
copies
(8)
RNA amplicon
DNA
Template
(12)
(11)
RNAse H
activities
(10)
(9)
Primer 2
IVD Technology. Volume 6, No. 7, Nov/Dec 2000.
Detección - Ensayo de Cinética Dual
(DKA)
La emisión de luz es capturada y medida
en Relative Light Units (RLU)
RLU
(Relative
Light Units)
Interval 25
0/0
1 Sec/25 readings
2 Sec/50 readings
TMA: Proceso de Ensayo e Instrumentación
Pipeteo
wTCR
Calibradores,
Muestras,
Controles
PIPETEO
MANUAL
TECAN
Captura
del Blanco
Lisis Viral
Captura del
blanco ,
Lavados
Detección
(HPA)
Amplificación
(TMA)
Rvo. Amp,
Aceite, y
Enzima
Hibridización de
sondas
Selección
Resultados
(DKA)
Lectura
automática
URL
Semi-Automación
BAÑOS DE
AGUA,
SISTEMA DE
CAPTURA DEL
BLANCO
PIPETAS DE
REPETICIÓN,
BAÑOS DE
AGUA
BAÑOS DE
AGUA
LUMINOMETRO
HC+
SEMIAUTOMATIZACIÓN
27
AUTOMATIZACIÓN
28
Algoritmo de trabajo para el screening
molecular de donantes
29
Estudios complementarios para
muestras RR HIV-NAT
Si es MP-NAT, abrir pool y resolver
individualmente, luego dHIV-NAT (ensayo
discriminatorio)
 Si
es
ID-NAT
ejecutar
ensayos
discriminatorios
 Test BM cualitativos
 Genotipificación
 Test BM cuantitativos (Carga Viral meq/ml o
Copias/ml)
 Test de Resistencia Viral (TTO)

30
31
Comparación entre el rendimiento de NAT-HIV esperado (gris)
vs. observado (blanco) por millón de donaciones testeadas.
Laperche et al. Vox Sanguinis (2007) 2, 78-84
32
Gracias por su atención!!!
33